CN110267721B - 用于降低色谱中生物负载的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于各种色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括在大规模的基于蛋白A的亲和色谱柱的背景下的生物负载降低。

Description

用于降低色谱中生物负载的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年1月30日提交的美国临时申请No.62/452,140的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明提供了用于各种色谱基质的微生物生物负载降低的方法，包括在大规模基于蛋白A的亲和色谱柱的背景下的生物负载降低。
发明背景
抗体药物是最普遍的生物制药产品。例如用天然或工程化的葡萄球菌蛋白A配体进行的亲合色谱被广泛用作抗体药物制造过程中的捕获方法，以除去杂质和污染物。蛋白A结合抗体的Fc区，蛋白A柱被认为对单克隆抗体的纯化具有选择性。使用蛋白A的亲和层析通常涉及原位清洗(CIP)步骤以清洁和去除与柱结合的杂质，例如沉淀或变性物质。CIP通常用氢氧化钠溶液进行。
除了清洁之外，氢氧化钠溶液或具有苯甲醇的磷酸溶液用于减少蛋白A色谱基质或柱中的微生物数量。来自用于培养产生单克隆抗体的细胞的培养基的细菌，以及相关的宿主细胞蛋白和DNA，可以在使用过程中快速增加蛋白A柱的生物负载。随着细菌和微生物在柱上累积，生物负载增加。随着生物负载的增加，柱性能通常会退化。这种退化的迹象包括产物纯度降低、柱填充劣化和背压增加。
管理和降低蛋白A柱上的微生物生物负载是重要的，因为蛋白A柱非常昂贵，这种亲和柱的填充和拆卸是劳动密集型的。为了避免更换蛋白A柱或在蛋白A柱纯化上游添加工艺步骤的费用，需要找到试剂，其能快速从柱中除去大量生物负载，而不会对蛋白A的结构和功能产生负面影响，并且下游影响很小。
微生物生物负载降低的重要性不限于蛋白A色谱基质，还包括具有与载体偶联的蛋白质配体的其他色谱基质，以及不涉及蛋白质配体的基质，例如各种离子交换色谱基质、疏水相互作用色谱(HIC)基质、混合模式色谱基质、尺寸排阻色谱基质等。
在良好生产规范(GMP)或现行良好生产规范(CGMP)的背景下，色谱基质的微生物生物负载降低尤其重要。这些实践必须提供制造步骤和产品质量的一致性，以满足监管机构的要求，如美国食品和药物管理局。GMP和CGMP要求制造过程中的高度可预测性和标准化，特别是确保用于人类患者的制造的治疗性生物分子的纯度。随着生产生物分子的生长培养物所涉及的劳动力，当发生故障时会产生巨大的费用。过量的生物负载会降低色谱柱性能，这会干扰以标准化和可预测的方式纯化产品，并可能导致其他故障点被触发。
本领域目前已知的降低生物负荷的试剂具有负的下游效应。例如，基于氢氧化钠的溶液和基于磷酸与苯甲醇的溶液可有效杀灭微生物，但也倾向于使蛋白质配体(例如蛋白A)变性，从而对其功能产生负面影响。
此外，这些溶液的氧化剂和其他组分可以与纯化的单克隆抗体一起保留，并进一步在下游降解它们。
因此，本领域普通技术人员理解，难以降低色谱基质中的生物负载，尤其是在具有蛋白质配体的基质中，例如蛋白A色谱基质。
发明概述
如上所述，需要可以在大规模GMP和CGMP的背景下使用的新的有效方法，以降低各种色谱基质的微生物生物负载，尤其是涉及蛋白质配体如蛋白A的那些。本发明通过提供用于降低色谱基质的微生物生物负载的组合物和方法来解决这个和其他需要。
在一个方面，本发明提供了一种用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约0.1M至约0.5M乙酸的组合物接触，其中接触步骤进行至少约2小时。
在相关方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约0.5M至约1.0M乙酸的组合物接触，其中接触步骤进行至少约1小时。
在相关方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约0.1M至约1.0M乙酸的组合物接触，其中所述接触步骤在色谱基质中产生以下一项或多项结果：产芽孢细菌量降低至少3log10，革兰氏阳性菌量降低至少5log10，和革兰氏阴性菌量降低至少5log10。
在另一方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约4.0M至约12.0M脲(urea)的组合物接触，其中接触步骤进行至少约30分钟。
在相关方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约4.0M至约12.0M脲的组合物接触，其中所述接触步骤在色谱基质中产生以下一项或多项结果：产芽孢细菌量降低至少2log10，革兰氏阳性菌量降低至少5log10，和革兰氏阴性菌量降低至少5log10。
在一个实施方案中，本发明提供了用于MabSelectTM Xtra色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本由约0.5M乙酸组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约4小时。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于MabSelectTM Xtra色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约0.1M乙酸和约20％乙醇组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约4小时。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于MabSelectTM Xtra色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约8M脲组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约1小时。
在又一个实施方案中，本发明提供了用于MabSelectTM Xtra色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约8M脲和约20％乙醇组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约1小时。
在一个实施方案中，本发明提供了一种在施用包含用于纯化的药剂的组合物之前降低微生物负荷的方法，所述方法包括(a)提供色谱基质；(b)执行本发明的任何上述方法；(c)将包含药剂的组合物施加于色谱基质。
在以下描述、权利要求和附图中，本发明的这些和其他方面对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
附图简述
图1示出了在含有0.5M乙酸的溶液中的加标研究的结果。在不存在色谱基质的溶液中测量细菌杀灭的程度。黑色条代表类坚强芽孢杆菌(Bacillus psuedofirmus)的量，对角条纹条代表MabSelectTM Xtra柱中暴露于0.5乙酸前(T＝0)和暴露于乙酸1小时(T＝1小时)后的微杆菌属的种数量。
图2示出了通过用类坚强芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)加标溶液并测量细菌滴度来在没有色谱基质的溶液中杀灭类坚强芽孢杆菌的结果。将以下试剂加入到单独的溶液中：(a)注射用水(WFI)，(b)8M脲，(c)8M脲和20％乙醇，(d)6M盐酸胍，(e)带有20％乙醇的盐酸胍。对每一种在PBS中进行加标确认测量，以及在0分钟、30分钟和60分钟时间点的测量。黑色条为WFI，水平条纹条为8M脲，白色条为8M脲和20％乙醇，对角条纹条为6M盐酸胍，交叉阴影条为6M盐酸胍和20％乙醇。
图3示出了通过用类坚强芽孢杆菌加标溶液并测量细菌滴度来在不存在色谱基质的溶液中杀灭微杆菌属的种的结果。加入下列试剂：(a)注射用水(WFI)，(b)8M脲，(c)8M脲和20％乙醇，(d)6M盐酸胍，(e)带有20％乙醇的盐酸胍。在PBS中进行加标确认测量，以及在0分钟、30分钟和60分钟时间点的测量。黑色条为WFI，水平条纹条为8M脲，白色条为8M脲和20％乙醇，对角条纹条为6M盐酸胍，交叉阴影条为6M盐酸胍和20％乙醇。
图4说明了通过用类坚强芽孢杆菌加标溶液并测量细菌滴度来在不含色谱基质的溶液中杀灭嗜麦芽寡养单胞菌的结果。加入下列试剂：(a)注射用水(WFI)，(b)8M脲，(c)8M脲和20％乙醇，(d)6M盐酸胍，(e)带有20％乙醇的盐酸胍。在PBS中进行加标确认测量，以及在0分钟、30分钟和60分钟时间点的测量。黑色条为WFI，水平条纹条为8M脲，白色条为8M脲和20％乙醇，对角条纹条为6M盐酸胍，交叉阴影条为6M盐酸胍和20％乙醇。
图5-9示出了对暴露于0.5M乙酸不同时间长度的含蛋白A的树脂(MabSelectTMXtra和MabSelectTM SuRe)进行的各种产品质量研究的结果。实心圆圈显示MabSelectTMXtra的值，其暴露于0.5M乙酸375小时，或根本不暴露。十字标记显示MabSelectTM SuRe的值，其未暴露于0.5M乙酸5、10、25、200或400小时，或根本未暴露。
图10-14示出了对MabSelectTM Xtra蛋白A树脂进行的各种产品质量研究的ANOVA分析。在酸后柱中，实心圆圈反映了表1中暴露于0.5M乙酸375小时的值。在酸前柱中，实心圆圈反映了表1中暴露于0.5M乙酸零小时的值。菱形形状表示基于95％置信区间的范围。酸后的所有范围都与酸前的范围重叠。ANOVA分析显示，树脂长时间暴露于0.5M乙酸，对蛋白质质量没有统计学上显著的负面影响。
图15-19示出了对MabSelectTM SuRe蛋白A树脂进行的各种产品质量研究的ANOVA分析。在酸后柱中，实心圆圈反映了表1中暴露于0.5M乙酸400小时的值。在酸前柱中，实心圆圈反映了表1中暴露于0.5M乙酸零小时的值。菱形形状表示基于95％置信区间的范围。在图15中，在暴露于酸达到统计学显著程度后范围更大。在图16-19中，酸前的范围都与酸后的范围重叠。ANOVA分析显示，树脂长时间暴露于0.5M乙酸，对蛋白质质量没有统计学上显著的负面影响。
发明详述
在一个方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约0.1M至约0.5M乙酸的组合物接触，其中接触步骤进行至少约2小时。在多个实施方案中，接触步骤进行2至5小时、2至10小时、2至25小时、2至200小时、2至375小时或2至400小时。在一个实施方案中，接触步骤进行至少约4小时。在多个实施方案中，接触步骤进行4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。在一个实施方案中，组合物包含约0.1M乙酸，且接触步骤进行至少约4小时。在一个实施方案中，组合物包含约0.5M乙酸，且接触步骤进行至少约4小时。在多个实施方案中，组合物包含约0.5M乙酸，且接触步骤进行4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。
在一个实施方案中，组合物还包含醇。可使用的醇的非限制性实例包括乙醇(例如，约20％)和苯甲醇(例如，约1％至约2％)。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由约0.1M乙酸和约20％乙醇组成。
在一个实施方案中，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约0.1M至约0.5M乙酸组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约2小时。在一个特定的实施方案中，接触步骤进行至少约4小时。在多个实施方案中，接触步骤进行4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由约0.1M乙酸组成，且接触步骤进行至少约4小时。在另一个特定的实施方案中，组合物基本上由约0.5M乙酸组成，且接触步骤进行至少约4小时。在多个实施方案中，组合物包含约0.5M乙酸，且接触步骤进行4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。
在相关方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约0.5M至约1.0M乙酸的组合物接触，其中接触步骤进行至少约1小时。在多个实施方案中，接触步骤进行1至5小时、1至10小时、1至25小时、1至200小时、1至375小时、1至400小时、4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。在一个实施方案中，组合物包含约0.5M乙酸，且接触步骤进行至少约1小时。在多个实施方案中，组合物包含约0.5M乙酸，且接触步骤进行1至5小时、1至10小时、1至25小时、1至200小时、1至375小时、1至400小时、4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。
在一个实施方案中，组合物还包含醇。可使用的醇的非限制性实例包括乙醇(例如，约20％)和苯甲醇(例如，约1％至约2％)。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由约0.5M乙酸和约20％乙醇组成。
在一个实施方案中，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约0.5M至约1.0M乙酸组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约1小时。在多个实施方案中，组合物基本上由约0.5M至约1.0M乙酸组成，且接触步骤进行1至5小时、1至10小时、1至25小时、1至200小时、1至375小时、1至400小时、4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由约0.5M乙酸组成，且接触步骤进行至少约1小时。在多个实施方案中，组合物基本上由约0.5M乙酸组成，且接触步骤进行1至5小时、1至10小时、1至25小时、1至200小时、1至375小时、1至400小时、4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。
在相关方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约0.1M至约1.0M乙酸的组合物接触，其中所述接触步骤在色谱基质中产生以下一项或多项结果：产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)量降低至少3log10，革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属(Microbacterium spp.))量降低至少5log10和革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia))量降低至少5log10。在一个特定的实施方案中，接触步骤在色谱基质中导致产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)、革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属)和革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌)中的一种或多种的量降低至低于如通过以下测定确定的检测限，例如，(1)生物过滤测定、(2)显微细菌染色、(3)IR/FTIR光谱法、(4)无菌试验或(5)细菌鉴定试验。在多个实施方案中，接触步骤进行至少约1小时、1至5小时、1至10小时、1至25小时、1至200小时、1至375小时、1至400小时、进行至少约4小时、4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。
在一个实施方案中，组合物还包含醇。可使用的醇的非限制性实例包括乙醇(例如，约20％)和苯甲醇(例如，约1％至约2％)。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由约0.1M乙酸和约20％乙醇组成。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由约0.5M乙酸和约20％乙醇组成。
在一个实施方案中，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约0.1M至约1.0M乙酸组成的组合物接触，其中所述接触步骤在色谱基质中产生以下一项或多项结果：产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)量降低至少3log10、革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属)量降低至少5log10和革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌)量降低至少5log10。在一个特定的实施方案中，接触步骤在色谱基质中导致产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)、革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属)和革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌)中的一种或多种的量降低至低于如通过以下测定确定的检测限，例如，(1)生物过滤测定、(2)显微细菌染色、(3)IR/FTIR光谱法、(4)无菌试验或(5)细菌鉴定试验。在多个实施方案中，接触步骤进行至少约1小时、1至5小时、1至10小时、1至25小时、1至200小时、1至375小时、1至400小时、至少约4小时、4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。
在本发明任何上述方法的一个实施方案中，组合物还包含乙酸盐。
在本发明任何上述方法的一个实施方案中，组合物的pH为约2至约3。
在另一方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约4.0M至约12.0M脲的组合物接触，其中接触步骤进行至少约30分钟。在一个实施方案中，接触步骤进行至少约1小时。在一个实施方案中，组合物包含约8M脲。
在一个实施方案中，组合物还包含醇。可使用的醇的非限制性实例包括乙醇(例如，约20％)和苯甲醇(例如，约1％至约2％)。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由约8M脲和约20％乙醇组成。
在一个实施方案中，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约4.0M至约12.0M脲组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约30分钟。在一个特定的实施方案中，接触步骤进行至少约1小时。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由8M脲组成。
在相关方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约4.0M至约12.0M脲的组合物接触，其中所述接触步骤在色谱基质中产生以下一项或多项结果：产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)量降低至少2log10，革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属)量降低至少5log10，和革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌)量降低至少5log10。在一个特定的实施方案中，接触步骤在色谱基质中导致产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)、革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属)和革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌)中的一种或多种的量降低至低于如通过以下测定确定的检测限，例如，(1)生物过滤测定、(2)显微细菌染色、(3)IR/FTIR光谱法、(4)无菌试验或(5)细菌鉴定试验。
在一个实施方案中，组合物还包含醇。可使用的醇的非限制性实例包括乙醇(例如，约20％)和苯甲醇(例如，约1％至约2％)。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由约8M脲和约20％乙醇组成。
在一个实施方案中，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约4.0M至约12.0M脲组成的组合物接触，其中所述接触步骤在色谱基质中产生以下一项或多项结果：产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)量降低至少2log10，革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属)量降低至少5log10，革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌)量降低至少5log10。在一个特定的实施方案中，接触步骤在色谱基质中导致产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)、革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属)和革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌)中的一种或多种的量降低至低于如通过以下测定确定的检测限，例如，(1)生物过滤测定、(2)显微细菌染色、(3)IR/FTIR光谱法、(4)无菌试验或(5)细菌鉴定试验。
在进一步的方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约4.0M至约12.0M盐酸胍的组合物接触，其中接触步骤进行至少约30分钟。在一个实施方案中，接触步骤进行至少约1小时。在一个实施方案中，组合物包含约6M盐酸胍。
在一个实施方案中，组合物还包含醇。可使用的醇的非限制性实例包括乙醇(例如，约20％)和苯甲醇(例如，约1％至约2％)。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由约6M盐酸胍和约20％乙醇组成。
在一个实施方案中，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约4.0M至约12.0M盐酸胍组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约30分钟。在一个特定的实施方案中，接触步骤进行至少约1小时。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由约6M盐酸胍组成。
在相关方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与包含约4.0M至约12.0M盐酸胍的组合物接触，其中所述接触步骤在色谱基质中产生以下一项或多项结果：产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)量降低至少2log10，革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属)量降低至少4log10，和革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌)量降低至少2log10。在一个特定的实施方案中，接触步骤在色谱基质中导致产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)、革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属)和革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌)中的一种或多种的量降低至低于如通过以下测定确定的检测限，例如，(1)生物过滤测定、(2)显微细菌染色、(3)IR/FTIR光谱法、(4)无菌试验或(5)细菌鉴定试验。
在一个实施方案中，组合物还包含醇。可使用的醇的非限制性实例包括乙醇(例如，约20％)和苯甲醇(例如，约1％至约2％)。在一个特定的实施方案中，组合物基本上由约6M盐酸胍和约20％乙醇组成。
在一个实施方案中，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约4.0M至约12.0M盐酸胍组成的组合物接触，其中所述接触步骤在色谱基质中产生以下一项或多项结果：产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)量降低至少2log10，革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属)量降低至少4log10，和革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌)量降低至少2log10。在一个特定的实施方案中，接触步骤在色谱基质中导致产芽孢细菌(例如，类坚强芽孢杆菌)、革兰氏阳性菌(例如，微杆菌属)和革兰氏阴性菌(例如，嗜麦芽寡养单胞菌)中的一种或多种的量降低至低于如通过以下测定确定的检测限，例如，(1)生物过滤测定、(2)显微细菌染色、(3)IR/FTIR光谱法、(4)无菌试验或(5)细菌鉴定试验。
在一个方面，本发明提供了用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与组合物接触，所述组合物包含约0.5M至约1.0M乙酸和(i)约4.0M至约12.0M脲和/或(ii)约4.0M至约12.0M盐酸胍，其中接触步骤进行至少约1小时。在一个特定的实施方案中，组合物还包含醇。可使用的醇的非限制性实例包括乙醇(例如，约20％)和苯甲醇(例如，约1％至约2％)。
在本发明任何上述方法的一个实施方案中，接触步骤在15℃至30℃的温度进行。在一个特定的实施方案中，接触步骤在20℃至25℃的温度进行。
在本发明任何上述方法的一个实施方案中，该组合物基本上不含氧化剂。
在本发明任何上述方法的一个实施方案中，该组合物不包含过氧酸。
在本发明任何上述方法的一个实施方案中，该组合物不包含过氧化物。
在本发明任何上述方法的一个实施方案中，该组合物不包含NaOH。
在本发明任何上述方法的一个实施方案中，接触步骤重复至少一次。
在本发明任何上述方法的一个实施方案中，色谱基质填充在色谱柱中。在一个特定的实施方案中，色谱柱具有0.5cm至1.5cm的内径，和15cm至30cm的床高度。在一个特定的实施方案中，色谱柱具有约1cm的内径和约20cm的床高度。在一个特定的实施方案中，色谱柱具有40cm至1.6米的内径和15cm至30cm的床高度。在一个特定的实施方案中，色谱柱具有约1.4米的内径和约20cm的床高度。
在本发明任何上述方法的一个实施方案中，色谱基质包含与载体偶联的蛋白质配体。在一个特定的实施方案中，蛋白质配体包含一个或多个免疫球蛋白结合结构域。在一个特定的实施方案中，蛋白质配体为蛋白A或其片段或衍生物。在一个特定的实施方案中，蛋白质配体选自葡萄球菌属(Staphylococcus)蛋白A、消化链球菌属(Peptostreptococcus)蛋白L、链球菌属(Streptococcus)蛋白G、链球菌属蛋白A及其片段和衍生物。在一个特定的实施方案中，色谱基质选自MabSelectTM、MabSelectTM Xtra、MabSelectTM SuRe、MabSelectTMSuRe pcc、MabSelectTM SuRe LX、MabCaptureTM A、nProtein A Sepharose 4 Fast Flow、Protein A Sepharose 4 Fast Flow、Protein A Mag Sepharose、Protein A SepharoseCL-4B、rmp Protein A Sepharose Fast Flow、rProtein A Sepharose 4 Fast Flow、CaptoTM L、ProSepTM-A、ProSep Ultra Plus、AbSoluteTM、CaptivATM PriMabTM、Protein ADiamond、EshmunoTM A、ToyopearlTM AF-rProtein A、AmsphereTM Protein A、KanCapATM、Protein G Mag Sepharose Xtra和Protein G Sepharose 4Fast Flow。在一个特定的实施方案中，色谱基质选自MabSelectTM、MabSelectTM Xtra、MabSelectTM SuRe、MabSelectTMSuRe PCC和MabSelectTM SuRe LX。在一个特定的实施方案中，在进行该方法后，蛋白质配体不可测量地变性。
在一个实施方案中，本发明提供了用于MabSelectTM Xtra色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本由约0.5M乙酸组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约4小时。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于MabSelectTM Xtra色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约0.1M乙酸和约20％乙醇组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约4小时。在多个实施方案中，接触步骤进行至少约1小时、1至5小时、1至10小时、1至25小时、1至200小时、1至375小时、1至400小时、至少约4小时、4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于MabSelectTM Xtra色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约8M脲组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约1小时。
在又一个实施方案中，本发明提供了用于MabSelectTM Xtra色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约8M脲和约20％乙醇组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约1小时。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于MabSelectTM Xtra色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约6M盐酸胍组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约1小时。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于MabSelectTM Xtra色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与基本上由约6M盐酸胍和约20％乙醇组成的组合物接触，其中接触步骤进行至少约1小时。
在一个实施方案中，本发明提供了在施用包含用于纯化的药剂的组合物之前降低微生物负载的方法，所述方法包括(a)提供色谱基质；(b)执行本发明的任何上述方法；和(c)将包含药剂的组合物施加于色谱基质。
应理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不意欲限制，因为本发明的范围由权利要求限定。
除非上下文另有明确说明，否则如在本说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种方法”包括一种或多种方法和/或本文所述类型的步骤和/或在阅读本公开后其对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
术语“约”和“大概”可互换使用，表示在统计学上有意义的值范围内。该范围可以在给定值或范围的50％以内、更优选在20％以内、还更优选在10％以内、甚至更优选在5％以内。
如本文所用，术语“微生物(microbe)”或“微生物(microorganism)”包括原核生物，其包括细菌和古细菌，以及真核生物，其包括真菌。这些术语包括活细胞和芽胞(用于产芽胞生物)以及微生物产品例如内毒素。
如本文所用的术语“微生物生物负载降低”结合了微生物的杀灭和对微生物与色谱基质之间的相互作用的一些干扰。根据本发明的微生物生物负载的降低与任何先前公开的消毒方法不同，所述消毒方法被设计用于杀灭可能存在于色谱柱或基质上的基本上全部或甚至至少99％的微生物。
相反，本发明包括能够杀灭少于80％、少于70％、少于60％或40-60％的非产芽孢微生物的方法。在这样的实施方案中，本发明的方法将杀灭柱上的少于50％、少于40％、少于30％、少于20％或少于10％或10-20％的产芽孢微生物如芽孢杆菌属(Bacillus)。
尽管本发明包括不杀灭柱上所有细菌的方法，但在处理后，从色谱基质中除去至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、约98％、约99％或约100％的能够通过生物过滤测定法或本领域公开的和本领域已知的任何其他微生物测定法检测的活微生物。在本发明的一些实施方案中，微生物生物负载的水平在使用前的冲洗样品中、平衡样品中、负载样品中或来自运行期间随后负载的所有GMP样品中降低至GMP可接受水平以下。即使没有杀灭所有微生物，本发明也可以将微生物生物负载降低到GMP警报水平以下，因为在要求保护的发明的方法的过程中也发生微生物和色谱基质之间的相互作用之间的干扰。这种干扰可能涉及但不限于机制、如降低微生物和色谱基质之间的亲和力、结合或任何其他相互作用。这种机制类似于色谱柱上使用的常见脱除(strip)步骤，其中杂质如来自柱的DNA和宿主细胞蛋白质。因此，在使用本发明的方法后，可以检测到这种干扰，当微生物生物负载已经降低到与生物药物的GMP生产要求一致的水平时，该方法不会杀灭所有微生物。通过使用不是设计用于杀灭柱上的所有微生物的本发明的方法之一，试剂不一定是苛刻的，因此更有利于获得必须批准该过程和产品用于市场的管理机构例如FDA或EMA的批准。优选地，在GMP生产生物药物期间在色谱柱上使用的相同的脱除缓冲组分或至少活性剂(常用乙酸)可以用于在更高浓度(例如，10X，15X或20X)以及以更长的收缩(contract)时间(例如，3X、4X或5X)施用时降低微生物生物负载。此外，以更高的浓度进行更长的时间对于相同的脱除缓冲液可以更有效地降低微生物生物负载。
本文描述的任何方法、方面和实施方案可以用作良好生产规范(GMP)或现行良好生产规范(CGMP)的一部分。这些实践必须提供制造步骤和产品质量的一致性，以满足监管机构的要求，如美国食品和药物管理局。GMP和CGMP要求制造过程中的高度可预测性和标准化，特别是确保用于人类患者的制造的治疗性生物分子的纯度。在GMP或CGMP期间存在许多其中检测到需要停止过程和/或报废生产批次的参数的故障点。随着生产生物分子的生长培养物所涉及的劳动力，当发生故障时会产生巨大的费用。
如果在分离中使用的色谱柱或基质中生物负载或微生物负载变得太高，则可能出现各种不可预测的和/或不期望的效果。可以触发故障点以便停止该过程，从而识别出被微生物污染的产品，且不会进一步产生。为了防止故障点，检测至少5CFU/10mL的生物负载可以触发警报。至少10CFU/10mL的生物负载可以触发行动以降低生物负荷，所述行动可以包括单独或组合地进行本文所述的一种或多种方法或实施方案。
例如，微生物可以被引入产品中，这使其对于治疗用途而言不可接受。过量的生物负载也会降低色谱柱性能，这会干扰以标准化和可预测的方式纯化产品，并可能导致其他故障点被触发。因此，期望使用预先降低生物负载的本文描述的方面和实施方式以确保符合GMP或CGMP，并最小化故障点触发，以及相关的故障排除和停机时间。
本文所述的任何方面或实施方案还可包括在接触步骤后应用含有小分子或含生物分子(例如，含单克隆抗体)的制剂用于纯化的步骤。在应用含有小分子或含生物分子(例如，含单克隆抗体)的制剂用于纯化之前降低微生物负载的方法可包括本文所述的任何微生物负载降低方法的步骤。或者，纯化生物分子的方法可以可包括进行本文所述的任何方法的步骤，然后将包含生物分子的制剂应用于色谱基质。
本文所述的任何方面或实施方案可在取出储存的色谱基质之后、但在施加待纯化的含药物、含生物分子或含单克隆抗体的制剂之前进行。在长期储存期间，色谱基质或色谱柱中存在的少量细菌可生长并增加生物负载。
本文描述的任何方面或实施例可以用作无菌技术的一部分，或者用于支持无菌技术。所得到的色谱基质上的生物负载的降低可足以用于无菌技术，或者可以在无菌技术中的其他步骤之前或之后使用。所描述的降低生物负载的方法可以降低无菌技术故障点被触发的可能性，并且可以用于响应即将发生的故障点触发。
在另一个方面，MabSelectTM Xtra色谱基质通过使基质与基本上由约0.5M乙酸组成的组合物接触至少4小时而经历微生物生物负载降低。在多个实施方案中，接触步骤进行4至5小时、4至10小时、4至25小时、4至200小时、4至375小时或4至400小时。在另一个方面，MabSelectTM Xtra色谱基质通过使基质与基本上由0.1M乙酸和约20％乙醇组成的组合物接触至少4小时而经历微生物生物负载降低。
可以使用各种色谱基质。色谱基质可包含与载体偶联的蛋白质配体。蛋白质配体又可包含一个或多个免疫球蛋白结合结构域。其他有用的色谱基质包括但不限于各种离子交换色谱基质、疏水相互作用色谱(HIC)基质、混合模式色谱基质和尺寸排阻色谱基质。
色谱基质的蛋白质配体可以是蛋白A或其片段或衍生物。示例性蛋白质配体包括葡萄球菌属蛋白A、消化链球菌属蛋白L、链球菌属蛋白G、链球菌属蛋白A、以及葡萄球菌属蛋白A、消化链球菌属蛋白L、链球菌属蛋白G、链球菌属蛋白A的任何一种的片段和衍生物。
葡萄球菌属蛋白A可以在细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的细胞壁上发现。蛋白A可以结合Fc区中CH2和CH3结构域之间的抗体。蛋白A可以在金黄色葡萄球菌中培养或在其他细菌中重组产生，例如，大肠杆菌(E.coli)或芽孢杆菌(Brevibacillus)。葡萄球菌蛋白A的片段或衍生物也可以结合Fc区中CH2和CH3结构域之间的抗体。
消化链球菌蛋白L可以在大消化链球菌(Peptostreptococcus magnus)的表面上发现，并且可以通过与抗体轻链的相互作用与抗体结合。与蛋白A不同，蛋白L可以与单链可变片段(scFv)和Fab片段结合。蛋白L的片段或衍生物还可以与抗体的轻链、单链可变片段(scFv)和Fab片段结合。
可以在G组链球菌菌株的细胞壁上发现链球菌属蛋白G。蛋白G可以结合Fab和Fc区中的抗体。蛋白G可以在其他细菌中重组产生，例如大肠杆菌。蛋白G的片段或衍生物也可以与Fab和Fc区中的抗体结合。
色谱基质可以是为柱的一部分的树脂。一种合适的树脂是GEHealthcare的MabSelect SuReTM。适用于小规模纯化的示例性柱填充有MabSelect SuReTM，直径约1.0cm，长约20cm。较大的柱，如1.4米×20cm，可用于制备规模净化。
更一般地，本发明的方法可用于各种尺寸的色谱柱，包括实验室规模、大工艺规模和非常大的工艺规模。在一些实施方案中，色谱柱可具有0.5厘米至1.5厘米的内径和15至30厘米(例如20厘米)的床高度。内径可以为0.7至1.2厘米，或者0.9至1.4厘米、1.2至1.5厘米、1.0至1.2厘米、或约1厘米。在一些实施方案中，色谱柱可以具有40厘米至1.6米(例如，60厘米，80厘米，1.0米，1.2米或1.4米)的内径。色谱柱可具有15至30厘米(例如，20厘米)的床高度。
示例性色谱基质包括MabSelectTM、MabSelectTM Xtra、MabSelectTM SuRe、MabSelectTM SuRe pcc、MabSelectTM SuRe LX、nProtein A Sepharose 4 Fast Flow、Protein A Sepharose 4 Fast Flow、Protein A Mag Sepharose、Protein A SepharoseCL-4B、rmp Protein A Sepharose Fast Flow、rProtein A Sepharose 4 Fast Flow、CaptoTM L、ProSepTM-A、ProSep Ultra Plus、AbSoluteTM、CaptivATM PriMabTM、Protein ADiamond、EshmunoTM A、ToyopearlTM AF-rProtein A、AmsphereTMProtein A、KanCapATM、Protein G Mag Sepharose Xtra和Protein G Sepharose 4 Fast Flow。
MabSelectTM、MabSelectTM Xtra、MabSelectTM SuRe和MabSelectTM SuRe LX具有在大肠杆菌中产生的重组蛋白A配体，其与高度交联的琼脂糖基质连接。
微生物生物负载降低可以恢复色谱基质的性能，使得它可以用于额外的纯化而不是被替换。因此，在本文所述的任何方法中，可以在使用色谱基质之后进行微生物生物负载降低。在这种情况下，可以除去可以从包含目标单克隆抗体的细胞培养液引入色谱基质中的细菌和其他微生物。当使用由蛋白质配体(如蛋白A)组成的色谱基质时，可以节省大量费用。
此外，使用含乙酸的溶液代替常用的含氢氧化钠的溶液可导致蛋白质配体的较少变性和对色谱基质的较少损伤。蛋白质配体的变性和/或色谱基质的损伤可以通过测定色谱基质的各种性能特征来间接测量，例如，通过测定从基质洗脱的产物的纯度和丰度和通过测定基质的组分(例如，蛋白A)的残留的洗脱。例如，如果蛋白质配体是蛋白A，则将测定单克隆抗体的纯度和丰度。示例性测定包括尺寸排阻色谱(例如，SE-HPLC和SE-UPLC)、毛细管电泳(例如CE-SDS)、毛细管等电聚焦(iCIEF)，其可任选地包括全柱成像。而且，可以测量来自柱的残留蛋白A(例如，通过包含ELISA的测定)。
根据本文描述的方法进行的微生物负载降低可以是通过去除细菌而不损害蛋白A来维持包含蛋白A或其他蛋白质配体的柱的性能的成本有效方式。例如，含蛋白A的基质暴露与含有乙酸的溶液(例如，0.5M乙酸)375或400小时不会导致包含蛋白A的柱的任何统计学上显著的性能损失。参见例如实施例6、表10和图5-19。例如，通过尺寸排阻色谱、在还原或非还原条件下的毛细管电泳或通过毛细管等电聚焦，洗脱的单克隆抗体纯度没有统计学上显著的损失。
根据本文描述的方法的微生物生物负载降低可以去除几乎所有细菌而不杀灭所有细菌。不希望受理论束缚，乙酸可干扰细菌与蛋白质配体(例如蛋白A)之间的亲和力。微生物污染的基质或柱可根据本文所述的方法通过破坏微生物与树脂之间的相互作用而减少微生物。细菌倾向于保留在含乙酸的溶液中。通过重复与乙酸的接触步骤或用含乙酸的溶液进行额外的色谱基质冲洗，可以进一步增强细菌的去除。
在一些实施方案中，该方法从色谱基质中去除产芽孢细菌。产芽孢细菌具有转变为内芽孢形式的能力。内芽孢形式是一种精简的休眠形式，细菌可以自我减少。内芽孢的形成通常是由缺乏营养物质或由苛刻条件引起的，例如酸性或碱性环境。即使在不利的条件下，内芽孢也能使细菌长时间处于休眠状态。当环境变得更加有利时，内芽孢可以重新激活到植物状态。可形成内芽孢的细菌的实例包括芽孢杆菌属和梭菌属(Clostridium)。由于在制造过程中存在这些产芽孢细菌的不利条件，这些产芽孢细菌被认为能够在色谱纯化过程中的正常操作条件下形成内芽孢。有许多方法可用于检测产芽孢细菌，包括但不限于显微细菌染色法、IR/FTIR光谱法、无菌试验和细菌鉴定试验(如生化反应、16S rRNA序列测定或分类群特定的序列测定)。
在一些实施方案中，该方法从色谱基质中除去革兰氏阳性菌。在一些实施方案中，该方法可从色谱基质中除去革兰氏阴性菌。在一些实施方案中，该方法从色谱基质中去除产芽孢细菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。接触步骤可以导致色谱基质中产芽孢细菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的一种或多种的量降低至低于选自以下测定的检测限：(1)生物过滤测定，(2)显微细菌染色，(3)IR/FTIR光谱法，(4)无菌测试，和(5)细菌鉴定测试(例如，生化反应、16S rRNA序列测定或分类群特定的序列测定)。生物过滤测定描述于美国药典章节<71>的标题为“无菌测试”的内容中。在生物过滤测定中，来自柱的洗脱物通过选择性结合细菌的过滤器。然后将过滤器接种在具有适当的培养基的琼脂上以培养细菌，孵育并计数细菌。可以根据需要进行柱洗脱的稀释。
在美国药典章节<61>中(标题为“非无菌产品的微生物检测：微生物计数测试”(“Microbial examination of nonsterile products:microbial enumeration tests”))描述了显微细菌染色。IR/FTIR光谱法描述于BRUKER Application Note AN#405CurrentResearch,Technology and Education Topics in Applied MicrobiologyBiotechnology A.Mendez-Vilas(编撰)中。微生物学测试描述于Reynolds,J.等人,“Differential staining of bacteria:endospore stain”Curr.Proc.Microbiol.2009,附录3:附录3J中。
在一些实施方案中，组合物中乙酸的浓度为约0.1M至约1.0M。在一些实施方案中，组合物中乙酸的浓度为约0.2M至约0.8M。在一些实施方案中，组合物中乙酸的浓度为约0.4M至约0.7M。在一些实施方案中，组合物中乙酸的浓度为约0.5M。在一些实施方案中，组合物中乙酸的浓度为约0.1M至约0.5M。在一些实施方案中，组合物中乙酸的浓度为约0.1M。
在一些实施方案中，组合物中脲的浓度为约4M至约12M。在一些实施方案中，组合物中脲的浓度为约6M至约10M。在一些实施方案中，组合物中脲的浓度为约6M至约8M。在一些实施方案中，组合物中脲的浓度为约8M。
在一些实施方案中，组合物中盐酸胍的浓度为约3M至约10M。在一些实施方案中，组合物中盐酸胍的浓度为约4M至约8M。在一些实施方案中，组合物中盐酸胍的浓度为约5M至约7M。在一些实施方案中，组合物中盐酸胍的浓度为约6M。
在一些实施方案中，组合物中盐酸胍的浓度为约3M至约10M。在一些实施方案中，组合物中盐酸胍的浓度为约4M至约8M。在一些实施方案中，组合物中盐酸胍的浓度为约5M至约7M。在一些实施方案中，组合物中盐酸胍的浓度为约6M。
在一些实施方案中，溶液的pH为至少2.0。pH可以为2.0至7.0。pH可以为2.5至6.5、3.0至6.0、4.0至7.0、2.0至5.0、3.5至5.5、3.0至4.0或约4.0。pH可以是以下任何一种：2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。
在一些实施方案中，组合物包含乙醇。该组合物可包含1-40％乙醇、5-35％乙醇、10-25％乙醇、15-30％乙醇、18-24％乙醇、约20％乙醇或20％乙醇。在一些实施方案中，组合物包含约0.1M乙酸和约20％乙醇。在一些实施方案中，组合物基本上由约0.1M乙酸和约20％乙醇组成。使用乙醇是有利的，同时最小化所用苯甲醇的量，或者由于人体毒性而避免使用苯甲醇，或者避免可能由于苯甲醇的存在而对人产生不利影响。
在一些实施方案中，组合物还包含乙酸盐。乙酸盐可以用作包含乙酸的组合物的缓冲剂。例如，除乙酸外，组合物可包含乙酸钠，使得组合物为缓冲剂。该组合物可包含0.1M乙酸钠至1.0M乙酸钠，0.2至0.8M乙酸钠，0.4至0.7M乙酸钠，约0.5M乙酸钠或0.5M乙酸钠。用乙酸钠或另一种乙酸盐缓冲乙酸可有效地保持色谱基质中溶液的pH。pH可以是至少2.0、约2至3、2.0至3.0、2.0至7.0、2.5至6.5、3.0至6.0、4.0至7.0、2.0至5.0、3.5至5.5、3.0至4.0或约4.0。pH可以是以下任何一种：2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。
在其中组合物包含乙酸的一些实施方案中，接触步骤进行至少1小时、或者1至4小时、或者至少2小时。在一些实施方案中，接触步骤进行2至4小时。在一些实施方案中，接触步骤进行至少4小时。在多个实施方案中，接触步骤进行90分钟至6小时、2小时至5小时、4小时至5小时、4小时至6小时、90分钟至3小时、5小时至6小时、4小时至10小时、4小时至25小时、4小时至200小时、4小时至375小时或4小时至400小时。
在其中组合物包含脲的一些实施方案中，接触步骤进行至少30分钟、或者至少1小时、或者至少2小时。在一些实施方案中，接触步骤进行1至2小时。在一些实施方案中，接触步骤进行至少2小时。在多个实施方案中，接触步骤进行30分钟至4小时、1小时至3小时或90分钟至2小时。
在其中组合物包含盐酸胍的一些实施方案中，接触步骤进行至少30分钟、或者至少1小时、或者至少2小时。在一些实施方案中，接触步骤进行1至2小时。在一些实施方案中，接触步骤进行至少2小时。在多个实施方案中，接触步骤进行30分钟至4小时、1小时至3小时或90分钟至2小时。
在其中组合物包含脲或盐酸胍的一些实施方案中，接触步骤进行至少30分钟、或者至少约1小时、或者1至4小时、或者至少2小时。
在一些实施方案中，可以重复接触步骤。例如，接触步骤可以进行约一小时，然后重复多次。在一些实施方案中，接触步骤重复2、3、4、5或6次。通过重复微生物生物负载降低，可以将柱暴露于另外的乙酸，这可以导致来自色谱基质的细菌和微生物的额外破坏。重复接触步骤可导致从色谱基质(例如蛋白A配体)和柱中更多地冲洗或除去细菌和微生物。当连续多次进行时，微生物生物负载降低过程可以更多地降低生物负载。
可以通过使用任何数量的生物负载测定来监测本文所述的任何微生物生物负载降低方法的有效性。一种这样的测定是过滤测定，其中一定体积的洗脱液通过过滤膜，其捕获洗脱液中存在的细菌。可以通过将滤膜置于琼脂平板上使得滤膜上的细菌在平板上形成菌落来确定细菌滴度。琼脂平板可含有胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)。培养可在25℃至37℃的温度下进行3至7天。然后计数菌落数。如果形成太多的菌落，可以进行洗脱液的稀释。
在一些实施方案中，产芽孢细菌量降低至少1.5log10。例如，当色谱基质被类坚强芽孢杆菌污染时，使该基质与8M脲溶液、8M脲/20％乙醇溶液、6M盐酸胍溶液或6M盐酸胍/20％乙醇溶液接触至少1小时可以将类坚强芽孢杆菌的数量降低至少1.5log10。
在一些实施方案中，当进行微生物生物负载降低的方法时，色谱基质的结合能力保持10个或更多个周期。在其他实施方案中，结合能力保持50个或更多个周期。在一些其他实施方案中，结合能力保持100个或更多个周期。在一些实施方案中，结合能力保持200个或更多个周期。
在一些实施方案中，在接触步骤期间或在多个接触步骤中基本上没有色谱基质的降解，其中暴露于组合物至少5小时、至少10小时、至少25小时、至少200小时、至少375小时或至少400小时。在一些实施方案中，在接触步骤期间或在多个接触步骤中没有可测量的色谱基质降解，其中暴露于组合物至少5小时、至少10小时、至少25小时、至少200小时、至少375小时或至少400小时。在一些实施方案中，色谱基质的降解通过结合基质的蛋白质的蛋白质质量来测量(例如，结合蛋白A基质的单克隆抗体)。
在一些实施方案中，蛋白质配体不可测量地变性。变性可以使用功能测定、例如测量柱性能、产物产率和/或质量、来自基质的可浸出蛋白质配体、蛋白质配体的变性等来确定。
在一些实施方案中，在接触步骤期间或在多个接触步骤中没有蛋白质配体或蛋白A的可测量的浸出。在一些实施方案中，在将色谱基质暴露于组合物(例如，0.5M乙酸)5小时、10小时、25小时、200小时、375小时或400小时之后，没有统计学上显著的可测量的蛋白质配体或蛋白A的浸出。蛋白A的浸出的测量是一种这样的示例性测定。蛋白A的变性可以改变其构象，使得其不再与色谱基质中的珠或其他固相载体相互作用。然后变性的蛋白A将从珠或固体载体中浸出并进入液相。因此，在亲和柱的洗脱液或液相中检测蛋白质配体或蛋白A可以指示可测量的变性。除了蛋白A之外，其他蛋白质配体的变性也可能导致它们从色谱基质中浸出。在一些实施方案中，蛋白A和/或其他蛋白质配体的浸出的测量包括ELISA。示例性测定描述于实施例6和图8、13和18中。
实施例
以下实施例描述了上述各个方面和实施方案。然而，在说明书中的任何地方使用这些和其他实施例仅是说明性的，并且决不限制任何公开内容或任何示例性术语的范围和含义。同样地，任何要求保护的主题不限于这里描述的任何特定优选实施方案。实际上，在阅读本说明书后，许多修改和变化对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以在不背离本发明所公开的方面和实施方案的精神或范围的情况下做出这样的变化。因此，任何要求保护的主题仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围的限制。
实施例1
乙酸溶液降低蛋白A柱中的生物负载
通过在柱掺入特定细菌后测量生物负载、然后在用0.5M乙酸溶液减少微生物后再次测量生物负载来评估三个填充的1cm MabSelectTMXtra柱中微生物的减少。
首先，用两个柱体积的注射用水(WFI)冲洗柱。收集20mL样品并用作相对于柱中细菌的量的阴性对照。
在三个MabSelectTM Xtra柱的每一个中，通过将微生物添加至WFI以形成加标的WFI来将代表性微生物添加至柱，其中微生物以约105cfu/mL的滴度存在。一个柱中掺入了产芽孢细菌，特别是类坚强芽孢杆菌。一个柱中掺入革兰氏阳性菌，特别是微杆菌属。第三个柱中掺入革兰氏阴性菌，特别是嗜麦芽寡养单胞菌。
然后将每个加标的WFI加载到各柱上。然后用14个柱体积的WFI以229cm/小时冲洗柱子，将其收集。每个柱保持1小时，然后用加标的WFI再次冲洗。从每个柱收集20mL样品作为阳性对照，随后测定样品中每种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和产芽孢细菌的量。
然后将两个柱体积的0.5M乙酸的微生物减少溶液以229cm/小时施加到每个柱上。将每个柱保持1小时，然后用两个柱体积的WFI以229cm/小时冲洗。对于微杆菌属和嗜麦芽寡养单胞菌，将1.5倍柱体积的WFI冲洗通过柱子，然后收集1.5倍柱体积的流出物。对于类坚强芽孢杆菌，将2倍柱体积的平衡缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠、pH7.2)冲洗通过柱，然后收集1.5倍柱体积的流出物。
重复上述实验，在将0.5M乙酸微生物减少溶液施加到柱上后，将柱保持4小时而不是1小时。
进行基于过滤的生物负载测定。制备具有TSA培养基的琼脂平板。
将来自色谱柱的所有上述样品放入锥形管中，倒置10次，然后通过过滤器歧管，所述过滤器歧管连接到具有0.45微米过滤膜的无菌一次性过滤漏斗，或通过具有
Figure BDA0002144656080000251
过滤漏斗装置的
Figure BDA0002144656080000252
加泵，所述
Figure BDA0002144656080000253
过滤漏斗装置具有0.45微米过滤膜。无菌技术用于处理过滤器歧管或过滤漏斗单元，以便不引入色谱样品中未发现的其他细菌。然后将每个膜置于用TSA培养基制备的琼脂平板的顶部。将板在30-35℃温育5-7天。然后计数并记录菌落形成单位的数量。
通过将100mL无菌PBS通入具有0.45微米滤膜的单独的过滤歧管或过滤漏斗单元来制备阴性对照板。然后将每个膜置于用TSA培养基制备的琼脂平板的顶部。将板在30-35℃温育5-7天。然后计数菌落形成单位的数量并以log10格式表示。
下表显示了三种细菌类型中的每一种的降低前和降低后的菌落形成单位。
表1.
Figure BDA0002144656080000261
表2.
Figure BDA0002144656080000262
表3.
Figure BDA0002144656080000263
对于假芽孢杆菌，当将0.5M乙酸微生物生物负载降低溶液在柱中保持1小时时，观察到0.4log10的降低。当将0.5M乙酸微生物生物负载降低溶液在柱中保持4小时时，观察到3.4log10的降低。
对于微杆菌属细菌，当将0.5M乙酸微生物生物负载降低溶液在柱中保持1小时时，观察到1.4log10的降低，当保持4小时时观察到5.6log10的降低。
对于嗜麦芽寡养单胞菌细菌，当将0.5M乙酸微生物生物负载降低溶液在柱中保持1小时时，观察到5.5log10的降低，且当保持4小时时观察到6.2log10的降低。
当在蛋白A柱中保持4小时时，0.5M乙酸可有效去除多种微生物，包括产芽孢细菌。
实施例2
乙酸/乙醇溶液降低蛋白A柱中的生物负载
进行上述实施例1中的步骤，不同之处在于使用0.1M乙酸和20％乙醇的溶液代替0.5M乙酸。与实施例1一样，0.1M乙酸和20％乙醇溶液在一组实验中保持1小时，在另一组实验中保持4小时。下面的结果还表明，在将微生物生物负载降低溶液保持在柱中1小时或4小时后，细菌量显著降低。
表4.
Figure BDA0002144656080000271
表5.
Figure BDA0002144656080000281
表6.
Figure BDA0002144656080000282
对于类坚强芽孢杆菌，当0.1M乙酸和20％乙醇微生物生物负载降低溶液在柱中保持1小时时，观察到0.4log10的降低。当0.1M乙酸和20％乙醇微生物生物负载降低溶液在柱中保持4小时时，观察到2.5log10的降低。
对于微杆菌属细菌，当0.1M乙酸和20％乙醇微生物生物负载降低溶液在柱中保持1小时时，观察到4.5log10的降低，且当保持4小时时，观察到5.1log10的降低。
对于嗜麦芽寡养单胞菌细菌，当0.1M乙酸和20％乙醇微生物生物负载降低溶液在柱中保持1小时时，观察到5.3log10的降低，且当保持4小时时，观察到5.1log10的降低。
实施例3
脲溶液降低蛋白A柱中的生物负载
进行上述实施例1中的步骤，不同之处在于使用8M脲溶液和8M脲/20％乙醇溶液代替0.5M乙酸，并且仅测量1小时。下表7中的结果显示在将微生物生物负载降低溶液保持在柱中1小时后细菌显著减少。产芽孢的类坚强芽孢杆菌的减少是广泛和意想不到的，特别是在仅一小时的处理之后。
表7
Figure BDA0002144656080000291
实施例4
盐酸胍溶液降低蛋白A柱中的生物负载
进行上述实施例1中的步骤，不同的是使用6M盐酸胍和6M盐酸胍/20％乙醇溶液代替0.5M乙酸，仅测量1小时保持。下表8中的结果显示在将微生物生物负载降低溶液保持在柱中1小时后细菌显著减少。产芽孢的类坚强芽孢杆菌的减少是广泛和意想不到的，特别是在仅一小时的处理之后。
表8
Figure BDA0002144656080000301
实施例5
溶液中微生物生物负载降低试剂的测试
使用0.5M乙酸进行溶液加标研究，其中在不存在色谱基质的溶液中测量类坚强芽孢杆菌和微杆菌属的种的杀灭程度。数据如图1所示。在1小时后观察到几乎没有杀灭的类坚强芽孢杆菌，同时有一些杀灭的微杆菌属的种。这些数据表明，杀菌不仅仅是在色谱基质上用0.5M乙酸降低这些细菌的微生物生物负载。与预期杀灭相比，破坏色谱基质与类坚强芽孢杆菌和微杆菌属的种之间的相互作用导致生物负荷降低增加。
使用其他试剂进行另外的溶液加标研究，其中在溶液中测量杀灭类坚强芽孢杆菌、微杆菌属的种和嗜麦芽寡养单胞菌的程度。加入下列试剂：(a)注射用水(WFI)，(b)8M脲，(c)8M脲和20％乙醇，(d)6M盐酸胍，(e)6M盐酸胍与20％乙醇。在PBS中进行加标确认测量，以及在0分钟、30分钟和60分钟时间点的测量。数据显示在图2-4中，其中蓝色条表示WFI，黄色条表示8M脲，灰色条表示8M脲和20％乙醇，红色条表示6M盐酸胍，且绿色条表示6M盐酸胍和20％乙醇。
对于类坚强芽孢杆菌，通过用至少以下溶液组合杀灭和破坏微生物与色谱树脂之间的相互作用来实现生物负载降低：0.5M乙酸、8M脲和8M脲/20％乙醇、6M盐酸胍和6M盐酸胍/20％乙醇。
对于微杆菌属的种，生物负载降低可以通过8M脲和0.5M乙酸(其为不能杀灭100％微杆菌属的种的溶液)的杀灭和破坏相互作用的组合来进行。然而，杀灭可能是8M脲/20％乙醇、6M盐酸胍和6M盐酸胍/20％乙醇降低生物负荷的主要原因，观察到其在溶液中杀灭100％的微杆菌属。类似地，对于嗜麦芽寡养单胞菌，8M脲、8M脲/20％乙醇能够杀灭溶液中100％的嗜麦芽寡养单胞菌。
实施例1-5总结显示0.5M乙酸保持4小时，8M脲保持1小时，8M脲/20％乙醇保持1小时，6M盐酸胍保持1小时和6M盐酸胍/20％乙醇保持1小时被发现在制造中对于填充的MabSelectTM Xtra柱是有效的微生物生物负载降低方法。如实施例1-5中所述，这些试剂是有效的，其通过杀灭微生物和破坏微生物与色谱树脂之间的相互作用的组合，或100％杀灭微生物。
另外，MabSelectTM Xtra树脂暴露于0.5M乙酸产生对蛋白A树脂的最小影响。
实施例6
长期暴露于乙酸后亲和柱保持性能
在将树脂浸泡在0.5M乙酸中不同的时间长度后，评估两种不同的色谱亲和树脂MabSelectTM Xtra和MabSelectTM SuRe的性能特征。具体地，将一部分的MabSelectTM Xtra(用于捕获mAb A)浸泡在0.5M乙酸中375小时。作为阴性对照，另一部分的MabSelectTM Xtra未浸泡在0.5M乙酸中。将MabSelectTM SuRe(用于捕获mAb B)的5个不同部分在0.5M乙酸中浸泡5小时、10小时、25小时、200小时或400小时。作为对照，另一个部分的MabSelectTM SuRe未浸泡在0.5M乙酸中。
然后对上述每个部分进行五个不同的实验以评估性能。进行尺寸排阻色谱(SE-HPLC和SE-UPLC)以评估在每种上述色谱亲和树脂上纯化后的mAb纯度。
表9
Figure BDA0002144656080000321
进行两种不同的毛细管电泳实验。针对mAb A进行CE-SDS，对mAb B进行PICOMicrochip CE-电泳(PICO MCE-SDS)。在含有SDS的凝胶填充毛细管(CE-SDS)中进行毛细管电泳以测量分子量分布和来自单克隆抗体的轻链和重链的相对丰度。基于它们的大小和电泳迁移率分离这些蛋白质。在还原和非还原条件下进行总轻链和重链的相对丰度。使用IgG纯度分析试剂盒(Beckman Coulter，A10663)和裸融合二氧化硅毛细管(毛细管长度57厘米，有效长度50厘米)进行CE-SDS。使用Protein Express LabChip,
Figure BDA0002144656080000323
GXII或
Figure BDA0002144656080000322
GXII Touch HT(Perkin Elmer,760499或760528)进行PICO MCE-SDS。内部标准用于校准相对迁移时间。
为测定乙酸对含蛋白A的基质的影响，通过高通量ELISA对来自MabSelectTM Xtra和MabSelectTM SuRe柱的洗脱液进行残留蛋白A分析并定量。
进行具有全柱成像(iCIEF)的毛细管等电聚焦以定量单克隆抗体样品中互补决定区2(CDR2)的量。通过对观察到的每个样品衍生的等电点(pi)分布峰下的面积进行积分并计算可归因于CDR2的百分比，在每个电泳图中计算CDR2的相对丰度。报告的iCIEF区域2是中性物种的主峰，对应于内部参考标准中最大的蛋白质峰。
上述每种分析的结果显示在下表10中。
表10
Figure BDA0002144656080000331
Figure BDA0002144656080000341
来自上表的数据显示在图5至9的每一个中。这些图的目视检查显示性能特征与暴露于0.5M乙酸的时间长度之间没有负相关。
进行产品质量数据的方差分析(ANOVA)以评估在每次树脂条件下运行三次色谱长时间暴露于0.5M乙酸之前和之后的树脂之间的统计学显著差异。图10至14显示了在MabSelect Xtra纯化后得到的mAb A池(pool)的蛋白质质量。
图15至19显示在MabSelect SuRe纯化后得到的mAb B池的蛋白质质量。除了在mAbB MabSelect SuRe池的SE-UPLC百分比纯度之外，蛋白质质量的ANOVA分析显示没有统计学显著性(p<0.05)。然而，后酸池纯度高于预酸池纯度。因此，在用MabSelect SuRe纯化后对mAbB池没有负面影响，所述MabSelect SuRe长时间暴露于0.5M乙酸。
***
要求保护的主题不限于本文描述的具体实施方案的范围。实际上，除了本文所述的那些之外，所要求保护的主题的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述中变得显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料通过引用整体并入本文，如同实际存在于本说明书中一样。

Claims (18)

1.用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与组合物接触，其中所述组合物由下列组成：
(a)0.4M至0.7M乙酸；
(b)0.4M至0.7M乙酸和苯甲醇；
(c)0.1M至0.5M乙酸和1％苯甲醇；或
(d)0.5M至1.0M乙酸和1％至2％苯甲醇；
其中接触步骤进行1小时至4小时。
2.权利要求1的方法，其中接触步骤进行4小时。
3.权利要求1的方法，其中组合物由0.5M乙酸组成，且接触步骤进行至少4小时。
4.用于色谱基质的微生物生物负载降低的方法，所述方法包括使色谱基质与组合物接触，其中所述组合物由下列组成：
(a)0.4M至0.7M乙酸；
(b)0.4M至0.7M乙酸和苯甲醇；
(c)0.1M至0.5M乙酸和1％苯甲醇；或
(d)0.5M至1.0M乙酸和1％至2％苯甲醇；
其中所述接触步骤在色谱基质中产生以下一项或多项结果：产芽孢细菌量降低至少3log10，革兰氏阳性菌量降低至少5log10，和革兰氏阴性菌量降低至少5log10。
5.权利要求4的方法，其中所述接触步骤导致色谱基质中产芽孢细菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的一种或多种的量降低至低于选自以下测定的检测限：(1)生物过滤测定、(2)显微细菌染色、(3)IR/FTIR光谱法、(4)无菌试验和(5)细菌鉴定试验。
6.权利要求5的方法，其中所述产芽孢细菌为类坚强芽孢杆菌，革兰氏阳性菌为微杆菌属(Microbacterium spp.)，和革兰氏阴性菌为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中组合物的pH为2至3。
8.权利要求1-6中任一项的方法，其中接触步骤在15℃至30℃的温度进行。
9.权利要求8的方法，其中接触步骤在20℃至25℃的温度进行。
10.权利要求1的方法，其中所述色谱基质包括与载体偶联的蛋白质配体。
11.一种在施加包含用于纯化的药剂的组合物之前降低微生物负载的方法，其包括
提供色谱基质；
进行权利要求1的方法；和
将包含蛋白质的组合物施加于色谱基质以纯化蛋白质。
12.权利要求1的方法，其中组合物由0.4M至0.7M乙酸组成。
13.权利要求1的方法，其中组合物由0.4M至0.7M乙酸和苯甲醇组成。
14.权利要求1的方法，其中组合物由0.4M至0.5M乙酸组成。
15.权利要求1的方法，其中组合物由0.1M至0.5M乙酸和1％苯甲醇组成。
16.权利要求1的方法，其中组合物由0.5M至1.0M乙酸和1％至2％苯甲醇组成。
17.权利要求1的方法，其中所述组合物由下列组成：
(a)0.4M至0.7M乙酸；
(b)0.4M至0.7M乙酸和苯甲醇；或
(c)0.5M至1.0M乙酸和1％至2％苯甲醇。
18.权利要求4的方法，其中所述组合物由下列组成：
(a)0.4M至0.7M乙酸；
(b)0.4M至0.7M乙酸和苯甲醇；或
(c)0.5M至1.0M乙酸和1％至2％苯甲醇。
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