KR20190109493A - 크로마토그래피에서 바이오버든을 감소시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대규모 단백질 A-기반 친화성 크로마토그래피 컬럼들과 관련하여 다양한 크로마토그래피 매트릭스들의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공한다.
Description
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 1월 30일 출원된 미국 가특허출원 번호 제 62/452,140에 대한 우선권을 주장하며, 이 문헌의 내용은 그 전문이 참고문헌으로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 대규모 단백질 A-기반 친화성 크로마토그래피 컬럼들과 관련하여 다양한 크로마토그래피 매트릭스들의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공한다.
발명의 배경
항체 약물은 가장 널리 사용되는 생물 의약품이다. 예컨대, 자연 또는 조작된 스타필로코커스 단백질 A 리간드로 수행되는 친화성 크로마토그래피는 항체 약물 제조 공정에서 불순물 및 오염물을 제거하기 위해 포획방법으로서 가장 널리 사용된다. 단백질 A는 항체의 Fc-영역에 결합하며, 단백질 A 컬럼들은 단클론 항체의 정제에 선택적인 것으로 간주된다. 단백질 A를 이용한 친화성 크로마토그래피는 통상적으로 컬럼에 결합된 불순물들, 가령, 침전 또는 변형된 물질들을 세정하고 제거하기 위하여 제자리 세정 (clean-in-place , CIP) 단계를 포함한다. CIP는 일반적으로 소듐 하이드록사이드 용액을 이용하여 실시된다.
세정 이외에도, 소듐 하이드록사이드 용액들, 또는 벤질 알콜과 함께 인산 용액들이, 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스 또는 컬럼에서 미생물들의 수를 감소시키기 위해 사용된다. 단클론- 항체 생성 세포, 뿐만 아니라 관련 숙주 세포 단백질 및 DNA를 배양하기 위해 사용되는 매질의 세균은, 사용하는 동안 단백질 A 컬럼의 바이오버든을 급속하게 증가시킬 수 있다. 바이오버든은 컬럼에서 이러한 세균 및 미생물 축적을 증가시킨다. 컬럼 성능은 바이오버든이 증가함에 따라 일반적으로 저하된다. 이러한 저하의 징후에는 산물 순도의 감소, 컬럼 충전 악화, 및 역압 증가가 포함된다.
단백질 A 컬럼들은 매우 값비싸고, 이러한 친화성 컬럼들을 충전하고 비우는 일은 노동 집약적인 일이기 때문에, 단백질 A 컬럼들에서의 미생물 바이오버든의 관리 및 감소가 중요하다. 단백질 A 컬럼을 교체하거나 단백질 A 컬럼 정제 상위에 공정 단계를 추가하는데 드는 비용을 없애기 위해, 단백질 A의 구조와 기능에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 상당한 양의 바이오버든을 컬럼에서 신속히 제거하여, 하류 효과가 거의 없게 하는 물질들을 찾아야한다.
미생물 바이오버든 감소의 중요성은 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스들에 제한되지 않지만 단백질성 리간드가 지지체에 결합되어 있는 그 외 크로마토그래피 매트릭스들, 뿐만 아니라 단백질성 리간드를 포함하지 않는 매트릭스들, 가령, 예컨대, 다양한 이온 교환 크로마토그래피 매트릭스들, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 매트릭스들, 혼합방식의 크로마토그래피 매트릭스들, 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스들, 등을 포함한다.
크로마토그래피 매트릭스들의 미생물 바이오버든 감소는 의약품 제조품질 관리 기준 (GMP), 또는 현행 의약품 제조품질 관리 기준 (CGMP)과 관련하여 특히 중요하다. 이러한 관리기준들은 규제 기관들, 가령, 미국 식품 의약국의 요구사항을 충족시킬 수 있도록 제작 단계들 및 제품의 품질에 있어서 일관성을 제공하여야 한다. GMP 및 CGMP는 제작 공정들, 특히 사람 환자들에서 사용되는 제작된 치료용 생물분자의 순도를 확보함에 있어서 높은 정도의 예측가능성 및 표준화를 요구한다. 결함 발생시 생물분자를 제조하기 위한 배지를 배양함에 관련되는 노동으로 인해, 많은 비용이 발생한다. 과도한 바이오버든은 컬럼 성능을 감소시킬 수 있고, 이는 표준화되고 예측 가능한 방식으로 제품을 정제하는 것을 방해 할 수 있으며 다른 결함 지점을 유발시킬 수도 있다.
현재 바이오버든을 감소시키는 것으로 해당 분야에 공지된 물질들은 부정적 하류 효과를 갖는다. 예를 들면, 소듐 하이드록사이드에 기반한 용액들, 및 벤질 알콜과 인산에 기반한 용액들은, 미생물을 효과적으로 사멸시킬 수 있지만 또한 단백질성 리간드 (예컨대, 단백질 A)를 변성시키기는 경향이 있어서 이들 리간드의 기능에 부정적인 영향을 준다.
또한, 이러한 용액들의 산화제 및 기타 성분들은 정제된 단클론 항체에 여전히 남을 수 있어 항체들의 질을 하류에서 추가로 저하시킨다.
그러므로, 해당 분야의 숙련된 기술자들은 크로마토그래피 매트릭스들, 특히, 단백질성 리간드를 가지는 매트릭스들, 가령, 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스들에서 바이오버든을 감소시키기 어려움을 이해하고 있을 것이다.
발명의 요약
상기 설명한 바와 같이, 다양한 크로마토그래피 매트릭스들, 그리고 특히, 단백질성 리간드, 가령, 단백질 A를 포함하는 매트릭스들의 미생물 바이오버든을 감소시키기 위하여 대규모 GMP 및 CGMP와 관련하여 사용될 수 있는 새롭고 효과적인 방법들이 필요하다. 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스들의 미생물 바이오버든 감소용 조성물 및 감소 방법을 제공함으로써 이러한 그리고 기타 필요성을 해결한다.
한 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 아세트산을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 2시간 동안 실시된다.
관련 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 0.5 M 내지 약 1.0 M의 아세트산을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다.
관련 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 아세트산을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 최소한 3 log10만큼의 포자 형성 세균의 양 감소, 최소한 5 log10 만큼 그람 양성 세균의 양 감소, 그리고 최소한 5 log10 만큼 그람 음성 세균의 양 감소 중 하나 이상을 가져온다.
별도의 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 요소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 30분 동안 실시된다.
관련 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 요소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 최소한 2 log10만큼의 포자 형성 세균의 양 감소, 최소한 5 log10 만큼 그람 양성 세균의 양 감소, 그리고 최소한 5 log10 만큼 그람 음성 세균의 양 감소 중 하나 이상을 가져온다.
한 구체예에서, 본 발명은 MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 0.5 M의 아세트산으로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 4시간 동안 실시된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 0.1 M의 아세트산 및 약 20%의 에탄올로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 4시간 동안 실시된다.
추가 구체예에서, 본 발명은 MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 8 M의 요소로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다.
또한 또 다른 구체예에서, 본 발명은 MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 8 M의 요소 및 약 20%의 에탄올로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다.
한 구체예에서, 본 발명은 정제를 위한 제약학적 물질을 포함하는 조성물을 처리하기 이전에 미생물 부하를 감소시키는 방법을 제공하며 이 방법은 (a) 크로마토그래피 매트릭스를 제공하는 단계; (b) 본 발명의 상기 방법들 중 어느 하나를 실시하는 단계; 및 (c) 상기 제약학적 물질을 포함하는 조성물을 상기 크로마토그래피 매트릭스에 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이러한 그리고 기타 양상들은 하기 설명, 청구범위 및 도면에서 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 자명할 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 0.5 M 아세트산을 보유한 용액에서의 스파이크 연구 결과를 보여준다. 세균 사멸 정도는 크로마토그래피 매트릭스가 존재하지 않는 용액에서 측정된다. 검은색 막대는 0.5 아세트산에 노출시키기 전 (T=0) 및 아세트산에 노출시키고 한 시간 후 (T=1 hr) Mab Select™Xtra 컬럼에서 바실루스 슈도퍼무스 (Bacillus psuedofirmus) 양을 나타내고 대각선 막대는 마이크로박테리움 (Microbacterium) 종의 양을 나타낸다.
도 2는 크로마토그래피 매트릭스가 없는 용액에서, 이 용액을 바실루스 슈도퍼무스로 스파이크하고 세균 역가를 측정함에 의한, 바실루스 슈도퍼무스 사멸 결과를 보여준다. 다음 물질들이 별도의 용액들에 추가되었다: (a) 주사용수 (WFI), (b) 8 M 요소, (c) 8 M 요소 및 20% 에탄올, (d) 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, (e) 20% 에탄올과 구아니딘 하이드로클로라이드. 각각에 대해 PBS에서 스파이크 확인 측정을 실시하였으며, 뿐만 아니라 0분, 30분, 및 60분 시점에서도 측정을 실시하였다. 검은색 막대는 WFI에 대한 것이며, 수평선 막대는 8 M 요소에 대한 것이고, 흰색 막대는 8 M 요소 및 20% 에탄올에 대한 것이고, 대각선 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드에 대한 것이고 십자형 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 20% 에탄올에 대한 것이다.
도 3은 크로마토그래피 매트릭스가 없는 용액에서, 이 용액을 바실루스 슈도퍼무스로 스파이크하고 세균 역가를 측정함에 의한, 마이크로박테리움 종 사멸 결과를 보여준다. 다음 물질들이 추가되었다: (a) 주사용수 (WFI), (b) 8 M 요소, (c) 8 M 요소 및 20% 에탄올, (d) 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, (e) 20% 에탄올과 구아니딘 하이드로클로라이드. PBS에서 스파이크 확인 측정을 실시하였으며, 뿐만 아니라 0분, 30분, 및 60분 시점에서도 측정을 실시하였다. 검은색 막대는 WFI에 대한 것이며, 수평선 막대는 8 M 요소에 대한 것이고, 흰색 막대는 8 M 요소 및 20% 에탄올에 대한 것이고, 대각선 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드에 대한 것이고 십자형 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 20% 에탄올에 대한 것이다.
도 4는 크로마토그래피 매트릭스가 없는 용액에서, 이 용액을 바실루스 슈도퍼무스로 스파이크하고 세균 역가를 측정함에 의한, 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia) 사멸 결과를 보여준다. 다음 물질들이 추가되었다: (a) 주사용수 (WFI), (b) 8 M 요소, (c) 8 M 요소 및 20% 에탄올, (d) 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, (e) 20% 에탄올과 구아니딘 하이드로클로라이드. PBS에서 스파이크 확인 측정을 실시하였으며, 뿐만 아니라 0분, 30분, 및 60분 시점에서도 측정을 실시하였다. 검은색 막대는 WFI에 대한 것이며, 수평선 막대는 8 M 요소에 대한 것이고, 흰색 막대는 8 M 요소 및 20% 에탄올에 대한 것이고, 대각선 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드에 대한 것이고 십자형 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 20% 에탄올에 대한 것이다.
도 5-9는 상이한 길이의 시간 동안 0.5 M 아세트산에 노출시킨 단백질 A-함유 수지들 (MabSelect™Xtra 및 MabSelect™SuRe)에 대해 실시된 다양한 제품 품질 연구 결과를 보여준다. 채워진 원들은 0.5 M 아세트산에 375 시간 동안 노출되었거나, 전혀 노출되지 않았던 MabSelect™Xtra에 대한 값들을 보여준다. 십자 표시는 5, 10, 25, 200 또는 400 시간 동안 0.5 M 아세트산에 노출시키지 않았던, 또는 전혀 노출시키지 않았던 MabSelect™SuRe에 대한 값들을 보여준다.
도 10-14는 MabSelect™Xtra 단백질 A 수지에 대해 실시된 다양한 제품 품질 연구들의 ANOVA 분석을 보여준다. 산-처리후의 컬럼에서, 채워진 원들은 0.5 M 아세트산에 375시간 노출시 표 1의 값들을 반영한다. 산-처리전 컬럼에서, 채워진 원들은 0.5 M 아세트산에 0시간 노출시 표 1의 값들을 반영한다. 다이아몬드 모양은 95% 신뢰 구간에 기반한 범위를 나타낸다. 산-처리후 모든 범위들은 산-처리전 범위와 중첩된다. ANOVA 분석은 0.5 M 아세트산에 수지를 장기 노출시 단백질 품질에 통계적으로 유의한 부정적인 영향이 없음을 보여준다.
도 15-19는 MabSelect™SuRe 단백질 A 수지에 대해 실시된 다양한 제품 품질 연구들의 ANOVA 분석을 보여준다. 산-처리후의 컬럼에서, 채워진 원들은 0.5 M 아세트산에 400시간 노출시 표 1의 값들을 반영한다. 산-처리전 컬럼에서, 채워진 원들은 0.5 M 아세트산에 0시간 노출시 표 1의 값들을 반영한다. 다이아몬드 모양은 95% 신뢰 구간에 기반한 범위를 나타낸다. 도 15에서, 상기 범위는 통계적으로 유의한 정도로 산에 대한 노출 후에 더 크다. 도 16-19에서, 산-처리전 범위들은 산-처리 후 범위들과 중첩된다. ANOVA 분석은 0.5 M 아세트산에 수지를 장기 노출시 단백질 품질에 통계적으로 유의한 부정적인 영향이 없음을 보여준다.
도 1은 0.5 M 아세트산을 보유한 용액에서의 스파이크 연구 결과를 보여준다. 세균 사멸 정도는 크로마토그래피 매트릭스가 존재하지 않는 용액에서 측정된다. 검은색 막대는 0.5 아세트산에 노출시키기 전 (T=0) 및 아세트산에 노출시키고 한 시간 후 (T=1 hr) Mab Select™Xtra 컬럼에서 바실루스 슈도퍼무스 (Bacillus psuedofirmus) 양을 나타내고 대각선 막대는 마이크로박테리움 (Microbacterium) 종의 양을 나타낸다.
도 2는 크로마토그래피 매트릭스가 없는 용액에서, 이 용액을 바실루스 슈도퍼무스로 스파이크하고 세균 역가를 측정함에 의한, 바실루스 슈도퍼무스 사멸 결과를 보여준다. 다음 물질들이 별도의 용액들에 추가되었다: (a) 주사용수 (WFI), (b) 8 M 요소, (c) 8 M 요소 및 20% 에탄올, (d) 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, (e) 20% 에탄올과 구아니딘 하이드로클로라이드. 각각에 대해 PBS에서 스파이크 확인 측정을 실시하였으며, 뿐만 아니라 0분, 30분, 및 60분 시점에서도 측정을 실시하였다. 검은색 막대는 WFI에 대한 것이며, 수평선 막대는 8 M 요소에 대한 것이고, 흰색 막대는 8 M 요소 및 20% 에탄올에 대한 것이고, 대각선 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드에 대한 것이고 십자형 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 20% 에탄올에 대한 것이다.
도 3은 크로마토그래피 매트릭스가 없는 용액에서, 이 용액을 바실루스 슈도퍼무스로 스파이크하고 세균 역가를 측정함에 의한, 마이크로박테리움 종 사멸 결과를 보여준다. 다음 물질들이 추가되었다: (a) 주사용수 (WFI), (b) 8 M 요소, (c) 8 M 요소 및 20% 에탄올, (d) 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, (e) 20% 에탄올과 구아니딘 하이드로클로라이드. PBS에서 스파이크 확인 측정을 실시하였으며, 뿐만 아니라 0분, 30분, 및 60분 시점에서도 측정을 실시하였다. 검은색 막대는 WFI에 대한 것이며, 수평선 막대는 8 M 요소에 대한 것이고, 흰색 막대는 8 M 요소 및 20% 에탄올에 대한 것이고, 대각선 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드에 대한 것이고 십자형 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 20% 에탄올에 대한 것이다.
도 4는 크로마토그래피 매트릭스가 없는 용액에서, 이 용액을 바실루스 슈도퍼무스로 스파이크하고 세균 역가를 측정함에 의한, 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia) 사멸 결과를 보여준다. 다음 물질들이 추가되었다: (a) 주사용수 (WFI), (b) 8 M 요소, (c) 8 M 요소 및 20% 에탄올, (d) 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, (e) 20% 에탄올과 구아니딘 하이드로클로라이드. PBS에서 스파이크 확인 측정을 실시하였으며, 뿐만 아니라 0분, 30분, 및 60분 시점에서도 측정을 실시하였다. 검은색 막대는 WFI에 대한 것이며, 수평선 막대는 8 M 요소에 대한 것이고, 흰색 막대는 8 M 요소 및 20% 에탄올에 대한 것이고, 대각선 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드에 대한 것이고 십자형 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 20% 에탄올에 대한 것이다.
도 5-9는 상이한 길이의 시간 동안 0.5 M 아세트산에 노출시킨 단백질 A-함유 수지들 (MabSelect™Xtra 및 MabSelect™SuRe)에 대해 실시된 다양한 제품 품질 연구 결과를 보여준다. 채워진 원들은 0.5 M 아세트산에 375 시간 동안 노출되었거나, 전혀 노출되지 않았던 MabSelect™Xtra에 대한 값들을 보여준다. 십자 표시는 5, 10, 25, 200 또는 400 시간 동안 0.5 M 아세트산에 노출시키지 않았던, 또는 전혀 노출시키지 않았던 MabSelect™SuRe에 대한 값들을 보여준다.
도 10-14는 MabSelect™Xtra 단백질 A 수지에 대해 실시된 다양한 제품 품질 연구들의 ANOVA 분석을 보여준다. 산-처리후의 컬럼에서, 채워진 원들은 0.5 M 아세트산에 375시간 노출시 표 1의 값들을 반영한다. 산-처리전 컬럼에서, 채워진 원들은 0.5 M 아세트산에 0시간 노출시 표 1의 값들을 반영한다. 다이아몬드 모양은 95% 신뢰 구간에 기반한 범위를 나타낸다. 산-처리후 모든 범위들은 산-처리전 범위와 중첩된다. ANOVA 분석은 0.5 M 아세트산에 수지를 장기 노출시 단백질 품질에 통계적으로 유의한 부정적인 영향이 없음을 보여준다.
도 15-19는 MabSelect™SuRe 단백질 A 수지에 대해 실시된 다양한 제품 품질 연구들의 ANOVA 분석을 보여준다. 산-처리후의 컬럼에서, 채워진 원들은 0.5 M 아세트산에 400시간 노출시 표 1의 값들을 반영한다. 산-처리전 컬럼에서, 채워진 원들은 0.5 M 아세트산에 0시간 노출시 표 1의 값들을 반영한다. 다이아몬드 모양은 95% 신뢰 구간에 기반한 범위를 나타낸다. 도 15에서, 상기 범위는 통계적으로 유의한 정도로 산에 대한 노출 후에 더 크다. 도 16-19에서, 산-처리전 범위들은 산-처리 후 범위들과 중첩된다. ANOVA 분석은 0.5 M 아세트산에 수지를 장기 노출시 단백질 품질에 통계적으로 유의한 부정적인 영향이 없음을 보여준다.
상세한 설명
한 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 아세트산을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 2시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 접촉 단계는 2 내지 5 시간, 2 내지 10 시간, 2 내지 25 시간, 2 내지 200 시간, 2 내지 375 시간, 또는 2 내지 400 시간 동안 실시된다. 한 구체예에서, 접촉 단계는 최소한 약 4시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 접촉 단계는 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다. 한 구체예에서, 조성물은 약 0.1 M 아세트산을 포함하고 접촉 단계는 최소한 약 4시간 동안 실시된다. 한 구체예에서, 조성물은 약 0.5 M 아세트산을 포함하고 접촉 단계는 최소한 약 4시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 조성물은 약 0.5 M 아세트산을 포함하고 접촉 단계는 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다.
한 구체예에서, 조성물은 알콜을 추가로 포함한다. 사용될 수 있는 알콜의 비-제한적 예들에는 에탄올 (예컨대, 약 20%) 및 벤질 알콜 (예컨대, 약 1% 내지 약 2%)이 포함된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 0.1M 아세트산 및 약 20% 에탄올로 구성된다.
한 구체예에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 0.1 M 내지 약 0.5 M의 아세트산으로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 2시간 동안 실시된다. 한 특정 구체예에서, 접촉 단계는 최소한 약 4시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 접촉 단계는 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 0.1 M 아세트산으로 구성되고 접촉 단계는 최소한 약 4시간 동안 실시된다. 또 다른 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 0.5 M 아세트산으로 구성되고 접촉 단계는 최소한 약 4시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 조성물은 약 0.5 M 아세트산을 포함하고 접촉 단계는 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다.
관련 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 0.5 M 내지 약 1.0 M의 아세트산을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 접촉 단계는 1 내지 5 시간, 1 내지 10 시간, 1 내지 25 시간, 1 내지 200 시간, 1 내지 375 시간, 1 내지 400 시간, 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다. 한 구체예에서, 조성물은 약 0.5 M 아세트산을 포함하고 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 조성물은 약 0.5 M 아세트산을 포함하고 접촉 단계는 1 내지 5 시간, 1 내지 10 시간, 1 내지 25 시간, 1 내지 200 시간, 1 내지 375 시간, 1 내지 400 시간, 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다.
한 구체예에서, 조성물은 알콜을 추가로 포함한다. 사용될 수 있는 알콜의 비-제한적 예들에는 에탄올 (예컨대, 약 20%) 및 벤질 알콜 (예컨대, 약 1% 내지 약 2%)이 포함된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 0.5M 아세트산 및 약 20% 에탄올로 구성된다.
한 구체예에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 0.5 M 내지 약 1.0 M의 아세트산으로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 조성물은 본질적으로 약 0.5 M 내지 약 1.0 M 아세트산으로 구성되고 접촉 단계는 1 내지 5 시간, 1 내지 10 시간, 1 내지 25 시간, 1 내지 200 시간, 1 내지 375 시간, 1 내지 400 시간, 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 0.5 M 아세트산으로 구성되고 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 조성물은 본질적으로 약 0.5 M 아세트산으로 구성되고 접촉 단계는 1 내지 5 시간, 1 내지 10 시간, 1 내지 25 시간, 1 내지 200 시간, 1 내지 375 시간, 1 내지 400 시간, 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다.
관련 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 아세트산을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 최소한 3 log10만큼의 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스) 의 양 감소, 최소한 5 log10 만큼 그람 양성 세균의 양 감소, 그리고 최소한 5 log10 만큼 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 의 양 감소 중 하나 이상을 가져온다. 한 특정 구체예에서, 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스), 그람 양성 세균 (예컨대, 마이크로박테리움 종), 및 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 중 하나 이상의 양을, 일정 분석법, 가령, 예를 들면, (1) 생물여과 분석, (2) 현미경 세균 염색, (3) IR/FTIR 분광법, (4) 무균 테스트, 또는 (5) 세균 동정 테스트로 결정된 탐지 한도 미만까지 감소시킨다. 다양한 구체예들에서, 접촉 단계는 최소한 약 1시간, 1 내지 5 시간, 1 내지 10시간, 1 내지 25 시간, 1 내지 200 시간, 1 내지 375 시간, 1 내지 400 시간 동안, 최소한 약 4시간 동안, 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다.
한 구체예에서, 조성물은 알콜을 추가로 포함한다. 사용될 수 있는 알콜의 비-제한적 예들에는 에탄올 (예컨대, 약 20%) 및 벤질 알콜 (예컨대, 약 1% 내지 약 2%)이 포함된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 0.1 M 아세트산 및 약 20% 에탄올로 구성된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 0.5M 아세트산 및 약 20% 에탄올로 구성된다.
한 구체예에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 아세트산으로 본질적으로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 최소한 3 log10만큼의 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스) 의 양 감소, 최소한 5 log10만큼 그람 양성 세균의 양 감소, 그리고 최소한 5 log10 만큼 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 의 양 감소 중 하나 이상을 가져온다. 한 특정 구체예에서, 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스), 그람 양성 세균 (예컨대, 마이크로박테리움 종), 및 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 중 하나 이상의 양을, 일정 분석법, 가령, 예를 들면, (1) 생물여과 분석, (2) 현미경 세균 염색, (3) IR/FTIR 분광법, (4) 무균 테스트, 또는 (5) 세균 동정 테스트로 결정된 탐지 한도 미만까지 감소시킨다. 다양한 구체예들에서, 접촉 단계는 최소한 약 1시간, 1 내지 5 시간, 1 내지 10시간, 1 내지 25 시간, 1 내지 200 시간, 1 내지 375 시간, 1 내지 400 시간 동안, 최소한 약 4시간, 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다.
본 발명의 임의의 상기 방법들의 한 구체예에서, 조성물은 아세테이트 염을 추가로 포함한다.
본 발명의 임의의 상기 방법들의 한 구체예에서, 조성물은 약 2 내지 약 3의 pH를 가진다.
별도의 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 요소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 30분 동안 실시된다. 한 구체예에서, 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다. 한 구체예에서, 조성물은 약 8 M 요소를 포함한다.
한 구체예에서, 조성물은 알콜을 추가로 포함한다. 사용될 수 있는 알콜의 비-제한적 예들에는 에탄올 (예컨대, 약 20%) 및 벤질 알콜 (예컨대, 약 1% 내지 약 2%)이 포함된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 8 M 요소 및 약 20% 에탄올로 구성된다.
한 구체예에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 요소로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 30분 동안 실시된다. 한 특정 구체예에서, 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 8 M 요소로 구성된다.
관련 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 요소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 최소한 2 log10 만큼의 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스) 의 양 감소, 최소한 5 log10 만큼 그람 양성 세균의 양 감소, 그리고 최소한 5 log10 만큼 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 의 양 감소 중 하나 이상을 가져온다. 한 특정 구체예에서, 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스), 그람 양성 세균 (예컨대, 마이크로박테리움 종), 및 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 중 하나 이상의 양을, 일정 분석법, 가령, 예를 들면, (1) 생물여과 분석, (2) 현미경 세균 염색, (3) IR/FTIR 분광법, (4) 무균 테스트, 또는 (5) 세균 동정 테스트로 결정된 탐지 한도 미만까지 감소시킨다.
한 구체예에서, 조성물은 알콜을 추가로 포함한다. 사용될 수 있는 알콜의 비-제한적 예들에는 에탄올 (예컨대, 약 20%) 및 벤질 알콜 (예컨대, 약 1% 내지 약 2%)이 포함된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 8 M 요소 및 약 20% 에탄올로 구성된다.
한 구체예에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 요소로 본질적으로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 최소한 2 log10만큼의 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스) 의 양 감소, 최소한 5 log10 만큼 그람 양성 세균의 양 감소, 그리고 최소한 5 log10 만큼 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 의 양 감소 중 하나 이상을 가져온다. 한 특정 구체예에서, 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스), 그람 양성 세균 (예컨대, 마이크로박테리움 종), 및 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 중 하나 이상의 양을, 일정 분석법, 가령, 예를 들면, (1) 생물여과 분석, (2) 현미경 세균 염색, (3) IR/FTIR 분광법, (4) 무균 테스트, 또는 (5) 세균 동정 테스트로 결정된 탐지 한도 미만까지 감소시킨다.
추가 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 30분 동안 실시된다. 한 구체예에서, 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다. 한 구체예에서, 조성물은 약 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함한다.
한 구체예에서, 조성물은 알콜을 추가로 포함한다. 사용될 수 있는 알콜의 비-제한적 예들에는 에탄올 (예컨대, 약 20%) 및 벤질 알콜 (예컨대, 약 1% 내지 약 2%)이 포함된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 약 20% 에탄올로 구성된다.
한 구체예에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 구아니딘 하이드로클로라이드로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 30분 동안 실시된다. 한 특정 구체예에서, 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드로 구성된다.
관련 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 최소한 2 log10만큼의 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스) 의 양 감소, 최소한 4 log10 만큼 그람 양성 세균의 양 감소, 그리고 최소한 2 log10 만큼 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 의 양 감소 중 하나 이상을 가져온다. 한 특정 구체예에서, 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스), 그람 양성 세균 (예컨대, 마이크로박테리움 종), 및 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 중 하나 이상의 양을, 일정 분석법, 가령, 예를 들면, (1) 생물여과 분석, (2) 현미경 세균 염색, (3) IR/FTIR 분광법, (4) 무균 테스트, 또는 (5) 세균 동정 테스트로 결정된 탐지 한도 미만까지 감소시킨다.
한 구체예에서, 조성물은 알콜을 추가로 포함한다. 사용될 수 있는 알콜의 비-제한적 예들에는 에탄올 (예컨대, 약 20%) 및 벤질 알콜 (예컨대, 약 1% 내지 약 2%)이 포함된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 본질적으로 약 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 약 20% 에탄올로 구성된다.
한 구체예에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 구아니딘 하이드로클로라이드로 본질적으로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 최소한 2 log10만큼의 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스) 의 양 감소, 최소한 4 log10 만큼 그람 양성 세균의 양 감소, 그리고 최소한 2 log10 만큼 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 의 양 감소 중 하나 이상을 가져온다. 한 특정 구체예에서, 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 포자 형성 세균 (예컨대, 바실루스 슈도퍼무스), 그람 양성 세균 (예컨대, 마이크로박테리움 종), 및 그람 음성 세균 (예컨대, 스테노트로포모나스 말토필리아) 중 하나 이상의 양을, 일정 분석법, 가령, 예를 들면, (1) 생물여과 분석, (2) 현미경 세균 염색, (3) IR/FTIR 분광법, (4) 무균 테스트, 또는 (5) 세균 동정 테스트로 결정된 탐지 한도 미만까지 감소시킨다.
한 양상에서, 본 발명은 크로마토그래피 매트릭스를 약 0.5 M 내지 약 1.0 M의 아세트산 및 (i) 약 4.0 M 내지 약 12.0 M 요소 및/또는 (ii) 약 4.0 M 내지 약 12.0 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다. 한 특정 구체예에서, 조성물은 알콜을 추가로 포함한다. 사용될 수 있는 알콜의 비-제한적 예들에는 에탄올 (예컨대, 약 20%) 및 벤질 알콜 (예컨대, 약 1% 내지 약 2%)이 포함된다.
본 발명의 임의의 상기 방법들의 한 구체예에서, 접촉 단계는 15°C 내지 30°C 온도에서 수행된다. 한 특정 구체예에서, 접촉 단계는 20°C 내지 25°C 온도에서 수행된다.
본 발명의 임의의 상기 방법들의 한 구체예에서, 조성물은 실질적으로 산화제가 없다.
본 발명의 임의의 상기 방법들의 한 구체예에서, 조성물은 과산화산을 포함하지 않는다.
본 발명의 임의의 상기 방법들의 한 구체예에서, 조성물은 과산화물을 포함하지 않는다.
본 발명의 임의의 상기 방법들의 한 구체예에서, 조성물은 NaOH를 포함하지 않는다.
본 발명의 임의의 상기 방법들의 한 구체예에서, 접촉 단계는 최소한 1회 반복된다.
본 발명의 임의의 상기 방법들의 한 구체예에서, 크로마토그래피 매트릭스는 크로마토그래피 컬럼에 충전된다. 한 특정 구체예에서, 크로마토그래피 컬럼은 0.5 cm 내지 1.5 cm의 내부 직경 및 15 cm 내지 30 cm의 층 높이를 가진다. 한 특정 구체예에서, 크로마토그래피 컬럼은 약 1 cm의 내부 직경 및 약 20 cm의 층 높이를 가진다. 한 특정 구체예에서, 크로마토그래피 컬럼은 40 cm 내지 1.6 미터의 내부 직경 및 15 cm 내지 30 cm의 층 높이를 가진다. 한 특정 구체예에서, 크로마토그래피 컬럼은 약 1.4 미터의 내부 직경 및 약 20 cm의 층 높이를 가진다.
본 발명의 임의의 상기 방법들의 한 구체예에서, 크로마토그래피 매트릭스는 지지체에 결합된 단백질성 리간드를 포함한다. 한 특정 구체예에서, 단백질성 리간드는 하나 이상의 면역글로불린 결합 도메인을 포함한다. 한 특정 구체예에서, 단백질성 리간드는 단백질 A 도는 이의 단편 또는 이의 유도체이다. 한 특정 구체예에서, 단백질성 리간드는 스타필로코쿠스 단백질 A, 펩토스트렙토코쿠스 단백질 L, 스트렙토코쿠스 단백질 G, 스트렙토코쿠스 단백질 A, 및 이의 단편 및 유도체들로 구성된 그룹에서 선택된다. 한 특정 구체예에서, 크로마토그래피 매트릭스는 MabSelect™, MabSelect™ Xtra, MabSelect™ SuRe, MabSelect™ SuRe pcc, MabSelect™ SuRe LX, MabCapture™ A, nProtein A Sepharose 4 Fast Flow, Protein A Sepharose 4 Fast Flow, Protein A Mag Sepharose, Protein A Sepharose CL-4B, rmp Protein A Sepharose Fast Flow, rProtein A Sepharose 4 Fast Flow, Capto™ L, ProSep™-A, ProSep Ultra Plus, Absolute™ , CaptivA™ PriMab™, Protein A Diamond, Eshmuno™ A, Toy opearl™ AF-rProtein A, Amsphere™ Protein A, KanCapA™, Protein G Mag Sepharose Xtra, 및 Protein G Sepharose 4 Fast Flow로 구성된 그룹에서 선택된다. 한 특정 구체예에서, 크로마토그래피 매트릭스는 MabSelect™, MabSelect™ Xtra, MabSelect™ SuRe, MabSelect™ SuRe PCC, 및 MabSelect™ SuRe LX으로 구성된 그룹에서 선택된다. 한 특정 구체예에서, 단백질성 리간드는 상기 방법이 실시된 후 측정가능하게 변성되지 않는다.
한 구체예에서, 본 발명은 MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 0.5 M의 아세트산으로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 4시간 동안 실시된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 0.1 M의 아세트산 및 약 20%의 에탄올로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 4시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 접촉 단계는 최소한 약 1시간, 1 내지 5 시간, 1 내지 10시간, 1 내지 25 시간, 1 내지 200 시간, 1 내지 375 시간, 1 내지 400 시간 동안, 최소한 약 4시간, 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다.
추가 구체예에서, 본 발명은 MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 8 M의 요소로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다.
또한 또 다른 구체예에서, 본 발명은 MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 8 M의 요소 및 약 20%의 에탄올로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다.
추가 구체예에서, 본 발명은 MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 6 M의 구아니딘 하이드로클로라이드로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법을 제공하며, 이 방법은, 크로마토그래피 매트릭스를 본질적으로 약 6 M의 구아니딘 하이드로클로라이드 및 약 20%의 에탄올로 구성된 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하고, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 1시간 동안 실시된다.
한 구체예에서, 본 발명은 정제를 위한 제약학적 물질을 포함하는 조성물을 처리하기 이전에 미생물 부하를 감소시키는 방법을 제공하며 이 방법은 (a) 크로마토그래피 매트릭스를 제공하는 단계; (b) 본 발명의 상기 방법들 중 어느 하나를 실시하는 단계; 및 (c) 상기 제약학적 물질을 포함하는 조성물을 상기 크로마토그래피 매트릭스에 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명은 설명된 특정 방법들 및 실험 조건들에 제한되는 것이 아니며, 이와 같은 방법 및 조건은 달라질 수 있음을 이해하여야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 구체예들을 오직 설명하기 위한 것이며, 제한을 하고자 하는 것이 아니므로, 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서 정의됨을 또한 이해하여야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수 형태( "a", "an") 및 관사("the")는 문맥상 명확히 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태를 포함한다. 그러므로, 예를 들면, "한 방법"에 대한 지칭은 본 명세서에 기재된 및/또는 본 명세서를 읽을 때 해당 분야의 숙련된 기술자들에게 명백해지는 유형의 하나 이상의 방법들 및/또는 단계들을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 해당 분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 동일한 의미를 가진다.
용어 "약" 및 “대략”은 통계적으로 유의한 값의 범위에 속함을 의미하기 위해 호환적으로 사용된다. 이러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 50% 이내, 더욱 바람직하게는 20% 이내, 더더욱 바람직하게는 10% 이내, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 5% 이내일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “미생물 (microbe)" 또는 "미생물 (microorganism)"은 세균 및 고세균을 비롯한 원핵 생물체, 및 진균을 비롯한 진핵 생물체를 포함한다. 이들 용어는 살아있는 세포 및 포자들 모두 (포자-형성 생물체에 있어서) 뿐만 아니라 미생물 산물, 가령, 예컨대, 내독소를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “미생물 (microbe) 바이오버든 감소” 및 “미생물(microbial) 바이오버든 감소”는 미생물의 사멸 그리고 미생물과 크로마토그래피 매트릭스 간의 상호작용에 따른 어느 정도의 간섭을 합한 것이다. 본 발명에 따른 미생물 바이오버든의 감소는 크로마토그래피 컬럼 또는 매트릭스에 존재할 수 있는 미생물을 본질적으로 모두, 또는 심지어 최소한 99% 사멸시키도록 설계되었던 기존에 개시된 임의의 위생화 공정과 동일하지 않다.
그보다는, 본 발명은 비-포자 형성 미생물의 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만 또는 40-60%를 사멸시킬 수 있는 방법들을 포함한다. 이러한 한 구체예에서, 컬럼 상의 포자 형성 미생물, 가령, 바실루스의 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만 또는 10% 미만, 또는 10-20%가 본 발명의 방법에 의해 사멸될 것이다.
본 발명은 컬럼 상의 세균 모두를 사멸시키지 않는 방법들을 포함하지만, 처리 후 생물여과 분석, 또는 본 명세서에 개시된 그리고 해당 분야에 공지된 임의의 기타 미생물학적 분석법에 의해 탐지될 수 있는 생존가능한 미생물의 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%가 크로마토그래피 매트릭스로부터 제거된다. 본 발명의 일부 구체예들에서, 미생물 바이오버든의 수준은 사용전 홍조 샘플에서, 평형화 샘플에서, 부하 샘플에서, 또는 실험 도중 연속적으로 채취한 부하로부터 얻은 모든 GMP 샘플에서 GMP-허용가능 수준 미만으로 감소된다. 미생물 모두를 사멸시키지 않을 경우 조차도, 본 발명은 청구한 발명의 방법들을 실시하는 동안 또한 발생하는 미생물과 크로마토그래피 매트릭스 간의 상호작용 간섭으로 인해 미생물 바이오버든을 GMP 경고 수준 미만으로 감소시킬 수 있다. 이러한 간섭은 미생물과 크로마토그래피 매트릭스 간의 친화성, 결합 또는 임의의 기타 상호작용을 감소시키는 것과 같은 기전을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 기전은 컬럼으로부터 숙주 세포 단백질 및 DNA와 같은 불순물을 제거하는 크로마토 그래피 컬럼에서 사용되는 일반적인 스트립 단계와 유사하다. 따라서, 이러한 간섭은 미생물 바이오버든이 생물 제약학적 약물의 GMP 생성 요구조건과 일치하는 수준까지 감소되었을 때, 미생물 모두를 사멸시키지 않는 본 발명의 방법을 사용한 후 탐지될 수 있다. 컬럼 상의 미생물 모두를 사멸하도록 설계되지 않은 본 발명의 방법들 중 하나를 사용함으로써, 시약들은 반드시 강력하여야 하는 것은 아니므로, 시판용 제품 및 공정을 승인하여야 하는 규제 기관들, 예컨대, FDA 또는 EMA로부터 승인을 받기에 더욱 바람직하다. 바람직하게는, 생물 약제에 관하여 GMP를 생성하는 동안 크로마토그래피 컬럼 상에서 사용되는 것과 동일한 스트립 완충 성분들 또는 최소한 활성 성분들 (아세트산이 통상적임)은 보다 높은 농도로 (예를 들면, 10X, 15X, 또는 20X) 그리고 보다 긴 접촉 시간 동안 (예를 들면, 3X, 4X, 또는 5X) 적용될 때 미생물 바이오버든을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 미생물 바이오버든을 감소시키기 위해 보다 긴 시간 동안 보다 높은 농도로 동일한 스트립 완충액을 사용하는 것이 보다 효율적일 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 방법들, 양상들 및 구체예들은 의약품 제조품질 관리 기준 (GMP), 또는 현행 의약품 제조품질 관리 기준 (CGMP)의 일부로서 사용될 수 있다. 이러한 관리기준들은 규제 기관들, 가령, 미국 식품 의약국의 요구사항을 충족시킬 수 있도록 제작 단계들 및 제품의 품질에 있어서 일관성을 제공하여야 한다. GMP 및 CGMP는 통상적으로 제작 공정들, 특히 사람 환자들에서 사용되는 제작된 치료용 생물분자의 순도를 확보함에 있어서 높은 정도의 예측가능성 및 표준화를 요구한다. GMP 또는 CGMP 중 공정을 중단 및/또는 생산 배치 폐기를 필요로 하는 매개변수가 탐지되는 많은 결함 지점들이 존재한다. 결함 발생시 생물분자를 제조하기 위한 배지를 배양함에 관련되는 노동으로 인해, 많은 비용이 발생한다.
바이오버든 또는 미생물 부하가 분리에 사용된 크로마토그래피 컬럼, 또는 매트릭스에서 매우 높아지는 경우, 예측불가능한 및/또는 바람직하지 않은 다양한 효과들이 발생할 수 있다. 결함 지점이 생기면 해당 공정은 중단될 수 있으며, 미생물로 오염된 제품이 식별되고 더 이상 제조되지 않는다. 결함 지점들을 방지하기 위하여, 10 mL 당 최소한 5 CFU의 바이오버든 탐지시 경고를 울릴 수 있다. 10 mL 당 최소한 10 CFU의 바이오버든은, 바이오버든을 감소시키기 위해 본 명세서에 기재된 하나 이상의 방법들 또는 구체예들을, 단독으로 또는 조합하여 시작하는 것을 포함할 수 있는 일정 작용을 유발할 수 있다.
예를 들면, 미생물이 제품 안으로 도입될 수 있는데, 이는 치료적으로 사용될 수 없다. 과도한 바이오버든은 또한 컬럼 성능을 감소시킬 수 있고, 이는 표준화되고 예측 가능한 방식으로 제품을 정제하는 것을 방해 할 수 있으며 다른 결함 지점을 유발시킬 수도 있다. 그러므로, GMP 또는 CGMP에 부합하도록, 그리고 결함 지점 유발, 및 이와 관련된 결함해결 및 결함시간을 최소화하기 위하여 우선적으로 바이오버든을 감소시키는 본 명세서에 기재된 양상들 및 구체예들을 사용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 기재된 임의의 양상들 또는 구체예들은 접촉 단계 후 정제를 위한 소형 분자-함유 또는 생물분자-함유 (예컨대, 단클론 항체-함유) 제제를 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 정제를 위하여 소형 분자-함유 또는 생물분자 함유 (예컨대, 단클론 항체-함유) 제제를 처리하기 전 미생물 부하를 감소시키는 방법은 본 명세서에 기재된 미생물 바이오버든을 감소시키는 방법들 중 어느 하나의 단계들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 생물분자의 정제 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 방법들의 단계들을 수행하는 단계 및 그 후 이러한 생물분자를 포함하는 제제를 크로마토그래피 매트릭스에 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 양상들 또는 구체예들은 크로마토그래피 매트릭스가 보관상태에서 제거된 후 정제를 위하여 약물 함유, 생물분자-함유, 또는 단클론 항체-함유 제제를 처리하기 이전에 실시될 수 있다. 장기간 보관하는 동안, 크로마토그래피 매트릭스 또는 컬럼에 존재하는 소량의 세균은 바이오버든을 성장 및 증가시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 양상들 또는 구체예들은 무균 기술의 일부로서, 또는 무균 기술을 보조하기 위해 사용될 수 있다. 크로마토그래피 매트릭스 상에서 발생한 바이오버든 감소는 무균 기술에 충분할 수 있고, 또는 무균 기술에서의 다른 단계들 이전 또는 이후에 사용될 수 있다. 상기 설명한 바이오버든 감소 방법들은 무균 기술 결함 지점이 유발될 가능성을 감소시킬 수 있으며 임박한 결함 지점 유발자에 반응하여 사용될 수 있다.
또 다른 양상에서, MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스는 약 0.5 M 아세트산으로 본질적으로 구성된 조성물과, 최소한 4 시간 동안 접촉시킴으로써 미생물 바이오버든이 감소된다. 다양한 구체예들에서, 접촉 단계는 4 내지 5 시간, 4 내지 10 시간, 4 내지 25 시간, 4 내지 200 시간, 4 내지 375 시간, 또는 4 내지 400 시간 동안 실시된다. 또 다른 양상에서, MabSelect™Xtra 크로마토그래피 매트릭스는 약 0.1 M 아세트산 및 약 20% 에탄올로 본질적으로 구성된 조성물과, 최소한 4 시간 동안 접촉시킴으로써 미생물 바이오버든 감소처리 된다.
다양한 크로마토그래피 매트릭스들이 사용될 수 있다. 크로마토그래피 매트릭스는 지지체에 결합된 단백질성 리간드를 포함할 수 있다. 단백질성 리간드는, 결과적으로, 하나 이상의 면역글로불린 결합 도메인을 포함할 수 있다. 기타 유용한 크로마토그래피 매트릭스들에는, 제한 없이, 다양한 이온 교환 크로마토그래피 매트릭스들, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 매트릭스들, 혼합 방식의 크로마토그래피 매트릭스들, 및 크기 배제 크로마토그래피 매트릭스들이 포함된다.
크로마토그래피 매트릭스의 단백질성 리간드는 may be 단백질 A 또는 이의 단편 또는 유도체일 수 있다. 예시적인 단백질성 리간드에는 스타필로코쿠스 단백질 A, 펩토스트렙토코쿠스 단백질 L, 스트렙토코쿠스 단백질 G, 스트렙토코쿠스 단백질 A, 및 스타필로코쿠스 단백질 A, 펩토스트렙토코쿠스 단백질 L, 스트렙토코쿠스 단백질 G, 스트렙토코쿠스 단백질 A 중 어느 하나의 단편 및 유도체가 포함된다.
스타필로코쿠스 단백질 A는 세균 스타필로코쿠스 아우레우스의 세포벽에서 발견될 수 있다. 단백질 A는 CH2와 CH3 도메인들 사이에서, Fc 영역의 항체에 결합할 수 있다. 단백질 A는 스타필로코쿠스 아우레우스에서 배양되거나 또는 다른 세균, 예를 들면, 대장균 또는 브레비바실루스에서 재조합방식으로 제조될 수 있다. 스타필로코쿠스 단백질 A의 단편 또는 유도체는 또한 CH2와 CH3 도메인 사이에서, Fc 영역의 항체에 결합할 수 있다.
펩토스트렙토코쿠스 단백질 L은 펩토스트렙토코쿠스 마그누스의 표면에서 발견될 수 있으며 항체 경쇄와의 상호작용을 통하여 항체에 결합할 수 있다. 단백질 A와 달리, 단백질 L은 단쇄 가변 단편 (scFv) 및 Fab 단편들에 결합할 수 있다. 단백질 L의 단편 또는 유도체는 또한 항체의 경쇄, 단쇄 가변 단편 (scFv) 및 Fab 단편에 결합할 수 있다.
스트렙토코쿠스 단백질 G는 그룹 G 스트렙토코쿠스 균주들의 세포벽에서 발견될 수 있다. 단백질 G는 Fab 및 Fc 영역에서 항체에 결합할 수 있다. 단백질 G는 다른 세균, 예를 들면, 대장균에서 재조합방식으로 제조될 수 있다. 단백질 G의 단편 또는 유도체는 또한 Fab 및 Fc 영역에서 항체에 결합할 수 있다.
크로마토그래피 매트릭스는 컬럼의 일부인 수지일 수 있다. 하나의 적합한 수지는 GE Healthcare사의 MabSelect SuRe™이다. 소규모 정제에 적합한 예시적인 컬럼은 MabSelect SuRe™으로 충전되며, 이는 직경이 약 1.0 cm이고 길이가 약 20 cm이다. 보다 대형인, 가령, 1.4 m x 20 cm인 컬럼은 , 제작 규모의 정제용으로 사용될 수 있다.
보다 일반적으로, 본 발명의 방법들은 실험용 규모, 대형 공정 규모 및 매우 대형 공정 규모를 비롯한, 다양한 크기의 크로마토그래피 컬럼들에 대해 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 크로마토그래피 컬럼은 0.5 cm 내지 1.5 cm의 내부 직경 및 15 내지 30 cm (예컨대, 20 cm)의 층 높이를 가질 수 있다. 내부 직경은 0.7 내지 1.2 cm, 대안적으로 0.9 내지 1.4 cm, 1.2 내지 1.5 cm, 1.0 내지 1.2 cm, 또는 약 1 cm일 수 있다. 일부 구체예들에서, 크로마토그래피 컬럼은 40 cm 내지 1.6 미터 (예컨대, 60 cm, 80 cm, 1.0 미터, 1.2 미터, 또는 1.4 미터)의 내부 직경을 가질 수 있다. 크로마토그래피 컬럼은 15 내지 30 cm (예컨대, 20 cm)의 층 높이를 가질 수 있다.
예시적인 크로마토그래피 매트릭스들에는 MabSelect™, MabSelect™ Xtra, MabSelect™ SuRe, MabSelect™ SuRe pcc, MabSelect™ SuRe LX, nProtein A Sepharose 4 Fast Flow, Protein A Sepharose 4 Fast Flow, Protein A Mag Sepharose, Protein A Sepharose CL-4B, rmp Protein A Sepharose Fast Flow, rProtein A Sepharose 4 Fast Flow, Capto™ L, ProSep™-A, ProSep Ultra Plus, Absolute™, CaptivA™ PriMab™, Protein A Diamond, Eshmuno™ A, Toy opearl™ AF-rProtein A, Amsphere™ Protein A, KanCapA™, Protein G Mag Sepharose Xtra, 및 Protein G Sepharose 4 Fast Flow가 포함된다.
MabSelect™, MabSelect™ Xtra, MabSelect™ SuRe, 및 MabSelect™ SuRe LX 는 대장균에서 생성된 재조합 단백질 A 리간드를 가지는데, 이 리간드는 고도로 교차 결합된 아가로스 매트릭스에 부착된다.
미생물 바이오버든 감소는 크로마토그래피 매트릭스의 성능을 복원시킬 수 있으므로 치환되기 보다는 추가 정제를 위해 사용될 수 있다. 그러므로, 본 명세서에 기재된 임의의 방법들에서, 미생물 바이오버든 감소는 크로마토그래피 매트릭스가 사용된 후 수행될 수 있다. 이러한 시나리오에서, 관심 단클론 항체를 포함하는 세포 배양 배지로부터 크로마토그래피 매트릭스로 도입될 수 있는 세균 및 기타 미생물은 제거될 수 있다. 단백질성 리간드, 가령, 단백질 A로 이루어진 크로마토그래피 매트릭스들을 사용하면 실질적인 비용이 절감될 수 있다.
더욱이, 통상적으로 사용되는 소듐 하이드록사이드-함유 용액들 대신 아세트산-함유 용액들을 사용하면 단백질 리간드의 변성을 줄일 수 있고 크로마토그래피 매트릭스에 대한 손상을 줄일 수 있다. 단백질 리간드의 변성 및/또는 크로마토그래피 매트릭스에 대한 손상은 크로마토그래피 매트릭스의 다양한 성능 특성들을 분석함으로써, 예컨대, 매트릭스로부터 용리하는 생성물의 순도 및 양을 분석함으로써 그리고 매트릭스의 한 성분 (예컨대, 단백질 A)의 잔부 용리를 분석함으로써 간접적으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 단백질성 리간드가 단백질 A인 경우, 단클론 항체의 순도 및 양이 분석될 것이다. 예시적인 분석법들에는 크기 배제 크로마토그래피 (예컨대, SE-HPLC 및 SE-UPLC), 모세관 전기영동 (예컨대, CE-SDS), 선택적으로 전체 컬럼 영상화를 포함할 수 있는 모세관 등전 초점조절 (iCIEF)이 포함된다. 또한, 컬럼으로부터 잔여 단백질 A가 측정될 수 있다 (예컨대, ELISA를 포함한 분석법에 의해).
본 명세서에 기재된 방법들에 따라 이루어진 바이오버든 감소는 단백질 A에 손상을 주지 않고 세균을 제거함으로써 단백질 A 또는 기타 단백질성 리간드를 포함하는 컬럼의 성능을 유지시키는 비용-효율적인 방법이 될 수 있다. 예를 들면, 단백질 A-함유 매트릭스의 아세트산 포함 용액 (예컨대, 0.5 M 아세트산)에 대한 375 또는 400 시간 동안의 노출은 단백질 A를 포함하는 컬럼의 성능에 어떠한 통계적으로 유의한 손실도 초래하지 않는다. 예컨대, 실시예 6, 표 10 및 도 5-19를 참고하라. 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피, 환원 또는 비-환원 조건하에서 모세관 전기영동, 또는 모세관 등전 초점조절에 의하여 용리된 단클론 항체의 통계적으로 유의한 순도 손실은 없다.
본 명세서에 기재된 방법들에 따른 미생물 바이오버든 감소는 세균 모두를 사멸시키지 않고 거의 모든 세균들을 제거할 수 있다. 특정 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 아세트산은 세균과 단백질성 리간드, 예컨대, 단백질 A 간의 친화성을 간섭할 수 있다. 균-오염된 매트릭스 또는 컬럼은 미생물 생물체와 수지 간의 상호작용을 방해함으로써 본 명세서에 기재된 방법들에 따라 감소된 미생물을 가질 수 있다. 세균은 아세트산-포함 용액에 잔류하고자 하는 경향이 있다. 세균의 제거는 아세트산과의 접촉 단계들을 반복함으로써 또는 아세트산-함유 용액들을 이용한 크로마토그래피 매트릭스의 추가 세척 (flushing)을 실시함으로써 추가로 개선될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 크로마토그래피 매트릭스로부터 포자-형성 세균을 제거한다. 포자-형성 세균은 내생포자 형태로 전환하는 능력을 가진다. 내생포자 형태는 세균이 스스로를 감소시킬 수 있는 기본적인 휴면 형태이다. 내생포자 형성은 일반적으로 영양소 결핍 또는 혹독한 조건들, 가령, 산성 또는 염기성 환경에 의해 유발된다. 내생포자는 바람직하지 않은 조건들에서조차도 세균을 장기 기간동안 휴면 상태로 존재하게 할 수 있다. 환경이 더욱 바람직해지면, 내생포자는 식물 상태로 재활성화될 수 있다. 내생포자를 형성할 수 있는 세균의 예들에는 바실루스 및 클로스트리디움이 포함된다. 제작 공정에서 이들 포자-형성 세균에 바람직하지 않은 조건들의 존재로 인해, 이들 포자-형성 세균은 크로마토그래피 정제 공정들에서의 정상적인 작동 조건들하에서 내생포자를 형성할 수 있는 것으로 생각된다. 포자-형성 세균을 탐지하기 위해 사용될 수 있는 많은 방법들이 존재하며 이러한 방법들에는 현미경 세균 염색법, IR/FTIR 분광법, 무균 테스트, 및 세균 동정 테스트 (예컨대, 생화학 반응, 16S rRNA 서열 결정, 또는 taxa-특이적 서열 결정)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 크로마토그래피 매트릭스로부터 그람 양성 세균을 제거한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 크로마토그래피 매트릭스로부터 그람 음성 세균을 제거할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 크로마토그래피 매트릭스로부터 포자-형성 세균, 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균을 제거한다. 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 포자 형성 세균, 그람 양성 세균, 및 그람 음성 세균 중 하나 이상의 양을, (1) 생물여과 분석, (2) 현미경 세균 염색, (3) IR/FTIR 분광법, (4) 무균 테스트, 및 (5) 세균 동정 테스트 (예컨대, 생화학 반응, 16S rRNA 서열 결정, 또는 taxa-특이적 서열 결정)으로 구성된 그룹에서 선택된 분석법의 탐지 한도 미만으로 감소시킬 수 있다. 생물여과 분석법들은 “Sterility Tests”라는 제목의 미국 약전 <71>장에 기재되어 있다. 생물여과 분석법들에서, 컬럼으로부터의 용리액들은 선택적으로 세균을 결합시키는 필터를 통해 통과된다. 그 후 세균을 생장시킬 적절한 배지와 함께 필터를 아가 위에 배치시키고, 배양시키고, 세균을 계수한다. 컬럼 용리액의 희석은 필요에 따라 실시될 수 있다.
현미경 세균 염색법은“Microbial examination of nonsterile products: microbial enumeration tests”라는 제목의 미국 약전 <61>장에 기재되어 있다.
IR/FTIR 분광법은 BRUKER Application Note AN&405 Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology Biotechnology A. Mendez-Vilas (Ed.) Microbiological tests are described in Reynolds, J. et al., “Differential staining of bacteria: endospore stain”Curr. Proc. Microbiol. 2009, Appendix3: Appendix 3 J에 기재되어 있다.
일부 구체예들에서, 조성물 내 아세트산의 농도는 약 0.1 M 내지 약 1.0 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 아세트산의 농도는 약 0.2 M 내지 약 0.8 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 아세트산의 농도는 약 0.4 M 내지 약 0.7 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 아세트산의 농도는 약 0.5 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 아세트산의 농도는 약 0.1 M 내지 약 0.5 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 아세트산의 농도는 약 0.1 M이다.
일부 구체예들에서, 조성물 내 요소의 농도는 약 4 M 내지 약 12 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 요소의 농도는 약 6 M 내지 약 10 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 요소의 농도는 약 6 M 내지 약 8 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 요소의 농도는 약 8 M이다.
일부 구체예들에서, 조성물 내 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도는 약 3 M 내지 약 10 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도는 약 4 M 내지 약 8 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도는 약 5 M 내지 약 7 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도는 약 6 M이다.
일부 구체예들에서, 조성물 내 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도는 약 3 M 내지 약 10 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도는 약 4 M 내지 약 8 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도는 약 5 M 내지 약 7 M이다. 일부 구체예들에서, 조성물 내 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도는 약 6 M이다.
일부 구체예들에서, 용액의 pH는 최소한 2.0이다. pH는 2.0 내지 7.0일 수 있다. pH는 2.5 내지 6.5, 3.0 내지 6.0, 4.0 내지 7.0, 2.0 내지 5.0, 3.5 내지 5.5, 3.0 내지 4.0, 또는 약 4.0일 수 있다. pH는 대략 다음 중 어느 하나 일 수 있다: 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0.
일부 구체예들에서, 조성물은 에탄올을 포함한다. 조성물은 1-40% 에탄올, 5-35% 에탄올, 10-25% 에탄올, 15-30% 에탄올, 18-24% 에탄올, 약 20% 에탄올, 또는 20% 에탄올을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 조성물은 약 0.1M 아세트산 및 약 20% 에탄올을 포함한다. 일부 구체예들에서, 조성물은 본질적으로 약 0.1M 아세트산 및 약 20% 에탄올로 구성된다. 에탄올을 사용하는 것에 대한 이점들이 존재하지만, 반면에 벤질 알콜의 양은 최소화하거나 벤질 알콜을 사용하지 않아야 하는데, 이는 벤질 알콜의 존재로부터 발생할 수 있는 인간에서의 독성 또는 인간에서의 유해 효과 때문이다.
일부 구체예들에서, 조성물은 아세테이트 염을 추가로 포함한다. 아세테이트 염은 아세트산을 포함하는 조성물에 대한 완충액으로서 기능할 수 있다. 예를 들면, 조성물은 아세트산 이외에도 소듐 아세테이트를 포함할 수 있고 그리하여 이 조성물은 완충액이다. 조성물은 0.1 M 소듐 아세테이트 내지 1.0 M 소듐 아세테이트, 0.2 내지 0.8 M 소듐 아세테이트, 0.4 내지 0.7 M 소듐 아세테이트, 약 0.5 M 소듐 아세테이트, 또는 0.5 M 소듐 아세테이트를 포함할 수 있다. 아세트산을 소듐 아세테이트 또는 또 다른 아세테이트 염으로 완충시키는 것은 크로마토그래피 매트릭스에서 용액의 pH를 유지시킴에 효과적일 수 있다. pH는 최소한 2.0, 약 2 내지 3, 2.0 내지 3.0, 2.0 내지 7.0, 2.5 내지 6.5, 3.0 내지 6.0, 4.0 내지 7.0, 2.0 내지 5.0, 3.5 내지 5.5, 3.0 내지 4.0, 또는 약 4.0일 수 있다. pH는 대략 다음 중 어느 하나 일 수 있다: 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 또는 7.0.
조성물이 아세트산을 포함하는 일부 구체예들에서, 접촉 단계는 최소한 한 시간 동안, 대안적으로 1 내지 4 시간 동안, 대안적으로 최소한 2 시간 동안 실시된다. 일부 구체예들에서, 접촉 단계는 2 내지 4 시간 동안 실시된다. 일부 구체예들에서, 접촉 단계는 최소한 4 시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 접촉 단계는 90 분 내지 6 시간, 2 시간 내지 5 시간, 4 시간 내지 5 시간, 4 시간 내지 6 시간, 90 분 내지 3 시간, 5 시간 내지 6 시간, 4 시간 내지 10 시간, 4 시간 내지 25 시간, 4 시간 내지 200 시간, 4 시간 내지 375 시간, 또는 4 시간 내지 400 시간 동안 실시된다.
조성물이 요소를 포함하는 일부 구체예들에서, 접촉 단계는 최소한 30 분, 대안적으로 최소한 1 시간, 대안적으로 최소한 2 시간 동안 실시된다. 일부 구체예들에서, 접촉 단계는 1 내지 2시간 동안 실시된다. 일부 구체예들에서, 접촉 단계는 최소한 2 시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 접촉 단계는 30 분 내지 4 시간, 1 시간 내지 3 시간, 또는 90 분 내지 2 시간 동안 실시된다.
조성물이 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함하는 일부 구체예들에서, 접촉 단계는 최소한 30 분, 대안적으로 최소한 1 시간, 대안적으로 최소한 2 시간 동안 실시된다. 일부 구체예들에서, 접촉 단계는 1 내지 2시간 동안 실시된다. 일부 구체예들에서, 접촉 단계는 최소한 2 시간 동안 실시된다. 다양한 구체예들에서, 접촉 단계는 30 분 내지 4 시간, 1 시간 내지 3 시간, 또는 90 분 내지 2 시간 동안 실시된다.
조성물이 요소 또는 구아니딘 하이드로클로라이드를 포함하는 일부 구체예들에서, 접촉 단계는 최소한 30 분 동안, 대안적으로 최소한 약 1 시간 동안, 대안적으로 1 내지 4 시간 동안, 대안적으로 최소한 2 시간 동안 실시된다.
일부 구체예들에서, 접촉 단계는 반복될 수 있다. 예를 들면, 접촉 단계는 약 1 시간 동안 실시된 다음 복수회 반복될 수 있다. 일부 구체예들에서, 접촉 단계는 2, 3, 4, 5, 또는 6회 반복된다. 미생물 바이오버든 감소를 반복함으로써, 컬럼은 추가 아세트산에 노출될 수 있고, 이는 크로마토그래피 매트릭스로부터 세균 및 미생물을 추가적으로 파괴시킬 수 있다. 접촉 단계를 반복하면 크로마토그래피 매트릭스, 예컨대, 단백질 A 리간드, 및 컬럼으로부터 세균 및 미생물을 보다 많이 세정 및 제거할 수 있다. 미생물 바이오버든 감소 공정은 연속으로 복수회 수행되었을 경우 바이오버든을 더욱 많이 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 미생물 바이오버든 감소 방법들의 유효성은 임의의 수의 바이오버든 분석법을 사용하여 모니터 될 수 있다. 이러한 분석법 중 하나는 여과 분석법인데, 이 분석법에서 일정 부피의 용출액이 여과막을 통과하고 여과막은 용출액에 존재하는 세균을 포획한다. 세균 역가는 아가 플레이트 위에 여과막을 배치하고 여과막 상의 세균이 플레이트 위에서 콜로니를 형성하도록 하여 결정될 수 있다. 아가 플레이트는 트립티케이스 소이 아가 (TSA)를 함유할 수 있다. 배양은 3 내지 7 일 동안 25°C 내지 37°C의 온도에서 발생할 수 있다. 이후 콜로니의 수를 계수한다. 콜로니가 너무 많이 형성된 경우, 용출액의 희석이 이루어질 수 있다.
일부 구체예들에서, 포자 형성 세균의 양은 최소한 1.5 log10 만큼 감소한다. 예를 들면, 크로마토그래피 매트릭스가 바실루스 슈도퍼무스로 오염된 경우, 이러한 매트릭스를 8 M 요소 용액, 8 M 요소 / 20% 에탄올 용액, 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 용액, 또는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 / 20% 에탄올 용액과, 최소한 1 시간 동안 접촉시키면 바실루스 슈도퍼무스의 수를 최소한 1.5 log10만큼 감소시킬 수 있다.
일부 구체예들에서, 미생물 바이오버든 감소 방법이 실시되는 경우, 크로마토그래피 매트릭스의 결합능은 10회 이상의 주기에 걸쳐 보존된다. 다른 구체예들에서, 결합능은 50회 이상의 주기에 걸쳐 보존된다. 일부 다른 구체예들에서, 결합능은 100회 이상의 주기에 걸쳐 보존된다. 일부 구체예들에서, 결합능은 200회 이상의 주기에 걸쳐 보존된다.
일부 구체예들에서, 해당 접촉 단계 동안 또는 복수회의 접촉 단계게 걸쳐 크로마토그래피 매트릭스의 실질적 성능저하는 존재하지 않으며 여기서 조성물에 대한 노출은 최소한 5 시간, 최소한 10 시간, 최소한 25 시간, 최소한 200 시간, 최소한 375 시간, 또는 최소한 400 시간 동안이다. 일부 구체예들에서, 해당 접촉 단계 동안 또는 복수회의 접촉 단계게 걸쳐 크로마토그래피 매트릭스의 측정가능한 성능저하는 존재하지 않으며 여기서 조성물에 대한 노출은 최소한 5 시간, 최소한 10 시간, 최소한 25 시간, 최소한 200 시간, 최소한 375 시간, 또는 최소한 400 시간 동안이다. 일부 구체예들에서, 크로마토그래피 매트릭스의 성능저하는 매트릭스에 결합하는 단백질 (예컨대, 단백질 A 매트릭스에 결합하는 단클론 항체)의 단백질 품질로 측정된다.
일부 구체예들에서, 단백질성 리간드는 측정가능하게 변성되지 않는다. 변성은 가령, 예컨대, 컬럼 성능, 산물 수율 및/또는 품질, 매트릭스로부터 용출가능한 단백질성 리간드, 단백질성 리간드의 변성, 등을 측정하는 기능적 분석법들을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구체예들에서, 접촉 단계 동안 또는 복수회의 접촉 단계들에 걸쳐 측정가능한 단백질성 리간드, 또는 단백질 A의 용출은 없다. 일부 구체예들에서, 5 시간, 10 시간, 25 시간, 200 시간, 375 시간 또는 400 시간 동안 조성물 (예컨대, 0.5 M 아세트산)에 대한 크로마토그래피 매트릭스의 노출 후 단백질성 리간드, 또는 단백질 A의 통계적으로 유의한 측정가능한 용출은 없다. 용출가능한 단백질 A의 측정은 상기 예시 분석법 중 하나이다. 단백질 A의 변성은 그 입체형태를 변화시킬 수 있으므로, 단백질 A는 크로마토그래피 매트릭스에서 비드 또는 다른 고체상 지지체와 더 이상 상호작용하지 않게 된다. 변성된 단백질 A는 이후 비드 또는 고체 지지체 밖으로 용출되어 액체 상으로 유입할 것이다. 그러므로 용출액 또는 친화성 컬럼의 액체상에서 단백질성 리간드, 또는 단백질 A의 탐지는 측정가능한 변성을 나타낼 수 있다. 단백질 A 이외의 다른 단백질성 리간드의 변성 또한 크로마토그래피 매트릭스로부터 이를 용출시킬 수 있다. 일부 구체예들에서, 단백질 A 및/또는 다른 단백질성 리간드의 용출 측정법에는 ELISA가 포함된다. 예시적인 분석법은 실시예 6 및 도 8, 13 및 18에 기재되어 있다.
실시예
하기 실시예는 상기 설명한 다양한 양상들 및 구체예들을 설명한다. 그러나, 본 명세서에 존재하는 이들 및 다른 실시예들의 이용은 단지 설명을 위한 것이며 본 발명의 또는 예시된 조항의 범위 및 의미를 전혀 제한하는 것이 아니다. 이와 유사하게, 어떠한 청구범위 발명도 본 실시예에 기재된 바람직한 특정 구체예들에 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서를 읽을 때 해당 분야의 숙련된 기술자들은 많은 변형들 및 변화들을 잘 알 수 있으며, 본 명세서에 개시된 양상들 및 구체예들로부터 그 사상 또는 범위에서 벗어나지 않고 이러한 변화들이 이루어질 수 있다. 그러므로 청구범위에 기재된 주제는 이러한 청구범위에 기재된 발명들에 대한 균등한 전체 범위의 발명과 함께 청구범위에 의해서만 제한된다.
실시예 1
아세트산 용액은 단백질 A 컬럼에서 바이오버든을 감소시킨다
충전된 3개의 1 cm MabSelect™Xtra 컬럼들에서 미생물의 감소는 컬럼을 특정 세균으로 스파이크 한 다음 다시 0.5 M 아세트산 용액으로 미생물을 감소시킨 후 바이오버든을 측정함으로써 평가되었다.
먼저, 컬럼을 2 컬럼 부피의 주사용수 (WFI)로 세척하였다. 20 mL 샘플이 수집되었으며 컬럼에서 세균의 양에 대한 음성 대조로 사용되었다.
상기 3개 MabSelect™Xtra 컬럼들 각각에서, 대표적인 미생물을 WFI에 추가함으로써 이러한 미생물이 컬럼에 추가되어 스파이크된 WFI가 형성되었으며, 이 때 미생물은 대략 105 cfu/mL의 역가로 존재한다. 1개의 컬럼은 포자-형성 세균, 특히, 바실루스 슈도퍼무스로 스파이크되었다. 1개의 컬럼은 그람 양성 세균, 특히, 마이크로박테리움 속으로 스파이크되었다. 3번째 컬럼은 그람 음성 세균, 특히, 스테노트로포모나스 말토필리아로 스파이크되었다.
이후 스파이크된 WFI 각각은 각 컬럼에 부하되었다. 다음으로 컬럼들을 14 컬럼 부피의 WFI로 229 cm/시간 세척하고, 이들을 수집하였다. 각 컬럼을 1 시간 동안 보류시킨 다음 스파이크된 WFI로 다시 세정하였다. 각 컬럼으로부터 20 mL 샘플을 양성 대조로 수집하였으며, 샘플내 각 그람 음성 세균, 그람 양성 세균 및 포자-형성 세균의 양을 후속하여 분석하였다.
이후 2 컬럼 부피의 0.5 M 아세트산 미생물 감소 용액을 229 cm/시간으로 각 컬럼에 처리하였다. 각 컬럼을 1 시간 동안 보류시킨 다음 2 컬럼 부피의 WFI로 229 cm/시간으로 세척하였다. 마이크로박테리움 속 및 스테노트로포모나스 말토필리아에 대해, 1.5 컬럼 부피의 WFI로 해당 컬럼을 세척한 다음, 1.5 컬럼 부피의 유출액을 수집하였다. 바실루스 슈도퍼무스에 대해, 2 컬럼 부피의 평형 완충액 (10mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드, pH7.2)으로 해당 컬럼을 세척한 다음, 1.5 컬럼 부피의 유출액을 수집한다.
상기 실험을 반복하였으며, 0.5 M 아세트산 미생물 감소 용액을 컬럼에 처리한 후 해당 컬럼들을 1시간 대신 4시간 동안 보류시켰다.
여과-기반 바이오버든 분석법을 실시하였다. TSA 배지를 가지는 아가 플레이트들을 준비한다.
크로마토그래피 컬럼으로부터 얻은 상기 샘플들 모두를
삼각 시험관에 넣고, 10회 뒤집은 다음, 0.45 마이크론 필터막을 가지는 무균 1회용 필터 깔때기, 또는 0.45 마이크론 필터막을 가지는 Milliflex®필터 깔때기가 장착된 Milliflex®플러스 펌프에 연결된 필터 매니폴드를 통과시켰다. 크로마토그래피 샘플에서 발견되지 않는 추가 세균들이 들어가지 않도록 하기 위해 필터 매니폴드 또는 필터 깔때기 유닛을 취급함에 있어 무균 기술이 사용되었다. 그 후 각각의 막을 TSA 배지로 준비된 아가 플레이트의 상부에 두었다. 이들 플레이트들을 5-7일 동안 30-35 °C에서 배양하였다. 그 후 콜로니 형성 유닛의 수를 계수하고 기록하였다.
100 mL의 무균 PBS를 0.45 마이크론 필터막을 보유한 별도의 필터 매니폴드 또는 필터 깔때기 유닛에 통과시킴으로써 음성 대조 플레이트들을 준비한다. 그 후 각각의 막을 TSA 배지로 준비된 아가 플레이트의 상부에 둔다. 이들 플레이트들을 5-7일 동안 30-35 °C에서 배양하였다. 그 후 콜로니 형성 유닛의 수를 계수하고 log10의 형식으로 나타내었다.
아래 표들은 감소-전 및 감소-후 3가지 세균 유형들 각각에 대한 콜로니 형성 유닛을 보여준다.
바실루스 슈도퍼무스에 대하여, 0.5 M 아세트산 미생물 바이오버든 감소 용액이 해당 컬럼에서 1 시간 동안 보류되었을 때 0.4 log10 감소가 관찰되었다. 0.5 M 아세트산 미생물 바이오버든 감소 용액이 해당 컬럼에서 4 시간 동안 보류되었을 때 3.4 log10 감소가 관찰되었다.
마이크로박테리움 속 세균에 대해, 0.5 M 아세트산 미생물 바이오버든 감소 용액이 해당 컬럼에서 1 시간 동안 보류되었을 때 1.4 log10 감소가 관찰되었으며, 4시간 동안 보류되었을 때 5.6 log10 감소가 관찰되었다.
스테노트로포모나스 말토필라 세균에 대해, 0.5 M 아세트산 미생물 바이오버든 감소 용액이 해당 컬럼에서 1 시간 동안 보류되었을 때 5.5 log10 감소가 관찰되었으며, 4시간 동안 보류되었을 때 6.2 log10 감소가 관찰되었다.
0.5 M 아세트산은 단백질 A 컬럼에서 4시간 동안 보류되었을 때 포자-형성 세균을 비롯한 광범위한 미생물을 제거함에 효과적이다
.
실시예 2
아세트산/에탄올 용액은 단백질 A 컬럼에서 바이오버든을 감소시킨다
상기 실시예 1의 단계들이 수행되었으며, 0.5 M 아세트산 대신, a 용액 of 0.1 M 아세트산 및 20% 에탄올 용액이 사용되었다. 실시예 1에서와 같이, 0.1 M 아세트산 및 20% 에탄올 용액은 한 세트의 실험들에서 1시간 동안 보류되었고 또 다른 세트의 실험들에서 4시간 동안 보류되었다. 아래 결과는 또한 미생물 바이오버든 감소 용액이 1 시간 또는 4 시간 동안 해당 컬럼에서 보류된 이후 세균양의 실질적인 감소를 보여준다.
바실루스 슈도퍼무스에 대하여, 0.1 M 아세트산 및 20% 에탄올 미생물 바이오버든 감소 용액이 해당 컬럼에서 1 시간 동안 보류되었을 때 0.4 log10 감소가 관찰되었다. 0.1 M 아세트산 및 20% 에탄올 미생물 바이오버든 감소 용액이 해당 컬럼에서 4 시간 동안 보류되었을 때 2.5 log10 감소가 관찰되었다.
마이크로박테리움 속 세균에 대해, 0.1 M 아세트산 및 20% 에탄올 미생물 바이오버든 감소 용액이 해당 컬럼에서 1 시간 동안 보류되었을 때 4.5 log10 감소가 관찰되었으며, 4시간 동안 보류되었을 때 5.1 log10 감소가 관찰되었다.
스테노트로포모나스 말토필라 세균에 대해, 0.1 M 아세트산 및 20% 에탄올 미생물 바이오버든 감소 용액이 해당 컬럼에서 1 시간 동안 보류되었을 때 5.3 log10 감소가 관찰되었으며, 4시간 동안 보류되었을 때 5.1 log10 감소가 관찰되었다.
실시예 3
요소 용액은 단백질 A 컬럼에서 바이오버든을 감소시킨다
상기 실시예 1에서의 단계들이 수행되었으며, 0.5 M 아세트산 대신, 8 M 요소 용액 및 8 M 요소/20% 에탄올 용액이 사용되었고 1 시간 보류만이 측정되었다. 아래 표 7의 결과는 미생물 바이오버든 감소 용액이 1 시간 동안 컬럼에서 보류된 이후 세균의 실질적 감소를 보여준다. 포자-형성 B. 슈도퍼무스의 감소는 광범위하고 예기치 않게 나타났으며, 특히 1 시간만 처리한 후 특히 그러했다.
실시예 4
구아니딘 하이드로클로라이드 용액은 단백질 A 컬럼에서 바이오버든을 감소시킨다
상기 실시예 1에서의 단계들이 수행되었으며, 0.5 M 아세트산 대신, 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 용액 및 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드/20% 에탄올 용액이 사용되었고 1 시간 보류만이 측정되었다. 아래 표 8의 결과는 미생물 바이오버든 감소 용액이 1 시간 동안 컬럼에서 보류된 이후 세균의 실질적 감소를 보여준다. 포자-형성 B. 슈도퍼무스의 감소는 광범위하고 예기치 않게 나타났으며, 특히 1 시간만 처리한 후 특히 그러했다.
실시예 5
용액 내 미생물 바이오버든 감소 물질들의 테스트
0.5 M 아세트산을 사용하여 용액 스파이크 연구를 실시하였으며, 이 때 바실루스 슈도퍼무스 및 마이크로박테리움 종의 사멸 정도를 크로마토그래피 매트릭스가 존재하지 않는 용액중에서 측정하였다. 데이터를 도 1에 도시한다. 1 시간 후 바실루스 슈도퍼무스 사멸은 거의 관찰되지 않았던 반면, 마이크로박테리움 종은 일부 사멸하였다. 이들 데이터는 0.5 M 아세트산이 있는 크로마토그래피 매트릭스 상에서 이들 세균의 미생물 바이오버든이 감소하는 이유가 사멸만은 아님을 보여준다. 크로마토그래피 매트릭스와 바실루스 슈도퍼무스 및 마이크로박테리움 종들 사이의 상호작용 방해는 사멸로부터 예상되는 것 보다 바이오버든의 감소를 증가시킨다.
다른 물질들을 사용하여 추가 용액 스파이크 연구들을 실시하였으며, 이 때 바실루스 슈도퍼무스, 마이크로박테리움 종, 및 스테노트로포모나스 말토필리아 의 사멸 정도를 용액에서 측정하였다. 다음 물질들이 추가되었다
: (a) 주사용수 (WFI), (b) 8 M 요소, (c) 8 M 요소 및 20% 에탄올, (d) 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, (e) 20% 에탄올과 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드. PBS에서 스파이크 확인 측정을 실시하였으며, 뿐만 아니라 0분, 30분, 및 60분 시점에서도 측정을 실시하였다. 데이터를 도 2-4에 도시하며, 여기서 파란색 막대는 WFI에 대한 것이고, 노란색 막대는 8 M 요소에 대한 것이고, 회색 막대는
8 M 요소 및 20% 에탄올에 대한 것이고, 빨간색 막대는 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드에 대한 것이고
녹색 막대는
6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 20% 에탄올에 대한 것이다.
바실루스 슈도퍼무스에 있어서,바이오버든 감소는 최소한 다음 용액들을 이용한 미생물과 크로마토그래피 수지 간의 상호작용 방해 그리고 사멸의 조합에 의해 구현된다: 0.5 M 아세트산, 8 M 요소 및 8 M 요소/20% 에탄올, 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드/20% 에탄올.
마이크로박테리움 종에 있어서, 바이오버든 감소는 마이크로박테리움 종을 100% 사멸시킬 수 없는 용액들에 해당하는 8 M 요소와 0.5 M 아세트산에 있어서 상호작용 방해 및 사멸의 조합에 의해 발생할 수 있다. 그러나, 용액 중의 마이크로박테리움을 100% 사멸시키는 것으로 관찰되었던 8 M 요소/20% 에탄올, 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드/20% 에탄올을 이용한 바이오버든 감소에 있어서는 사멸이 가장 큰 이유가 될 수 있다. 스테노트로포모나스 말토필리아와 유사하게, 8 M 요소, 8 M 요소/20% 에탄올은 용액 중의 스테노트로포모나스 말토필리아를 100% 사멸시킬 수 있었다.
요약하면 실시예 1-5는 4-시간 보류의 0.5 M 아세트산, 1-시간 보류의 8 M 요소 및 1-시간 보류의 8 M 요소/20% 에탄올, 1-시간 보류의 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드 및 1-시간 보류의 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드/20% 에탄올은 제조공정에서 충전된 MabSelect™Xtra 컬럼에 대한 효과적인 미생물 바이오버든 감소법인 것으로 밝혀졌음을 보여준다. 실시예 1-5에 기재된 바와 같이, 이들 물질들은 미생물 사멸 그리고 미생물 생물체와 크로마토그래피 수지 간의 상호작용 방해를 조합함으로써, 또는 100% 미생물 생물체를 사멸시킴으로써 효과적이다.
또한, MabSelect™Xtra 수지의 0.5 M 아세트산에 대한 노출은 단백질 A 수지에 대해 최소한의 영향만을 주었다.
실시예 6
친화성 컬럼들은 아세트산에 대한 장기 노출 후 성능을 유지한다
2가지 상이한 크로마토그래피 친화성 수지, MabSelect™Xtra 및 MabSelect™SuRe의 성능 특성들은, 다양한 길이의 시간 동안 0.5 M 아세트산에 이 수지들을 침지시킨 이후 평가되었다. 구체적으로, 1개 분획의 MabSelect™Xtra (mAb A를 포획하기 위해 사용됨)를 0.5 M 아세트산에 375 시간 동안 침지시켰다. 음성 대조로서, 또 다른 분획의 MabSelect™Xtra는 0.5 M 아세트산에 침지시키지 않았다. 5개의 상이한 분획들의 MabSelect™SuRe (mAb B를 포획하기 위해 사용됨)를 0.5 M 아세트산에 각각 5 시간, 10 시간, 25 시간, 200 시간, 또는 400 시간 동안 침지시켰다. 대조로서, 또 다른 분획의 MabSelect™SuRe는 0.5 M 아세트산에 침지시키지 않았다.
그 후 성능을 평가하기 위하여 상기 분획들 각각에 대해 5번의 서로 다른 실험들을 수행하였다. 상기 크로마토그래피 친화성 수지들 각각에서 정제 후 mAb 순도를 평가하기 위해 크기 배제 크로마토그래피 (SE-HPLC 및 SE-UPLC)를 실시하였다.
2번의 서로 다른 모세관 전기영동 실험들을 실시하였다. mAb A에 대해 CE- SDS를 수행하였으며 mAb B에 대해 PICO 마이크로칩 CE-전기영동 (PICO MCE- SDS)을 수행하였다. 단클론 항체의 경쇄 및 중쇄에 대한 분자량 분포 및 상대 흡광도를 측정하기 위해 SDS- 함유 겔-충전 모세관에서 모세관 전기영동(CE-SDS)을 수행하였다. 이들 단백질들은 크기 및 전기영동 이동성을 기준으로 분리되었다. 총 경쇄 및 중쇄의 상대 흡광도 측정을 환원 및 비환원 조건하에서 수행하였다. Bare Fused Silica Capillary (모세관 길이 57 cm, 유효 길이 50 cm)를 보유한 IgG 순도 분석 키트 (Beckman Coulter, A10663)를 사용하여 CE-SDS를 실시하였다. Protein Express LabChip, LabChip®GXII, 또는 LabChip®GXII Touch HT (Perkin Elmer, 760499 또는 760528)를 사용하여 PICO MCE-SDS를 실시하였다. 상대 이동 시간을 측정하기 위하여 내부 표준을 사용하였다.
단백질-A 함유 매트릭스에 대한 아세트산의 효과를 분석하기 위하여, MabSelect™Xtra 및 MabSelect™SuRe 컬럼들로부터의 용출액에 대해 고 출력 ELISA로 잔부 단백질 A 분석을 실시하고 정량하였다.
단클론 항체 샘플에서 상보성 결정 영역 2 (CDR2)의 양을 정량하기 위하여 전체-컬럼을 영상화한 모세관 등전 초점조절(iCIEF)을 실시하였다 . 관찰된 각각의 샘플-유래 등전점 (pi) 분포 피크들 아래의 면적을 적분하고 observed and calculating the percentage attributable to CDR2에 귀속되는 백분율을 계산함으로써 각 전기영동도에서 CDR2의 상대 흡광도를 계산하였다. 기록된 iCIEF 영역 2는 중성 화학종의 주요 피크로서 내부 참고 표준에서 가장 큰 단백질 피크에 해당한다.
상기 분석들 각각의 결과들을 아래 표 10에서 보여준다
.
상기 표의 데이터를 각각 도 5 내지 9에서 보여준다. 이들 도면들을 육안으로 관찰하면 0.5 M 아세트산에 노출된 시간의 길이와 성능 특성간의 음성 상관관계가 전혀 없음을 보여준다.
각 수지 조건에 대해 3번의 크로마토그래피 실험을 사용하여 0.5 M 아세트산에 대한 장기 노출 전과 후 수지들 간의 산물 품질 데이터에 관한 분산 분석 (ANOVA)을 실시하고 통계적으로 유의한 차이를 평가하였다. 도 10 내지 14는 MabSelect Xtra 정제 후 생성된 mAb A 풀에 대한 단백질 품질을 보여준다.
도 15 내지 19는 MabSelectSuRe 정제 후 생성된 mAb B 풀의 단백질 품질을 보여준다. 단백질 품질의 ANOVA 분석은 mAb B MabSelect SuRe 풀의 SE-UPLC 퍼센트 순도에서 외에는 통계적으로 유의하지 않음을 보여준다 (p < 0.05). 그러나, 산처리-후 풀 순도는 산처리-전 풀 순도보다 더 높다. 그러므로, 0.5 M 아세트산에 장기 노출된 MabSelect SuRe을 이용한 정제 후 mAb B 풀에 대해서는 부정적인 효과가 없다.
***
청구범위에 기재된 발명은 본 명세서에 기재된 특정 구체예들에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 전술한 기재내용으로부터 해당 분야의 숙련된 기술자들은 본 명세서에 기재된 변형들 이외에도 청구범위에 기재된 발명에 대한 다양한 변형들을 잘 이해할 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 청구범위에 속하는 것으로 간주된다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허, 특허출원, 간행물, 테스트방법, 문헌 및 기타 자료들은 마치 본 명세서에 물리적으로 기재된 것과 같이 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
Claims (35)
- 크로마토그래피 매트릭스를 약 0.1 M 내지 약 0.5 M 아세트산을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법으로서, 상기 접촉 단계는 약 1 시간 내지 약 4 시간 동안 실시되는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 접촉 단계는 최소한 약 4 시간 동안 실시됨을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1 M 아세트산을 포함하고 접촉 단계는 최소한 약 4 시간 동안 실시됨을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 약 0.5 M 아세트산을 포함하고 접촉 단계는 최소한 약 4 시간 동안 실시됨을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 알콜을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 5에 있어서, 알콜은 에탄올 또는 벤질 알콜임을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 조성물은 약 20% 에탄올을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 6에 있어서, 상기 조성물은 약 1% 내지 약 2% 벤질 알콜을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 크로마토그래피 매트릭스를 약 0.1 M 내지 약 1.0 M의 아세트산을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법으로서, 이 때 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 최소한 3 log10만큼의 포자 형성 세균의 양 감소, 최소한 5 log10 만큼 그람 양성 세균의 양 감소, 그리고 최소한 5 log10 만큼 그람 음성 세균의 양 감소 중 하나 이상을 생성하는 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 조성물은 알콜을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 10에 있어서, 알콜은 에탄올 또는 벤질 알콜임을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 조성물은 약 20% 에탄올을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 조성물은 약 1% 내지 약 2% 벤질 알콜을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 9에 있어서, 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 포자 형성 세균, 그람 양성 세균, 및 그람 음성 세균 중 하나 이상의 양을, (1) 생물여과 분석, (2) 현미경 세균 염색, (3) IR/FTIR 분광법, (4) 무균 테스트, 및 (5) 세균 동정 테스트로 구성된 그룹에서 선택된 분석법으로 측정한 탐지 한도 미만으로 감소시킴을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 14에 있어서, 포자 형성 세균은 바실루스 슈도퍼무스이고, 그람 양성 세균은 마이크로박테리움 속이고, 그람 음성 세균은 스테노트로포모나스 말토필리아임을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1 또는 9에 있어서, 상기 조성물은 아세테이트 염을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1-16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 2 내지 약 3의 pH를 가짐을 특징으로 하는 방법.
- 크로마토그래피 매트릭스를 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 요소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법으로서, 이 때 접촉 단계는 최소한 약 30분 동안 실시되는 방법.
- 청구항 18에 있어서, 접촉 단계는 최소한 약 1 시간 동안 실시됨을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 18 또는 청구항 19에 있어서, 상기 조성물은 약 8 M 요소를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 18-20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 알콜을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 21에 있어서, 알콜은 에탄올 또는 벤질 알콜임을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22에 있어서, 상기 조성물은 약 20% 에탄올을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 22에 있어서, 상기 조성물은 약 1% 내지 약 2% 벤질 알콜을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 크로마토그래피 매트릭스를 약 4.0 M 내지 약 12.0 M의 요소를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 크로마토그래피 매트릭스의 미생물 바이오버든 감소 방법으로서, 이 때 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 최소한 2 log10만큼의 포자 형성 세균의 양 감소, 최소한 5 log10 만큼 그람 양성 세균의 양 감소, 그리고 최소한 5 log10 만큼 그람 음성 세균의 양 감소 중 하나 이상을 생성하는 방법.
- 청구항 25에 있어서, 상기 조성물은 알콜을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 26에 있어서, 알콜은 에탄올 또는 벤질 알콜임을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27에 있어서, 상기 조성물은 약 20% 에탄올을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 27에 있어서, 상기 조성물은 약 1% 내지 약 2% 벤질 알콜을 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 25에 있어서, 접촉 단계는 크로마토그래피 매트릭스에서 포자 형성 세균, 그람 양성 세균, 및 그람 음성 세균 중 하나 이상의 양을, (1) 생물여과 분석, (2) 현미경 세균 염색, (3) IR/FTIR 분광법, (4) 무균 테스트, 및 (5) 세균 동정 테스트로 구성된 그룹에서 선택된 분석법으로 측정한 탐지 한도 미만으로 감소시킴을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 30에 있어서, 포자 형성 세균은 바실루스 슈도퍼무스이고, 그람 양성 세균은 마이크로박테리움 속이고, 그람 음성 세균은 스테노트로포모나스 말토필리아임을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1-31 중 어느 한 항에 있어서, 접촉 단계는 15°C 내지 30°C의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 32에 있어서, 접촉 단계는 20°C 내지 25°C의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 크로마토그래피 매트릭스는 MabSelectTM, MabSelectTM Xtra, MabSelectTM SuRe, MabSelectTM SuRe pcc, MabSelectTM SuRe LX, MabCaptureTM A, nProtein A Sepharose 4 Fast Flow, Protein A Sepharose 4 Fast Flow, Protein A Mag Sepharose, Protein A Sepharose CL-4B, rmp Protein A Sepharose Fast Flow, rProtein A Sepharose 4 Fast Flow, CaptoTM L, ProSepTM-A, ProSep Ultra Plus, AbsoluteTM , CaptivATM PriMabTM, Protein A Diamond, EshmunoTM A, Toy opearlTM AF-rProtein A, AmsphereTM Protein A, KanCapATM, Protein G Mag Sepharose Xtra, 및 Protein G Sepharose 4 Fast Flow로 구성된 그룹에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 다음 단계를 포함하는, 정제를 위한 제약학적 물질을 포함하는 조성물을 처리하기 이전에 미생물 부하를 감소시키는 방법:
크로마토그래피 매트릭스를 제공하는 단계;
청구항 1의 방법을 실시하는 단계; 및
상기 크로마토그래피 매트릭스에 상기 제약학적 물질을 포함하는 조성물을 처리하는 단계.
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