KR20150118120A - 단백질 제제들로부터 엔도톡신들을 제거하기 위한 물질들 및 방법들 - Google Patents

Abstract

방법은, (i) 알란토인을 과포화되는 양으로 원하는 단백질 및 오염물로 적어도 하나의 엔도톡신을 포함하는 단백질 제제에 첨가하는 단계를 구비하고, (ii) 상기 첨가하는 단계 후에 칼럼 내의 전기양성 입자들의 충전된 입자 베드에 보이드 배제 크로마토그래피에 의한 추가 정제를 위한 샘플을 제공하도록 고체들을 제거하는 단계를 구비하며, 상기 충전된 입자 베드는 입자간 부피를 가지고, (iii) 샘플 부피를 상기 충전된 입자 베드에 적용시키는 단계를 구비하며, 상기 전기양성 입자들은 보이드 배제 크로마토그래피를 지지하고, 상기 샘플 부피는 상기 입자간 부피보다 크지 않으며, (iv) 상기 원하는 단백질 및 감소된 양의 엔도톡신을 포함하는 정제된 샘플을 용리시키는 단계를 구비한다. 상기 방법은 상기 알란토인 처리만으로 또는 상기 보이드 배제 크로마토그래피만으로 선택적으로 수행된다.

Description

단백질 제제들로부터 엔도톡신들을 제거하기 위한 물질들 및 방법들{MATERIALS AND METHODS FOR REMOVING ENDOTOXINS FROM PROTEIN PREPARATIONS}

여기에 개시되는 실시예들은 정제되지 않은, 부분적으로 정제된 및 고도로 정제된 제제들을 포함하는 단백질 제제들 내의 엔도톡신 레벨들을 감소시키기 위한 방법들에 관한 것이다.

본 출원은 2013년 2월 22일에 출원되었고, 전체적인 내용이 여기에 참조로 포함되는 미국 임시 특허 출원 제61/768,232호를 우선권으로 수반하는 출원이다.

엔도톡신들은 그람음성균(gram negative bacteria)의 세포벽들로부터 유래되는 지질다당류들(lipopolysaccharides)이다. 이들은 생물학적 제제들의 흔한 오염물들이며, 이들은 조사 결과들을 혼란시킬 수 있고, 진단 분석들에서 잘못된 결과들을 가져올 수 있으며, 의도된 치료제들이 안전하지 않게 시용되게 할 수 있는 광범위의 세포독소들(cytotoxins)이기 때문에 심각한 문제를 야기한다. 이는 이들이 체류하는 상기 생물학적 제제들로부터 이들의 제거를 위해 효과적인 물질들과 방법들을 가지는 것을 중요하게 만든다. 많은 이러한 물질들 및 방법들이 개발되었다. 알려진 예들은 많은 경우들에서 상기 엔도톡신이 샘플 내의 원하는 단백질보다 강하게 결합하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 제제의 처리를 포함한다(Chen, R. 등의 "Protein Expression and Purification"(2009, 64, 76-81)). 다른 알려진 예들은, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피(Gagnon, P. 등의 "BioProcess International"(2006, 4, 50-60)), 고정화 금속 친화 크로마토그래피(Tan, L. 등의 "Journal of Chromatography A"(2007, 1141, 226-234)), 고정된 히스티딘(histidine) 또는 폴리믹신(polymixin) B로의 친화 크로마토그래피(Anspach, F. 등의 "Journal of Chromatography A"(1995, 711, 81-92)), 리뮐루스 변형세포들(Limulus amoebocytes)로부터 재조합적으로 유도되는 고정된 엔도톡신-결합 펩티드로의 고정 폴리믹신 B 친화 크로마토그래피를 갖는 친화 크로마토그래피(Ding, J. 등의 "Journal of Chromatography B"(2001, 759, 237-246)), 계면활성제 트리톤(Triton) X-113으로의 차등적 추출(Cotten, M. 등의 "Gene Therapy"(1994, 1, 239-246)), 그리고 수많은 등록 상표의 상업적 제품들과 방법들(Kang, Y. 등의 "Process Biochemistry"(2000, 36, 85-92)); Salema, V. 등의 "Pharmaceutical Technology Europe"(2009, 21, 36-41)); Clutterbuck, A. 등의 "Biopharm International"(2007, 20, 24-31))을 포함한다. 이들 방법들 모두는 강한 소수성 상호작용들, 금속 친화 상호작용들 및/또는 양성으로 대전된 표면들과의 강한 정전기 상호작용들로 함께 침전되는 상기 엔도톡신들의 지질-A 및 중심 다당류 부위들의 성질들을 활용한다. 보이드 배제 음이온 교환(void exclusion anion exchange)으로 호칭되는 기술은 IgG 정제를 위해 기재되었고, 또한 엔도톡신 함량을 감소시키며(Nian, R. 등의 "J. Chromatography A"(1282 (2013) 127-132)), 특정 크로마토그래피 조건들까지의 이들의 이전의 평형에 대한 요구 없이 샘플들을 수용하고 엔도톡신 제거와 함께 완충제 교환을 구현하는 그 능력으로 인하여 많은 이전에 알려진 방법들보다 넓은 활용도를 구현한다. 단백질 제제들로부터 엔도톡신을 제거하기 위해 과포화된 알란토인(allantoin)을 채용하는 기술이 넓은 범위들의 pH, 넓은 범위들의 염 농도 그리고 계면활성제들을 포함하여 유기 첨가제들의 존재를 포함하는 넓은 범위들의 화학적 조건들을 견디는 특징을 가지는 것으로 기재되었다(Vagenende, V. 등의 "CS. Appl. Mater. Interfaces 5"(2013, 4472-4478)); Vagenende, V. 등의 "J. Chromatography A"(1310, 2013 127-132)).

본 발명은 단백질 제제들로부터 엔도톡신들을 제거하기 위한 물질들 및 방법들을 제공한다.

일부 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은, (i) 알란토인(allantoin)을 과포화되는 양으로 원하는 단백질 및 오염물로 적어도 하나의 엔도톡신(endotoxin)을 포함하는 단백질 제제(protein preparation)에 첨가하는 단계를 구비하고, (ii) 상기 첨가하는 단계 후에, 칼럼 내의 전기양성(electropositive) 입자들의 충전된 입자 베드(bed)에 보이드 배제 크로마토그래피(void exclusion chromatography)에 의한 추가 정제를 위한 샘플을 제공하도록 고체들을 제거하는 단계를 구비하며, 상기 충전된 입자 베드는 입자간 부피를 가지고, (iii) 샘플 부피를 상기 충전된 입자 베드에 적용시키는 단계를 구비하며, 상기 전기양성 입자들은 보이드 배제 크로마토그래피를 지지하고, 상기 샘플 부피는 상기 입자간 부피보다 크지 않으며, (iv) 상기 원하는 단백질 및 감소된 양의 엔도톡신을 포함하는 정제된 샘플을 용리시키는 단계를 구비하며, 상기 원하는 단백질이 칼럼에 적용되는 완충제 함량들에 관계없이 상기 칼럼에 평형화되는 상기 완충제 내에 잔류하는 방법들에 관련된다.

다른 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은, (i) 알란토인을 과포화되는 양으로 원하는 단백질 및 오염물로 적어도 하나의 엔도톡신을 포함하는 단백질 제제에 첨가하는 단계, (ii) 상기 첨가하는 단계 후에 상기 원하는 단백질 및 감소된 양의 엔도톡신을 포함하는 샘플을 제공하도록 고체들을 제거하는 단계를 포함하는 방법들에 관련된다.

또 다른 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은, (i) 샘플 부피를 갖는 샘플로서 원하는 단백질을 포함하는 단백질 제제를 제공하는 단계를 구비하고, 상기 샘플은 칼럼 내의 전기양성 입자들의 충전된 입자 베드에 대한 보이드 배제 크로마토그래피를 위해 적합할 수 있으며, 상기 전기양성 입자들은 보이드 배제 크로마토그래피를 지지하고, 상기 충전된 입자 베드는 입자간 부피를 가지며, 상기 샘플 부피는 상기 입자간 부피보다 크지 않고; (ii) 상기 샘플을 상기 충전된 입자 베드에 적용시키는 단계를 구비하며, (iii) 상기 원하는 단백질 및 감소된 양의 엔도톡신을 포함하는 정제된 샘플을 용리시키는 단계를 구비하는 방법들과 관련된다.

보이드 배제 모드에서 충전된 전기양성(electropositive) 입자들에 크로마토그래피가 후속되는 과포화되는(supersaturating) 농도에서 알란토인(allantoin)으로 원하는 단백질을 포함하는 엔도톡신(endotoxin)-오염된 단백질 제제(protein preparation)의 배양을 포함하는 두 단계 처리가 종래의 처리들보다 다목적이고 효과적인 엔도톡신 감소를 제공하는 점이 발견되었다. 알려진 방법들과 대조적으로, 수소 결합이 분명한 것으로서 불용성 알란토인은 엔도톡신과 공침한다. 이론에 구속되지 않고, 알란토인과 수소 결합들을 형성하는 엔도톡신들의 부분들은 O-항원, 중심 다당류(core polysaccharide), 지질 A 부분으로 알려진 부분들을 포함할 수 있다. 수소 결합에 의존성으로 인하여, 엔도톡신에 대한 알란토인의 친화도가 pH, 염 농도 또는 유기 용제들의 존재에서의 넓은 변화들에 의해 상당한 영향을 받지 않는 점이 나타났다. 상기 보이드 배제 음이온 교환 단계는 상기 엔도톡신의 중심 다당류 및 지질-A 영역들을 결합시킬 수 있다. 알란토인 친화 및 보이드 배제 단계의 결합은 이에 따라 상기 엔도톡신 분자의 모든 영역들을 잠재적으로 표적으로 하며, 상기 이중 처리 시스템의 높은 엔도톡신 제거 효율을 설명할 수 있을 것이다. 상기 방법들의 결합은 또한 감소된 엔도톡신 샘플의 적용을 방해할 수 있는 처리된 샘플이 불용성의 잔류하는 알란토인을 함유하고 염들(salts)과 유기 첨가제들을 포함하는 다른 성분들을 함유할 수 있는 점인 알란토인에 의한 엔도톡신 제거의 잠재적인 단점들을 극복한다. 상기 보이드 배제 단계가 완충제 교환의 동시적 기능을 유지하고, 그 효능이 상기 pH, 전도도 또는 이에 적용되는 상기 단백질 제제의 다른 성질들에 의해 영향을 받지 않기 때문에, 고체들의 제거가 후속하는 상기 알란토인 처리된 샘플은 이가 칼럼이 평형화되었던 완충제 내에 용리되는 상기 보이드 배제 칼럼에 편리하게 직접적으로 적용될 수 있으며, 완충제는 엔도톡신이 제거된 단백질의 의도된 응용들의 요구 사항들과 부합되도록 조제될 수 있다. 많은 경우들에 있어서, 상기 보이드 배제 단계는 상기 원하는 단백질의 높은 정도의 정제를 구현하는 추가적인 이점을 제공한다. 그러나, 상기 보이드 배제 단계의 주요한 역할은 알란토인에 의해 구현되는 상기 엔도톡신 감소 인자를 증가시키는 것에 있다. 일부 경우들에 있어서, 알란토인은 보이드 배제보다 효과적으로 엔도톡신을 제거하며, 일부 경우들에서 이러한 패턴이 반전되지만, 모든 경우들에서 상기 결합이 전술한 다른 이점들 이외에도 단독인 경우보다 더 제거하는 점이 나타났다.

따라서, 일부 실시예들에서, (i) 과포화되는 양으로 알란토인을 원하는 단백질 및 오염물(contaminant)로 적어도 하나의 엔도톡신을 포함하는 단백질 제제에 첨가하는 단계, (ii) 상기 첨가하는 단계 후에 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피(void exclusion anion exchange chromatography)에 의한 추가 정제를 위해 샘플을 제공하도록 고체들을 제거하는 단계, (iii) 전기양성 매체들이 보이드 배제 크로마토그래피를 지지하고, 샘플 부피가 충전된 입자 베드(packed particle bed)의 입자간 부피보다 크지 않은 상기 샘플 부피를 상기 전기양성 입자들의 충전된 베드에 적용시키는 단계, 그리고 (iv) 상기 원하는 단백질 및 감소된 양의 엔도톡신을 포함하는 정제된 샘플을 용리시키는 단계를 구비하는 방법이 제공된다. 보이드 배제 크로마토그래피가 후속되는 알란토인을 적용하는 이러한 2상(two phase) 공정은 약 99% 이상으로, 다른 실시예들에서, 약 99.5% 이상으로, 다른 실시예들에서, 약 99.99% 이상으로 엔도톡신들의 제거로 상기 원하는 단백질을 제공할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 검출의 한계까지 엔도톡신 불순물들이 관찰되지 않는 상기 원하는 단백질을 제공할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 알란토인의 과포화되는 양은, (i) 약 10%, (ii) 약 5%, (ii) 약 0.6%부터 약 6%까지, (iii) 약 6%부터 약 10%까지, (iv) 약 10%부터 약 15%까지, (v) 약 15%부터 약 20%까지, 그리고 (vi) 20% 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양을 포함하며, 여기서 상기 양은 무게/부피로서 제공된다. 해당 기술 분야의 숙련자는 각각의 언급된 양들과 범위들이 모두 알란토인의 과포화되는 양을 구성하는 점을 인지할 수 있을 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 과포화된 양은 용해되지 않은 알란토인의 양을 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 고체들을 제거하는 단계는 원심 분리, 여과 및 이들의 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 포함한다. 고체들을 제거하기 위한 이들 및 다른 방법들은 해당 기술 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있다. 여과는 진공, 또는 중력, 또는 상기 요구되는 부피의 샘플들을 처리하도록 요구되는 임의의 규모의 펌프-강제 여과를 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제의 pH 또는 염 농도는 상기 첨가하는 단계 이전에, 동안에 또는 이후에 조절될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제의 pH 또는 염 농도는 상기 첨가하는 단계 이전에 조절될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적용된 샘플 부피는 상기 충전된 입자 베드의 입자 부피를 초과하지 않는다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플 부피는, (i) 약 40% 이하, (ii) 약 35% of 상기 베드 부피의 약 35% 이하, (iii) 상기 베드 부피의 약 30% 이하, (iv) 상기 베드 부피의 약 20% 이하, (v) 상기 베드 부피의 약 10% 이하, (vi) 상기 베드 부피의 약 5% 이하, (vii) 상기 베드 부피의 약 2% 이하, 그리고 (viii) 상기 베드 부피의 약 1% 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 포함하는 양만큼 상기 충전된 입자 베드의 입자간 부피보다 작다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플 부피는 상기 베드 부피의 약 40% 이하일 수 있다. 특정한 실시예들에 있어서, 이들이 반복마다 가장 큰 용적(volumetric capacity)을 지지하기 때문에 보이드 배제 크로마토그래피를 위한 적절한 범위 내에 여전히 유지하면서 가장 큰 가능한 샘플 부피를 적용시키는 것이 유익할 수 있다. 다른 특정한 실시예들에 있어서, 상기 베드 부피의 약 35%의 샘플 부피를 적용하는 것이 유리할 수 있다. 보다 큰 샘플이 유용할 수 있지만, 약 35%의 부피가 이론적인 한계에 보다 가까운 동작에 비해 작동 에러들을 위한 안전의 실질적인 마진을 제공할 수 있으며, 여기서 이러한 에러들은 상기 방법들이 그 가장 큰 이점들을 구현하는 것을 방해할 수 있다. 이러한 이유로, 일부 실시예들에서, 키트(kit)가 제공되며, 그 작동 명령들은 상기 베드 부피의 약 35%의 샘플 부피들을 유리하게 언급할 수 있으며, 이에 따라 가능한 작동 에러들에 대해 완충제를 제공한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적용시키는 단계 이전에, 상기 방법은 음이온 교환 매체들의 충전된 입자 베드를 상기 원하는 단백질이 상기 음이온 교환 매체들에 실질적으로 결합되는 것을 방지하도록 선택되는 완충제로 평형화시키는 단계를 더 포함한다. 일부 이러한 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질이 상기 전기양성 매체들에 실질적으로 결합하는 것을 방지하는 단계는 충분히 낮은 pH로 상기 완충제를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 이러한 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질이 상기 전기양성 매체들에 실질적으로 결합하는 것을 방지하는 단계는 충분히 높은 염 농도로 상기 완충제를 제공하는 단계를 포함한다.

따라서, 일부 실시예들에서, 상기 완충제는, (i) 약 7, (ii) 약 8, (iii) 약 6, 그리고 (iv) 약 6부터 약 8까지의 범위로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 pH를 가질 수 있다. 해당 기슬 분야의 숙련자는 상기 작동이 보다 높거나, 보다 낮거나, 임의의 중간 값이 될 수 있고, 정확한 조건들이 경우마다 특정한 원하는 단백질을 위한 통상적인 최적화를 통하는 것에 기초하여 결정될 수 있을 것인 점을 인지할 것이다. 따라서, 여기서 주어지는 값들은 통상적인 원하는 단백질들을 위한 예비 작동 조건들에 대한 초기 가이드라인만을 나타낸다. 예를 들면, 특정한 실시예들에서, 상기 pH는 9, 10, 11, 12 등과 같은 보다 높은 값들을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 특정 실시예들에서, 상기 pH는 5, 4, 3 등과 같은 보다 낮은 값들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 염 농도는 pH의 적정한 범위에 영향을 미칠 수 있고, 그 반대는 상기 염 농도의 적절한 범위에 영향을 미칠 수 있는 것을 유지할 수 있다.

일부 실시예들에서, 상기 완충제는, (i) 약 0mM, (ii) 약 50mM, (iii) 약 150mM, 그리고 (iv) 약 0mM부터 약 150mM까지의 범위로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 염화나트륨(sodium chloride) 농도를 포함한다. 다시, 해당 기술 분야의 숙련자는 보다 높거나 중간의 농도가 정제되는 상기 특정한 원하는 단백질의 성질들에 따라 원하는 결과를 구현할 수 있는 점을 인식할 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 0mM의 염화나트륨, 즉 염화나트륨의 부존재가 충분할 수 있으며, 일부 실시예들에서, 특정한 원하는 단백질을 위해 최적일 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질을 결합시키는 것을 방지하도록 먼저 조제되는 평형 완충제의 조성은 엔도톡신을 감소시키는 전체로서 상기 개시된 방법들의 능력을 최대화하기 위해 엔도톡신 결합의 가장 높은 정도를 선호하도록 더 조제될 수 있다. 일부 이러한 실시예들에 있어서, 일반적인 문제로서, 상기 보이드 배제 평형 조건들은 일반적으로 상기 원하는 단백질이 상기 크로마토그래피 매체들에 결합되지 않게 하고 상기 원하는 단백질을 손상시키지 않는 가장 높은 pH 및 가장 낮은 전도도의 일부 결합을 구현할 것이다. 하나의 IgG 단일클론 항체(monoclonal antibody)로의 실험 데이터는, 예를 들면, 50mM의 트리스(Tris), pH 8.2로 구성되는 완충제 조제로 가장 우수한 엔도톡신 감소를 보여주었다. 일반적인 문제로서, 상기 보이드 배제 단계를 위한 유효한 완충제 조제를 개발함에서 특성들은 상기 원하는 단백질의 결합을 야기하지 않는 조건들을 결정하고, 가장 높은 pH 및 가장 낮은 전도도의 결합을 결정하며, 상기 엔도톡신-결핍된 처리된 샘플의 의도된 응용을 수행하기 위해 가장 적합한 조건들을 결정하는 것이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 보이드 배제 크로마토그래피 모드에 채용되는 전기양성 크로마토그래피 매체들은 우노스피어(UNOsphere) Q, 누비아(Nuvia) Q, 캅토(Capto) Q, 캅토 애드히어(Capto adhere), 그리고 상기 방법을 수행하기 위해 적합한 다른 전기양성 입자 기반의 매체들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 전기양성 기들(groups)을 가지는 임의의 음이온 교환 매체들이 기능할 수 있지만, 그러나, 해당 기술 분야의 숙련자라면 모든 전기양성 매체들이 동등하게 적합하지는 않은 점을 인식할 것이다. 성공적인 매체를 정의하는 정확한 변수들이 완전히 설명되지는 않았지만, 해당 기술 분야의 숙련자는 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 그 능력을 위해 임의의 특정한 전기양성 매체들을 쉽게 선별할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 이는 간단한 실험으로 구현될 수 있고, 여기서 후보음이온 교환(또는 전기양성) 입자들이, 예를 들면 약 20mL의 부피로 칼럼 내에 충전된다. 상기 입자들은 중력에 의해 이상적으로 안정되며, 이후에 흐름 어댑터(flow adaptor)가 상기 베드에 접촉되지만 크게 압축시키지 않도록 설정된다. 상기 기술은 상기 베드들이 압축되었지만, 압축이 상기 칼럼의 샘플 용적을 감소시키는 직접적인 결과로 상기 입자간 공간을 감소시키는 칼럼들에 대해 수행될 수 있다. 예를 들면, 20mL의 중력-안정된 베드는 약 8mL와 같이 높은 샘플 용적을 가질 수 있지만, 15mL의 부피까지의 상기 베드의 25%의 압축은 중력-안정된 베드 내의 15mL의 동일한 매체들의 용량 보다 낮은 레벨 까지 용량을 감소시킬 것이다. 따라서, 압축은 상기 입자 부피에 대향하여 상기 입자간 부피를 불균형적으로 감소시키는 것으로 여겨진다. 상기 칼럼이 체류하는 상기 크로마토그래피 시스템은 또한 보이드 배제 크로마토그래피의 성공적인 수행에 중요하며, 상기 기술이 상기 칼럼의 입자간 부피보다 크지 않은 상기 샘플로 들어가는 상기 샘플의 부피에 의존하기 때문에 중도에 상기 샘플의 상당한 희석을 야기하지 않는 방식으로 샘플을 상기 칼럼에 전달하도록 이상적으로 구성된다. 층류(laminar flow)는 경계들에서 샘플들을 희석시키는 것으로 잘 알려져 있다. 몇 미터의 길이를 갖는 5mL의 샘플 루프(sample loop)의 예에 있어서, 상기 칼럼으로 들어가면서 상기 샘플의 부피는 상기 루프 내로 초기에 도입되는 5mL보다 실질적으로 클 수 있으며, 예를 들면 7.5mL 혹은 심지어 10mL 또는 그 이상도 가능하다. 이른바 슈퍼루프(superloop)를 갖는 시스템들은 층류를 통한 과도한 희석의 부담 없이 이들이 큰 샘플 부피들의 적용을 허용하는 실린더-플런저(cylinder-plunger) 설계에 대한 이들의 의존성의 도움으로 인하여 상기 방법들을 수행하기 위해 매우 적합하다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 임의의 주어진 크로마토그래피 시스템 또한 다양한 밸브들과 믹서들을 통과하는 흐름의 결과로서 샘플을 도입하는 장치(인젝터(injector))와 상기 칼럼 사이에 특정한 양의 샘플 희석을 부과하는 점과, 일반적인 문제로서, 특정 시스템의 내부 예비-칼럼 희석(pre-column dilution) 부피에 대한 상기 칼럼 부피의 비율이 보다 커질수록 시스템 희석의 기능으로서 칼럼에서 샘플 부피의 상대적인 증가를 보다 낮추는 점이 이해될 것이다. 실제적인 조건에 있어서, 이는 대규모 사용을 위해 설계되고 구성된 크로마토그래프 상에서 작은 칼럼을 작동시키는 것이, 이와 같은 시스템 상에 큰 칼럼을 동작시키는 것은 사용자가 상기 샘플들이 상기 칼럼으로 들어가는 지점에서 주어진 칼럼의 부피 한계들 내에 남는 상기 샘플들의 보다 큰 부피를 적용할 수 있게 하면서, 상기 인젝터에 적용될 수 있는 상기 샘플의 부피에 대한 이차적인 제한들을 부여할 것임을 의미한다. IgG 단일클론 항체를 함유하는 샘플로 미리 적재되었던 슈퍼루프를 구비하는, 다크 그린 피크 튜빙(dark green peek tubing)을 이용하여 AKTA 익스플로어(Explorer) 100과 같은 시스템 상의 20mL의 중력 충전된 압축되지 않은 칼럼으로서 및 50mM의 트리스(Tris)로 평형화된 상기 칼럼으로서, 50mM의 NaCl, pH 8.0, 1mL의 샘플이 상기 칼럼 상에 적재된다. 차트 마크(chart mark)는 상기 항체가 상기 칼럼으로부터 나오기 시작하는 지점에 만들어진다. 다른 차트 마크는 상기 샘플과 관련된 작은 분자들의 통로를 나타내는 상기 전도도가 변화되는 지점에서 만들어진다. 상기 마크들 사이의 부피는 상기 칼럼의 입자간 부피의 사용 가능한 추정을 제공한다. 전체 칼럼 부피에 대한 상기 입자간 부피의 비율이 계산된다. 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피의 기술을 수행하기 위해 적합한 음이온 교환 크로마토그래피 매체들은 약 1/2.5의 비율을 나타낼 것이지만, 1/2.4, 1/2.3, 1/2.2, 1/2.1, 1/2.0 또는 그 이하와 같은 보다 낮은 비율들을 나타내는 매체들은 상기 칼럼으로 들어가는 샘플의 부피가 위의 결과들에 따라 조절되는 조절된 부피를 초과하지 않는 한 유용한 결과들을 제공할 수 있다.

현재까지의 평가들은 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위해 적합한 매체들로서 특히 우노스피어(UNOsphere) Q, 누비아(Nuvia) Q, 캅토(Capto) Q 및 캅토 애드히어(Capto adhere)를 발견하였다. IgG 단일클론 항체로 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피를 위한 주어진 음이온 교환 매체의 적합성을 결정하기 위하여 여기에 제시되는 조건들이 필연적으로 가장 효과적인 엔도톡신 제거를 구현하는 조건들이나, 필연적으로 다른 단백질 종들에 대해 가장 적합한 조건들은 아니라는 점이 이해되어야 할 것이다. 이른바 다중모드 크로마토그래피를 위해 이들을 시판되게 하는 추가적인 화학적 작용성들을 구비하는 전지양성 매체들이 주어진 매체가 보이드 배제 모드에서 흡수 크로마토그래피(adsorption chromatography)를 수행하기 위해 적합한 지를 결정하도록 다른 완충제 조건들의 평가를 수반하는 공정 발전의 추가적인 차원을 요구할 것인 점도 더 이해되어야 할 것이다. 하나의 예는 캅토 애드히어(Capto adhere)의 상품명으로 시판되는 이른바 혼합-모드 또는 다중모드 전기양성 크로마토그래피 매체를 포함하며, 이는 수소 결합들 및 소수성 상호작용들에 이를 참여하게 하는 작용기들(functional groups)을 포함하는 것으로 알려져 있다. 음이온 교환체로 시판되는 일부 제품들이 8.0의 pH에서 염화나트륨과 같은 염의 부존재에서 IgG 단일클론 항체들의 보이드 배제를 지지하는 반면, 캅토 애드히어의 추가적인 작용성들은 보이드 배제 모드 내에서 기능하는 상기 매체를 위해 작동 pH를 약 5.0까지 감소시키는 것을 불가피하게 한다. 작동 pH의 감소가 상기 매체들의 전기양성도(electropositivity)에 대한 이의 반발성을 증가시키는 효과 및 소수성 상호작용들 및 수소 결합을 극복하는 다른 효과와 함께 처리되는 상기 항체의 전기양성도를 증가시키는 효과를 가지는 점이 이해될 것이다. 이와 같은 값으로 pH를 감소시키는 것이 상기 엔도톡신이 상기 크로마토그래피 입자들의 전기양성도에 이끌리는 엔도톡신 포스포릴 잔기들(phosphoryl residues) 상의 음성 전하를 현저하게 감소시키지 않을 것이므로, 추가적인 이차 작용성들을 구현하는 이러한 크로마토그래피 입자들을 이용하는 순 효과가 상기 추가적인 작용성들이 없는 전기양성 매체들에 비해 보다 효과적인 엔도톡신 제거를 잠재적으로 제공하는 것인 점이 동등하게 이해될 것이다.

일부 실시예들에 있어서, 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피는, (i) 약 300㎝/hr 또는 그 이하, (ii) 약 200㎝/hr 또는 그 이하, (iii) 약 100㎝/hr 또는 그 이하, 그리고 (iv) 약 50㎝/hr 또는 그 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 영이 아닌(non-zero) 선형 유량(linear flow rate)을 포함하는 선형 유량으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 흐름이 중력에 의해 유도되는 일부 실시예들에 있어서, 유량을 제어하는 능력은 소실되지만, 엔도톡신 제거 효율은 일반적으로 영향을 받지 않을 것이다.

일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 방법은, 상기 첨가하는 단계 이전에 및/또는 상기 적용시키는 단계 이전에, 상기 샘플을 비이온성 유기 폴리머들, 유기 용제들, 계면활성제들 및 우레이드들(ureides)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가용성 유기 조절인자(organic modulator)와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 가용성 유기 조절인자는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜((polypropylene glycol) 및 폴리부틸렌 글리콜(polybutylene glycol)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 비이온성 유기 폴리머가 될 수 있다. 일부 이러한 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 유기 폴리머는 약 500달톤(Dalton) 또는 그 이하의 평균 분자량을 가질 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 가용성 유기 조절인자는 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 부틸렌 글리콜(butylene glycol), 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide), 에탄올(ethanol), 이소프로판올(isopropanol) 및 페녹시에탄올(phenoxyethanol)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유기 용제가 될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 가용성 유기 조절인자는 약 1%(w/v) 또는 그 이상의 농도로 제공된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 가용성 유기 조절인자는 트윈(Tween), 트리톤(Triton), 차프스(CHAPS), 차프소(CHAPSO) 및 옥틸 글루코시드(octyl glucoside)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 계면활성제가 될 수 있다. 일부 이러한 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 약 1%(w/v) 또는 그 이하의 농도로 제공될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 약 0.1%(w/v) 또는 그 이하의 농도로 제공될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절인자는 아포화되는(subsaturating) 양으로 제공되는 우레이드가 될 수 있다. 일부 이러한 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 요소(urea) 및 히단토인(hydantoin)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, (i) 아포화되는 양으로 알란토인을 원하는 단백질 및 오염물로 적어도 하나의 엔도톡신을 포함하는 단백질 제제에 첨가하는 단계, 그리고 (ii) 상기 첨가하는 단계 후에 상기 원하는 단백질 및 감소된 양의 엔도톡신을 포함하는 샘플을 제공하도록 고체들을 제거하는 단계를 포함하는 방법에 제공된다. 이러한 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 엔도톡신이 충분히 없을 수 있으므로 검출의 한계가 엔도톡신 제거의 정도까지 후속하는 보이드 배제 전기양성 크로마토그래피에 대한 필요성을 제거하여 이미 구현된다. 뒤따르는 보이드 배제 단계는 그럼에도 불구하고 가용성 알란토인 및 다른 샘플 성분들을 제거하고, 알란토인 처리만으로는 구현하지 못할 수 있는 정제의 정도를 구현하는 추가적인 값을 제공할 수 있다. 이는 특히 IgG 단일클론 항체들로 보이드 배제 크로마토그래피의 기술이 엔도톡신의 제거이외에도 숙주 단백질들 및 DNA을 오염시키는 것의 99%의 제거를 지지할 수 있는 경우가 될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, (i) 샘플 부피를 가지는 샘플로서 원하는 단백질 및 오염물로 적어도 하나의 엔도톡신을 포함하는 단백질 제제를 제공하는 단계를 구비하고, (ii) 상기 샘플 부피를 음이온 교환 매체들의 충전된 입차 베드에 적용시키는 단계를 구비하며, 여기서 상기 음이온 교환 매체들은 보이드 배제 크로마토그래피를 지지하고, 상기 샘플 부피는 상기 충전된 입자 베드의 입자간 부피보다 크지 않으며, (iii) 상기 원하는 단백질 및 감소된 양의 엔도톡신을 포함하는 샘플을 용리시키는 단계를 구비하는 방법이 제공된다. 일부 이러한 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 엔도톡신이 충분히 없을 수 있으므로, 검출의 한계는 알란토인으로의 전처리에 대한 필요가 없이 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피에 의해만 구현된다. 보이드 배제 크로마토그래피만이 엔도톡신 감소의 원하는 정도를 구현하지 못하는 일부 이러한 실시예들에 있어서, 알란토인으로의 처리가 후속될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 방법들의 임의의 것의 간편한 수행을 위해 구성되는 키트들(kits)이 제공된다. 이러한 키트는 지시들과 함께 알란토인 처리 및 후속되는 보이드 전기양성 크로마토그래피를 수행하는 시약들을 구비할 수 있다.

다음의 제한적이지 않은 예는 상기 방법들의 기본적인 특징들과 수행을 예시한다. 원하는 단백질을 함유하는 엔도톡신-오염된 단백질 제제의 간편한 부피를 위하여, 알란토인이 중량 대 부피(W/v)로 10%의 양으로 첨가된다. 상기 샘플은 잠시 혼합되고 고체들이 정착하게 된다. 엔도톡신은 상기 고체들에 결합되며, 이에 따라 유체로부터 제거된다. 정착은 원심 분리에 의해 촉진될 수 있다. 감소된 엔도톡신 함량을 갖는 유체는 전류하는 고체들을 제거하기 위해 부어지거나 여과된다. 상기 샘플은 상기 칼럼 부피의 40% 또는 그 이하의 양으로 전기양성 보이드 배제 매체에 적용된다. 상기 단백질 제제 내의 원하는 단백질이 IgG 단일클론 항체일 수 있는 경우, 상기 전기양성 보이드 배제 칼럼은 상기 IgG가 이가 적용되는 상기 알란토인 처리된 샘플보다 낮은 레벨의 엔도톡신 오염으로 용리될 것인 50mM의 트리스, pH 8.0과 같은 완충제로 평형화될 수 있다. 현재까지의 실험은 엔도톡신 함량의 1,000-10,000폴드(fold) 감소가 상기 원하는 단백질의 90%-99%의 회수와 함께 구현될 수 있는 점을 나타낸다. 다른 것들 중에서 IgG, 라이소자임(lysozyme) 및 리보뉴클레아제(ribonuclease)를 포함하는 알칼리성 단백질들의 경우, 상기 단백질 또한 개시된 방법들에 의해 실질적으로 정제될 것이다. 실험 데이터는 상기 기술이 엔도톡신 제거와 독립적으로 비항체 단백질들의 99%의 제거를 구현할 수 있는 점을 나타낸다. 여기에 개시되는 방법들은 그 전체적인 편의성을 향상시키도록 키트들로 용이하게 구성된다.

일 실시예에 있어서, 상기 처리되는 단백질 제제는 엔도톡신으로 오염된 원하는 단백질의 종들을 함유하는 생물 용액(biological solution)이다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 엔도톡신으로 오염된 단백질 제제는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물(harvest)을 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 엔도톡신으로 오염된 단백질 제제는 세포 배양 상청액(supernatant)을 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 엔도톡신으로 오염된 단백질 제제는 인간이나 동물로부터의 체액(body fluid)을 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 엔도톡신으로 오염된 단백질 제제는 유기체로부터 또는 특정 종들의 복수의 유기체들로부터의 세포액(cellular fluid)을 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 엔도톡신으로 오염된 단백질 제제는 생물 조직의 호모게네이트(homogenate)를 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 엔도톡신으로 오염된 단백질 제제는 부분적으로 정제된 단백질을 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 엔도톡신으로 오염된 단백질 제제는 고도로 정제된 단백질을 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 원하는 단백질은 항체, 또는 Fab 및 F(ab')2, ScFv, VHH, 미니바디(minibody), 디아바디(diabody)와 같은 항체 조각(fragment), 또는 Fc-융합 단백질과 같은 항체 조각의 재조합 유도체이다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 원하는 단백질은 보체 단백질(complement protein)이다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 원하는 단백질은 응고성 단백질(clotting protein)이다. 이러한 일 실시예에 있어서, 상기 원하는 단백질은 인자(Factor) VIII 또는 인자 VIII과 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)의 복합체이다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 처리되는 단백질 제제는 4 또는 5 또는 6 또는 7 또는 8 또는 9, 혹은 보다 낮거나, 보다 높은 pH 또는 중간 pH 값이며, 상기 알란토인 친화 단계, 상기 전기양성 보이드 배제 단계를 수행하기 위해 pH의 변경을 요구하지 않는다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 단백질 제제의 pH는 특정 pH까지 조절될 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 처리되는 단백질 제제는 구아니딘(guanidine) 또는 이소티오시아네이트(isothiocyanate)와 같은 카오트로픽(chaotroic)(단백질을 가용화시키는) 염; 혹은 아세트산나트륨(sodium acetate) 또는 염화나트륨과 같은 중성 염; 혹은 황산암모늄(ammonium sulfate), 시트르산나트륨(sodium citrate) 또는 인산칼륨(potassium phosphate)과 같은 코스모트로픽(kosmotropic)(단백질을 침전시키는) 염을 함유하며, 상기 알란토인 친화 단계, 상기 전기양성 보이드 배제 단계를 수행하기 위해 임의의 염의 제거나 첨가를 요구하지 않는다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 처리되는 단백질 제제는 0.1M 또는 0.2M 또는 0.4M 또는 0.8M 또는 1.6M 또는 3.2M 혹은 보나 낮거나, 보다 높은 농도, 또는 중간 농도로 염을 함유하며, 상기 알란토인 친화 단계, 상기 전기양성 보이드 배제 단계를 수행하기 위해 임의의 염의 제거나 첨가를 요구하지 않는다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 하나 또는 그 이상의 염의 종들이 상기 단백질 제제에 첨가될 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 단백질 제제의 염 농도는, 예를 들면 보다 낮은 농도의 염을 함유하는 액체 또는 염이 결핍된 액체로 희석하여 감소될 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 처리되는 단백질 제제는 0.5M 또는 1.0M 또는 2.0M 또는 4.0M 또는 8.0M 혹은 보다 낮거나, 보다 높은 농도, 또는 중간 농도로 요소(urea)와 같은 비이온성 카오트로프(chaotrope)를 함유하며, 상기 알란토인 친화 단계, 상기 전기양성 보이드 배제 단계를 수행하기 위해 임의의 이러한 카오트로프의 제거나 첨가를 요구하지 않는다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 처리되는 단백질 제제는 1%-25%의 범위 또는 보다 낮거나, 보다 높은 농도, 또는 중간 농도로 에탄올(ethanol), 이소프로판올(isopropanol), 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol) 또는 글리세롤(glycerol)과 같은 유기 용체를 함유하며, 상기 알란토인 친화 단계, 상기 전기양성 보이드 배제 단계를 수행하기 위해 임의의 이러한 유기 용제의 존재, 부존재, 제거 또는 첨가를 요구하지 않는다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 처리되는 단백질 제제는 0.01% 내지 1% 또는 보다 낮거나, 보다 높은 농도, 또는 중간 농도로 양이온성, 비이온성, 쌍성 이온성(zwitter ionic) 또는 음이온성 계면활성제를 함유하며, 상기 알란토인 친화 단계, 상기 전기양성 보이드 배제 단계를 수행하기 위해 임의의 이러한 유기 용제의 제거 또는 첨가를 요구하지 않는다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 알란토인이 10% 또는 9% 또는 8% 또는 7% 또는 6% 또는 5%의 최종 농도 또는 0.6% 정도로 낮거나, 10% 보다 높은 농도, 혹은 중간 값까지 상기 단백질 제제에 첨가된다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 엔도톡신들의 농도를 감소시키는 상기 알란토인 친화 단계의 능력은 유기 다가 이온들의 첨가에 의해 향상될 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 고체 물질들은 상기 단백질 제제가 상기 전기양성 보이드 배제 단계에 적용되기 전에 상기 샘플로부터 제거된다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 전기양성 보이드 배제 칼럼의 부피는 이에 적용되는 상기 단백질 제제 샘플의 부피의 2.5배 또는 3배이거나, 이에 적용되는 상기 샘플의 부피의 4배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 그 이상이다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 전기양성 보이드 배제 칼럼에 적용되는 상기 부피 샘플은 상기 칼럼 부피의 40% 또는 그 이하이거나, 상기 칼럼 부피에 비해 30% 또는 그 이하, 혹은 20% 또는 그 이하, 혹은 10% 또는 그 이하, 혹은 5% 또는 그 이하, 혹은 1% 또는 그 이하이다.

일부 실시예들에 있어서, (i) 과포화되는 양으로 알란토인을 원하는 단백질 및 오염물로 적어도 하나의 엔도톡신을 포함하는 단백질 제제에 첨가하는 단계를 구비하고, (ii) 상기 첨가하는 단계 후에 칼럼 내의 전기양성 입자들의 충전된 입자 베드에 대한 보이드 배제 크로마토그래피에 의해 더욱 정제되기 위한 샘플을 제공하도록 고체들을 제거하는 단계를 구비하며, 상기 충전된 입자 베드는 입자간 부피를 가지고, (iii) 샘플 부피를 상기 충전된 입자 베드에 적용시키는 단계를 구비하며, 여기서 상기 전기양성 입자들은 보이드 배제 크로마토그래피를 지지하고, 상기 샘플 부피는 상기 입자간 부피보다 크지 않으며, (iv) 상기 원하는 단백질 및 감소된 양의 엔도톡신을 포함하는 정제된 샘플을 용리시키는 단계를 구비하고, 여기서 상기 원하는 단백질이 상기 칼럼에 적용되는 완충제 함량과 독립적으로 상기 칼럼이 평형화되는 상기 완충제 내에 잔류하는 방법들이 제공된다. 따라서, 여기에 개시되는 방법들은 상기 완충제 내로의 상기 원하는 단백질을 위한 완충제 교환의 수단을 효과적으로 제공한다. 이러한 완충제들은 적절한 후속되는 분석들 또는 처리 단계들을 위해 선택될 수 있다. 이에 따라, 상기 원하는 단백질이 초기에 상기 칼럼에 접촉되었을 때에 상기 초기 완충제 조제는 중요성을 가지지 않는다. 이러한 교환들은 여기에 개시되는 방법들의 이점들의 하나를 강조한다. 대조적으로, 다른 엔도톡신 제거 방법들은 이러한 능력을 부여하지 못한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 알란토인의 과포화되는 양은, (i) 약 10%, (ii) 약 5%, (ii) 약 0.6%부터 약 6%까지, (iii) 약 6%부터 약 10%까지, (iv) 약 10%부터 약 15%까지, (v) 약 15%부터 약 20%까지, (vi) 약 20%부터 약 50%까지, 그리고 (vii) 50% 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양을 포함하며, 여기서 상기 양은 무게/부피로서 제공된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 고체들을 제거하는 단계는 침강, 원심분리, 여과 및 이들의 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제의 pH 또는 염 농도는 상기 첨가하는 단계 이전에, 그 동안에 또는 이후에 조절된다. 일부 이러한 실시예들에 있어서, 조절들이 필수적이지 않으며, 상기 방법들은 이러한 조절들을 수행할 필요성이 배제되는 이점을 가질 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제제의 pH 또는 염 농도는 상기 적용시키는 단계 이전에 조절된다. 일부 실시예들에 있어서, 이러한 조절들이 필수적이지 않으며, 상기 방법들은 이러한 조절들을 수행할 필요성이 배제되는 이점을 가질 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플 부피가 상기 충전된 입자 베드의 입자간 부피보다 작으므로, 상기 충전된 베드에 대한 샘플 부피가 (i) 약 35% 이하, (ii) 약 30% 이하, (iii) 약 20% 이하, (iv) 약 10% 이하, (v) 약 5% 이하, (vi) 약 2% 이하, 그리고 (vii) 약 1% 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나가 된다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 베드에 적용되는 샘플 부피는, 상기 입자간 부피의 99%, 상기 입자간 부피의 95%, 상기 입자간 부피의 90%, 상기 입자간 부피의 80%, 상기 입자간 부피의 70%, 상기 입자간 부피의 60%, 상기 입자간 부피의 50%, 상기 입자간 부피의 25%, 상기 입자간 부피의 10%, 상기 입자간 부피의 5%, 상기 입자간 부피의 2%, 상기 입자간 부피의 1%, 그리고 이의 중간 부피 퍼센트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나로 구성되는 증가분만큼 상기 입자간 부피보다 작다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 적용시키는 단계 전에, 상기 방법은 상기 원하는 단백질이 상기 음이온 교환 매체들에 실질적으로 결합되는 것을 방지하도록 선택되는 완충제로 음이온 교환 매체들의 충전된 입자 베드를 평형화시키는 단계를 더 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질이 상기 음이온 교환 매체들에 실질적으로 결합되는 것을 방지하는 단계는 충분히 낮은 pH로 완충제를 제공하는 단계를 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질이 상기 음이온 교환 매체들에 실질적으로 결합되는 것을 방지하는 단계는 충분히 높은 염 농도로 완충제를 제공하는 단계를 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 완충제는, (i) 약 7, (ii) 약 8, (iii) 약 6 및 (iv) 약 6 내지 약 8까지의 범위로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 pH를 가진다. 일부 실시예들에 있어서, pH는, (i) 약 4의 pH부터 약 10의 pH까지, (ii) 약 5의 pH부터 약 9의 pH까지, (iii) 약 6의 pH부터 약 8의 pH까지, (iv) 약 6.5의 pH부터 약 7.5의 pH까지, 그리고 (v) 중간 범위로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 범위에 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 완충제는, (i) 약 0mM, (ii) 약 50mM, (iii) 약 150mM, 그리고 (iv) 약 0mM부터 약 150mM까지의 범위로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 염화나트륨 농도를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 150mM 보다 크지 않은 NaCl 농도에 대응되는 전도도가 채용될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 전도도는, (i) 영이 아닌 값으로부터 약 50mS/㎝까지, (ii) 영이 아닌 값으로부터 약 25mS/㎝까지, (iii) 영이 아닌 값으로부터 약 10mS/㎝까지, (iv) 영이 아닌 값으로부터 약 5mS/㎝까지, (v) 영이 아닌 값으로부터 약 2mS/㎝까지, (vi) 영이 아닌 값으로부터 약 1mS/㎝까지, 그리고 (vii) 영이 아닌 값으로부터 약 0.1mS/㎝까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 범위에 있을 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 대응되는 NaCl 농도는, (i) 영이 아닌 값으로부터 약 500mM까지, (ii) 영이 아닌 값으로부터 약 250mM까지, (iii) 영이 아닌 값으로부터 약 100mM까지, (iv) 영이 아닌 값으로부터 약 50mM까지, (v) 영이 아닌 값으로부터 약 20mM까지, (vi) 영이 아닌 값으로부터 약 10mM까지, 그리고 (vii) 영이 아닌 값으로부터 약 1mM까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 범위에 있을 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피에 채용되는 음이온 교환 크로마토그래피 매체들은, 우노스피어(UNOsphere) Q, 누비아(Nuvia) Q 또는 캅토(Capto) Q, 그리고 다른 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피-가능 음이온 교환 매체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피는, (i) 약 300㎝/hr 또는 그 이하, (ii) 약 200㎝/hr 또는 그 이하, (iii) 약 100㎝/hr 또는 그 이하, 그리고 (iv) 약 50㎝/hr 또는 그 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 영이 아닌 선형 유량(linear flow rate)을 포함하는 선형 유량으로 수행된다.

일부 실시예들에 있어서, (i) 샘플 부피를 갖는 샘플로서 원하는 단백질을 포함하는 단백질 제제를 제공하는 단계를 구비하고, 상기 샘플은 칼럼 내의 전기양성 입자들의 충전된 입자 베드에 대한 보이드 배제 크로마토그래피를 위해 적합하며, 상기 전기양성 입자들은 보이드 배제 크로마토그래피를 지지하고, 상기 충전된 입자 베드는 입자간 부피를 가지며, 상기 샘플 부피는 상기 입자간 부피보다 크지 않고; (ii) 상기 샘플을 상기 충전된 입자 베드에 적용시키는 단계를 구비하며, (iii) 상기 원하는 단백질 및 감소된 양의 엔도톡신을 포함하는 정제된 샘플을 용리시키는 단계를 구비하는 방법들이 제공된다.

일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 방법들의 편리한 수행을 위해 구성되는 키트들이 제공된다. 이러한 키트들은 여기에 개시되는 방법들의 수행에 필수적인 경우에 시약들, 명령들을 포함할 수 있다.

용어들은 상기 방법들이 보다 용이하게 이해되도록 정의된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 전체적으로 설정된다.

"입자간 부피(interparticle volume)" 또는 "입자간 베드 부피(interparticle bed volume)" 또는 "보이드 부피(void volume)"는 특히 크로마토그래피를 수행하기 위해 입자들로 충전된 칼럼을 포함하여, 입자들의 충전된 베드 내의 입자들 사이의 누적 공간을 언급하는 용어들이다. 평균적으로, 균일한 구형의 폴리머 마이크로입자들로 충전된 크로마토그래피 칼럼의 입자간 부피는 전체 베드 부피의 약 40%이며, 여기서 전체 베드 부피는 누적 입자 부피에 더하여 누적 입자간 부피로 구성된다. 충전된 베드의 입자간 부피는 상기 입자들이 불규칙할 경우에 40% 보다 클 수 있거나, 넓은 범위의 입자 크기를 포함할 수 있거나, 이들의 조성으로 인해 압축할 수 없을 수 있다. 입자간 베드는 상기 입자 베드가 압축되는 경우에 40%보다 작을 수 있다. 상기 칼럼의 입자간 베드는 이에 따라 상기 전체 베드 부피의 30% 이하로부터 60% 이상까지의 범위가 될 수 있다.

"단백질(protein)"은 탄소, 수소, 신소, 질소 및 통상적으로 황을 함유하고, 펩티드 결합들에 의해 연결되는 아미노산들의 하나 또는 그 이상의 사슬들로 주로 구성되는 복합 유기 고분자들의 기의 임의의 하나를 언급한다. 상기 단백질은 천연이나 재조합으로 유래된 것일 수 있다. 단백질들은 글리코실화(glycosylation), 페길레이션(pegylation) 또는 다른 화학 모이어티들(moieties)과의 접합(conjugation)을 통해서와 같이 비아미노산 모이어티들로 변형될 수 있다. 단백질의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 항체들, 응고 인자들, 효소들 그리고 펩티드 호르몬들을 포함한다.

"숙주 오염물(host contaminant)" 또는 "숙주 세포 오염물(host cell contaminant)"은 관심의 대상인 생성물이 성장되는 세포들에 의해 생성되는 생체 분자들을 언급한다. 상기 용어는 숙주 단백질 및 숙주 DNA와 같은 다양한 등급들의 숙주 오염물들을 포함할 수 있다.

"숙주 단백질(host protein)" 또는 "숙주 세포 단백질(host cell protein)" 또는 "HCP"는 관심의 대상인 생성물이 성장되는 세포들에 의해 생성되는 단백질들을 언급한다. 이러한 단백질들은 관심의 대상인 생성물로부터 제거되어야하는 하나의 등급의 오염물들을 나타낸다.

"항체(antibody)"는 인간화, 인간, 단일-사슬, 키메라(chimeric), 합성, 재조합, 하이브리드(hybrid), 돌연변이형, 그래프트된(grafted) 및 생체 외에서(in vitro) 생성된 항체들과 같이 천연이나 유전적으로 변형된 형태들을 포함하여 인간 또는 다른 포유동물 세포 주들로부터 유도되는 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 면역글로불린(immunoglobulin)을 언급한다. "항체"는 또한, 이에 한정되는 것은 아니지만, 면역글로불린 모이어티를 함유하는 융합 단백질들 또는 다른 항체, 효소, 플루오르포레(fluorphore)나 다른 신호 발생 모이어티, 바이오틴(biotin), 약물 또는 다른 기능성 모이어티를 포함하는 다른 기능성 모이어티에 대한 IgG의 합성 연결에 의해 생성되는 면역접합들(immunoconjugates)을 포함하여 혼성 형태들을 포함할 수 있다.

"엔도톡신(endotoxin)"은 세포 용해(lysis)에 따라 세포로부터 방출되는 그람-음성의(gram-negative) 박테리아의 외막 내에 존재하는 유독성의 열에 안정한 지질다당류(lipopolysaccharide) 물질을 언급한다. 엔도톡신들은 상기 중심 다당류와 연관된 인산염 및 카르복실 잔기들의 높은 함량으로 인해 일반적으로 산성일 수 있으며. 지질-A 부위의 지방산 함량으로 인해 높은 소수성을 나타낼 수 있다. O-항원 부위는 많은 숫자의 비이온성 다당류들을 포함한다.

"비이온성 유기 폴리머(non-ionic organic polymer)"는 대전된 기들이 결핍된 연결되는 반복적인 유기 서브단위들로 구성되는 자연 발생되거나 합성 탄화수소를 언급한다. 이는 선형일 수 있거나, 일부 분지들을 갖는 우세하게 선형일 수 있거나, 우세하게 분지될 수 있다. 상기 방법들을 수행하기에 적합한 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone: PVP) 및 다른 것들을 포함한다. PEG는 HO-(CH₂-CH₂-O)n-H의 구조식을 가진다. 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 500달톤 이하의 평균 중합체 분자 중량을 갖는 조성물들을 포함한다.

"단백질을 침전시키는 염(protein-precipitating salt)" 또는 "항체를 침전시키는 염(antibody-precipitating salt)" 또는 "IgG를 침전시키는 염(IgG-precipitating salt)"은 원하는 단백질의 침전을 매개하는 능력을 구현하는 염을 언급한다. 공통적인 예들은 황산나트륨이나 황산암모늄, 시트르산나트륨이나 시트르산칼륨, 인산나트륨이나 인산칼륨을 포함한다. 이와 같은 염들은 공통적으로 코스모트로픽(kosmotropic) 염들로 언급된다.

"비단백질을 침전시키는 염(non-protein-precipitating salt)" 또는 "비항체를 침전시키는 염(non-antibody-precipitating salt)" 또는 "비IgG를 침전시키는 염(non-IgG-precipitating salt)"은 원하는 단백질의 침전을 매개하는 능력이 결핍되고, 원하는 단백질의 용해도를 증가시키는 능력을 구현할 수 있는 염을 언급한다. 공통적인 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 염화나트륨이나 염화칼륨, 아세트산나트륨이나 아세트산칼륨, 나트륨 티오시아네이트(thiocyantate)나 칼륨 티오시아네이트, 또는 염화구아니디늄(guanidinium chloride)을 포함한다. 일부 이러한 염들은 공통적으로 카오트로픽(chaotropic) 염들로 언급되는 반면, 다른 것들은 카오트로픽 또는 코스모트로픽으로 언급되지 않는다.

"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 사슬 내에 공유 결합으로 결합되는 다중 뉴클레오티드 모노머들로 구성되는 생물 고분자를 언급한다. DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산)은 폴리뉴클레오티드들의 예들이다. 폴리뉴클레오티드들은 수소 결합들의 형성에 대한 높은 경향을 가질 수 있다.

"단백질 제제(protein preparation)"는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물, (실질적으로)세포가 없는 세포 배양 상청액(supernatant) 또는 정제의 단계로부터 관심의 대상인 단백질을 함유하는 용액과 같이 관심의 대상인 단백질을 함유하는 임의의 수성 또는 대부분의 수성 용액을 언급한다.

"바이러스(virus)" 또는 "비리온(virion)"은 살아있는 숙주들, 주로 박테리아, 식물들 및 동물들의 세포들 내에서만 복제되고, RNA 또는 DNA 코어, 단백질 막 및 보다 복잡한 형태들에서는 둘러싸는 외피(envelope)로 구성되는 한회 현미경적(ultramicroscopic)(대략 20㎚ 내지 300㎚의 직경)이고, 대사 작용적으로 불활성인 감염원(infectious agent)을 언급한다.

"보이드 배제(void exclusion)"는 정전기적으로 대전된 입자들로 충전된 칼럼의 환경 내부에서 샘플의 적어도 하나의 성분이 정전기적으로 밀려나거나 및/또는 상기 입자들 내에 잔류하는 공극들의 고유한 치수에 의해 부여될 수 있거나, 정전기 전하들이 상기 공극들 내에 존재하는 물리적인 형태에 의해 이차적으로 부여될 수 있는 공극 진입에 대한 물리적인 저항을 극복할 수 없는 결과로서 상기 칼럼 베드의 입자간 공간 내에 실질적으로 체류하도록 제한되는 화학적 상호작용을 언급한다.

"보이드 배제 모드(void exclusion mode)" 또는 "보이드 배제 크로마토그래피(void exclusion chromatography)"는 충전된 정전기적으로 대전된 입자들의 칼럼들 내에서 수행됨에 따라, 상기 칼럼에 적용되는 상기 샘플 부피가 상기 충전된 베드 내의 입자간 부피보다 크지 않고, 단백질과 같은 원하는 샘플 성분이 상기 입자들의 공극들로 들어갈 수 없으며, 이에 따라 상기 보이드 부피로도 통상적으로 알려진 상기 입자간 공간을 통해 진행하는 것이 제한되는 분별 방법을 언급한다. 보이드 배제 크로마토그래피의 기본적이고 구별되는 특징은, 상기 샘플 조건들이 정전기적으로 대전된 입자들에 크로마토그래피를 수행하기 위해 적합하지 않은 것으로 여겨지는 극히 높은 염 농도들 및 pH 값들을 포함할 수 있는 결과로서, 상기 샘플이 상기 칼럼 작동 조건들로 평형화될 필요가 없는 점이다. 다른 기본적이고 구별되는 특징들은 분별과 함께 완충제 교환을 구현하는 이의 독특한 능력을 포함한다. 보이드 배제 크로마토그래피에 있어서, 상기 원하는 단백질은 이가 상기 칼럼에 적용되는 삼기 샘플 조성과 독립적으로 상기 칼럼이 평형화되는 상기 완충제 내에 용리된다.

특정한 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 고체를 액체 부분으로부터 분리시키는 단계 이전에 적어도 십오분 동안 고체 알란토인과 접촉된다. 특정한 다른 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 15분 이하 혹은 약 15-30분, 혹은 30분 이상 또는 약 60분 혹은 약 60분 이상 동안 상기 고체로 배양된다. 일반적인 문제로서, 대부분의 생물학적 타겟들과 알란토인을 결합시키는 것은 본질적으로 즉각적으로 나타나며, 제거 단계가 수행될 수 있는 경우보다 적은 시간 내에 완전하게 구현된다. 신중한 실험실 운영은 그럼에도 불구하고 배양 시간이 체계적으로 평가되고, 이가 특정 응용을 위한 실질적인 효과를 가지지 않는 것으로 판명되는 경우에도, 일정한 처리 시간이 특정되어야 하며 특정 응용에 대해 고수되어야 하는 점을 권장한다.

여기에 개시되는 방법들을 적용시키는 데 유용한 출발점은 알란토인을 10%w/v의 양으로 상기 원하는 단백질을 함유하는 단백질 제제에 단순히 첨가하는 것이다. 샘플 조건들의 변경은 요구되지 않는다. 실험 증거는 엔도톡신 및 불용성 알란토인 사이의 반응이 본질적으로 즉각적이고, 고체들의 가장 신속한 실제적인 후속하는 제거를 위해 요구되는 경우보다 적은 시간에 가장 높은 레벨을 구현하는 점을 제시한다. 배양 시간은 이에 따라 중요한 실제적인 고려 사항으로 여겨지지 않으며, 이에 따라 어떤 배양 시간이 가장 간편하여도 이러한 단계가 수행될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 신중한 실험실 운영은 실험들 사이의 재현성을 최대화하는 관찰되는 일정한 시간 간격을 제시한다. 규칙적이거나 통상적인 바탕으로 생성될 수 있는 특정한 원하는 단백질의 다중 샘플들로부터 엔도톡신 제거의 정도 응 최적화하도록 의도되는 실험들은 알란토인의 부분을 과포화되는 농도보다 높거나 낮게 조절하는 단계 및/또는 제제의 pH 또는 그 염들이나 다른 성분들의 함량을 조절하는 단계를 수반할 수 있다. 비록 이와 같은 조절들이 알란토인 및 엔도톡신 사이의 상호작용에 영향을 미치지 않을 수 있더라도, 이들은 엔도톡신 및 상기 원하는 단백질 사이의 상호작용에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 엔도톡신의 원하는 감소를 구현하는 현재의 기술이나 어떠한 다른 것의 능력에 실질적인 영향을 미칠 수 있다. 기초 데이터는 생성물 회수가 존재하는 알란토인의 양에 반비례할 수 있으므로, 가장 우수한 효과를 구현하는 알란토인의 최소의 양을 결정하는 데 유리할 수 있는 점을 나타낸다. 실험 데이터는 또한 이러한 효과가 보다 큰 단백질들로 더 언급되므로, 보다 작은 단백질들이 알란토인의 매우 높은 농도에도 불구하고 높은 회수를 가장 잘 지지할 것인 점을 나타낸다. 해당 기술 분야의 숙련자는 여기에 개시되는 방법들이 20% 또는 30% 또는 40% 또는 50% 혹은 그 보다 높은 경우와 같이 10%보다 실질적으로 높은 알란토인 농도들로 수행될 수 있는 점을 인식할 것이다. 이러한 방식으로 상기 방법들을 수행하는 비용적인 효율이 감소될 수 있지만, 이는 알란토인이 상대적으로 비싸지 않은 상품인 점에서 용인될 수 있다.

상기 알란토인 처리된 단백질 제제로부터의 고체들의 제거는 여과, 원심분리, 원심분리와 여과의 결합 또는 다른 수단을 포함하는 임의의 간편한 수단들에 의해 수행될 수 있다. 고체들을 제거하는 수단은 엔도톡신의 추가적인 소스들을 도입하지 않도록 주의가 기울여지는 한 여기에 개시되는 방법들의 수행에 영향을 미치지 않는다.

상기 전기양성 보이드 배제 단계는 상기 단백질 제제의 평형을 위한 요구 사항을 부여하지 않으며, 그로부터 고체가 제거되었던 임의의 단백질 제제를 수용할 수 있다. 그러나, 상기 전기양성 보이드 배제 칼럼에 적용되는 샘플의 부피가 상기 전기양성 보이드 배제 크로마토그래피 매체들을 함유하는 상기 칼럼의 입자간 부피보다 크지 않아야 하기 때문에, 상기 전기양성 보이드 배제 단계는 단일 사이클로 처리될 수 있는 상기 샘플의 부피를 결정한다. 중력 안정된 칼럼에 있어서, 이러한 칼럼의 입자간 부피는 일반적으로 상기 중력 안정된 베드의 부피의 약 40%로 이루어진다. 상기 매체들의 축방향 압축은 상기 입자간 부피를 감소시키고, 결과적으로 특정한 전기양성 보이드 배제 칼럼에 적용될 수 있는 상기 샘플의 부피를 감소시킬 것이므로 회피되어야 한다. 우노스피어 Q(바이오-라드(Bio-Rad))로 알려진 크로마토그래피 매체는 비록 원하는 경우에 다른 것들도 평가될 수 있지만 현재까지 관찰된 가장 높은 보이드 배제 효율을 지지하기 때문에 함께 개시되기에 편리한 선택을 제공한다. 상기 보이드 배제 단계가 상기 적용되는 샘플의 부피에 특정한 의존성을 가지기 때문에, 상기 칼럼으로 들어가는 상기 샘플의 부피를 증가시키는 것으로 이해될 수 있으므로 상기 칼럼으로 들어가는 도중에 희석되는 상기 샘플을 위한 최소의 가능한 기회를 제공하는 방식으로 상기 샘플이 적용되는 것이 중요하다. 상기 칼럼으로 들어가는 상기 샘플의 부피가 상기 입자간 부피를 초과할 경우, 엔도톡신 제거 효율이 절충될 수 있다. 과도한 샘플 부피를 가져오는 샘플 희석을 최소화하는 하나의 방식은 이른바 슈퍼루프를 통해 상기 샘플을 적용시키는 것이다. 다른 방식은 상기 유체 레벨이 상기 베드의 상단까지 자발적으로 내려가게 되고, 상기 샘플을 첨가하며, 상기 샘플이 완전히 진입할 때까지 상기 칼럼으로 들어가도록 두고, 이후에 상기 샘플이 상기 칼럼을 통하게 되도록 완충제를 첨가하도록 설계되는 칼럼들을 이용하는 것이다. 상기 보이드 배제 단계의 가장 효과적인 적용은 일부 경우들에서 적절한 칼럼 평형 완충제 조건들의 개발을 요구할 것이다. 이러한 조건들은 적용되는 상기 원하는 단백질의 성질들에 의존할 것이다. 많은 IgG 단일클론항체들, Fab 및 이러한 항체들로부터 유도되는 F(ab')₂ 조각들과 같은 알칼리성 단백질들의 경우에 있어서, 상기 평형 완충제를 위한 편리한 출발 조제는 50mM의 트리스(Tris), pH 8.0이 될 수 있다. 상기 원하는 단백질의 회수가 98% 이하일 경우, 그러면 NaCl 농도가 50mM의 증가분들로 증가되는 일련의 실험들이 평가될 수 있다. 추가적인 최적화는 보다 작은 증가분들로 수행될 수 있다. 일반적인 문제로서, 상기 원하는 단백질의 충분한 회수를 지지하는 가장 낮은 염 농도는 엔도톡신의 가장 큰 감소를 구현할 것이다. pH는 실험적으로 변화될 수 있다. 실험 데이터는 50mM의 트리스, pH 8.0 내의 일부 IgG 단일클론 항체들의 전기양성 보이드 배제가 비항체 단백질들의 99% 이상의 감소를 추가적으로 구현하는 점을 보여준다. 비IgG 단백질들의 경우에 있어서, 함께 개시되는 간편한 평형 완충제는 50mM의 헤페스(Hepes), pH 7.0이다. IgG로써, r98% 이하의 회수는 보다 우수한 성능이 상기 염 농도를 증가시키는 것 또는 pH를 조절하는 것으로부터 얻어질 수 있는 점을 제시한다. 상기 칼럼 평형 완충제와 동일한 제형을 갖는 작용하는 완충제를 사용하는 것이 일반적으로 보다 편리하지만, 다른 완충제도 상기 작용하는 완충제에 대해 사용될 수 있다. 상기 작용하는 완충제가 상기 평형 완충제와 다를 경우, 이는 엔도톡신을 감소시키는 방법들의 능력에 영향을 미치지 않을 것이므로 상기 칼럼에 손상을 입히지 않는 임의의 제형이 될 수 있다. 상기 전기양성 보이드 배제 평형 완충제의 조제를 최적화하도록 수행되는 실험들은 상기 원하는 단백질의 소비를 최소화하도록 20% 또는 10% 또는 5% 또는 1%와 같이 주어진 칼럼 내의 최대 용적보다 상당히 작은 샘플들을 채용할 수 있다. 상기 평형 완충제의 조제에 따라, 상기 엔도톡신의 가장 큰 감소가 상기 알란토인 친화 단계 또는 상기 전기양성 보이드 배제 단계에서 관찰될 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 보다 효과적인 단계의 상대적인 기여가 매우 우세할 수 있다. 약 200㎝/hr의 선형 유량이 상기 전기양성 보이드 배제 단계를 작동시키기 위한 적절한 유량이다. 보다 낮은 유량들이 보다 우수한 결과들을 제공할 수 있지만, 처리 시간을 증가시킬 수 있다. 보다 높은 유량들은 수용 가능한 결과들을 제공할 수 있고, 상기 처리 시간을 감소시킬 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자라면 여기에 개시되는 방법들이 200㎝/hr보다 실질적으로 높은 유량들에서 수행될 수 있지만, 이렇게 하는 것으로부터 수행의 손실이 허용 가능하지 않을 수 있는 점을 인식할 것이다.

해당 기술 분야의 숙련자에게는 이가 상기 엔도톡신에 기여할 수 있는 가능성을 최소화하도록 사용되기 이전에 상기 전기양성 보이드 배제 칼럼 및 관련 하드웨어를 1M의 수산화나트륨(sodium hydroxide)으로 살균하는 점이 유리할 수 있는 것이 분명해질 것이다. 동일한 이유로, 이들의 엔도톡신 함량을 최소화하도록 완충제들의 제조 동안에 특별한 노력을 기울이는 것이 유리할 수 있다. 이러한 목적을 위한 하나의 수행은 약 10kDa 이하의 분자 질량을 갖는 구형의 화합물들에 대응되어 절단된 공극 크기를 갖는 멤브레인을 통해 모든 완충제들을 여과시키는 것이다. 칼슘이나 인산염이 결핍된 완충제를 위한 다른 접근은 0.22미크론 또는 0.45미크론 멤브레인을 통한 여과 전에 하이드록시 아파타이트(hydroxy apatite)를 상기 완충제에 약 0.1%-0.2%의 양으로 첨가하는 것이다. 모든 경우들에서, 상기 방법들을 수행하는 데 사용되는 용기들은 합리적으로 가능한 한 이상적으로는 엔도톡신이 없다. 엔도톡신 오염의 소스들을 제거하도록 복합 크로마토그래피 세척이 수반되는 정해진 노력이 주어질 경우, 독립된 키트들의 유용성이 매우 유리한 점이 분명해질 것이다.

실험예들

실험예 1: 알란토인 및 보이드 배제 크로마토그래피의 결합에 의한 IgG-엔도톡신 혼합물로부터의 엔도톡신 감소

엔도톡신이 20mM의 헤페스(Hepes), 150mM의 NaCl, pH 7.5 내지 3 내에서 3,300EU/ml까지 1㎎/mL의 인간 IgG(클론(clone) her2)에 첨가되었다. 30%(w/v)의 알란토인이 이러한 혼합물의 부분 표본들(aliquots)에 첨가되었고, 실온에서 15분 동안 혼합되게 두었다. 서스펜션(suspension)은 원심분리에 의해 투명하게 되었다. 단백질 회수는 50% 이상이었고, 상청액의 엔도톡신 함량은 99% 이상 내지 20EU/ml 이하로 감소되었다. 1mL의 IgG를 함유하는 상청액이 이후에 20mM의 헤페스, 150mM의 NaCl, pH 7.5로 평형화된 전기양성의 다공성 입자들(우노스피어 Q, 바이오-라드 라보라토리스(Bio-Rad Laboratories))로 충전된 8.8mL의 중력 칼럼에 적용되었다. 다음에, 15ml의 평형 완충제가 적용되었고, 1ml의 부분들이 상기 칼럼의 유출구에서 수집되었다. 용리 부분들은 280㎚ 및 254㎚에서 자외선(UV) 흡수에 의해서 및 LAL 비색 엔도톡신 분석(kinetic chromogenic endotoxin assay)에 의해서 분석되었다. 90% 이상의 IgG가 결합된 부분들 4, 5 및 6(즉, 3ml부터 6ml까지의 용리 부피) 내에 용리되었던 반면, 가용성 알란토인만이 부분 7로부터 계속 용리되었다. 보이드 배제 크로마토그래피는 상기 결합된 부분들 4, 5 및 6 내에서 95% 이상으로 엔도톡신 레벨들을 더 감소시켰다. 알란토인-매개 공동 침전 및 전기양성 보이드 배제 크로마토그래피의 결합에 의한 전체적인 엔도톡신 감소는 1EU/ml 이하까지 99.95% 이상이었다. 50mM의 트리스, pH 8.2까지 평형화된 상기 보이드 배제 칼럼만이 다른 관련 실험에 있어서, 알란토인-보이드 배제 처리의 결합된 결과는 mL 당 0.01EU 이하로의 엔도톡신의 감소였다.

실험예 2: 보이드 배제만에 의한 IgG-엔도톡신 혼합물로부터의 엔도톡신 감소

엔도톡신이 20mM의 헤페스, 150mM의 NaCl, pH 7.5 내의 1㎎/mL의 인간 IgG(클론 her2)에 400EU/ml까지 첨가되었다. 샘플은 실험예 1에 기재된 바와 동일한 조건들 하에서 보이드 배제를 거쳤다. 약 90%의 IgG가 결합된 부분들 4, 5 및 6 내에 용리되었고, 엔도톡신 함량은 99.6%로 감소되었다.

실험예 3: 알란토인-매개 공동 침전 및 보이드 배제 크로마토그래피의 결합에 의한 단백질 용액으로부터의 엔도톡신 감소

엔도톡신이 20mM의 헤페스, 350mM의 NaCl pH 7.5 내의 1㎎/ml의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA)의 샘플에 첨가되었다. 전기양성 보이드 배제 크로마토그래피를 위해 사용된 평형 및 용리 완충제가 350mM의 NaCl을 함유하였던 점을 제외하면, 샘플은 실험예 1에서와 같이 처리되었다. 알란토인-매개 공동 침전은 90%이상의 단백질 회수로 99.95% 이상으로 엔도톡신을 감소시켰다. 보이드 배제 크로마토그래피는 추가적인 엔도톡신의 감소를 구현하지 않았지만, 이는 85% 이상의 단백질 회수로 상기 단백질 샘플로부터 가용성 알란토인을 효과적으로 제거하였다.

실험예 4: 알란토인-매개 공동 침전에 의한 엔도톡신-제거에 대한 염의 효과

알란토인(30%w/v)이 10,000EU/ml를 함유하는 20mM의 헤페스, pH 7.5의 수용액에 첨가되었다. 염 농도들은 0M, 0.05M, 0.15M, 0.5M 및 2M의 NaC에서 선택되었다. 0M의 NaCl에서 알란토인의 엔도톡신 제거 효율은 99.99% 이상이었고, 0.5M의 NaCl까지 염 농도들과 독립적이었다. 2M의 NaCl에서, 상기 알란토인의 엔도톡신 제거 효율은 99.997%까지 증가하였다.

실험예 5: 알란토인-매개 공동 침전에 의한 엔도톡신-제거에 대한 pH의 효과

실험예 4의 실험이 150mM의 NaCl 및 3.5, 5.5, 7.5 그리고 9.5의 pH 값들에서 반복되었다. 엔도톡신 제거는 모든 pH 값들에서 99.9% 이상이었고, pH 7.5에서 가장 높았다(99.99%).

실험예 6: 알란토인-매개 공동 침전에 의한 엔도톡신-제거에 대한 계면활성제의 효과

실험예 4에서 기재한 실험이 세척제(0.1%-10%의 트윈(Tween) 20)의 존재에서 150mM의 NaCl에서 반복되었다. 알란토인의 엔도톡신 제거 효율은 세척제의 존재에서 약간 감소되었지만, 지속적으로 99.8% 보다 높았다.

실험예 7: 보이드 배제 크로마토그래피에 의한 엔도톡신-제거에 대한 염의 효과

약 1,000EU/ml를 함유하는 20mM의 헤페스, pH 7.5의 1ml의 수용액이 실험예 1에 기재된 바와 같이 전기양성의 다공성 입자들(우노스피어 Q, 바이오-라드 라보라토리스)로 충전된 8.8mL의 중력 칼럼에 적용되었다. 샘플의 염 농도들, 평형 및 용리 완충제들은 150mM, 250mM 및 350mM의 NaCl에서 선택되었다. 보이드 배제에 의한 엔도톡신-감소는 350mM의 NaCl에서 35%였고, 250mM의 NaCl에서 99.99%였다. 150mM의 NaCl에서, 전기양성 보이드 배제는 검출 한계(＜0.01EU/ml) 아래로 모든 용리 부분들의 엔도톡신 레벨들을 감소시켰다.

실험예 8: 전기양성 보이드 배제 크로마토그래피에 의한 엔도톡신-제거에 대한 pH의 효과

실험예 7의 실험이 150mM의 NaCl에서 pH 3.5, 5.5 및 7.5에서 반복되었다. 전기양성 보이드 배제 크로마토그래피는 전체 pH 범위들에 대해 검출 한계(＜0.01EU/ml) 아래로 모든 용리 부분들의 엔도톡신 레벨들을 감소시켰다.

실험예 9: 알란토인과 결합한 유기 첨가제들의 효과

단일클론 IgG를 포함하는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물이 0.01%의 에타크리딘(ethacridine)과 결합하여 1%의 알란토인으로 처리되었다. 이들 조건들이 이른바 생리적 조건들에 대응되는 약 7.2의 pH 및 약 13.5mS의 전도도에서 샘플이 동등한 양들의 금속 친화 리간드 트렌(TREN)(바이오 웍스(Bio Works) 트렌 하이-서브(TREN hi-sub)) 및 소수성 리간드들(매크로프렙(Macroprep) T-부틸(butyl))을 포함하는 칼럼 충전 크로마토그래피 매체들에 대해 통과되었다. 이전의 단계들을 수반하는 항체 회수는 99%였다. 상기 샘플은 우노스피어 Q로 충전된 보이드 배제 칼럼에 적용되었다. 상기 전기양성 보이드 배제 단계로부터의 회수는 98%의 전체적인 회수에 대응되는 99%였다. 엔도톡신 함량은 1EU/mL 이하였고, 99% 이상의 숙주 단백질 오염물들이 제거되었으며, DNA는 6로그(log) 이상으로 감소되었다. 결합된 바이러스 감소는 76% 이상이었다. 이러한 실험예는 상기 알란토인 친화 및 전기양성 보이드 배제 단계들이 하나 또는 그 이상의 단계들로 될 수 있고, 상기 알란토인 단계가 유기 조절제들(modifiers)의 존재에서 효과적으로 수행될 수 있으며, 여기에 개시되는 방법들이 엔도톡신들을 넘어서 오염물들의 범위를 제거하는 추가적인 이점을 가질 수 있는 것을 나타낸다.

실험예 10: 전기양성 보이드 배제-한정 크로마토그래피 매체들

다양한 상업적인 음이온 교환 크로마토그래피 매체들이 전기양성 보이드 배제 크로마토그래피를 수행하는 이들의 능력을 위해 평가되었다. 우노스피어 Q 및 누비아 Q는 보이드 부피에 대한 실험적인 IgG 단일클론 항체의 허용 가능한 배제를 구현하였다. 캅토 Q는 덜 효과적이지만 미미하게는 효과적이었다. 기가캅토(GigaCap) Q, 텐타클(Tentacle) DEAE-프락토겔(Fractogel), 다우엑스(Dowex) Ag1x4, Q 세파덱스(Sephadex) A25, Q 세파로스 패스트 플로우(Sepharose Fast Flow) 그리고 포로스(POROS) HQ를 포함하여 다른 음이온 교환체들은 훨씬 낮은 효율을 나타내었다. 모놀리식(monolithic) 및 멤브레인 교환체들은 완전히 부적합하였다. 이들 결과들은 모든 교환체들이 전기양성 보이드 배제-가능한 것이 아닌 점을 나타낸다. 비록 우노스피어 Q 및 누비아 Q를 능가하는 후보들이 적합할 수 있지만, 이들 매체들은 간편한 출발점을 제공한다.

실험예 11: 다중 모드의 소수성 상호작용-수소 결합-전기양성 크로마토그래피 입자들로의 보이드 배제 크로마토그래피

칼럼은 캅토 애드히어, 음이온 교환, 수소 결합 그리고 소수성 상호작용 작용성들을 구현하도록 알려진 크로마토그래피 매체를 포함하도록 제조되었다. 단순한 전기양성도를 넘어서 그 화학적 작용성들 및 상기 칼럼 내로 도입된 단백질들로 이들 작용성들 중에서 협력적인 상호작용들 때문에, 항체들은 이들이 음이온 교환 크로마토그래피의 기술을 위해 시판되는 매체들 상에서 행해지는 경우보다 넓은 범위의 조건들에 대해 결합되는 경향이 있으며, 이는 전기양성 보이드 배제가 수행될 수 있는 조건들이 비례하여 좁아지는 것을 의미한다. NaCl의 다양한 농도들 및 다양한 pH 값들로의 실험들로 적용되는 항체의 보이드 배제를 매개하기 위해 적합한 것으로 50mM의 아세테이트(acetate), pH 5.0이 확인되었다. 이들 조건들 하에서, 캅토 애드히어는 우노스피어 Q보다 약 10-폴드(fold) 큰 엔도톡신 감소를 구현하였다.

실험예 12

5%의 알란토인으로 처리 후에 mL 당 22.8의 엔도톡신 유닛들을 함유하는 정제된 IgG의 샘플이 과잉의 알란토인을 제거하고 엔도톡신 레벨들을 더 감소시키도록 우노스피어 Q에 대한 보이드 배제 모드에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 더 처리되었다. 상기 칼럼이 50mM의 헤페스, 150mM의 NaCl, pH 7.0으로 평형화되었던 하나의 실험에서, 엔도톡신은 0.472EU/mL까지 감소하였다. 상기 칼럼이 50mM의 헤페스, 100mM의 NaCl, pH 7.0으로 평형화되었던 또 다른 실험에서, 엔도톡신은 0.078EU/mL까지 감소하였다. 상기 칼럼이 50mM의 헤페스, 50mM의 NaCl, pH 7.0으로 평형화되었던 또 다른 실험에서, 엔도톡신은 0.022EU/mL까지 감소하였다.

여기에 개시되는 방법들이 1mL 이하 내지 수백 또는 심지어는 수천 리터의 샘플 부피들의 처리로부터 넓은 범위의 규모에 걸쳐 수행될 수 있는 점이 분명해질 것이다. 여기서 제공되는 정보에 근거하여 임의의 특정한 응용의 규모를 여기에 개시되는 방법들의 가장 큰 이점들을 향유하는 데 요구되는 임의의 레벨까지 조절하는 것은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자들의 능력의 범위 내에 있을 것이다.

여기서 언급되는 모든 참조 문헌들은 개개의 공보나 특허 또는 특허 출원이 각기 모든 목적들을 위해 그 개시 사항들이 참조로 포함되는 구체적이고 개별적으로 나타내어졌던 바와 같은 동일한 정도로 모든 목적들을 위해 그 개시 사항들이 참조로 포함된다. 참조로 포함되는 공보들 및 특허들 또는 특허 출원들이 본 명세서에 포함되는 개시 사항들과 모순되는 점에 있어서, 본 명세서는 임의의 이와 같은 모순되는 물질을 대체하거나 및/또는 이에 우선하는 것으로 의도된다.

성분들, 크로마토그래피 조건들의 양들을 나타내고 본 명세서와 특허청구범위에 설시되는 모든 수치들이 모든 예들에서 "약(about)"이라는 용어로 변경될 수 있는 점이 이해되어야 한다. 이에 따라, 대조적으로 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 설시되는 수치적인 변수들은 본 발명의 방법들에 의해 얻어지는 것으로 여겨지는 원하는 수행에 따라 변화될 수 있는 근사치들이다.

상기 방법들의 많은 변경들과 변화들이 해당 기술 분야의 숙련자에게는 자명할 것인 바와 같이 그 사상과 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 기재되는 특정 실시예들은 예로서만 제시되는 것이며, 어떠한 방식으로도 한정하는 것을 의미하지는 않는다. 다음의 특허청구범위에 의해 나타나는 여기에 개시되는 실시예들의 진실한 사상과 범주에서 본 명세서와 실험예들은 단지 예시적으로 간주되도록 의도된 것이다.

Claims (16)

1. (i) 알란토인(allantoin)을 과포화되는(supersaturating) 양으로 원하는 단백질 및 오염물로 적어도 하나의 엔도톡신(endotoxin)을 포함하는 단백질 제제(protein preparation)에 첨가하는 단계를 구비하고; (ii) 상기 첨가하는 단계 후에 칼럼 내의 전기양성 입자들의 충전된 입자 베드(bed)에 보이드 배제 크로마토그래피(void exclusion chromatography)에 의한 추가 정제를 위한 샘플을 제공하도록 고체들을 제거하는 단계를 구비하며, 상기 충전된 입자 베드는 입자간 부피를 가지고; (iii) 샘플 부피를 상기 충전된 입자 베드에 적용시키는 단계를 구비하며, 상기 전기양성 입자들은 보이드 배제 크로마토그래피를 지지하고, 상기 샘플 부피는 상기 입자간 부피보다 크지 않으며, (iv) 상기 원하는 단백질 및 감소된 양의 상기 엔도톡신을 포함하는 정제된 샘플을 용리시키는 단계를 구비하고, 상기 용리된 원하는 단백질은 칼럼에 적용되는 완충제 함량과 독립적으로 상기 칼럼이 평형화되는 상기 완충제 내에 잔류하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 알란토인의 과포화되는 양은, (i) 약 10%, (ii) 약 5%, (ii) 약 0.6%부터 약 6%까지, (iii) 약 6%부터 약 10%까지, (iv) 약 10%부터 약 15%까지, (v) 약 15%부터 약 20%까지, (vi) 약 20%부터 약 50%까지 그리고 (vii) 50% 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 양을 포함하며, 상기 양은 중량/부피로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 고체들을 제거하는 단계는 침강, 원심분리, 여과 및 이들의 결합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 제제의 pH 또는 염 농도는 상기 첨가하는 단계 전에, 그 동안에 또는 후에 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 제제의 pH 또는 염 농도는 상기 첨가하는 단계 전에 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 충전된 베드에 대한 상기 샘플 부피가 (i) 약 40% 이하, (ii) 약 35% 이하, (iii) 약 30% 이하, (iv) 약 20% 이하, (v) 약 10% 이하, (vi) 약 5% 이하, (vii) 약 2% 이하, 그리고 (viii) 약 1% 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나가 되도록 상기 샘플 부피는 상기 충전된 입자 베드의 입자간 부피보다 작은 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 베드에 적용되는 상기 샘플 부피는, 상기 입자간 부피의 99%, 상기 입자간 부피의 95%, 상기 입자간 부피의 90%, 상기 입자간 부피의 80%, 상기 입자간 부피의 70%, 상기 입자간 부피의 60%, 상기 입자간 부피의 50%, 상기 입자간 부피의 25%, 상기 입자간 부피의 10%, 상기 입자간 부피의 5%, 상기 입자간 부피의 2%, 상기 입자간 부피의 1%, 그리고 이의 중간 부피 퍼센트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나로 구성되는 증가분만큼 상기 입자간 부피보다 작은 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항에 있어서, 상기 적용시키는 단계 전에, 상기 방법은 상기 음이온 교환 매체들의 충전된 입자 베드를 상기 원하는 단백질이 상기 음이온 교환 매체에 실질적으로 결합되는 것을 방지하도록 선택되는 완충제로 평형화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 원하는 단백질이 상기 음이온 교환 매체들에 실질적으로 결합되는 것을 방지하는 단계는 충분히 낮은 pH로 상기 완충제를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 원하는 단백질이 상기 음이온 교환 매체들에 실질적으로 결합되는 것을 방지하는 단계는 충분히 높은 염 농도로 상기 완충제를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 완충제는, (i) 약 7, (ii) 약 8, (iii) 약 6, 그리고 (iv) 약 6부터 약 8까지의 범위로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 pH를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 상기 완충제는, (i) 약 0mM, (ii) 약 50mM, (iii) 약 150mM, 그리고 (iv) 약 0mM부터 약 150mM까지의 범위로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 염화나트륨 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항에 있어서, 상기 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피에 채용되는 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography) 매체들은 우노스피어(UNOsphere) Q, 누비아(Nuvia) Q 또는 캅토(Capto) Q, 그리고 다른 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피가 가능한 음이온 교환 매체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항에 있어서, 보이드 배제 음이온 교환 크로마토그래피는, (i) 약 300㎝/hr 또는 그 이하, (ii) 약 200㎝/hr 또는 그 이하, (iii) 약 100㎝/hr 또는 그 이하, 그리고 (iv) 약 50㎝/hr 또는 그 이하로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 영이 아닌 선형 유량(linear flow rate)을 포함하는 선형 유량에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. (i) 샘플 부피를 갖는 샘플로서 원하는 단백질을 포함하는 단백질 제제를 제공하는 단계를 구비하고, 상기 샘플은 칼럼 내의 전기양성 입자들의 충전된 입자 베드에 대한 보이드 배제 크로마토그래피를 위해 적합하며, 상기 전기양성 입자들은 보이드 배제 크로마토그래피를 지지하고, 상기 충전된 입자 베드는 입자간 부피를 가지며, 상기 샘플 부피는 상기 입자간 부피보다 크지 않고; (ii) 상기 샘플을 상기 충전된 입자 베드에 적용시키는 단계를 구비하며, (iii) 상기 원하는 단백질 및 감소된 양의 엔도톡신을 포함하는 정제된 샘플을 용리시키는 단계를 구비하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1 항 내지 제15 항 중 어느 한 항에 따른 방법들의 간편한 실행을 위해 구성되는 키트(kit).