CN105121457B - 用于从蛋白制剂去除内毒素的材料和方法 - Google Patents

Abstract

一种方法包括：(i)将尿囊素以过饱和量添加至蛋白制剂中，所述蛋白制剂包含所需蛋白和作为污染物的至少一种内毒素，(ii)在所述添加步骤后去除固体以提供样品用于通过柱中正电性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色谱进一步纯化，所述填充粒子床具有粒子间体积，(iii)将样品体积施加到所述填充粒子床，其中所述正电性粒子支持空隙排阻色谱,并且其中所述样品体积不大于所述粒子间体积,和(iv)洗脱包含所需蛋白和减少量的内毒素的经纯化样品。所述方法任选地仅利用尿囊素处理或仅利用空隙排阻色谱进行。

Description

用于从蛋白制剂去除内毒素的材料和方法

相关申请的声明

本申请要求于2013年2月22日提交的美国临时申请号61/768,232的优先权，该申请的全部内容通过引用整体地结合于本文中。

背景技术

本文公开的实施方案涉及用于减小蛋白制剂中的内毒素水平的方法，所述蛋白制剂包括未纯化的、部分纯化的、和高度纯化的制剂。内毒素是源自革兰氏阴性细菌的细胞壁的脂多糖。它们是生物制剂中普遍存在的污染物，其造成了严重的问题，因为它们是广谱细胞毒素，能够混淆研究结果，在诊断测定中得出错误结果，并且使得期望的治疗性产品不能安全的使用。这使得具有将它们从其驻留的生物制剂中去除的有效材料和方法是重要的。已经开发了许多这样的材料和方法。已知的实例包括通过阴离子交换色谱处理制剂，在阴离子交换色谱中在许多情况下内毒素比样品中的所需蛋白更强力的结合(Chen,R.,等，Protein Expression and Purification 2009,64,76-81)。其他已知的实例包括羟磷灰石色谱(Gagnon,P.,等，BioProcess International 2006,4,50-60),固定化金属亲和色谱(Tan,L.,等，Journal of Chromatography A 2007,1141,226-234),利用固定化组氨酸或多粘菌素B的亲和色谱(Anspach,F.,等，Journal of Chromatography A 1995,711,81-92),利用固定化多粘菌素B的亲和色谱，利用固定化的从鲎变形细胞重组得到的内毒素-结合肽的亲和色谱(Ding,J.,等，Journal of Chromatography B 2001,759,237-246)，利用表面活性剂Triton X-113的微分萃取(Cotten,M.,等，Gene Therapy 1994,1,239-246)，和大量的专有商业产品和方法(Kang,Y.,等，Process Biochemistry 2000,36,85-92)；Salema,V.,等，Pharmaceutical Technology Europe 2009,21,36-41)；Clutterbuck,A.,等，Biopharm International 2007,20,24-31)。所有这些方法利用了内毒素的脂质-A和核心多糖区域的特性，脂质-A和核心多糖区域一起参与了强力的疏水相互作用)，金属亲和相互作用，和/或与带正电荷的表面的强力的静电相互作用。已经记载了一种称为空隙排阻阴离子交换(void exclusion anion exchange)的技术用于IgG纯化，该技术也减少内毒素含量(Nian,R.,等，J.Chromatography A 1282(2013)127-132)，与许多以前已知的方法相比其实现了较宽的实用性，因为它适应各种样品，不需要它们提前平衡至特定的色谱条件，以及其实现缓冲液交换与去除内毒素相结合的能力。已经记载了一种采用过饱和尿囊素来从蛋白制剂去除内毒素的技术，其具有耐受宽范围的化学条件的特性，所述化学条件包括宽范围的pH、宽范围的盐浓度和有机添加剂(包括表面活性剂)的存在(Vagenende,V.,等，ACS.Appl.Mater.Interfaces 5(2013)4472-4478；Vagenende,V.,等，J.ChromatographyA,1310(2013)127-132)。

发明内容

在一些方面，本文公开的实施方案涉及这样的方法，所述方法包括：(i)将尿囊素以过饱和量添加至蛋白制剂中，所述蛋白制剂包含所需蛋白和作为污染物的至少一种内毒素，(ii)在所述添加步骤后去除固体以提供样品用于通过柱中正电性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色谱进一步纯化，所述填充粒子床具有粒子间体积，(iii)将样品体积施加到所述填充粒子床，其中所述正电性粒子支持空隙排阻色谱,并且其中所述样品体积不大于所述粒子间体积,和(iv)洗脱包含所需蛋白和减少量的内毒素的经纯化样品，其中所需蛋白驻留在平衡所述柱的缓冲液中，无论施加至所述柱的缓冲液的成分。

在其他方面，本文公开的实施方案涉及这样的方法，所述方法包括：(i)将尿囊素以过饱和量添加至蛋白制剂中，所述蛋白制剂包含所需蛋白和作为污染物的至少一种内毒素，(ii)在所述添加步骤后去除固体以提供包含所需蛋白和减少量的内毒素的样品。

还在其他方面，本文公开的实施方案涉及这样的方法，所述方法包括：(i)提供包含所需蛋白的蛋白制剂作为具有样品体积的样品，所述样品适合用于在柱中正电性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色谱，其中所述正电性粒子支持空隙排阻色谱,所述填充粒子床具有粒子间体积,并且其中所述样品体积不大于所述粒子间体积；(ii)将所述样品施加至所述填充粒子床,和(iii)洗脱包含所述所需蛋白和减少量的所述内毒素的经纯化样品。

具体实施方式

在一些实施方案中，已经发现与常规处理相比，两步处理提供更通用和有效的内毒素减少，所述两步处理包括将内毒素污染的包含所需蛋白的蛋白制剂与处于过饱和浓度的尿囊素孵育，接着以空隙排阻模式在填充的正电性粒子上进行色谱。与已知方法相反，不溶的尿囊素与内毒素共沉淀，显然两者通过氢键键合。不受限于理论，与尿囊素形成氢键的那部分内毒素可能包括已知为O-抗原的部分，核心多糖，或脂质A部分。已经指出，由于依赖于氢键结合，尿囊素对内毒素的亲和力不受pH、盐浓度的宽范围变化，或有机溶剂的存在的显著影响。空隙排阻阴离子交换步骤可以结合内毒素的核心多糖和脂质-A区域。尿囊素亲和性和空隙排阻步骤的组合由此潜在地靶向内毒素分子的所有区域，这可能是双重处理系统的高内毒素去除效率的原因。方法组合还克服了通过尿囊素去除内毒素的潜在缺点，即经处理的样品含有可溶的残留尿囊素并且可能含有其他组分，包括盐和有机添加剂，这可能干扰内毒素减少的样品的应用。由于空隙排阻步骤支持缓冲液交换的同步功能，并且其效力不受pH、导电率、或施加于其的蛋白制剂的其他性质影响，在去除固体后的经尿囊素处理的样品可以方便地直接施加至空隙排阻柱，从空隙排阻柱所述经尿囊素处理的样品在平衡所述柱的缓冲液中洗脱，并且所述缓冲液可以被配制成满足缺少内毒素的蛋白的预期应用的要求。在许多情况下，空隙排阻步骤提供了实现对所需蛋白的高度纯化的额外益处。然而空隙排阻步骤的基本作用仍然是增加由尿囊素所达到的内毒素减少因数。在一些情况下，尿囊素比空隙排阻更有效地去除内毒素；在一些情况下，该种模式是相反的，但在至今观察到的所有情况下，除了具有上文提及的其他益处外，组合还比任一种单独情况去除得更多。

因此，在一些实施方案中，提供了一种方法，其包括：(i)将尿囊素以过饱和量添加至蛋白制剂中，所述蛋白制剂包含所需蛋白和作为污染物的至少一种内毒素，(ii)在所述添加步骤后去除固体以提供样品用于通过空隙排阻阴离子交换色谱进一步纯化，(iii)将样品体积施加到正电性粒子的填充床，其中所述正电性介质支持空隙排阻色谱，其中所述样品体积不大于所述填充粒子床的粒子间体积,和(iv)洗脱包含所需蛋白和减少量的内毒素的经纯化样品。这种采用尿囊素接着采用空隙排阻色谱的两阶段方法可以提供去除了大于约99％内毒素的所需蛋白，在其他实施方案中，去除大于约99.5％，在其他实施方案中，大于约99.99％的内毒素。在一些实施方案中，所述方法可以提供没有可观察到的、直至检测限的内毒素杂质的所需蛋白。

在一些实施方案中，过饱和量的尿囊素包括选自由下列各项组成的组的量:(i)约10％，(ii)约5％，(ii)约0.6-约6％，(iii)约6％-约10％，(iv)约10％-约15％，(v)约15-约20％,和(vi)大于20％，其中所述量作为重量/体积提供。本领域技术人员将会认识到每一个述及的量和范围都构成尿囊素的过饱和量。在一些实施方案中，过饱和量可以包括未溶解的尿囊素的量。

在一些实施方案中，去除固体包括选自由下列各项组成的组的一个：离心、过滤、及其组合。这些和其他去除固体的方法是本领域技术人员所熟知的。过滤可以包括加工所需体积的样品所需的任何规模的真空、或重力、或泵推动的过滤。

在一些实施方案中，可以在添加步骤之前、期间或之后调整蛋白制剂的pH或盐浓度。

在一些实施方案中，可以在施加步骤之前调整蛋白制剂的pH或盐浓度。

在一些实施方案中，施加的样品体积不超过填充粒子床的粒子体积。在一些实施方案中，样品体积比填充粒子床的粒子间体积小一定的量，所述量包括选自由下列各项组成的组的一个：(i)小于约40％,(ii)小于床体积的约35％，(iii)小于床体积的约30％，(iv)小于床体积的约20％，(v)小于床体积的约10％，(vi)小于床体积的约5％，(vii)小于床体积的约2％，和(viii)小于床体积的约1％。在一些实施方案中，样品体积可以小于床体积的约40％。在具体实施方案中，施加最可能大的、同时仍然处在适合于空隙排阻色谱的范围内的样品体积可以是有益的，因为它们将支持每次重复的最大体积计容量。在其他具体实施方案中，施加为床体积的约35％的样品体积可以是有益的。尽管较大的样品可以是可用的，但与接近于理论限值的工作相比，约35％的体积可以提供对操作误差的实用安全系数，其中这些误差可能防止所述方法达到其最大益处。因此原因，在一些实施方案中，提供了成套装备，其操作说明书可以有利地将样品体积描述为床体积的约35％，由此提供克服可能的操作误差的缓冲液。

在一些实施方案中，在施加步骤前，所述方法还包括利用缓冲液平衡阴离子交换介质的填充粒子床，所述缓冲液被选择用于防止所需蛋白与阴离子交换介质显著结合。在一些这样的实施方案中，防止所需蛋白与正电性介质显著结合包括提供具有足够低的pH的缓冲液。在一些这样的实施方案中，防止所需蛋白与正电性介质显著结合包括提供具有足够高的盐浓度的缓冲液。

因此，在一些实施方案中，缓冲液可以具有的pH包括选自由下列各项组成的组的一个：(i)约7，(ii)约8，(iii)约6,和(iv)约6-约8的范围。本领域技术人员将会认识到操作pH可以是较高的值、较低的值或任意的中间值，并且确切的条件将在个例的基础上通过对特定的所需蛋白的常规优化来确定。因此，在此给出的值仅代表对用于典型的所需蛋白的初步操作条件的初始指导。例如，在具体实施方案中，pH可以包括较高的值诸如9、10、11、12等。同样，在具体实施方案中，pH可以包括较低的值诸如5、4、3等。在一些实施方案中，盐浓度可以影响pH的合适范围，并且反过来pH可以影响盐浓度的合适范围。

在一些实施方案中，缓冲液包含的氯化钠浓度包括选自由下列各项组成的组的一个：(i)约0mM,(ii)约50mM,(iii)约150mM,和(iv)约0mM-约150mM的范围。再次，本领域技术人员将认识到较高的或中间的浓度可以达到所需的结果，取决于被纯化的特定的所需蛋白的性质。在一些实施方案中，0mM氯化钠,即，不含氯化钠可以是足够的，并且在一些实施方案中，对于特定的所需蛋白是最佳的。

在一些实施方案中，首先被配制用来防止结合所需蛋白的平衡缓冲液的组合物可以进一步被配制用来促进最大程度的内毒素结合，从而使所公开的方法整体上减少内毒素的能力最大化。在一些这样的实施方案中,一般来说，空隙排阻平衡条件通常将体现不会导致所需蛋白与色谱介质结合且不损害所需蛋白的最高pH和最低电导率的一些组合。例如，利用一种IgG单克隆抗体的实验数据已经显示利用由50mM Tris,pH 8.2组成的缓冲液制剂的最佳内毒素减少。一般来说，在开发用于空隙排阻步骤的缓冲液制剂中的优先事宜依次是确定不引起所需蛋白结合的条件、确定最高pH和最低电导率的组合、以及确定最适合于进行缺少内毒素的经处理样品的预期应用的条件。

在一些实施方案中，在空隙排阻色谱模式中采用的正电性色谱介质包括选自由下列各项组成的组的一个：UNOsphere Q、Nuvia Q、Capto Q、Capto adhere，和适合用于实施所述方法的其他基于正电性粒子的介质。在一些实施方案中，具有正电性基团的任意阴离子交换介质可以适用，然而，本领域技术人员将理解不是所有的正电性介质都是同等适合的。尽管定义成功的介质的确切参数还没有被完全阐明，但本领域技术人员可以基于其进行空隙排阻阴离子交换色谱的能力而容易地筛选任意具体的正电性介质。在一些实施方案中，这可以在简单的实验中完成，在所述实验中候选的阴离子交换(或正电性)粒子被填充在柱中，例如，约20mL的体积。理想地使粒子通过重力沉降，然后设定流量适配器使得其接触但不显著地压缩床。可以在床已经被压缩的柱上执行该技术，但压缩减小了粒子间空间，直接结果是减少了柱的体积计样品容量。例如，20mL重力沉降床可以具有高至约8mL的样品体积容量，但床压缩25％至15mL的体积会使容量降低至低于在重力沉降床中相同介质的15mL容量的水平。因此，据信与粒子体积相反，压缩不成比例地减小粒子间体积。柱所驻留的色谱系统对于空隙排阻色谱的成功运行也是很重要的，并且其理想地被配置以致能够以不导致样品在通向柱的路径上被显著稀释的方式递送样品，因为该技术依赖于进入柱的样品体积不大于柱的粒子间体积。充分知晓层流会在边界处稀释样品。在具有几米长度的5mL样品回路的实例中，进入柱时样品的体积可以显著大于初始被引入至回路中的5mL，例如，可能增加至7.5mL或甚至10mL以上。具有所谓超容量回路(superloop)的系统非常适于实施所述方法，因为借助于它们依赖于缸-柱塞设计，它们允许施加大的样品体积而不会导致通过层流的过多的稀释。本领域普通技术人员要理解的是，由于流体通过各种阀门和混合器，任何给定的色谱系统还在样品引入装置(注射器)和柱之间导致一定量的样品稀释，并且一般来说，柱体积与特定系统的内部柱前稀释体积的比率越大，受系统稀释影响的柱上样品体积的相对增加越小。在实践中，这意味着在设计和配置用于大规模使用的色谱分析仪上操作小的柱将对可以在注射器处施加的样品的体积施加二次限制，而在这样的系统上操作大的柱将允许用户在样品进入给定柱时施加更大体积的样品，所述更大体积仍然处于该柱的体积限值范围内。利用在使用深绿色PEEK管并且装配有预先已经加载了含有IgG单克隆抗体的样品的超容量回路的诸如AKTA Explorer 100的系统上的20mL重力填充的未压缩柱，且柱子用50mM Tris,50mM NaCl,pH 8.0平衡，将1mL样品加载到柱上。在抗体开始从柱离开的点处做图形标记。在电导率发生变化的点处做另一个图形标记，指示与样品相关的小分子的通过。标记之间的体积提供了对柱的粒子间体积的可用估计值。计算粒子间体积与总柱体积的比率。适用于进行空隙排阻阴离子交换色谱的技术的阴离子交换色谱介质将表现约1/2.5的比率，但表现较低比率，诸如1/2.4、1/2.3、1/2.2、1/2.1、1/2.0或更低的介质可以提供有用的结果，只要进入柱的样品的体积不超过根据上述结果调整的经调整体积。

迄今的评价已经具体地鉴定了UNOsphere Q、Nuvia Q、Capto Q和Capto adhere作为适合用于实施空隙排阻阴离子交换色谱的介质。要理解的是在本文中建议的用于确定给定阴离子交换介质用于利用IgG单克隆抗体进行空隙排阻阴离子交换色谱的适用性的条件不一定是实现最有效内毒素去除的条件，也不一定是最适合于另一蛋白种类的条件。还要理解的是包含使得它们在市场上用于所谓的多模式色谱的附加化学官能团的正电性介质将需要额外维度的工艺开发，涉及评价不同的缓冲液条件以确定是否给定的介质适合用于以空隙排阻模式执行吸附色谱。一个实例包括以商业名称Capto adhere在市场上销售的所谓的混合模式或多模式正电性色谱介质，其旨在掺入使其参与氢键和疏水相互作用的官能团。而一些作为阴离子交换剂在市场上销售的产品支持在缺少盐诸如氯化钠的情况下在8.0的pH下的IgG单克隆抗体的空隙排阻，Capto adhere的附加官能团使得必须将介质的工作pH降低至约5.0从而在空隙排阻模式下发挥作用。要理解的是工作pH的降低具有增加被处理的抗体的正电性的作用，其作用是增加其对介质的正电性的排斥性，进一步的作用是克服疏水相互作用和氢键键合。同样要理解的是将pH降低至这样的值不会明显地减少内毒素磷酰基残基上的负电荷，通过所述负电荷内毒素被色谱粒子的正电性吸引，使得使用这样的表现出附加的二级官能团的色谱粒子的净效应是其潜在地提供了比缺少附加官能团的正电性介质更有效的内毒素去除。

在一些实施方案中，空隙排阻阴离子交换色谱可以在线性流速下进行，所述线性流速包括选自由下列各项组成的组的非零线性流速：(i)约300cm/hr或更小,(ii)约200cm/hr或更小,(iii)约100cm/hr或更小,和(iv)约50cm/hr或更小。在一些实施方案中，例如其中流动通过重力引发的情况，控制流速的能力丧失但通常内毒素去除效率不受影响。

在一些实施方案中，本文公开的方法可以包括使样品与可溶性有机调节剂接触，所述有机调节剂选自由下列各项组成的组：非离子型有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂和酰脲，在添加步骤之前，和/或在施加步骤之前。

在一些实施方案中，可溶性有机调节剂可以是选自由下列各项组成的组的非离子型有机聚合物：聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇。在一些这样的实施方案中,非离子型有机聚合物可以具有约500道尔顿或更小的平均分子量。

在一些实施方案中，可溶性有机调节剂可以是选自由下列各项组成的组的有机溶剂：乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲亚砜、乙醇、异丙醇和苯氧乙醇。

在一些实施方案中，可溶性有机调节剂以约1％(w/v)或更高的浓度提供。

在一些实施方案中，可溶性有机调节剂可以是选自由下列各项组成的组的表面活性剂：Tween、Triton、CHAPS、CHAPSO和辛基糖苷。在一些这样的实施方案中,表面活性剂可以以约1％(w/v)或更小的浓度提供。在其他实施方案中，表面活性剂可以以约0.1％(w/v)或更小的浓度提供。

在一些实施方案中，有机调节剂可以是以亚饱和(subsaturating)量提供的酰脲。在一些这样的实施方案中，酰脲包括选自由下列各项组成的组的一个：尿素和乙内酰脲。

在一些实施方案中，提供了一种方法，所述方法包括：(i)将尿囊素以过饱和量添加至蛋白制剂，所述蛋白制剂包含所需蛋白和作为污染物的至少一种内毒素，(ii)在所述添加步骤后去除固体以提供包含所需蛋白和减少量的内毒素的样品。在这样的实施方案中，所需蛋白可以充分地不含内毒素使得已经达到检测限，不需要随后进行空隙排阻正电性色谱以达到内毒素去除程度。然而，后续的空隙排阻步骤可以提供以下的附加价值：去除可溶性尿囊素和其他样品组分，以及达到单独尿囊素处理不可能达到的纯化程度。对于IgG单克隆抗体，情况尤其如此，其中空隙排阻阴离子交换色谱的技术不仅去除了内毒素，还可以支持除去99％的污染宿主蛋白和DNA。

在一些实施方案中，提供了一种方法，该方法包括：(i)提供包含所需蛋白和作为污染物的至少一种内毒素的蛋白制剂作为具有样品体积的样品，(ii)将样品体积施加至阴离子交换介质的填充粒子床，其中所述阴离子交换介质支持空隙排阻色谱，并且其中所述样品体积不大于所述填充粒子床的粒子间体积，和(iii)洗脱包含所需蛋白和减少量的所述内毒素的经纯化样品。在一些这样的实施方案中，所需蛋白可以充分地不含内毒素使得仅通过空隙排阻阴离子交换色谱就达到检测限，不需要用尿囊素预处理。在其中单独空隙排阻色谱不能达到所需的内毒素减少程度的一些这样的实施方案中，可以接着用尿囊素处理。

在一些实施方案中，提供了被配置用于方便地实施本文公开的任一种方法的成套装备。这样的成套装备可以装配有用于进行尿囊素处理和后续的空隙正电性色谱的试剂以及说明书。

下面的非限制性实例举例说明了所述方法的基本特征和实施。向合适体积的内毒物污染的含有所需蛋白的蛋白制剂中加入10％重量/体积(w/v)的量的尿囊素。简单地混合样品并使固体沉降。内毒素结合于固体并且因此从流体中被去除。通过离心加速沉降。具有减少的内毒素含量的流体被倾析或过滤以去除剩余的固体。将样品以40％的量或小于柱体积的量施加至正电性空隙排阻介质。在蛋白制剂中的所需蛋白可以是IgG单克隆抗体的情况下，正电性空隙排阻柱可以用诸如50mM Tris,pH 8.0的缓冲液平衡，其中与施加了IgG的经尿囊素处理的样品相比IgG将以较低的内毒物污染水平洗脱。迄今的经验表明可以实现内毒素减少1,000-10,000倍，同时回收90-99％的所需蛋白。在包括IgG、溶菌酶和核糖核酸酶等的碱性蛋白的情况下，蛋白也将基本上通过本公开的方法纯化。实验数据表明该技术可以达到减少99％的非抗体蛋白，而不依赖于内毒素去除。本文公开的方法容易地被配置成成套装备以增加其总体便利性。

在一个实施方案中，要处理的蛋白制剂是含有被内毒素污染的一种所需蛋白的生物溶液。

在一个或多个前述实施方案中，被内毒素污染的蛋白制剂包含含有细胞的细胞培养收获物。

在一个或多个前述实施方案中，被内毒素污染的蛋白制剂包含细胞培养上清液。

在一个或多个前述实施方案中，被内毒素污染的蛋白制剂包含来自人或动物的体液。

在一个或多个前述实施方案中，被内毒物污染的蛋白制剂包括来自特定物种的一个或多个生物体的细胞液。

在一个或多个前述实施方案中，被内毒物污染的蛋白制剂包含生物组织的匀浆。

在一个或多个前述实施方案中，被内毒物污染的蛋白制剂包含部分纯化的蛋白。

在一个或多个前述实施方案中，被内毒物污染的蛋白制剂包含高度纯化的蛋白。

在一个或多个前述实施方案中，所需蛋白是抗体，或抗体片段诸如Fab、和F(ab’)2、ScFv、VHH、微型抗体、双链抗体，或抗体片段的重组衍生物诸如Fc-融合蛋白。

在一个或多个前述实施方案中，所需蛋白是补体蛋白。

在一个或多个前述实施方案中，所需蛋白是凝血蛋白。在一个这样的实施方案中，所需蛋白是因子VIII,或因子VIII与血管性血友病因子(von Willebrand factor)的复合物。

在一个或多个前述实施方案中，要处理的蛋白制剂处于4、或5、或6、或7、或8或9的pH，或较低、较高或中间的pH值，并且不需要改变pH来进行尿囊素亲和步骤、正电性空隙排阻步骤。

在一个或多个前述实施方案中，蛋白制剂的pH可以被调整至特定的pH。

在一个或多个前述实施方案中，要处理的蛋白制剂含有离液(蛋白增溶)盐，诸如胍，或异硫氰酸盐；或中性盐诸如乙酸钠,或氯化钠；或kosmotropic(蛋白沉淀)盐诸如硫酸铵、柠檬酸钠、或磷酸钾，并且不需要去除或添加或去除任意盐来进行尿囊素亲和步骤、正电性空隙排阻步骤。

在一个或多个前述实施方案中，要处理的蛋白制剂含有浓度为0.1M、或0.2M、或0.4M、或0.8M、或1.6M、或3.2M，或较低、较高、或中间浓度的盐，并且不需要去除或添加或去除任意盐以进行尿囊素亲和步骤、正电性空隙排阻步骤。

在一个或多个前述实施方案中，可以将一种或多种盐加入至蛋白制剂。

在一个或多个前述实施方案中，可以减小蛋白制剂的盐浓度，例如，通过用含有较低浓度的盐的液体或缺少盐的液体稀释来减小。

在一个或多个前述实施方案中，要处理的蛋白制剂含有非离子型离液剂诸如浓度为0.5M、或1.0M、或2.0M、或4.0M、或8.0M,或较低、较高、或中间浓度的尿素，并且既不需要去除也不需要添加任何这样的离液剂来进行尿囊素亲和步骤、正电性空隙排阻步骤。

在一个或多个前述实施方案中，要处理的蛋白制剂含有浓度范围为1-25％，或较低、较高、或中间浓度的有机溶剂诸如乙醇、异丙醇、乙二醇,丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、或甘油，并且不需要任何这样的有机溶剂的存在、缺少、去除或添加来进行尿囊素亲和步骤、正电性空隙排阻步骤。

在一个或多个前述抗体中，要处理的蛋白制剂含有浓度为0.01-1％，或较低、较高、或中间浓度的阳离子、非离子型、两性离子、或阴离子表面活性剂，并且不需要去除或添加任何这样的表面活性剂来进行尿囊素亲和步骤、正电性空隙排阻步骤。

在一个或多个前述实施方案中，将尿囊素添加至蛋白制剂中至10％、或9％、或8％、或7％、或6％、或5％、或低至0.6％的浓度、或大于10％的浓度、或中间值的终浓度。

在一个或多个前述实施方案中，尿囊素亲和步骤减小内毒素浓度的能力可以通过添加有机多价离子来增强。

在一个或多个前述实施方案中，在将蛋白制剂施加到正电性空隙排阻步骤之前从样品去除固体物质。

在一个或多个前述实施方案中，正电性空隙排阻柱的体积是施加至其上的蛋白制剂样品的体积2.5倍大，或是施加至其上的样品的体积3倍大，或4倍大、5倍大、10倍大、20倍大、50倍大或更多倍大。

在一个或多个前述实施方案中，施加到正电性空隙排阻柱的样品体积比柱体积小40％或更少，或比柱体积小30％或更少、或20％或更少、或10％或更少、或5％或更少、或1％或更少。

在一些实施方案中，提供了方法，所述方法包括：(i)将尿囊素以过饱和量添加至蛋白制剂，所述蛋白制剂包含所需蛋白和作为污染物的至少一种内毒素；(ii)在所述添加步骤后去除固体以提供样品用于通过柱中正电性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色谱进一步纯化,所述填充粒子床具有粒子间体积；(iii)将样品体积施加到所述填充粒子床，其中所述正电性粒子支持空隙排阻色谱,并且其中所述样品体积不大于所述粒子间体积,和(iv)洗脱包含所需蛋白和减少量的内毒素的经纯化样品，其中所需蛋白驻留在平衡所述柱的缓冲液中，而不依赖于施加至所述柱的缓冲液成分。因此，本文公开的方法有效地提供了一种用于使所需蛋白进入至缓冲液中的缓冲液交换方式。可以选择这种缓冲液用于适当的后续测定或加工步骤。因此，所需蛋白当初始接触柱时所处的初始缓冲液制剂无关紧要。此交换突出了本文公开的方法的一个优点。相反，其他内毒素去除方法没有赋予这种能力。

在一些实施方案中，过饱和量的尿囊素包括选自由下列各项组成的组的量:(i)约10％、(ii)约5％、(ii)约0.6-约6％、(iii)约6％-约10％、(iv)约10％-约15％、(v)约15-约20％、(vi)约20-约50％，和(vii)大于50％,其中所述量作为重量/体积提供。

在一些实施方案中，去除固体包括选自由下列各项组成的组的一种：沉降、离心、过滤、及其组合。

在一些实施方案中，在添加步骤之前、期间或之后调整蛋白制剂的pH或盐浓度。在一些这样的实施方案中，调整不是必需的，并且所述方法可以受益于消除了进行这种调整的需要。

在一些实施方案中，在施加步骤之前调整蛋白制剂的pH或盐浓度。在一些实施方案中，这种调整不是必需的，并且所述方法可以受益于消除了进行这种调整的需要。

在一些实施方案中，样品体积小于填充粒子床的粒子间体积使得相对于填充床的样品体积为选自由下列各项组成的组的一个:(i)小于约35％,(ii)小于约30％,(iii)小于约20％,(iv)小于约10％,(v)小于约5％,(vi)小于约2％,和(vii)小于约1％。

在一些实施方案中，施加至所述床的样品体积比粒子间体积小一定的增量，所述增量由选自下列组的一个组成：所述粒子间体积的99％,所述粒子间体积的95％，所述粒子间体积的90％，所述粒子间体积的80％，所述粒子间体积的70％，所述粒子间体积的60％，所述粒子间体积的50％，所述粒子间体积的25％，所述粒子间体积的10％，所述粒子间体积的5％，所述粒子间体积的2％，所述粒子间体积的1％，和它们的中间体积百分比。

在一些实施方案中，在施加步骤之前，所述方法还包括利用缓冲液平衡阴离子交换介质的填充粒子床，所述缓冲液被选择用于防止所需蛋白与阴离子交换介质显著结合。

在一些实施方案中，防止所需蛋白与阴离子交换介质显著结合包括提供具有足够低的pH的缓冲液。

在一些实施方案中，防止所需蛋白与阴离子交换介质显著结合包括提供具有足够高的盐浓度的缓冲液。

在一些实施方案中，所述缓冲液具有的pH包括选自由下列各项组成的组的一个：(i)约7，(ii)约8，(iii)约6,和(iv)约6-约8的范围。在一些实施方案中，pH处于包括选自由下列各项组成的组的一个的范围：(i)约4的pH至约10的pH，(ii)约5的pH至约9的pH，(iii)约6的pH至约8的pH，(iv)约6.5的pH至约7.5的pH，和(v)中间范围。

在一些实施方案中，缓冲液包含的氯化钠浓度包括选自由下列各项组成的组的一个：(i)约0mM，(ii)约50mM，(iii)约150mM,和(iv)约0mM-约150mM的范围。在一些实施方案中，可以采用对应于不大于150mM的NaCl浓度的电导率值。在一些实施方案中，电导率可以处于包括选自由下列各项组成的组的一个的范围：(i)非零值-约50mS/cm,(ii)非零值-约25mS/cm,(iii)非零值-约10mS/cm,(iv)非零值-约5mS/cm,(v)非零值-约2mS/cm,(vi)非零值-约1mS/cm,和(vii)非零值-约0.1mS/cm。在一些实施方案中，对应的NaCl浓度可以处于包括选自由下列各项组成的组的一个的范围：(i)非零值-约500mM,(ii)非零值-约250mM,(iii)非零值-约100mM,(iv)非零值-约50mM,(v)非零值-约20mM,(vi)非零值-约10mM，和(vii)非零值-约1mM。

在一些实施方案中，在空隙排阻阴离子交换色谱中采用的阴离子交换色谱介质包括选自由下列各项组成的组的一种：UNOsphere Q、Nuvia Q或Capto Q、和另一种能够进行空隙排阻阴离子交换色谱的阴离子交换介质。

在一些实施方案中，在一定的线性流速下执行空隙排阻阴离子交换色谱，所述线性流速包括选自由下列各项组成的组的非零线性流速：(i)约300cm/hr或更低，(ii)约200cm/hr或更低，(iii)约100cm/hr或更低，和(iv)约50cm/hr或更低。

在一些实施方案中，提供了方法，所述方法包括：(i)提供包含所需蛋白的蛋白制剂作为具有样品体积的样品，所述样品适合用于在柱中正电性粒子的填充粒子床上的空隙排阻色谱，其中所述正电性粒子支持空隙排阻色谱,所述填充粒子床具有粒子间体积,并且其中所述样品体积不大于所述粒子间体积；(ii)将所述样品施加至所述填充粒子床,和(iii)洗脱包含所述所需蛋白和减少量的所述内毒素的经纯化样品。

在一些实施方案中，提供了成套装备，所述成套装备被配置用于方便地实施本文公开的方法。这样的成套装备可以包括试剂、使用说明书，根据实施本文公开的方法的需要而定。

定义一些术语使得可以更容易地理解所述方法。在整个具体实施方式中给出了附加的定义。

“粒子间体积”或“粒子间床体积”或“空隙体积”是指粒子的填充床(尤其包括填充了用来进行色谱的粒子的柱)中的粒子之间的累积空间的术语。平均起来，用均一的球形聚合微粒填充的色谱柱的粒子间体积为总床体积的40％，其中总床体积由累积粒子体积加累积粒子间体积组成。如果粒子是不规则的、或包括宽范围的粒径、或由于它们的组成从而是不可压缩的，则填充床的粒子间体积可以大于40％。如果粒子床是压缩的，则粒子间体积可以小于40％。柱的粒子间体积可以因此在小于30％至大于60％的总床体积的范围内。

“蛋白”是指含有碳、氢、氧、氮并且通常含有硫的复杂的有机大分子的组中的任一个，所述复杂有机大分子基本上由通过肽键连接的一个或多个氨基酸链组成。蛋白可以是天然或重组来源的。蛋白可以用非氨基酸部分诸如通过糖基化作用、聚乙二醇化作用、或与其他化学部分缀合修饰。蛋白的实例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肽激素。

“宿主污染物”或“宿主细胞污染物”是指由其中生长有目的产物的细胞产生的生物分子。该属于可以包括各种类型的宿主污染物，诸如宿主蛋白和宿主DNA。

“宿主蛋白”或“宿主细胞蛋白”或“HCP”是指由其中生长有目的产物的细胞产生的蛋白。这样的蛋白代表了必须要从目的产物中去除的污染物的一种类型。

"抗体"是指来源于人或其他哺乳动物细胞系的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类型的免疫球蛋白，包括天然的或遗传修饰的形式诸如人源化、人、单链、嵌合的、合成的、重组的、杂交的、突变的、接枝的和体外产生的抗体。“抗体”也可以包括复合形式，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白，或通过IgG与另一个功能部分的合成连接所产生的免疫缀合物，所述另一个功能部分包括另一抗体、酶、荧光团或其他信号生成部分、生物素、药物或其他功能部分。

“内毒素”是指在革兰氏阴性细菌的外膜中存在的对热稳定的毒性脂多糖物质，所述脂多糖物质在裂解过程中从细胞释放。由于与核心多糖相连的磷酸酯和羧基残基的高含量，内毒素可以通常是酸性的，并且由于脂质-A区域的脂肪酸含量而可以是高度疏水的。O-抗原区域包含大数目的非离子型多糖。

“非离子型有机聚合物”是指由连接的缺少带电荷基团的重复有机亚基构成的天然存在的或合成的烃。其可以是线性的、主要是线性的且带有一些分支，或主要是分支的。适合于实施所述方法的实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，等等。PEG具有结构式HO-(CH2-CH2-O)n-H。实例包括，但不限于，平均聚合物分子量小于500道尔顿的组合物。

“蛋白沉淀盐”或“抗体沉淀盐”或“IgG-沉淀盐”是指表现出介导所需蛋白沉淀的能力的盐。常见的实例包括硫酸钠或硫酸铵、柠檬酸钠或柠檬酸钾、磷酸钠或磷酸钾。这样的盐通常称为kosmotropic盐。

“非蛋白沉淀盐”或“非抗体沉淀盐”或“非IgG沉淀盐”是指缺少介导所需蛋白沉淀的能力的盐，并且可以表现出增加所需蛋白的溶解度的能力。常见的实例包括但不限于氯化钠或氯化钾、乙酸钠或乙酸钾、硫氰酸钠或硫氰酸钾、或盐酸胍。一些这样的盐通常被称为离液盐，而其他的既不称为离液盐也不称为kosmotropic盐。

“多核苷酸”是指由在链中共价结合的多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。多核苷酸可以具有氢键形成的高倾向性。

“蛋白制剂”是指含有感兴趣蛋白的任意水性溶液或主要为水性的溶液，诸如含细胞的细胞培养收获物、(基本上)不含细胞的细胞培养上清液，或含有来自纯化阶段的感兴趣蛋白的溶液。

“病毒”或“病毒粒子”是指超显微的(直径大约20-300nm)、代谢惰性的传染原，其仅在活的宿主(主要是细菌、植物和动物)细胞内复制：由RNA或DNA核心、蛋白外壳以及在更复杂的类型中，包绕的包膜构成。

“空隙排阻”是指一种化学相互作用，通过该作用，由于被静电排斥和/或不能克服对孔隙入口的物理阻力(其可能由存在于粒子中的孔隙的固有尺寸施加，或其次由在孔隙内存在的静电电荷的物理格式所施加)，因而在用带静电电荷的粒子填充的柱的环境内部样品的至少一个组分被约束从而基本上驻留在柱床的粒子间空间内。

“孔隙排阻模式”或“空隙排阻色谱”是指一种在填充的带静电电荷的粒子的柱中实施的分级分离方法，其中施加到柱的样品体积不大于填充床内的粒子间体积，并且所需的样品组分，诸如蛋白，不能进入粒子的孔隙中，并且因此被约束为通过粒子间空间行进，所述粒子间空间也通常被称为空隙体积。空隙排阻色谱的根本和区别特征是样品不需要被平衡至柱操作条件，其结果是样品条件可以包括被认为不适合用于在带静电电荷的粒子上进行色谱的极高盐浓度和pH值。进一步的根本和区别特征包括其实现缓冲液交换与分级分离相结合的独特能力。在空隙排阻色谱中，所需蛋白在平衡柱的缓冲液中洗脱，而不依赖于施加至柱的样品组成。

在某些实施方案中，样品与固体尿囊素接触至少约15分钟，然后进行将固体与液体级分分离的步骤。在某些其他实施方案中，样品与固体孵育小于15分钟或约15-30分钟，或超过30分钟或约60分钟或超过约60分钟。一般来说，大多数大的生物靶标与尿囊素的结合似乎基本上是瞬时的，并且在比可以进行去除步骤更短的时间内完成。虽然如此，审慎实验室实践(Prudent laboratory practice)推荐系统性地评价孵育时间，并且即使其结果对于特定的应用不具有实质性效应，仍应当对特定的应用指定并坚持一致的处理时间。

在应用本文公开的方法中有用的起始点是简单地将尿囊素以10％w/v的量加入至含有所需蛋白的蛋白制剂中。不需要改变样品条件。实验证据表明内毒素和不溶的尿囊素之间的反应基本上是瞬时的，并且以与实践中随后最快速的去除固体所需的时间相比更少的时间内达到其最高水平。因此孵育时间似乎不是实践中有意义的考虑因素，因而此步骤可以以哪种孵育时间最为便利来进行。虽然如此，审慎实验室实践表明观察一致的时间间隔从而使各实验之间的可重现性最大化。旨在优化从特定的所需蛋白的多个样品(可以定期的或常规的产生)中去除内毒素的程度的实验可以任选地包括调整尿囊素的比例至更高或更低的过饱和浓度，和/或调整制剂的pH，或其盐或其他组分的含量。即使这样的调整可能不影响尿囊素和内毒素之间的相互作用，但它们可能影响内毒素和所需蛋白之间的相互作用，这可能对本发明的技术的能力或任何其它方面产生实质的影响，从而实现所需的内毒素减少。初步的数据表明产物回收可以与存在的尿囊素的量成反比，因此可能有利的是确定实现最佳效应的最小尿囊素量。实验数据还表明此效应对于较大的蛋白更为突出，因此较小的蛋白最可能支持高回收率，而不管尿囊素的极高浓度。本领域技术人员将认识到本文所述的方法可以利用显著大于10％，诸如20％,或30％,或40％,或50％或更高的尿囊素浓度来进行。以此方式执行所述方法的成本效率可以消失，但鉴于尿囊素是相对廉价的商品，这是可以耐受的。

从经尿囊素处理的蛋白制剂中去除固体可以通过任何方便的手段执行，包括过滤、离心、离心和过滤的组合，或其他手段。去除固体的手段不影响本文公开的方法的性能，只要小心不引入额外的内毒素源即可。

正电性空隙排阻步骤不需要平衡蛋白制剂，并且可以适应于其中已经去除了固体的任意蛋白制剂。然而，正电性空隙排阻步骤要确定可以在单个循环中被处理的样品的体积，因为施加至正电性空隙排阻柱的样品体积必须不大于含有正电性空隙排阻色谱介质的柱的粒子间体积。在重力沉降柱中，这样的柱的粒子间体积通常占重力沉降床的体积的约40％。应当避免介质的轴向压缩，因为其将减小粒子间体积并且接下来减小可以施加至特定的正电性空隙排阻柱的样品的体积。已知为UNOsphere Q(Bio-Rad)的色谱介质提供了一种方便的选择来开始，因为其支持迄今观察到的最高空隙排阻效率，尽管如果需要可以评价其他的介质。由于空隙排阻步骤对施加的样品的体积具有特别的依赖性，因此重要的是以这样的方式施加样品，该方式使得样品在施加至柱的行程中被稀释的可能机会最小，因为稀释将会被理解为增加进入柱的样品的体积。如果进入柱的样品的体积超过粒子间体积，则会消弱内毒素去除效率。一种使导致过量样品体积的样品稀释最小化的方法是通过所谓的超容量回路施加样品。另一种方法是使用被设计成允许流面自发地降低至床的顶部的柱，添加样品并使其进入柱直至其已经完全进入，然后施加缓冲液从而驱使样品通过柱。在一些情况下空隙排阻步骤的最有效应用将需要开发适宜的柱平衡缓冲液条件。这样的条件将依赖于被施加的所需蛋白的性质。在碱性蛋白诸如许多IgG单克隆抗体、来源于这样的抗体的Fab和F(ab’)2片段的情况下，平衡缓冲液的适宜起始配方可以是50mM Tris,pH8.0。如果所需蛋白的回收率小于98％，则可以评价一系列实验，在所述一系列实验中NaCl浓度以50mM的增量增加。可以以较小的增量进行进一步的优化。一般来说，支持所需蛋白的足够回收率的最低盐浓度将实现最大的内毒素减少。可以实验性地改变pH。实验数据显示在50mM Tris,pH 8.0中一些IgG单克隆抗体的正电性空隙排阻额外地实现了减少大于99％的非抗体蛋白。在非-IgG蛋白的情况下，起始的适宜平衡缓冲液是50mM Hepes,pH 7.0。与IgG一样，小于98％的回收率提示增加盐浓度，或调整pH可以获得较好的性能。通常更方便的是使用具有与柱平衡缓冲液相同配方的电泳缓冲液，但对于电泳缓冲液可以使用不同的缓冲液。在电泳缓冲液不同于平衡缓冲液的情况下，其可以具有不会损坏柱的任意配方，因为其将不影响所述方法减少内毒素的能力。所进行的用于优化正电性空隙排阻平衡缓冲液的配方的实验可以采用比给定柱的最大体积容量小得多的样品，诸如20％,或10％,或5％,或1％以使所需蛋白的消耗最小化。取决于平衡缓冲液的配方，可以在尿囊素亲和步骤或正电性空隙排阻步骤处观察到内毒素的最大减少。在一些情况下，较有效的步骤的相对贡献可以是高度占优势的。约200cm/hr的线性流速是用于操作正电性空隙排阻步骤的合理流速。较小的流速可以产生较好的结果，但增加处理时间。较大的流速可以产生可接受的结果并且减少处理时间。本领域技术人员将认识到本文所述的方法可以以基本上大于200cm/hr的流速进行，但这样做导致的性能损失可能是无法接受的。

对于本领域技术人员显而易见的是在使用前用1M氢氧化钠来消毒正电性空隙排阻柱和相连接的硬件以最小化其可能有助于内毒素产生的可能性可以是有利的。出于相同的原因，在制备缓冲液期间作出特殊的努力以使其内毒素含量最小化可以是有利的。为此目标的一种实践方法是将所有缓冲液通过膜过滤，所述膜的孔隙大小截止值与分子质量小于约10kDa的球状化合物相符。对于缺少钙或磷酸盐的缓冲液，另一种方式是向缓冲液添加约0.1-0.2％的量的羟磷灰石，然后通过0.22或0.45微米膜过滤。在所有情况下，用来实施所述方法的容器理想的是尽量合理地不含内毒素。鉴于洗涤复合色谱仪以消除内毒物污染源所涉及的劳动，很显然的是独立式成套装备的利用将是非常有利的。

实施例

实施例1.通过尿囊素和空隙排阻色谱的组合从IgG-内毒素混合物减少内毒素。将内毒素添加到处于20mM Hepes,150mM NaCl,pH 7.5中的1mg/mL人IgG(克隆her2)至3,300EU/ml。将30％(w/v)尿囊素添加到此混合物的等分试样中并使其在室温混合15分钟。通过离心澄清上清液。蛋白回收率大于50％，并且上清液的内毒素含量降低了大于99％，达到小于20EU/ml。然后将1mL含IgG的上清液施加到8.8mL用20mM Hepes,150mM NaCl,pH 7.5平衡的填充了正电性多孔粒子(UNOsphere Q,Bio-Rad Laboratories)的重力柱。下一步，施加15ml平衡缓冲液，并在柱的出口处收集1ml级分。通过在280nm和254nm的UV吸光度并且通过LAL动态显色内毒素测定分析洗脱级分。大于90％的IgG在合并的级分4、5和6中洗脱(即，洗脱液体积3-6ml),而可溶的尿囊素仅从级分7向前洗脱。空隙排阻色谱进一步将合并的级分4、5和6中的内毒素水平减少超过95％。尿囊素-介导的共沉淀和正电性空隙排阻色谱的组合减少总内毒素超过99.95％，达到小于1EU/ml。在相关实验(不同之处仅在于空隙排阻柱被平衡至50mM Tris,pH 8.2)中，尿囊素-空隙排阻处理的组合结果为内毒素减小至小于0.01EU/mL。

实施例2.单独通过空隙排阻从IgG-内毒素混合物减少内毒素。将内毒素添加至处于20mM,Hepes 150mM,NaCl pH 7.5中的1mg/mL人IgG(克隆her2)至400EU/ml。使样品在与实施例1中所述的相同条件下进行空隙排阻。约90％的IgG在合并的级分4、5和6中洗脱，并且内毒素含量减少99.6％。

实施例3.通过尿囊素-介导的共沉淀和空隙排阻色谱的组合从蛋白溶液中减少内毒素。将内毒素添加至1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)在20mM Hepes 350mM NaCl pH 7.5中的样品中。样品如在实施例1中那样处理，不同之处在于用于正电性空隙排阻色谱的平衡和洗脱缓冲液含有350mM NaCl。尿囊素-介导的共沉淀将内毒素减少超过99.95％，同时蛋白回收率超过90％。空隙排阻色谱不会实现内毒素的进一步减少，但其有效地从蛋白样品中去除可溶的尿囊素，蛋白回收率超过85％。

实施例4.盐对通过尿囊素-介导的共沉淀去除内毒素的作用。将尿囊素(30％w/v)添加至含有10,000EU/ml的20mM HEPES,pH 7.5的水溶液中。盐浓度选择为0、0.05、0.15、0.5和2M NaCl。在0M NaCl时尿囊素的内毒素去除效率超过99.99％，并且内毒素去除效率不依赖于一直到0.5M NaCl的盐浓度。在2M NaCl，尿囊素的内毒素去除效率增加至99.997％。

实施例5.pH对通过尿囊素-介导的共沉淀去除内毒素的作用。在150mM NaCl以及3.5、5.5、7.5和9.5的pH值重复实施例4中的实验。在所有pH值内毒素去除均超过99.9％，并且在pH 7.5最高(99.99％)。

实施例6.表面活性剂对通过尿囊素-介导的共沉淀去除内毒素的作用。在洗涤剂(0.1-10％Tween 20)的存在下在150mM NaCl重复实施例4所述的实验。在洗涤剂的存在下尿囊素的内毒素去除效率稍稍下降，但却一致地高于99.8％。

实施例7.盐对通过空隙排阻色谱去除内毒素的作用。如实施例1中所述那样，将1ml含有约1,000EU/ml的20mM HEPES,pH 7.5的水溶液施加至8.8mL填充了正电性多孔粒子(UNOsphere Q,Bio-Rad Laboratories)的重力柱。样品、平衡和洗脱缓冲液的盐浓度选择为150、250和350mM NaCl。在350mM NaCl空隙排阻减少的内毒素为35％，在250mM NaCl空隙排阻减少的内毒素为99.99％。在150mM NaCl，正电性空隙排阻将所有洗脱级分的内毒素水平减少至检测限以下(<0.01EU/ml)。

实施例8.pH对通过正电性空隙排阻色谱去除内毒素的作用。在150mM NaCl在pH3.5、5.5和7.5重复实施例7中的实验。在全部pH范围内，正电性空隙排阻色谱将所有洗脱级分的内毒素水平减少至检测限以下(<0.01EU/ml)。

实施例9.有机添加剂与尿囊素组合的作用。含有单克隆IgG的含细胞细胞培养收获物用1％尿囊素联合0.01％依沙吖啶处理。样品处于约7.2的pH和约13.5mS的电导率，这些条件与所谓的生理条件相符，使样品通过装填了包含相等量的金属亲和配体TREN(BioWorks TREN hi-sub)和疏水配体(Macroprep T-丁基)的色谱介质的柱。在前述步骤后的抗体回收率为99％。将样品施加至装填了UNOsphere Q的空隙排阻柱。来自正电性空隙排阻步骤的回收率为99％，与98％的总回收率相对应。内毒素含量小于1EU/mL，去除了大于99％的宿主蛋白污染物，并且DNA减少了超过6个log。总病毒减少大于76％。此实施例说明了尿囊素亲和以及正电性空隙排阻步骤可以间隔一个或多个步骤；可以在有机改性剂的存在下有效地进行尿囊素步骤；并且本文公开的方法除了去除内毒素，还可以具有去除一定范围的污染物的附加益处。

实施例10.能够进行正电性空隙排阻的色谱介质。评价多种市售阴离子交换色谱介质进行正电性空隙排阻色谱的能力。UNOsphere Q和Nuvia Q达到了将实验性IgG单克隆抗体至空隙体积的可接受的排阻。Capto Q不太有效但轻微有效。其他阴离子交换介质获得了低得多的效率，包括GigaCap Q、Tentacle DEAE-Fractogel、Dowex Ag1x4、Q SephadexA25、Q Sepharose Fast Flow和POROS HQ。整体交换介质和膜交换介质完全不适合。这些结果说明不是所有阴离子交换介质都能够进行正电性空隙排阻。尽管UNOsphere Q和Nuvia Q以外的候选物可能是适合的，但这些介质提供了合适的起始之处。

实施例11.具有多模式疏水相互作用-氢键键合-正电性色谱粒子的空隙排阻色谱。制备含有Capto adhere的柱子，Capto adhere是一种声称表现阴离子交换、氢键键合和疏水相互作用官能性的色谱介质。由于除简单正电性以外该色谱介质还具有化学官能性以及在这些官能性之中与引入至柱中的蛋白的协同相互作用，抗体在该色谱介质的结合条件往往在比它们在市售的用于阴离子交换色谱技术的介质上结合的条件具有更宽的范围，这意味着可以进行正电性空隙排阻的条件成比例地缩窄。利用各种浓度的NaCl和各种pH值的实验将50mM乙酸盐,pH 5.0鉴定为适合于介导所施加的抗体的空隙排阻。在这些条件下，Capto adhere所实现的内毒素减少比UNOsphere Q高约10倍。

实施例12.在用5％尿囊素处理后含有22.8内毒素单位/mL的纯化IgG的样品进一步通过阴离子交换色谱以空隙排阻模式在UNOsphere Q上进行处理以去除过多的尿囊素并且进一步减少内毒素水平。在一个实验中，其中柱子用50mM Hepes,150mM NaCl,pH 7.0平衡，内毒素减少至0.472EU/mL。在另一个实验中，其中柱子用50mM Hepes,100mM NaCl,pH7.0平衡，内毒素减少至0.078EU/mL。在另一个实验中，其中柱子用50mM Hepes,50mM NaCl,pH 7.0平衡，内毒素减少至0.022EU/mL。

很显然的是本文公开的方法可在宽范围的规模内实施，从处理体积小于1mL的样品至处理体积为几百或甚至几千升的样品。基于本文提供的信息，将任何特定的应用的规模调整至享受本文公开的方法的最大益处所需的任何水平在本领域普通技术人员的能力范围之内。

本文引用的所有参考文献整体地通过引用并入并用于所有目的，其程度如同每篇单个出版物或专利或专利申请特定地和个别地被指明整体地通过引用并入用于所有目的。当通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相悖时，说明书意在代替和/或优先于任何这样的相矛盾的材料。

在说明书和权利要求书中使用的所有表示成分的量、色谱条件等等的数字要被理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在说明书和附带的权利要求书中给出的数字参数是近似值，其可以根据本发明的方法所要获得的所需性能而发生变化。

在不偏离本发明的方法的精神和范围的前提下可以对所述方法做出许多改型和变化，如对本领域技术人员显而易见的。本文所述的具体实施方案仅作为实施例提供，并且不旨在以任何方式限制。期望说明书和实施例仅被认为是示例性的，本文公开的实施方案的真实范围和精神由下面的权利要求指示。

Claims (26)

1.一种方法，包括：(i)将过饱和量的尿囊素添加至蛋白制剂中，所述蛋白制剂包含所需蛋白和作为污染物的至少一种内毒素，其中所述所需蛋白是抗体；(ii)在步骤(i)后去除固体以提供样品用于进一步纯化；(iii)提供包括填充在柱中的正电性粒子的填充粒子床，所述填充粒子床具有粒子间体积；(iv)用被选择用于防止所述所需蛋白与所述柱中的正电性粒子结合的缓冲液平衡所述填充粒子床，其中所述缓冲液具有6-8的范围的pH，并且所述缓冲液具有0mM-150mM的范围的氯化钠浓度；(v)将样品体积施加到所述填充粒子床，其中所述正电性粒子支持空隙排阻色谱，并且其中所述样品体积不大于所述粒子间体积；和(vi)洗脱包含所述所需蛋白和减少量的所述内毒素的经纯化样品，其中洗脱的所述所需蛋白驻留在平衡所述柱的缓冲液中。

2.权利要求1所述的方法，其中尿囊素的过饱和量是选自由下列各项组成的组的量：(i)5％，(ii)6％-10％，和(iii)15-20％，其中所述量作为重量/体积提供。

3.权利要求1所述的方法，其中尿囊素的过饱和量是选自由下列各项组成的组的量：(i)0.6-6％，(ii)10％-15％，(iii)20-50％，和(iv)大于50％，其中所述量作为重量/体积提供。

4.权利要求1所述的方法，其中尿囊素的过饱和量是10％的量，其中所述量作为重量/体积提供。

5.权利要求1所述的方法，其中去除所述固体包括选自由下列各项组成的组中的一种：沉降、离心、过滤、及其组合。

6.权利要求1所述的方法，其中在步骤(i)之前、期间或之后调整所述蛋白制剂的pH或盐浓度。

7.权利要求1所述的方法，其中在步骤(iii)之前调整所述蛋白制剂的pH或盐浓度。

8.权利要求1所述的方法，其中所述样品体积相对于填充床的所述样品体积为小于40％。

9.权利要求1所述的方法，其中所述样品体积相对于填充床的所述样品体积为小于35％。

10.权利要求1所述的方法，其中所述样品体积相对于填充床的所述样品体积为小于30％。

11.权利要求1所述的方法，其中所述样品体积相对于填充床的所述样品体积为小于20％。

12.权利要求1所述的方法，其中所述样品体积相对于填充床的所述样品体积为小于10％。

13.权利要求1所述的方法，其中施加至所述床的所述样品体积比所述粒子间体积小一个增量，所述增量为所述粒子间体积的99％。

14.权利要求1所述的方法，其中施加至所述床的所述样品体积比所述粒子间体积小一个增量，所述增量为所述粒子间体积的95％。

15.权利要求1所述的方法，其中施加至所述床的所述样品体积比所述粒子间体积小一个增量，所述增量为所述粒子间体积的90％。

16.权利要求1所述的方法，其中施加至所述床的所述样品体积比所述粒子间体积小一个增量，所述增量为所述粒子间体积的80％。

17.权利要求1所述的方法，其中施加至所述床的所述样品体积比所述粒子间体积小一个增量，所述增量为所述粒子间体积的70％。

18.权利要求1所述的方法，其中施加至所述床的所述样品体积比所述粒子间体积小一个增量，所述增量为所述粒子间体积的60％。

19.权利要求1所述的方法，其中施加至所述床的所述样品体积比所述粒子间体积小一个增量，所述增量为所述粒子间体积的50％。

20.权利要求1所述的方法，其中施加至所述床的所述样品体积比所述粒子间体积小一个增量，所述增量为所述粒子间体积的25％。

21.权利要求1所述的方法，其中施加至所述床的所述样品体积比所述粒子间体积小一个增量，所述增量为和所述粒子间体积的10％。

22.权利要求1所述的方法，其中所述柱中的正电性粒子选自由下列各项组成的组：UNOsphere Q、Nuvia Q和Capto Q。

23.权利要求1所述的方法，其中步骤(v)和(vi)在300cm/hr或更低的非零线性流速执行。

24.权利要求1所述的方法，其中步骤(v)和(vi)在200cm/hr或更低的非零线性流速执行。

25.权利要求1所述的方法，其中步骤(v)和(vi)在100cm/hr或更低的非零线性流速执行。

26.权利要求1所述的方法，其中步骤(v)和(vi)在50cm/hr或更低的非零线性流速执行。