JP2001139600A - Ｉｌ−６ｒ・ｉｌ−６融合蛋白質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】工業的規模でＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質
を変性や失活を生じさせずに高純度に精製するための精
製方法を提供する。 【解決手段】ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質を含
有する溶液を流動床中に浮遊する吸着体粒子に接触させ
た後、溶離液を送液して吸着体粒子への吸着画分を溶出
し回収することを特徴とする、前記ＩＬ−６ＲとＩＬ−
６との融合蛋白質の精製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子組換え微生
物や遺伝子組換え動物細胞等を培養することによって製
造し得る、人工蛋白質であるＩＬ−６レセプター（イン
ターロイキン−６レセプター、以下「ＩＬ−６Ｒ」と略
記する）とＩＬ−６（インターロイキン−６、以下「Ｉ
Ｌ−６」と略記する）との融合蛋白質（以下「ＩＬ−６
Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質」と略記する）を精製する方法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、Ｉ
Ｌ−６とその受容体であるＩＬ−６Ｒを遺伝子工学的手
法により結合させた人工蛋白質であり、例えば全アミノ
酸を含む天然ヒトＩＬ−６Ｒと全アミノ酸前記を含む天
然ヒトＩＬ−６を３個から１８個程度のペプチドリンカ
ーを介して融合したもの（国際公開（ＷＯ）９７／３２
８９１号、同９９／０２５５２号）、天然ヒトＩＬ−６
ＲのＮ末端１１２〜３３３位までの部分アミノ酸残基の
Ｃ末端側に天然ヒトＩＬ−６のＮ末端３８〜２１２位ま
での部分ＩＬ−６を直接（リンカーを介することなく）
融合させたもの（特願平１１−８８６５０等）等、種々
のものが知られている。中でもペプチドリンカーを解す
ることなく両者を直接結合したものは、ペプチドリンカ
ーの抗原性を考慮する必要がないために、造血幹細胞増
殖用医薬品等の臨床分野での応用が試みられている（Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２
巻、２８５９頁、１９９５年参照、Ｂｌｏｏｄ、７４
巻、１２４１頁、１９８９年）。

【０００３】以上のような種々のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６
融合蛋白質は天然には存在しないため、遺伝子工学的手
法を用いて遺伝子組換え微生物や遺伝子組換え動物細胞
等を製造し、これを培養することによってはじめて製造
し得る。ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質に限らず、生
体成分として本来天然には存在し得ない蛋白質を生産し
臨床応用するためには、通常遺伝子工学的手法により微
生物や動物細胞にこれをコードする遺伝子を導入し、大
量に発現させ、その細胞破砕液や培養液を原料としてク
ロマトグラフィーにより精製し、宿主として使用した微
生物や動物細胞に由来する夾雑蛋白質を除去するための
精製工程が必須である。

【０００４】クロマトグラフィーによる蛋白質の精製
は、使用する担体と精製されるべき蛋白質間の相互作用
の原理に基づき、イオン交換クロマトグラフィー、疎水
性相互作用クロマトグラフィー、アフィニテイクロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマ
トグラフィーに分類される。そして、通常は精製度を上
げるために、精製されるべき蛋白質と夾雑物の物理的性
質等の差異を指標として異なる種類のクロマトグラフィ
ーを組み合わせた精製工程を実施することになるが、組
み合わせるクロマトグラフィーの種類、順序、そして吸
着、洗浄、溶出条件等は、試行錯誤の後、経験的に決め
ることになる。これは、精製されるべき蛋白質と夾雑物
双方の複雑性、クロマトグラフィー技術の幅広い柔軟性
が原因で、分離に影響するパラメーターを最適化するこ
とが極めて困難であるからである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、インタ
ーロイキンを始め、蛋白質を高純度に精製するために
は、精製されるべき蛋白質と夾雑物の物理的性質の差異
等を踏まえたうえでのクロマトグラフィーパラメーター
の最適化が要求される。

【０００６】一方、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の
ような融合蛋白質を精製する場合には、該蛋白質が本来
天然には存在しない蛋白質であること、そして融合され
た蛋白質それぞれの物理的性質を考慮する必要があるた
め、天然の蛋白質を精製する場合に比べ、クロマトグラ
フィーパラメーターの最適化は困難になる。しかも、精
製したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を医薬品等とし
て使用する場合には、精製工程において融合蛋白質の変
性や失活が起こらないことや、一度に大量の原料を処理
し得ることが必須となる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って本願発明の目的
は、遺伝子組換え微生物や遺伝子組換え動物細胞等を培
養した後の培養液や細胞破砕液から、工業的規模でＩＬ
−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を変性や失活を生じさせず
に高純度に精製するための精製方法を提供することにあ
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成すべくな
された本願請求項１の発明は、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融
合蛋白質を変性、失活させることなく工業的に精製し得
る精製方法であり、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を
含有する溶液を流動床中に浮遊する吸着体粒子に接触さ
せた後、溶離液を送液して吸着体粒子への吸着画分を溶
出し回収することを特徴とする。

【０００９】また本願請求項２の発明は、請求項１の発
明に係り、ＩＬ−６ＲとＩＬ−６との融合蛋白質を含有
する溶液を吸着体粒子が浮遊する流動床に対して上方か
ら送液した後、溶離液を下方から送液して吸着体粒子へ
の吸着画分を溶出し回収することを特徴とする。本願請
求項３の発明は、請求項１又は２の発明に係り、前記吸
着体粒子が陽イオン交換体であることを特徴とする。本
願請求項４の発明は、請求項１又は２の発明に係り、溶
離液の送液により回収された画分を、更に陽イオン交換
クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィ
ー、アフィニテイクロマトグラフィ、ゲルろ過クロマト
グラフィー及び限外ろ過膜処理からなる精製処理の一種
以上に供することを特徴とする。そして本願請求項５の
発明は、請求項４の発明に係り、前記精製処理が吸着体
粒子が有する吸着基と同一の吸着基を有する担体を用い
るクロマトグラフィーであることを特徴とする。以下、
本発明を詳細に説明する。

【００１０】精製原料となるＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合
蛋白質を含有する溶液は、該融合蛋白質を生産し得るよ
うに遺伝子組換えされた微生物や動物細胞等であるが、
特にこれらに制限されない。具体的には、遺伝子工学的
手法によりＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質遺伝子を微
生物や動物細胞に導入して大量に発現させ、これらの細
胞破砕液や培養液を原料として用いることが例示でき
る。中でもピキア属に属する酵母を宿主細胞として、こ
れにＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質遺伝子を導入した
遺伝子組換え酵母の培養液を精製原料として用いること
が特に好ましい。本願発明者らの知見によれば、ピキア
属に属する酵母を宿主として用いることによりＩＬ−６
Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の大量発現が容易であるため、
本願発明の精製方法と組み合わせることで高純度のＩＬ
−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を大量に取得可能となるか
らである。

【００１１】なお精製原料としては、細胞破砕液や培養
液等をそのまま用いることもできるが、更にはそれらを
緩衝液や純水によって希釈した調製液や、限外ろ過膜処
理又は硫酸アンモニウム等の無機塩を用いた塩析操作等
を行った濃縮液を用いることもできる。

【００１２】上記の精製原料を流動床中に浮遊する吸着
体粒子に接触させた後、溶離液を送液して吸着体粒子へ
の吸着画分を溶出し回収する。流動床中に浮遊した吸着
体粒子を用いて蛋白質を精製する技術（吸着流動床技
術）は、不溶性物質、細胞、固形物等の除去や精製原料
の濃縮等の前処理を必要とせず、クルードな培養液から
直接目的の蛋白質を精製回収することを可能とする技術
である（特表平６−５０００５０号）。本願発明では、
吸着体粒子としてイオン交換基、好ましくは陽イオン交
換基を有する粒子を使用する。好ましい吸着体粒子は、
例えば、イオン交換基としてカルボキシメチル（ＣＭ）
基、スルホエチル（ＳＥ）基、特に好ましくはスルホプ
ロピル（ＳＰ）基を有し、基剤がセルロース基剤、アガ
ロース基剤、デキストラン基剤、シリカ基剤又は合成ポ
リマー基剤の吸着体粒子が例示できる。ＳＰ基を有する
吸着体粒子を含む装置（商品名；吸着流動床ストリーム
ライン−ＳＰ（カラム；ＳＴＬＥＡＭＬＩＮＥ Ｃ−５
０；５ｃｍＩＤ×１００ｃｍ、ゲル；ストリームライン
用ＳＰ；３００ｍｌ、アマシャムファルマシアバイオテ
ク社製）は本願発明に特に好適な吸着体粒子である。吸
着体粒子の選択は、精製原料に含まれると予想される夾
雑物の物理的性質等を考慮したうえで適当なものを選択
すればよい。夾雑物は精製原料により異なるが、遺伝子
組み換え微生物又は遺伝子組換え動物細胞の培養液が精
製原料である場合には、当該微生物や動物細胞が生産し
分泌する蛋白質等の他、これら微生物や動物細胞の細胞
断片等である。

【００１３】まずＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を含
有する精製原料を緩衝液等により希釈してｐＨ及びイオ
ン強度を調製し、吸着体粒子に接触させる。希釈後のｐ
Ｈは、前記したように陽イオン交換基を有する吸着体粒
子を使用するのであれば２．０〜７．０、好ましくはｐ
Ｈ４．５〜５．５である。ｐＨの調製は、精製原料を適
当な緩衝液で希釈することで容易に行い得る。希釈液は
酸性側で緩衝能を有するものであれば特に制限はなく、
例えば、酢酸塩緩衝液を例示することができる。そして
最終的には、例えば５０％酢酸水溶液等の適当な酸性溶
液を加えることで所望のｐＨに調製する。希釈後のイオ
ン強度は、電気伝導度計を用いてＮａＣｌ濃度に換算し
て２００ｍＭ以下、好ましくは４０〜７０ｍＭ、さらに
好ましくは５０ｍＭ程度である。

【００１４】吸着体粒子は予め適当な緩衝液で平衡化し
ておく。平衡化は、精製原料ｐＨを調製するのに用いた
のと同一で、精製原料と同程度のｐＨに調製された緩衝
液を使用することが好ましい。前記好ましく陽イオン交
換基を有する吸着体粒子を用い、精製原料のｐＨをｐＨ
２．０〜ｐＨ７．０程度に調製する場合には、例えばｐ
Ｈ３．０〜６．０、好ましくはｐＨ４．５〜５．５であ
る。

【００１５】精製原料を吸着体粒子と接触させ、好まし
くは精製原料の希釈に用いた緩衝液又は前記平衡化に用
いた緩衝液を用いて吸着体粒子を洗浄した後、適当な溶
出液を供することにより吸着体粒子に吸着したＩＬ−６
Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を溶出させる。溶出液は、前記
したような条件でＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を吸
着体粒子に吸着させた場合には、例えば弱酸性から弱ア
ルカリ性側のｐＨを有する及び／又は高イオン強度であ
る、例えば、５００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ６．４）等を使用することが例示で
きる。

【００１６】具体的な精製の一例について説明すると、
ピキア属に属する酵母組換え体の培養液を精製原料とす
るのであれば、吸着体粒子として陽イオン交換基（Ｓ
Ｐ）を有する粒子を選択することが例示できる。ピキア
属に属する酵母でＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を発
現させると、糖鎖が結合したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合
蛋白質が得られるため、糖鎖の有無に基づく精製が有効
であり、これを行ううえで陽イオン交換基（ＳＰ）が好
適だからである。吸着体粒子は処理しようとする精製原
料の液量、予想される総蛋白質を考慮のうえ、適当量を
適当なサイズのカラム（例えばガラス製のカラム等）に
充填し、ｐＨ３．０〜６．０、好ましくはｐＨ４．５〜
５．５に調製した５．０〜１００ｍＭの酢酸塩緩衝液で
平衡化しておく。

【００１７】吸着体粒子を適当なカラムに充填して平衡
化し、沈降させた後、好ましくはカラム下部開口から上
方向に向けて平衡化に用いた緩衝液を送液し、吸着体粒
子を浮遊させる。この際カラム内では、カラム下方から
上昇する緩衝液の流速と重力により沈降しようとする吸
着体粒子の間で均一な浮遊平衡状態（流動床）が形成さ
れることになる。かかる流動床が形成されたカラム内
に、カラム下部開口から精製原料を上方向に向けて送液
し、吸着体粒子と接触させる。精製されるべきＩＬ−６
Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を吸着体粒子に吸着させ、一方
で精製原料中の夾雑物は吸着体粒子を素通りさせてカラ
ム上部出口から排出除去する。また吸着体粒子にゆるく
吸着した夾雑物は、引き続きカラム下部開口から上方に
向けて緩衝液を送液することで洗浄し、カラム上部出口
から排出除去する。前記のとおり洗浄緩衝液としては精
製原料の希釈に用いた緩衝液等を用いれば良いが、ＩＬ
−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質と夾雑物の物理的性質等の
相違に着眼し、これらとは異なる洗浄液を別途調製のう
え使用しても良い。

【００１８】ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は、上記
における送液方向を逆転し、溶出液をカラム上部開口か
ら下方向に向けて送液することにより回収できる。溶出
液は、上記例の場合には弱酸性から弱アルカリ性側のｐ
Ｈを有する及び／又は高イオン強度である、例えば、５
００ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸塩緩衝液
（ｐＨ６．４）等を用いれば良い。溶出する蛋白質は２
８０ｎｍの吸収を測定することで回収することができ
る。即ち、２８０ｎｍの吸収を連続的にモニターして吸
収の上昇段階から回収を開始し、吸収が例えば観察され
た最大吸収の１０％程度まで減少するまで溶出した液を
連続して回収する等すれば良い。回収画分は２〜８℃で
冷蔵し、又は、−８０〜−２０℃で冷凍して保管するこ
とが好ましい。

【００１９】回収画分中にＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋
白質が存在するか否か、またその量（濃度）は、例えば
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過
クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー手法、エン
ザイムイムノアッセイ等の免疫測定の手法、一般的な蛋
白質検定の手法により知ることができる（Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１９９巻，４７頁，１９９６年等
参照）。

【００２０】本願発明の好ましい態様では、上記流動床
から回収したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６画分を引き続き陽イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマト
グラフィー、アフィニテイクロマトグラフィー、ゲルろ
過クロマトグラフィー及び限外ろ過膜処理からなる精製
処理の一種以上に供し、更に高純度化等する。この付加
的な精製処理工程のなかでも限外ろ過膜処理を行えばＩ
Ｌ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質の濃縮、緩衝液の交換、
脱塩、更には分子量サイズの大きな夾雑物の除去が容易
であり、他のクロマトグラフィー処理ではＩＬ−６Ｒ・
ＩＬ−６融合蛋白質の更なる高純度化と蛋白質的な均一
性の向上が容易である。従って、精製処理工程を付加的
に実施する場合は、限外ろ過膜処理とクロマトグラフィ
ー処理の少なくとも２種類以上の工程を行うことが好ま
しい。

【００２１】上記の付加的な精製処理は、陽イオン交換
クロマトグラフィーであれば前記吸着体粒子が有する陽
イオン交換基と同様の吸着基を有する担体を用いること
が好ましく、特に好ましくはスルホプロピル基を有する
担体（例えば商品名；ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ、東
ソー（株）製）であり、疎水性相互作用クロマトグラフ
ィークロマトグラフィーであれば、例えば吸着基として
オクチル基、ベンゾイル基、フェニル基、ブチル基、エ
ーテル基を有するセルロース基剤、アガロース基剤、デ
キストラン基剤、シリカ基剤又は合成ポリマー基剤製の
担体から、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質と夾雑物と
の物理的性質の差異を検討して適当な担体を選択して用
いることが好ましい。またゲルろ過クロマトグラフィー
を行うのであれば、アガロース系、デキストラン系、ポ
リアクリルアミド系、セルロース系又は合成ポリマー系
の担体を用いることが例示できる。ゲルろ過クロマトグ
ラフィーにおいては、一回にカラムに供するＩＬ−６Ｒ
・ＩＬ−６融合蛋白質画分の液量をゲルろ過剤のカラム
ベッド量の１０％以下、さらに好ましくは１〜５％とす
ることが好ましい。このため、ゲルろ過クロマトグラフ
ィーに先立っては限外ろ過等による濃縮を行うことが特
に好ましい。ゲルろ過クロマトグラフィーを行うのであ
れば、アガロース系、デキストラン系、ポリアクリルア
ミド系、セルロース系又は合成ポリマー系の担体で、排
除限界分子量として５００万以下、好ましくは５０万以
下、特に好ましくは２０万程度のもの（例えば商品名；
ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ、東ソー（株）製）を使
用する。アフィニティクロマトグラフィーを行うのであ
れば、例えば合成ポリマー系の基材に抗ＩＬ−６Ｒ抗体
又は抗ＩＬ−６抗体を固定した担体や、ｇｐ１３０蛋白
質（特許第２８９８０６４号）を固定した担体を用いる
ことが例示できる。そして限外ろ過膜処理を行うのであ
れば、その材質には特に制限されることなく、分画分子
量１０００〜１００万、好ましくは１万〜１０万、更に
好ましくは分画分子量が３万程度の限外ろ過膜（例えば
商品名；Ｐｅｌｉｃｏｎ ＸＬ、日本ミリポア（株）
製）を用いることが例示できる。

【００２２】この付加的な精製処理工程について、ピキ
ア属に属する酵母組換え体の培養液を精製原料とし、流
動床から回収したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６溶出画分を例と
して具体的に説明すると、流動床から回収したＩＬ−６
Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分を、まず、好ましくは限外
ろ過膜処理に供する。限外ろ過膜の種類は特に限定され
ず、分画分子量１０００〜１００万、好ましくは１万〜
１０万、さらに好ましくは２万〜５万の限外ろ過膜を例
示できる。限外ろ過膜処理により緩衝液の交換、脱塩、
さらには夾雑物質の除去が容易であるが、目的に応じて
限外ろ過膜処理機構における透過液、保持液にＩＬ−６
Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質をおき、安定に回収することが
できる。特に引き続き陽イオン交換クロマトグラフィー
を実施する場合は、脱塩及び緩衝液交換を目的として限
外ろ過膜処理を行うことが好ましい。

【００２３】次に、限外ろ過膜処理により調製されたＩ
Ｌ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分を好ましくは陽イオ
ン交換クロマトグラフィーに供する。限外ろ過膜処理後
のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分中のＩＬ−６Ｒ
・ＩＬ−６融合蛋白質を分離するうえで好適な陽イオン
交換体として、例えばイオン交換基がスルホプロピル基
であるものを使用することが例示できる。スルホプロピ
ル基を有するイオン交換体を充填後ｐＨ３．０〜６．
０、好ましくはｐＨ４．５〜５．５に調製した酢酸塩緩
衝液で平衡化したカラムに、限外ろ過膜処理により調製
されたＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分を供して陽
イオン交換基に接触させ、前記平衡化緩衝液で洗浄す
る。洗浄による溶出液の２８０ｎｍにおける吸収が充分
低下した後、塩化ナトリウムの濃度を連続的、あるいは
段階的に変えてＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を溶出
させる。ここで溶出するＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白
質は、前記した流動床からの回収と同様の方法により回
収することができる。次に陽イオン交換クロマトグラフ
ィーで回収したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分
を、好ましくはゲルろ過クロマトグラフィー処理に供す
る。ゲルろ過クロマトグラフィーでは、特にＩＬ−６Ｒ
・ＩＬ−６融合蛋白質と夾雑物の分子サイズの相違を考
慮し、ゲルろ過剤の排除限界分子量として５００万以
下、好ましくは５０万以下、さらに好ましくは２０万程
度のものを使用することが好ましい。かかるゲルろ過剤
を充填した適当なサイズのカラムをｐＨ５．０〜８．
０、好ましくはｐＨ６．５〜７．５に調製した、１０〜
１０００ｍＭ程度のＮａＣｌを含む５〜５００ｍＭのリ
ン酸塩緩衝液で平衡化し、前記回収した画分を供する。
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質はカラムに供した後２
８０ｎｍにおける吸収を指標にして連続的に回収するこ
とができるが、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質は標準
蛋白質の保持時間から算出して、分子サイズ３〜７万付
近に溶出される。

【００２４】

【発明の効果】本願発明の精製方法によれば、遺伝子組
換え微生物や遺伝子組換え動物細胞等により発現させた
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質を精製することができ
る。特に本願発明の方法は一度に大量の精製原料を容易
に処理可能な方法であり、特に純化ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−
６融合蛋白質の工業的な生産に有用である。

【００２５】

【発明の実施の形態】以下、本発明をさらに詳細に説明
するために実施例を示すが、本発明はこれら実施例に限
定されるものではない。

【００２６】実施例１ 特願平１１−１８８６５０号公報に記載した方法に従
い、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質発現ピキア属酵母
を調製、培養し、培養液（１０．０リットル）を得た。
前記培養液を遠心分離操作によりピキア属酵母菌体と上
清（８．５リットル）に分離し、上清を精製原料とし
た。なお、蛋白質の定量は、市販の定量キット（商品
名；プロテインアッセイキット、日本バイオ・ラッドラ
ボラトリー社製）を使用した。また、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ
−６融合蛋白質の確認は、特願平１１−１８８６５０号
記載の方法に従った。

【００２７】精製原料に対し、電気伝導度計でモニター
しながら２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）及び純水
を添加し、ＮａＣｌ濃度として約５０ｍＭとなるまで希
釈した。更にｐＨメーターをモニターしながら５０％酢
酸水溶液を滴下し、ｐＨを５．０とした。

【００２８】ＳＰ基を有する吸着体粒子を含む市販の装
置（商品名；吸着流動床ストリームライン−ＳＰ（カラ
ム；ＳＴＬＥＡＭＬＩＮＥ Ｃ−５０；５ｃｍＩＤ×１
００ｃｍ、ゲル；ストリームライン用ＳＰ；３００ｍ
ｌ、アマシャムファルマシアバイオテク社製）に対し、
２０ｍＭ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）を上方送液するこ
とにより平衡化し、上記のように調製した精製原料（６
２．０リットル、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質量が
１０９ｍｇ、総蛋白質量が２．４ｇ）を線速毎時３００
ｃｍで送液した。精製原料の送液後、平衡化緩衝液を引
き続き上方送液することで充分に洗浄し、カラム上部に
純水を注入してアダプターを下降させ、ゲルをパック状
態にした。次いで、７５ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ
酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．０）を線速毎時３００ｃｍで下
方に向けて送液し、夾雑物を除去した。洗浄による夾雑
物の除去後、２００ｍＭ ＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）グ
リセロールを含む２０ｍＭ リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．
５）を線速毎時１５０ｃｍで下方に向けて送液し、ＩＬ
−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分（２０２ミリリット
ル、ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質量６５ｍｇ、総蛋
白質量１０３ｍｇ）を回収した。

【００２９】次に、回収したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合
蛋白質画分を陽イオン交換クロマトグラフィーに供する
ため、限外ろ過膜処理により緩衝液を交換した。市販の
限外ろ過膜（商品名；ペリコンＸＬ、日本ミリポア社
製）に０．４５マイクロメーターのメンプランフィルタ
ー（日本ミリポア社製）でろ過した回収画分を供した。
限外ろ過膜処理の間、適宜、５％（ｖ／ｖ）グリセロー
ルを含む２０ｍＭ 酢酸塩緩衝液を保持液であるＩＬ−
６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質溶液に添加することにより、
緩衝液の交換を行った。緩衝液交換はｐＨ及び電気伝導
度の測定値を目安として行った。

【００３０】引き続き限外ろ過膜処理後のＩＬ−６Ｒ・
ＩＬ−６融合蛋白質画分を、陽イオン交換クロマトグラ
フィー処理に供した。陽イオン交換クロマトグラフ用カ
ラム（商品名；ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５ＰＷ（２１．５
ｍｍＩＤ×１５ｃｍ）東ソー（株）製）を５％（ｖ／
ｖ）グリセロールの２０ｍＭ 酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．
０）で平衡化した後、流速８．０（ミリリットル／分）
で前記画分を送液した。送液後、前記平衡化緩衝液でカ
ラムを洗浄し、平衡化緩衝液と１０００ｍＭ ＮａＣｌ
を含む２０ｍＭ 酢酸塩緩衝液を用いて９５〜１９５ｍ
ＭのＮａＣｌ濃度勾配によりＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合
蛋白質画分を流速毎分８．０ミリリットルで溶出させ、
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分７５ミリリットル
を回収した（ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質量５８ｍ
ｇ、総蛋白質量７１ｍｇ）。

【００３１】陽イオン交換クロマトグラフィー処理で回
収したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分は、引き続
き、ゲルろ過クロマトグラフィー処理に供した。ゲルろ
過クロマトグラフィーの前処理として、０．４５マイク
ロメーターのメンプランフィルター（日本ミリポア社
製）でろ過したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分
を、限外ろ過膜（商品名；ペリコンＸＬ、日本ミリポア
社製）により濃縮した。濃縮液（２１ミリリットル）を
１００ｍＭ ＮａＣｌの２０ｍＭ リン酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ６．５）で平衡化したゲルろ過クロマトグラフィーカ
ラム（商品名；ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（２１．
５ｍｍＩＤ×３０ｃｍ）東ソー（株）製）に、毎分５．
０ミリリットルで送液、添加し、２８０ｎｍにおける吸
収のモニター結果と標準蛋白質の保持時間を指標として
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質画分を回収した。これ
により最終的に４５ミリグラムの精製ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ
−６融合蛋白質が回収された。

【００３２】実施例２ 精製物のＨＰＬＣ分析 実施例１における精製原料である培養遠心上清、流動床
からの回収画分、陽イオン交換クロマトグラフィー処理
での回収画分、そして、ゲルろ過クロマトグラフィー処
理での回収画分中のＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質精
製純度を次の二つのＨＰＬＣ分析による確認した。

【００３３】（１）ゲルろ過クロマト分析 ゲルろ過クロマトグラフィー用カラム（商品名；ＴＳＫ
ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（７．８ｍｍID×３０ｃｍ）東
ソー（株）製）を用い、溶離液（１００ｍＭＮａＣｌを
含む２０ｍＭ リン酸塩緩衝液（ｐＨ６．５））を流速
毎分１．０ミリリットルで送液し、２８０ｎｍの吸光度
を検出した。

【００３４】（２）逆相クロマト分析 逆相クロマトグラフィー用カラム（商品名；ＴＳＫｇｅ
ｌ Ｏｃｔｙｌ８０ｔｓ（４．６ｍｍＩＤ×１５ｃｍ）
東ソー（株）製）を用い、溶離液（０．０５％トリフル
オロ酢酸のアセトニトリル２０〜８０％（ｖ／ｖ）水溶
液）を流速毎分１．０ミリリットルで送液し、２８０ｎ
ｍの吸光度を検出した。

【００３５】図１は精製原料である遠心培養上清、図２
は流動床からの回収画分、図３は陽イオン交換クロマト
グラフィー処理での回収画分、図４はゲルろ過クロマト
グラフィー処理での回収画分について、それぞれ上記分
析を行った結果を示す。

【００３６】図１〜４に示すように各精製処理を経るに
従って夾雑物は除去され、最終処理として行ったゲルろ
過クロマトグラフィーで回収したＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６
融合蛋白質はシングルピークを示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は精製原料である培養遠心上清のＨＰＬＣ
ゲルろ過クロマト分析（左側のグラフ）及び逆相クロマ
ト分析（右側のグラフ）の結果を示す図である。図中の
矢印はＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質のピークを示
す。

【図２】図２は流動床からの回収画分のＨＰＬＣゲルろ
過クロマト分析（左側のグラフ）及び逆相クロマト分析
（右側のグラフ）の結果を示す図である。図中の矢印は
ＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋白質のピークを示す。

【図３】図３は陽イオン交換クロマトグラフィー処理で
の回収画分のＨＰＬＣゲルろ過クロマト分析（左側のグ
ラフ）及び逆相クロマト分析（右側のグラフ）の結果を
示す図である。図中の矢印はＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合
蛋白質のピークを示す。

【図４】図４はゲルろ過クロマトトグラフィー処理での
回収画分のＨＰＬＣゲルろ過クロマト分析（左側のグラ
フ）及び逆相クロマト分析（右側のグラフ）の結果を示
す図である。図中の矢印はＩＬ−６Ｒ・ＩＬ−６融合蛋
白質のピークを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｚ Ｆターム(参考） 4B064 AG03 AG20 CA06 CA19 CC24 CE06 CE07 CE10 CE11 CE12 DA01 4H045 AA20 BA10 CA40 DA02 DA51 EA24 FA72 FA74 GA21 GA22 GA23 GA26

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６との融合蛋
   白質を含有する溶液を流動床中に浮遊する吸着体粒子に
   接触させた後、溶離液を送液して吸着体粒子への吸着画
   分を溶出し回収することを特徴とする、前記ＩＬ−６レ
   セプターとＩＬ−６との融合蛋白質の精製方法。
2. 【請求項２】ＩＬ−６レセプターとＩＬ−６との融合蛋
   白質を含有する溶液を吸着体粒子が浮遊する流動床に対
   して上方から送液した後、溶離液を下方から送液して吸
   着体粒子への吸着画分を溶出し回収することを特徴とす
   る、請求項１の精製方法。
3. 【請求項３】前記吸着体粒子は陽イオン交換体であるこ
   とを特徴とする、請求項１又は２に記載の精製方法。
4. 【請求項４】溶離液の送液により回収された画分を、更
   に陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用ク
   ロマトグラフィー、アフィニテイクロマトグラフィ、ゲ
   ルろ過クロマトグラフィー及び限外ろ過膜処理からなる
   精製処理の一種以上に供することを特徴とする、請求項
   １又は２に記載の精製方法。
5. 【請求項５】前記精製処理は、吸着体粒子が有する吸着
   基と同一の吸着基を有する担体を用いるクロマトグラフ
   ィーであることを特徴とする、請求項４に記載の精製方
   法。