CN105008384A - 在高电导率下在非离子性有机聚合物的存在下的蛋白质纯化 - Google Patents

Abstract

一种从制品中纯化期望蛋白质的方法，其包括：提供制品，所述制品处于具有小于约5％的存在于原始生产基质中的染色质的形式，将制品与足以引起期望蛋白质沉淀或吸附在非离子性亲水表面上的量的非离子性有机聚合物接触，和在接触步骤之前或期间调节盐浓度，所述调节步骤提供足以产生大于生理电导率的电导率的盐浓度。

Description

在高电导率下在非离子性有机聚合物的存在下的蛋白质纯化

相关申请的声明

本申请要求2013年2月28日提交的美国临时申请61/770,890的优先权，其以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

本文中所公开的实施方案涉及用于纯化蛋白质的方法，所述蛋白质包括抗体，所述抗体包括IgG抗体。

用非离子性有机聚合物(例如聚乙二醇(PEG))沉淀蛋白质的技术是已知的。所述技术最常在低盐浓度下和不存在添加盐的情况下使用，但例外也是已知的(D.Gervais等人,美国专利申请2010/0204455A1；K.Ingham,Arch.Biochem.Biophys.186(1978)106-113；K.Yamamoto等人,Virology,40(1970)734-744；S.Branston等人,Biotechnol.Progr.28(2012)129-136)。

空间排阻色谱技术是已知的(J.Lee等人,J.Chromatogr.A 1270(2012)162-170；也参见PCT/SG2012/000199，其以引用的方式并入本文中并且作为附录A被附上)。其利用非离子性亲水表面，非离子性有机聚合物例如PEG诱导期望产物被保留在所述亲水表面上。已经报道了高NaCl浓度能增加病毒结合效率(Lee等人，上文)。也已经报道了在高浓度NaCl的存在下在流化粒子上执行所述技术能增加IgG制品的回收率和纯度(P.Gagnon等人,J.Chromatogr.A,1324:171-180,2014)。

已经描述了用于降低含有单克隆抗体的细胞培养收获物中的染色质含量的方法(H.Gan等人,J.Chromatogr.A,1291(2013)33-40)。已知染色质包括处于被称为核小体的稳定缔合物的DNA和组蛋白。Gan等人报道了染色质和其分解代谢物也与抗体形成缔合物，这限制后续的分级分离方法的效率。他们报道了实现99％的染色质减少的方法，并且进一步报道了所述减少提高了通过阳离子交换色谱获得的纯化质量。Gagnon等人(2013，上文)报道了由Gan等人所报道的技术的一种变体，其用于提高在流化亲水粒子上通过空间排阻色谱分级分离的IgG的回收率和纯度。

发明内容

一种从制品中纯化期望蛋白质的方法，其包括：提供制品，所述制品处于具有小于约5％的存在于原始生产基质中的染色质的形式，将制品与足以引起期望蛋白质沉淀或吸附在非离子性亲水表面上的量的非离子性有机聚合物接触，和在接触步骤之前或期间调节盐浓度，所述调节步骤提供足以产生大于生理电导率的电导率的盐浓度。

具体实施方式

已经意外地发现，与利用已知的高功能生物亲和性色谱方法的当前实践相比，对于已经过调节而被去除至少95％的染色质的期望蛋白质的不纯制品进行的由PEG介导的分级分离方法可以实现更高程度的期望蛋白质的纯化，其中由PEG介导的方法包括期望蛋白质与足以产生大于生理电导率的额外盐接触的至少一个阶段。

在某些实施方案中，本文中所公开的方法提供用于从已经过调节而被去除至少95％的染色质的不纯制品中纯化期望抗体的多步骤方法，其包括以下步骤：(i)在同时存在足以产生大于正常生理电导率的电导率的盐浓度的情况下，使不纯制品与足以引起期望抗体沉淀的量的非离子性有机聚合物接触，(ii)任选地减少或除去混合物中的盐，(iii)将非离子性有机聚合物减少到不足以维持期望抗体处于沉淀状态的浓度，得到高度纯化的抗体，必要时可通过另外的分级分离方法进一步纯化所述高度纯化的抗体。

在某些实施方案中，本文中所公开的方法提供用于从已经过调节而被去除至少95％的染色质的不纯制品中纯化期望抗体的多步骤方法，其包括以下步骤：(i)使不纯制品与足以引起期望抗体沉淀的量的非离子性有机聚合物接触，(ii)加入盐，达到足以产生大于正常生理电导率的电导率的盐浓度，(iii)减少或除去混合物中的盐，(iii)将非离子性有机聚合物减少到不足以在存在至少一种正电性表面的情况下维持期望抗体处于沉淀状态的浓度，和(iv)分离所述至少一个正电性表面与所述制品，得到高度纯化的抗体，必要时可通过另外的分级分离方法进一步纯化所述高度纯化的抗体。

在某些实施方案中，本文中所公开的方法提供用于从已经过调节而被去除至少95％的染色质的不纯制品中纯化期望抗体的多步骤方法，其包括以下步骤：(i)在同时存在足以产生大于正常生理电导率的电导率的盐浓度的情况下，使不纯制品与足以引起期望抗体沉淀的量的非离子性有机聚合物接触，(ii)将非离子性有机聚合物减少到不足以维持期望抗体处于沉淀状态的浓度，得到高度纯化的抗体，必要时可通过另外的分级分离方法进一步纯化所述高度纯化的抗体。

在某些实施方案中，本文中所公开的方法提供用于从已经过调节而被去除至少95％的染色质的不纯制品中纯化期望抗体的多步骤方法，其包括以下步骤：(i)在存在足以产生大于正常生理电导率的电导率的盐的情况下，使不纯制品与足以引起期望抗体在具有非离子性亲水表面的整体柱(monolith)的表面上附着的量的非离子性有机聚合物接触，(ii)用聚合物和盐的清洁溶液洗涤所附着的抗体，然后任选地用不含盐或盐不足的聚合物的清洁溶液洗涤所附着的抗体，(iii)然后通过将非离子性有机聚合物减少到不足以维持期望抗体处于附着状态的浓度来洗脱被纯化的抗体。

在某些实施方案中，本文中所公开的方法提供用于从已经过调节而被去除至少95％的染色质的不纯制品中纯化期望抗体的多步骤方法，其包括以下步骤：(i)使不纯制品与足以引起期望抗体沉淀的量的非离子性有机聚合物接触，(ii)加入盐，达到足以产生大于正常生理电导率的电导率的盐浓度，(iii)减少或除去混合物中的盐，(iii)将非离子性有机聚合物减少到不足以在存在至少一种正电性表面的情况下维持期望抗体处于沉淀状态的浓度，和(iv)分离所述至少一个正电性表面与所述制品，得到高度纯化的抗体，必要时其可通过另外的分级分离方法进一步纯化所述高度纯化的抗体。

在任何前述实施方案中，非离子性亲水粒子可以任选地存在于所述方法的任何阶段。在一些此类实施方案中，非离子性亲水粒子可以具有10纳米、或100纳米、或1微米、或10微米、或100微米、或中间尺寸或更大尺寸的平均尺寸。在一些实施方案中，粒子可以是磁性的或顺磁的，使得它们能被收集在磁场中或磁性表面上。

在某些实施方案中，所述方法可以用死端过滤介质来实施，其中沉淀物被保留，而未沉淀的污染物通过过滤介质并且因此被除去。

在某些实施方案中，所述方法可以通过离心来实施，其中沉淀物被沉降出来，从而使得能够丢弃含污染物的上清液。

在其中方法以离心方式实施的一些实施方案中，通过加入平均分子量为6000的聚乙二醇(PEG-6000)和NaCl以产生含有19％PEG-6000和0.8M NaCl的沉淀溶液来使已被去除至少95％的染色质的不纯IgG制品沉淀。通过离心使沉淀物沉降并且丢弃含污染物的上清液。沉淀的IgG任选地再悬浮于19％PEG-6000、0.8MNaCl和用于赋予期望pH值的缓冲物质的新鲜溶液中，再沉降，并且丢弃上清液。沉淀物然后可以任选地再悬浮于PEG-6000和用于赋予期望pH值的缓冲物质、但是不含盐或盐不足的新鲜溶液中，然后再沉降，此后丢弃上清液。沉淀的高度纯化的IgG然后再溶解于缓冲液中，所述缓冲液被配制成与可能需要的任何后续分级分离步骤或纯化抗体的应用一致。

在其中方法以过滤方式实施的一些实施方案中，通过加入平均分子量为6000的聚乙二醇(PEG-6000)和NaCl以产生含有19％PEG-6000和0.8M NaCl的沉淀溶液来使已被去除至少95％的染色质的不纯IgG制品沉淀。沉淀物被捕获在平均孔径为0.22微米的薄膜滤器上，而含污染物的上清液流过薄膜并且被丢弃。沉淀的IgG任选地再悬浮于19％PEG-6000、0.8M NaCl和用于赋予期望pH值的缓冲物质的新鲜溶液中，再过滤，并且丢弃上清液。沉淀物然后可以任选地再悬浮于由PEG-6000和用于赋予期望pH值的缓冲物质、但是不含盐或盐不足的新鲜溶液中，然后再过滤，此后丢弃上清液。沉淀的高度纯化的IgG然后再溶解于缓冲液中，所述缓冲液被配制成与可能需要的任何后续分级分离步骤或纯化抗体的应用一致，并且IgG任选地过滤通过先前被用于分离沉淀抗体与上清液中的可溶性污染物的相同薄膜。

在其中方法以过滤方式实施并且利用非离子性亲水粒子作为成核中心的一些实施方案中，已被去除至少95％的染色质的不纯IgG制品，加入总计5％w/v的淀粉粒子，随后通过加入平均分子量为6000的聚乙二醇(PEG-6000)和NaCl以产生含有19％PEG-6000和0.8M NaCl的沉淀溶液而使IgG被强降于粒子上。IgG附着在粒子上而不是单纯形成IgG沉淀物。具有附着IgG的粒子被捕获在平均孔径为0.22微米的薄膜滤器上，而含污染物的上清液流过薄膜并且被丢弃。具有附着IgG的粒子任选地再悬浮于19％PEG-6000、0.8M NaCl和用于赋予期望pH值的缓冲物质的新鲜溶液中，再过滤，并且丢弃上清液。具有附着IgG的粒子然后可以任选地再悬浮于PEG-6000和用于赋予期望pH值的缓冲物质、但是不含盐或盐不足的新鲜溶液中，然后再过滤，此后丢弃上清液。经过高度纯化的IgG然后再溶解于缓冲液中，所述缓冲液被配制成与可能需要的任何后续分级分离步骤或纯化抗体的应用一致，并且IgG过滤通过薄膜，所述薄膜保留淀粉粒子而经过纯化的IgG被薄膜保留并丢弃。

在其中方法以磁性粒子方式实施并且利用非离子性亲水粒子作为成核中心的一些实施方案中，已被去除至少95％的染色质的不纯IgG制品，加入总计1％w/v的涂布有淀粉的磁性纳米粒子，随后通过加入平均分子量为6000的聚乙二醇(PEG-6000)和NaCl以产生含有19％PEG-6000和0.8M NaCl的沉淀溶液而使IgG被强降于粒子上。IgG附着在粒子上而不是单纯形成IgG沉淀物。具有附着IgG的粒子被捕获在磁场中，而含污染物的上清液被丢弃。具有附着IgG的粒子任选地再悬浮于19％PEG-6000、0.8M NaCl和用于赋予期望pH值的缓冲物质的新鲜溶液中，再捕获于磁场中，并且丢弃上清液。具有附着IgG的粒子然后可以任选地再悬浮于PEG-6000和用于赋予期望pH值的缓冲物质、但是不含盐或盐不足的新鲜溶液中，然后再捕获于磁场中，此后丢弃上清液。高度纯化的IgG然后再溶解于缓冲液中，所述缓冲液被配制成与可能需要的任何后续分级分离步骤或纯化抗体的应用一致。通过在磁场中捕获纳米粒子来去除纳米粒子。

在其中方法以磁性粒子方式实施并且利用非离子性亲水粒子作为成核中心的一些实施方案中，已被去除至少95％的染色质的不纯IgG制品，加入总计1％w/v的涂布有淀粉的磁性纳米粒子，随后通过加入平均分子量为6000的聚乙二醇(PEG-6000)和NaCl以产生含有19％PEG-6000和0.8M NaCl的沉淀溶液而使IgG被强降于粒子上。IgG附着在粒子上而不是单纯形成IgG沉淀物。具有附着IgG的粒子被捕获在磁场中，而含污染物的上清液被丢弃。具有附着IgG的粒子任选地再悬浮于19％PEG-6000、1.0M NaCl、50mM Tris、pH 8.0的新鲜溶液中，再捕获于磁场中，并且丢弃上清液。高度纯化的IgG然后被再溶解。通过在磁场中捕获纳米粒子来去除纳米粒子，并且将IgG施加到装填有疏水性阴离子交换剂例如Capto adhere(GE Healthcare)的柱上，其中抗体发生结合。然后可以通过将NaCl浓度降低到300mM来洗脱抗体。

在其中方法以固定床色谱方式实施并且利用具有非离子性亲水表面的整体柱作为成核中心用于IgG附着的的一些实施方案中，在存在平均分子量为6000的聚乙二醇(PEG-6000)和NaCl以产生含有19％PEG-6000和0.8M NaCl的沉淀溶液的情况下，使已被去除至少95％的染色质的不纯IgG制品强降于所述整体柱表面上。IgG附着在整体柱表面上而不是产生沉淀物。含污染物的上清液流过整体柱并且被丢弃。用19％PEG-6000、1.0M NaCl、50mM Tris、pH 8.0的新鲜溶液洗涤整体柱。通过施加1.0M NaCl、50mM Tris、pH 8.0的溶液而从整体柱洗脱高度纯化的IgG。在其中期望进行额外纯化的一些此类实施方案中，将IgG任选地施加到装填有疏水性阴离子交换剂例如Capto adhere(GE Healthcare)的柱上，其中抗体发生结合。然后通过将NaCl浓度降低到300mM来洗脱抗体。在一个密切相关的实施方案中，最终的洗涤缓冲液含有19％PEG-6000、50mM MES、pH6.0，并且在50mM MES pH 6.0中洗脱IgG，并将其施加到阳离子交换剂，随后通过增加盐浓度和/或增加pH来洗脱。在一个密切相关的实施方案中，最终的洗涤缓冲液含有19％PEG-6000、50mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 7.0，并且在50mM磷酸钠、100mM NaCl、pH 7.0中洗脱IgG，并将其施加到疏水性阳离子交换剂以进行额外纯化。在一个密切相关的实施方案中，最终的洗涤缓冲液含有19％PEG-6000、10mM磷酸钠、pH 7.0，并且在10mM磷酸钠、pH 7.0中洗脱IgG，并将其施加到羟磷灰石以进行额外纯化。将认识到，除了去除可能存在的额外污染物之外，如上所述的所有额外纯化步骤还具有从IgG制品中去除残余PEG的效果。

在一些实施方案中，期望蛋白质可以是抗体。在一些实施方案中，期望蛋白质可以是IgG抗体。在一些实施方案中，期望蛋白质可以是IgM抗体。在一些实施方案中，期望蛋白质可以是单克隆抗体。在一些实施方案中，期望蛋白质可以是非抗体蛋白质。在一些实施方案中，期望蛋白质可以是凝血因子。在一些实施方案中，期望蛋白质可以是纤维蛋白原。在一些实施方案中，期望蛋白质可以是因子VIII。在一些实施方案中，期望蛋白质可以是因子VIII和血管性血友病因子(von Willebrand factor)的复合物，其中所述复合物也被称为抗血友病因子。

在某些实施方案中，足以产生大于正常生理电导率的电导率的盐浓度可以显著大于正常生理电导率。当正常电导率可以在12到16mS/cm的范围时，被视为显著大于的值可包括20mS/cm、或30mS/cm、或40mS/cm、或50mS/cm、或60mS/cm、或70mS/cm、或80mS/cm、或90mS/cm、或100mS/cm、或150mS/cm、或200mS/cm、或中间值或更高值，例如高达饱和NaCl溶液的电导率。实验数据表明最有效的污染物减少和IgG回收可以在约50到150mS/cm的范围获得，对应于约0.5到约1.5M范围的NaCl浓度。在其它情况下，术语“大于生理电导率”可被理解为17或18或19mS/cm或中间值。应理解，每一IgG的表现都不同，并且其中存在IgG的不纯制品的各种组分也施加影响，因此有必要进行简单实验以确定用于适应特定IgG制品的最有利的电导率。重要的是，认识到除了能够进行PEG沉淀以实现更高纯度的优点之外，污染物(包括酸性污染物)的减少还降低了所述至少一个正电性表面的必需容量，这使得其更有效并且还可以允许减小所述表面的尺寸。

在某些实施方案中，用于增加电导率的盐可以是中性盐，例如氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸钾。在某些实施方案中，盐可以是离液盐，例如乙酸胍、盐酸胍、硫酸胍、磷酸盐、硫氰酸钠或硫氰酸钾等。在某些实施方案中，将避免使用包括硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、磷酸钾的沉淀盐，因为它们具有很强的造成自发相分离的倾向，从而会产生漂浮在浓缩盐溶液顶部的浓缩PEG溶液。对于大多数目的并且特别是作为起点，NaCl通常将是所选的盐。

在某些实施方案中，盐的浓度大于2.0M，或大于2.5M，或大于3M，或大于4M，直到饱和溶液。在一些所述实施方案中，盐是NaCl。在一些所述实施方案中，盐是KCl。

在某些实施方案中，在其中电导率大于生理电导率(特别包括显著大于生理电导率的值)的处理阶段期间，优化操作pH的需求可以降低或暂停。在低导电率值下，pH调整蛋白质间的电荷相互作用。当蛋白质处于其等电点时，其净电荷为零并且其是最低限度地自我排斥的。当pH高于其等电点时，其具有净负电荷，并且随着pH提高其自我排斥性增加。当pH低于其等电点时，其具有净正电荷，并且随着pH降低其自我排斥性增加。因此，当给定IgG处于或接近于其等电点时，其通常促进通过PEG进行沉淀。因为盐离子与溶液中的带电体之间的静电相互作用竞争，所以所述盐离子降低在远离蛋白质等电点的pH值下、蛋白质之间的排斥程度，这减弱或消除pH的影响。在所公开方法的情形中的实际意义在于，在一些实施方案中，产生高电导率的浓度的盐的存在在很大程度上消除了调节pH的需求。为了针对特定不纯制品中的特定IgG定制所述方法，7.0的中性pH成为良好的起点，并且可能不需要调节所述中性pH。

在其中盐以大于2M的浓度存在的一些实施方案中，溶液的pH为7或8或8.5或更高，或6或6.5，或介于6与8.5之间的另一个值，或低于6。

在一些所述实施方案中，盐是NaCl或KCl或其组合，或者任一者或两者与其它盐的组合。

在一些实施方案中，非离子性有机聚合物可以是聚乙二醇(PEG)、或聚丙二醇、或右旋糖酐、或纤维素、或淀粉、或聚乙烯吡咯烷酮等、或组合。

在一些实施方案中，非离子性有机聚合物是聚合物尺寸为约2,000道尔顿(D)、或3,000D、或4,000D、或5,000D、或6,000D、或8,000D、或10,000D、或12,000D、或中间聚合物尺寸的PEG。经验证明平均聚合物尺寸越小，实现沉淀所需的浓度越高。这不仅仅是用于调节质量；存在累进效果，其由以下事实介导：PEG聚合物的有效性与其不依赖于流体动力学半径的质量成比例，使得质量相同但分支程度不同的PEG聚合物具有不同的用于介导沉淀的能力。在一些实施方案中，可以使用聚合物尺寸的组合。

在一些实施方案中，PEG是PEG-6000，并且在生理或更低电导率值下实现IgG沉淀或在那些电导率值下维持IgG处于沉淀状态所需的PEG浓度可以在12％到18％或14-16％的范围。在一些实施方案中，在足以产生约80mS/cm的电导率的盐浓度(例如1M NaCl)下的PEG-6000浓度将需要升高以便实现IgG沉淀和/或维持IgG处于沉淀状态。在其中实现生理浓度下的沉淀所需的PEG-6000浓度是15-16％的一个此类实施方案中，在存在1M NaCl的情况下实现沉淀所需的PEG-6000浓度是18-22％。这反映了盐的一种已知但通常被忽视的作用，借此其降低PEG的流体动力学半径。这些浓度可用作指南或起点，应理解适应每一IgG克隆和其存在于其中的不纯制品的独特的个别特征将需要优化。

在一些实施方案中，不纯的IgG制品可由例如来自哺乳动物细胞、酵母或细菌的细胞培养收获物组成。在一些实施方案中，不纯制品可由培养细胞的提取物组成。在一些实施方案中，不纯的IgG制品可由例如血浆、血清、奶或其它体液等体液组成。

在一些实施方案中，不纯制品可以是已经过处理而被去除细胞的细胞培养收获物。在一个所述实施方案中，收获物可以通过例如离心和过滤等物理方法预先调节。

在所有前述实施方案中，对已经过调节而被去除至少95％清除率的染色质和相关分解代谢物的不纯制品实施所公开的方法不成比例地增加了所述系统实现高度纯化的能力。在一些此类实施方案中，收获物可以通过与一个或多个正电性表面接触而被调节，其中正电荷是由固定在表面上的多价有机离子赋予的。在另一个此类实施方案中，调节方法包括将期望产物制品与可溶性多价有机离子接触。在另一个此类实施方案中，调节方法包括将期望产物制品与可溶性和/或不可溶的多价有机离子接触。

在一些实施方案中，可以通过包括将收获物与一种或多种多价有机离子接触的调节方法使制品的染色质减少到比原始生物来源中低至少95％的水平。在一些此类实施方案中，多价有机离子是正电性的。

在一些实施方案中，可溶性的正电性多价离子包括选自由以下各项组成的阳离子群组中的一种：亚甲蓝、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵和其组合。

在一些实施方案中，多价离子因为共价连接到表面上而是不可溶的。

在一些实施方案中，不可溶的正电性多价离子选自由以下各项组成的群组：伯氨基、仲氨基、叔氨基、季氨基、含有超过一个(由一种或多种类型的氨基赋予的)正电荷的络合阳离子和其组合。

在一些实施方案中，不可溶的正电性多价离子是三(2-氨乙基)胺(TREN)。

在一些实施方案中，多价有机离子是负电性的。

在一些实施方案中，可溶性的负电性多价离子选自由以下各项组成的群组：庚酸、庚烯酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸、癸酸、甲基蓝和其组合。

在一些实施方案中，不可溶的负电性多价离子选自由以下各项组成的群组：二氧磷基(phospho group)、羧基、磺基、含有超过一个(由一种或多种类型的带负电基团所赋予的)负电荷的络合阴离子和其组合。

在一些实施方案中，不可溶的复合负电性多价可以是亚氨基二乙酸或次氮基乙酸。

在一些实施方案中，不可溶的多价离子对金属离子具有1:1亲和性。

在一些实施方案中，尿囊素可以任选地以过饱和浓度存在，所述过饱和浓度处于选自由(a)约0.6％到约50％、(b)约0.7％到约20％、(c)约0.8％到约10％、(d)约0.9％到约5％、(e)约1％到约2％和其中间范围组成的群组的范围。

在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节不纯制品包括将样品与可溶性的正电性有机添加剂接触。在一些此类实施方案中，正电性有机添加剂包括选自由依沙吖啶、亚甲蓝、十六烷基三甲基溴化铵组成的群组的至少一种物质。在一些此类实施方案中，此类物质的浓度或物质组合的总计浓度在0.001到1％、或0.01到0.1％、或0.02到0.05％、或0.01到0.1％的范围、或为中间值。在一些此类实施方案中，制品的pH可被上调到不会引起期望IgG的回收率显著降低的碱性值。在一个此类实施方案中，pH可被上调到抗体等电点的半个pH单位内的pH值，或如果实验结果表明抗体回收率可接受的话，则pH可被上调到抗体等电点的更高pH单位内的pH值，但是所述调节通常不是必需的。就进行任何pH调节来说，蛋白质等电点的1个pH单位内或1.5个pH单位内或2个单位内或更高pH单位内的值将是足够的。

在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节不纯制品包括将样品与可溶性的负电性有机添加剂接触。在一些此类实施方案中，负电性有机添加剂包括选自由庚酸、庚烯酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸、癸酸、甲基蓝组成的群组的至少一种物质。在一些此类实施方案中，此类物质的浓度或物质组合的总浓度在0.001％到10％、或0.01％到1％、或0.1％到0.5％的范围。在一些此类实施方案中，制品的pH可被下调到不会引起期望蛋白质的回收率显著降低的酸性值。在一些此类实施方案中，制品的pH可被调节到3.5到6.5、4.0到6.0、4.5到5.5、5.0到5.3、5.15到5.25的范围，或调节到5.2或另一个中间值。

在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节不纯制品包括将样品与不溶解的尿囊素接触。在一些此类实施方案中，存在于不纯制品中的加入的尿囊素可以合计为约0.6％到50％、或0.7％到20％、或0.8％到10％、或0.9％到5％、或1％到2％或中间值。在一个或多个前述实施方案中，干燥尿囊素的平均粒子尺寸被选择为可用的最小尺寸，目标是实现不溶解的尿囊素在过饱和溶液中的最高总表面积。在一个此类实施方案中，尿囊素经过粒化以产生较小的粒子尺寸。

在一些实施方案中，当固定在固体表面上的多模式有机离子为正电性时，被固定的多峰有机离子可以是含氮基团，例如伯氨基、或仲氨基、或叔氨基、或季氨基、或所述基团的组合或聚合物。在一些此类实施方案中，含氮化合物可以是2(氨乙基)胺(TREN)。在一些实施方案中，带正电的含氮基团可以是亚胺或吡啶或其它正电性的基团。在一些实施方案中，含氮化合物的正电荷可以存在于除氮原子以外的残基上，例如硫原子。

在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节不纯制品包括将样品与浓度低于临界胶束浓度的非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂接触。

在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节不纯制品包括：(i)提供第一组分，其是具有负电性表面的第一固体基底；(ii)使不纯制品与第一组分接触，其中操作条件基本上防止期望蛋白质结合到第一组分上；和(iii)将具有降低的染色质含量的期望蛋白质与第一组分分离。在一些此类实施方案中，第一负电性表面可以伴随有第二负电性表面。

在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节不纯制品包括：(i)提供第一组分，其是具有正电性表面的第一固体基底；(ii)使不纯制品与第一组分接触，其中操作条件基本上防止期望蛋白质结合到第一组分上；和(iii)将具有降低的染色质含量的期望蛋白质与第一组分分离。在一些此类实施方案中，第一正电性表面携带有2(氨乙基)胺残基。在一些此类实施方案中，第一正电性表面可以伴随有第二正电性表面。

在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节不纯制品包括：(i)提供第一组分，其是具有正电性表面的第一固体基底；(ii)提供第二组分，其是具有负电性表面的第二固体基底；(iii)使不纯制品与第一和第二组分接触，其中第一和第二组分被配置成使得不纯制品可以同时接触这两种组分，其中操作条件基本上防止期望蛋白质结合到第一或第二组分上；和(iv)将具有降低的染色质含量的期望蛋白质与第一和第二组分分离。在一些此类实施方案中，第一正电性表面携带有2(氨乙基)胺(TREN)残基。

在一个或多个前述实施方案中，用有机多价离子调节不纯制品包括：(i)使不纯制品与包含能够结合金属的至少一种表面结合配体的至少一个固体表面接触，其中能够结合金属的表面结合配体起初基本上不含金属，其中选择操作条件以基本上防止期望蛋白质结合到所述至少一个固体表面上，和(ii)将不纯制品与所述至少一种表面结合配体分离。

在一个或多个前述实施方案中，不纯制品已经用可溶性的正电性或负电性有机添加剂和/或携带有负电性配体、正电性配体或金属亲和性配体的固体表面处理，所述不纯制品可以随后流过其流体接触表面包含正电荷的装置。

在一个说明针对染色质的净化方法的应用的实施方案中，以1％(v/v)的量将尿囊素加入到细胞培养收获物中。细胞培养物可以包含细胞，或者细胞可以预先已经被去除。加入浓度达到0.025％(w/v)的亚甲蓝。或者，可以加入浓度达到0.025％的依沙吖啶。或者，可以加入浓度达到0.025％的0.025％十六烷基三甲基溴化铵。或者，可以使用0.025％组合浓度的这些或其它正电性的有机添加剂的组合。然后将混合物在搅拌下孵育2小时。以2-5％v:v的量加入携带有正电性金属亲和性配体2(氨乙基)胺(TREN)的粒子。将混合物在搅拌下孵育4小时，然后通过任何方便的手段去除固体。包含期望蛋白质的剩余溶液可以任选地流过深层过滤器，所述深层过滤器在其流体接触表面上携带有正电荷。

在另一个说明针对染色质的净化方法的应用的实施方案中，以1％(v/v)的量将尿囊素加入到细胞培养收获物中。细胞培养物可以包含细胞，或者细胞可以预先已经被去除。加入0.7％庚酸。或者加入0.4％辛酸。或者加入0.4％辛烯酸。或者加入0.3％壬酸。或者加入0.3％壬烯酸。或者加入0.2％癸酸。或者加入0.5％甲基蓝。或者，可以使用这些或其它负电性的有机添加剂的组合。然后将混合物在搅拌下孵育2小时。以2-5％v:v的量加入携带有正电性金属亲和性配体2(氨乙基)胺(TREN)的粒子。将混合物在混合下孵育4小时，然后通过任何方便的方法去除固体。包含期望蛋白质的剩余溶液可以任选地流过深层过滤器，所述深层过滤器在其流体接触表面上携带有正电荷。

在一些实施方案中，通过测量DNA减少的程度和组蛋白减少的程度并且对这两个值取平均值来估算特定调节方法的染色质减少程度。在一些此类实施方案中，DNA由嵌入染料分析法测量，而组蛋白典型地由免疫测定法测量。在一些此类实施方案中，因为组蛋白的量是染色质的量的正函数，所以总组蛋白含量可以通过测定一类组蛋白的含量并且与染色质中其它组蛋白的相对比例成比例地调节该量来测量。举例来说，总组蛋白可能通过测量组蛋白H1，然后乘以9以考虑到H1与完整染色质中的其它组蛋白的质量比来估算。或者，总组蛋白可能通过测量H2a、H2b、H3或H4，并且将其中任一个结果乘以4.5来估算。或者，可能对H1和H2a、和H2b、和H3、和H4进行单独的测定，并且将结果加在一起。或者可以用聚合酶链式反应技术辅助DNA测定。然而，实验数据表明使用DNA估算总染色质可能导致总染色质被低估，因为在生产期间在细胞死亡后发生由酶介导的DNA水解。组蛋白和DNA测定都可能需要特殊的提取程序以获得精确结果。

在某些实施方案中，IgG制品可以在所述方法的一个或多个阶段期间与一种或多种抗病毒化合物接触。在一些此类实施方案中，一种或多种抗病毒化合物选自由以下各项组成的群组：依沙吖啶、亚甲蓝、苯扎氯铵、氯己定、十六烷基三甲基溴化铵、磷酸三正丁酯。

在某些实施方案中，在所述方法的执行期间使用的非离子性亲水粒子是纳米粒子或微粒。在某些此类实施方案中，非离子性亲水粒子是多孔的。在某些实施方案中，粒子尺寸在下述范围：约50nm至约500μm，或约50nm至约50μm，或约50nm至约4μm，或约50nm至约3μm，或约50nm至约1μm，或约100nm至约1μm，或约200nm至约2μm，或约200nm至约500nm，或约500nm至约1μm，或约5μm至约50μm。

在一些实施方案中，提供了从制品中纯化期望蛋白质的方法，其包括：提供制品，所述制品处于具有小于约5％的存在于原始生产基质中的染色质的形式，将制品与足以引起期望蛋白质沉淀或吸附在非离子性亲水表面上的量的非离子性有机聚合物接触，和在接触步骤之前或期间调节盐浓度，所述调节步骤提供足以产生大于生理电导率的电导率的盐浓度。

在一些实施方案中，本文中所公开的方法进一步包括将沉淀的期望蛋白质保留在多孔薄膜上，从而允许可溶性污染物通过所述薄膜。

在一些实施方案中，本文中所公开的方法进一步包括通过借助于离心来沉降出沉淀物而使沉淀的期望蛋白质与可溶性污染物分离。

在一些实施方案中，非离子性亲水表面包括选自由以下各项组成的群组中的一种：薄膜、整体柱、粒子(所述粒子任选的为磁性的)和其组合。

在一些实施方案中，所述方法在单个集成装置中执行。

在一些实施方案中，非离子性有机聚合物是聚乙二醇(PEG)。

在一些实施方案中，非离子性有机聚合物的平均聚合物尺寸在选自由以下各项组成的群组的范围：(a)约1,500道尔顿到约15,000道尔顿，(b)约2,000道尔顿到约12,000道尔顿，(c)约3,000道尔顿到约10,000道尔顿，(d)约4,000道尔顿到约8,000道尔顿，和(f)约5,000道尔顿到约6,000道尔顿。

在一些实施方案中，电导率比生理电导率大至少1mS/cm。在一些实施方案中，电导率比生理电导率大超过约1mS/cm、5mS/cm、10mS/cm、20mS/cm、40mS/cm、80mS/cm、160mS/cm，最高为对应于一种或多种所选盐溶液的饱和溶液的电导率，或中间增量。在一些实施方案中，所使用的大于生理电导率的电导率的范围可以为约35mS/cm至约超出生理电导率约135mS/cm。

在一些实施方案中，盐选自由以下各项组成的群组：氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸钾、盐酸胍和其组合。

在一些实施方案中，盐是氯化钠，其浓度选自由以下各项组成的群组：(a)约0.5M到约1.5M、(b)约2.0M到约3.0M、和其中间范围。

在一些实施方案中，方法进一步包括将pH调节到选自由以下各项组成的群组的范围：(a)约5到约9、(b)约6到约8、(c)约6.5到约7.5、(d)约7.5到约8.5、和其中间范围。

在一些实施方案中，制品是从选自由以下各项组成的群组的生物来源获得：细胞培养基、来自培养有机体的提取物、和体液。

定义以下术语，使得可以更容易地理解本文中所公开的方法。在具体实施方式中阐明另外的定义。

“染色质”是指染色体的基本组分。在活细胞中在其完整形式下，染色质主要包含DNA和组蛋白，连同较小量的其它蛋白质和肽。其被组织成核小体，核小体包含用1.65转的DNA包裹的组蛋白八聚体，所述组蛋白包括组蛋白2a、2b、3和4中的每一种的2个。核小体通过连接子DNA的部分在线性区域中连接，所述部分与组蛋白H1相连。在细胞死亡的同时，染色质开始分解。在例如用于产生重组蛋白质的细胞培养过程中，染色质和其分解产物被排入细胞培养基中，在其中它们可以与细胞培养基的成分(包括期望重组产物)形成联合体。术语“染色质分解代谢物”可用于指染色质分解产物。这些分解产物包括含有2-30个或更多核小体的阵列、单独核小体、核小体片段、DNA和组蛋白(Gan等人,上文,Gagnon等人(2013)上文)。“组蛋白”被理解为代表染色质分解代谢物。与尺寸无关，“DNA”被理解为代表一类染色质分解代谢物。单独“核小体”和核小体阵列被理解为代表染色质分解代谢物。

“空间排阻色谱”是指一种纯化方法，其中通过非离子性有机聚合物(例如PEG)与抗体和非离子性粒子的亲水表面的同时相互空间排斥来介导抗体分子(例如IgG或其它抗体产物)的保留。相信在蛋白质表面与粒子表面之间没有发生直接的化学相互作用。这特别地赋予所述方法在比传统色谱方法(例如离子交换色谱或疏水性相互作用色谱)更广的条件范围内维持结合的能力。

“水合表面”或“高度水合表面”或“亲水表面”是指潜在地通过氢键合、电致伸缩或这两种机制的一些组合与水高度相互作用的表面。所述相互作用可以由例如羟基、负电荷或正电荷或不带电的极性基团等化学基团介导。能水合的化学基团的存在可以是指定材料(例如粒子或对流色谱材料)的天然组成的一个基本特征，或者其可以通过化学修饰以将所述基团(包括但不限于碳水化合物和酰脲)固定在表面上而被添加或促进。所谓的疏水表面通常被认为不是高度水合的，但是包括能高度水合的基团以及疏水性残基的表面可以是能充分水合的，以实施本文中所公开的方法。

“聚集体”是指在生理条件下稳定并且在广泛范围的pH和电导率条件下可以保持稳定的两个或更多个分子的缔合。聚集体常常包含至少一个生物分子(例如蛋白质、核酸或脂质)和另一个分子或金属离子。缔合可以通过任何类型的化学相互作用或化学相互作用的任何组合发生。抗体的聚集体可被分为两类：“同种聚集体”是指两个或更多个抗体分子的稳定缔合；“异种聚集体”是指一个或多个抗体分子与一个或多个非抗体分子的稳定缔合。非抗体组分可由一个或多个选自由以下各项组成的群组的实体组成：核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白质、脂质或细胞培养基组分。

“抗体”是指衍生自人或其它哺乳动物细胞系的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类的免疫球蛋白，包括天然形式或基因改造的形式，例如人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变的抗体、移植的抗体和体外产生的抗体。“抗体”还可以包括复合物形式，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白，或通过IgG与另一种功能部分的合成连接而产生的免疫缀合物，所述另一种功能部分包括另一种抗体、酶、荧光团或其它产生信号的部分、生物素、药物或其它功能部分。

“抗体产物”是指至少一部分包含抗体或抗体的一部分的蛋白质实体。最简单的实例是抗体。复合实例包括Fc-融合蛋白，其是通过重组方式结合到抗体Fc部分的功能性非抗体蛋白质。另一个复合实例是抗体缀合物或免疫缀合物，其由最通常地通过合成方式连接到另一个部分的抗体组成，以增加抗体的功能性，例如使抗体发荧光以使得其可用于免疫测定法中，或将抗体结合到酶上以用于相同目的，或结合到细胞毒素上以杀死癌细胞，或结合到其它部分上以用于其它目的。其它抗体产物是具有两个结构域的二价化合物(例如两个抗体片段的融合体)，所述两个结构域对两个独立的目标具有结合特异性。

“内毒素”是指存在于革兰氏阴性细菌的外膜中的毒性的热稳定脂多糖物质，其在细胞溶解时从细胞释放。因为内毒素的磷酸盐和羧基残基的含量较高，所以其通常可以是酸性的，并且因为脂质-A区域的脂肪酸含量，所以内毒素可以是高度疏水性的。内毒素可以为氢键合提供广泛的机会。

“非离子性有机聚合物”是指由不含带电基团的相连接的重复有机亚单元构成的天然存在的烃或合成烃。其可以是线性的、具有少量分支的主要线性的或主要分支的。适合于实施本文中所公开的方法的实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。PEG具有结构式HO-(CH₂-CH₂-O)_n-H。实例包括但不限于平均聚合物分子量在小于100到大于10,000道尔顿的范围的组合物。市售PEG制品的平均分子量典型地由带有连字符的后缀表明。举例来说，PEG-6000是指平均分子量为约6,000道尔顿的制品。此类试剂的有效浓度随聚合物的特性和通过本文中所公开的方法处理的抗体产物的特征而变。

“有机多价离子”是指天然或合成来源的有机分子、离子或盐，其具有至少一个电荷和至少一种额外的化学官能性从而赋予其多价性。在某些实施方案中，有机多价离子至少一种额外的化学官能性是额外电荷，使得有机多价离子携带两个或更多个相同或不同的电荷。有机多价离子可以带有净正电荷、净负电荷或净中性电荷。在有机多价离子是净正电性的情况下，其可以与例如氯离子、溴离子、硫酸根、有机酸、乳酸根、葡糖酸根和不与所述方法不相容的任何其它阴离子等阴离子一起提供。在某些实施方案中，有机多价离子的正电荷中的一些由胺、亚胺或其它氮部分供应。有机多价离子可以另外具有混合化学特性，并且包括疏水性残基、其它功能部分和/或其可以具有参与其它类型的化学相互作用的能力，包括(例如)参与氢键、疏水性相互作用、π-π键合、金属配位和插入的能力。在某些实施方案中的带正电的有机多价离子的实例包括但不限于：二氨基酸、二元同型肽(homo-peptide)或异型肽(hetero-peptide)、三元同型肽或异型肽或更多元的同型肽或异型肽，例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸；聚乙烯亚胺；聚烯丙基胺；聚苄菊酯(polydimethrine)、聚甲基丙烯基酰胺基丙基三甲基铵；聚二烯丙基二甲基铵；聚乙烯基苯甲基三甲基铵；聚乙烯基胍；聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶；DEAE-右旋糖酐；DEAE-纤维素；依沙吖啶(CAS编号442-16-0；7-乙氧基吖啶-3,9-二胺)；三(2-氨乙基)胺；胍；氯己定；阿来西定(alexidine)；适翠达(citricidal)、鱼精蛋白；精胺；亚精胺；鲑精蛋白；壳聚糖；和前述物质的变异体和衍生物。举例来说，依沙吖啶的变异体和衍生物应被理解成包括9-氨基吖啶(氨吖啶(aminacrine))、3,6-吖啶二胺(原黄素(proflavin))、吖啶琐辛(acrisorcin)、吖啶氯(acrizane)(酚吖啶(phenacridane))、吖啶橙、阿的平(quinacrine)、乐杀螨(acricide)、吖啶酮(acridone)、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖胺(acranil)(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、酚藏花红(phenosafranin)、吩嗪、吩噻嗪、吖啶黄(acriflavine)(氯化3,6-二氨基-10-甲基吖啶和3,6-吖啶二胺)和其盐(例如氯化物、溴化物、硫酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐)。另一类有效的正电性的多价有机离子包括噻嗪，例如亚甲蓝、其衍生物、类似物和其盐。在有机多价离子是净负电性的情况下，其可以与例如钠或钾或任何其它不与所述方法不相容的阳离子等阳离子一起提供。在某些实施方案中，有机多价离子的负电荷中的一些由羧基、二氧磷基或磺基部分供应。有机多价离子可以另外具有混合化学特性，并且包括疏水性残基、其它功能部分和/或其可以具有参与其它类型的化学相互作用的能力，包括例如参与氢键、疏水性相互作用、π-π键合、金属配位和插入的能力。某些实施方案中的带负电的有机多价离子的实例包括但不限于脂肪酸(例如庚酸、庚烯酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸、癸酸)、甲基蓝、阴离子性聚合物和其盐(例如氯化物、溴化物、硫酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐)。

“多核苷酸”是指由共价结合在链中的多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。多核苷酸可以具有较高的形成氢键的倾向。

“蛋白质”是指含有碳、氢、氧、氮和通常地硫并且主要由一条或多条通过肽键连接的氨基酸链构成的一组复合有机大分子中的任一种。蛋白质可以是天然或重组来源。蛋白质可以用非氨基酸部分修饰，例如通过糖基化作用、聚乙二醇化作用或与其它化学部分结合。蛋白质的实例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肽激素。

“蛋白质制品”是指含有目的蛋白质的任何水性溶液或主要水性的溶液，例如含细胞的细胞培养收获物、(基本上)不含细胞的细胞培养上清液或含有来自纯化阶段的目的蛋白质的溶液。

“表面活性剂(surfactant)”包括“表面活性试剂(surface active agent)”，例如通常具有疏水部分和亲水部分，从而被称为两亲型的一类有机分子。在水溶液中于足够浓度下，表面活性剂可以自我联合成簇，其中疏水部分集中在中心以最小化与水的接触，并且亲水部分向外辐射以最大化与水的接触。在存在生物制品、特别是包含具有疏水特性或具有疏水特性区域的物质的那些生物制品的情况下，表面活性剂的疏水部分倾向于自发地与疏水物质的一些部分联合并且通过表面活性剂的亲水部分的影响来增加其溶解度。其也可用于调节在都溶于水溶剂中的不同疏水物质之间发生的疏水性相互作用。适合于实施本文中所公开的方法的某些实施方案的表面活性剂的实例包括但不限于：非离子性表面活性剂，例如聚山梨醇酯表面活性剂(例如Tween20(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯)和Tween80(聚氧乙烯(20)山梨醇酐单油酸酯))和Triton(例如聚乙二醇对(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)，和两性离子表面活性剂，例如CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷磺酸内盐)、CHAPSO(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙烷磺酸内盐)和辛基葡糖苷(例如(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羟甲基)-6-辛氧基环氧乙烷-3,4,5-三醇((2R,3S,4S,5R,6R)-2-(hydroxymethyl)-6-octoxyoxane-3,4,5-triol))。

“合成粒子”的尺寸范围可以为小于100nm到大于100微米。其可以是多孔的或无孔的。其可以是聚合物型，例如由聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、琼脂糖、纤维素、右旋糖酐或其它聚合物构成，或者其可以是无机的，例如硅石。其可以整体具有均匀结构，或者其可以是复合物，由一种材料(例如金属合金或疏水聚合物)的内核组成并且涂布有应用表面，所述表面高度水合或允许化学基团连接以产生高度水合的表面。“合成粒子”可以包括被设计用于色谱应用的粒子，或打算用于和色谱领域完全不同的应用的粒子。

“不纯制品”是指含有目的蛋白质的任何水性溶液或主要水性的溶液，例如含细胞的细胞培养收获物、(基本上)不含细胞的细胞培养上清液或含有来自纯化阶段的目的蛋白质的细胞提取物或体液或溶液。

“酰脲”是指天然或合成来源的环状或非环状有机分子，其包含一个或多个脲部分或其衍生物。在某些实施方案中，本文中所公开的方法提供酰脲，例如脲、尿酸、乙内酰脲、尿囊素(CAS编号97-59-6；尿囊素氯羟铝(alcloxa)、尿囊素铝(aldioxa)、hemocane(尿囊素)、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲)、嘌呤和其衍生物。在某些实施方案中，本文中所公开的方法提供式R-CO-NH-CO-NH₂或R-CO-NH-CO-NH-CO-R'或R'R”NH-CO-NR”'R””的有机分子，其中相关“R-基团”可以是H或任何有机部分。

“病毒”或“病毒粒子”是指超显微的(直径大致为20到300nm)在代谢上惰性的传染物，其仅在活宿主(主要是细菌、植物和动物)的细胞内复制，由RNA或DNA内核、蛋白质外壳和在更复杂的类型中的周围包膜构成。

在某些实施方案中，空间排阻色谱(SXC)在流化亲水性非离子性粒子上执行。在某些实施方案中，SXC粒子是可以在小于10微米到大于200微米的范围的微粒。在某些实施方案中，SXC粒子是尺寸可以在小于10nm到1000nm的范围的纳米粒子。在某些实施方案中，SXC粒子可以是无孔的。在某些实施方案中，SXC粒子可以是多微孔的。在某些实施方案中，SXC粒子可以是大孔性的。在某些实施方案中，SXC粒子可以使其能被捕获在磁性表面上或磁场中的方式构成。

在某些实施方案中，SXC在流化亲水性非离子性粒子上执行。在某些实施方案中，SXC粒子是可以在小于10微米到大于200微米的范围的微粒。在某些实施方案中，SXC粒子是尺寸可以在小于10nm到1000nm的范围的纳米粒子。在某些实施方案中，SXC粒子可以是无孔的。在某些实施方案中，SXC粒子可以是多微孔的。在某些实施方案中，SXC粒子可以是大孔性的。在某些实施方案中，SXC粒子可以使其能被捕获在磁性表面上或磁场中的方式构成。

在某些实施方案中，在洗涤步骤中可以使用除NaCl以外的一种或多种盐。所述盐可以包括所谓的离液盐，有时被称为结构破坏盐，如由异硫氰酸钠或异硫氰酸钾所例示，或所谓的亲液盐(kosmotropic salt)，有时被称为结构形成盐，如由硫酸铵、柠檬酸钠或磷酸钾所例示。

在某些实施方案中，除盐以外的洗涤剂可以与盐组合使用或代替盐使用，例如非离子性离液剂(如脲)，或非离子性或两性离子表面活性剂，例如CHAPS、CHAPSO、八葡萄糖苷、Tween或Triton；或非离子性有机溶剂，例如乙二醇或丙二醇；或糖，例如蔗糖或山梨糖醇；或螯合剂。由于其离子性质和其干扰阴离子交换法的可能性，例如TREN等正电性螯合剂可能优于例如EDTA等负电性螯合剂。也可以考虑其它洗涤剂，例如氨基酸(如精氨酸)，其中出于与螯合剂的情况下相同的原因，优选正电性占优势的物质。

在某些实施方案中，所述方法以单一单元操作执行。

在某些实施方案中，用于促进IgG保留在空间排阻色谱粒子上的PEG可以具有8kDa、或6kDa、或4kDa、或3kDa、或2kDa、或1kDa的平均尺寸。在某些实施方案中，用于促进IgG保留在空间排阻色谱粒子上的物质可以是除PEG以外的聚合物，例如聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐或另一种非离子性有机聚合物。

在某些实施方案中，期望抗体产物是完全完整的抗体，例如分子质量约150kDa的IgG。

在某些实施方案中，样品由条件细胞培养上清液(CCS)组成。在某些实施方案中，通过离心、或絮凝、或过滤、或这些技术的一些组合调节CCS。在某些实施方案中，通过包容性更高的方式调节CCS，包括使用尤其减低制品的染色质含量和/或聚集体含量的化学添加剂。在某些实施方案中，通过一种去除95％或更多的染色质、同时实现非组蛋白宿主蛋白质、内毒素和病毒的大量去除以及聚集体含量被降低到1％或更少，同时支持90-99％的抗体回收率的方法净化CCS。

在某些实施方案中，本文中所公开的要求保护的方法降低聚集体含量。在某些实施方案中，本文中所公开的要求保护的方法降低抗体片段的含量。

在所属领域中有经验的人将认识到，可以使用以上方法的许多变化而不会脱离其基本要素。举例来说，实施方案可以涉及拆解方法步骤以使得其在两个或三个或更多个单元操作中执行。

在某些实施方案中，在本文中所公开的要求保护的方法之前或之后可以存在其它纯化方法，或者在之前和之后都存在其它纯化方法。在一些此类实施方案中，在所公开的方法之后尤其可以存在分级分离方法，借此期望IgG被保留在表面上，使得可以洗掉残余PEG并且随后从保留其的表面洗脱不含PEG的抗体。在一些此类实施方案中，保留抗体的表面可以是色谱介质，其选自由以下各项组成的群组：阳离子交换色谱介质、磷灰石介质、组合正电荷和疏水性的混合模式介质。在一个此类实施方案中，组合正电荷和疏水性的混合模式色谱介质以在名称Capto adhere(GE Healthcare)下销售的商业色谱产品为代表。

在一些实施方案中，鉴于在所公开的方法结束时的IgG制品将含有非IgG沉淀浓度的非离子性有机聚合物，那么可特别地选择后续纯化方法以减少或除去制品中的所述聚合物。在一个此类实施方案中，IgG可以结合到至少一个负电性表面上，非离子性有机聚合物不能结合到所述表面上并且因此被除去。在一个此类实施方案中，至少一个负电性表面可以是所谓的阳离子交换剂，例如为了执行蛋白质(包括IgG制品)的色谱分离而已知的和销售的阳离子交换剂。在一个此类实施方案中，阳离子交换剂可以采取薄膜、整体柱、装填粒子的柱或另一种物理形式的形式。在另一个实施方案中，至少一个负电性表面可以由所谓的多模式色谱材料组成，其具有允许其除了通过负电性参与静电相互作用以外、还参与疏水性相互作用和/或氢键结合相互作用的表面组成。在另一个实施方案中，可以使用正电性色谱材料，其具有允许其参与疏水性相互作用和氢键合的表面组成。在一个此类实施方案中，将含PEG的IgG制品施加到装填有1M NaCl(pH 7.0)下的Capto adhere的柱上。抗体发生结合，PEG不结合并且因此被除去。通过将NaCl浓度降低到0.3M洗脱抗体，因此洗脱IgG。

在某些实施方案中，将SXC粒子加入到含有单克隆IgG抗体的细胞培养上清液中。加入聚乙二醇(PEG)，达到用粒子保留IgG所必需的水平。去除含有未结合到粒子上的污染物的液体，例如通过薄膜过滤，并且用干净的PEG缓冲液(下文称为洗涤缓冲液)替换。除存在PEG之外，缓冲液配方适合于将残余污染物结合到正电性粒子上，同时抗体保持未结合。再次去除液体，例如通过薄膜过滤。将SXC粒子悬浮于不含PEG或PEG不足但在其它方面类似于洗涤缓冲液的缓冲液中，结果IgG以可溶形式从粒子中分离出来。收集IgG，例如通过薄膜过滤，所述薄膜保留SXC粒子和正电性粒子，其可以被丢弃或再循环。

在某些实施方案中，将SXC粒子加入到含有单克隆IgG抗体的不纯制品中。加入PEG，达到在存在0.8M NaCl的情况下由粒子保留IgG所必需的水平，NaCl也存在于溶液中。去除含有未结合到粒子上的污染物的液体，例如通过薄膜过滤，并且用干净的PEG-NaCl缓冲液替换。去除高盐的洗涤缓冲液，例如通过薄膜过滤，并且用不含NaCl或NaCl不足的干净的PEG缓冲液替换。去除洗涤缓冲液。将SXC粒子悬浮于不含PEG或PEG不足的缓冲液中，结果IgG以可溶形式从粒子中分离出来。收集IgG，例如通过薄膜过滤，所述薄膜保留SXC粒子，其可以被丢弃或再循环。在一些实施方案中，在所述工艺中省略用于SXC的粒子。

在某些实施方案中，将SXC粒子加入到含有单克隆IgG抗体的不纯制品中。加入PEG，达到用粒子保留IgG所必需的水平。去除含有未结合到粒子上的污染物的液体，例如通过薄膜过滤，并且用干净的PEG缓冲液替换，所述PEG缓冲液也含有0.8M NaCl。粒子再次收集在薄膜上，同时去除高盐的缓冲液，并且用不含NaCl或NaCl不足的干净的PEG缓冲液替换。粒子再收集在薄膜上并且去除缓冲液。将SXC粒子悬浮于不含PEG或PEG不足的缓冲液中，结果IgG以可溶形式从粒子中分离出来。用薄膜去除SXC粒子，而经过纯化的IgG则流过薄膜。在一些实施方案中，在所述工艺中省略用于SXC的粒子。

在涉及使用薄膜的任何实施方案中，对于所属领域的普通技术人员显而易见的是，所述实施方案可以在所谓的死端过滤方式下或切向流动过滤方式下执行，其中前者更便于在实验室规模下执行所公开的方法或开发最有效的缓冲条件，并且后者可能更适合于工业规模应用，在其中其是部分或完全自动化的。

本文中所公开的方法的额外目标和优点将在以下描述中部分地阐述，并且根据所述描述将部分地显而易见，或者可以通过实施本文中所公开的方法被了解。本文中所公开的方法的目标和优点将借助于权利要求书中说明的要素和组合被认识并获得。

应理解前述的总体说明和以下详细说明都仅仅是示例性的和解释性的，并且不对要求保护的本文中所公开的方法构成限制。

实施例

实施例1.用于将IgG结合到空间排阻色谱介质上的条件的定义。进行实验以确定支持最有效地减少由哺乳动物细胞培养产生的抗HER2单克隆抗体中的宿主细胞蛋白质的盐浓度。所述实验使用平均直径约30微米的非离子性的亲水性淀粉粒子进行。将粒子与细胞培养上清液(CCS)的不同等分试样混合。CCS的宿主蛋白质浓度为约243,011百万分率(ppm)。用尿囊素、依沙吖啶、阴离子交换粒子和阳离子交换粒子处理样品，这将宿主蛋白质浓度降低到165,213ppm。加入PEG-6000达到18％的最终浓度。然后将NaCl加入到不同的等分试样中以产生含有0.0、0.2、0.4、0.8和1.0M的系列。经过处理的样品中的宿主细胞蛋白质污染物含量为15,558ppm、1,994ppm、662ppm、90ppm和266ppm。0.8M下的纯化因此代表着99.95％的改良；超过3个对数的降低。

实施例2.用于阴离子交换处理的盐浓度的确定。通过VEAX评估实施例1的抗体。将样品施加到在单独实验中在3到9范围的不同pH值、但不含盐下被平衡的VEAX柱上。另外将样品施加到在pH 8下但包括0M到1M的不同水平的盐的VEAX柱上。最有效的污染物减少在pH 8.0下在不存在盐的情况下实现。随后的实验改善目标pH为8.2。在pH 8.15和8.25下，表现都次之。在这些条件下，VEAX实现最高99.8％的宿主蛋白质(包括宿主蛋白质、DNA、病毒和内毒素)减少。这些条件定义了对于这个抗体来说，通过阴离子交换连同SXC提取污染物的条件。

实施例3.用于阴离子交换处理的盐浓度的确定。将实验1和2的抗体施加到堆叠平坦薄膜和中空纤维形式的阴离子交换膜上。污染物的减少与在用于VEAX的相同条件下是基本上相同的。这些实验结果显示，将SXC与阴离子交换膜整合可以实现超过6个对数的纯化(99.9999％)。

实施例4.SXC与正电性粒子的组合。在存在19％PEG-6000的情况下在1MNaCl下使来自细胞培养上清液的HER2IgG结合到淀粉粒子上。200-400目DowexAG1x8形式的正电性粒子也以4％w/v的量存在。通过滤过具有0.22微米孔的薄膜去除流体，然后用含有19％PEG-6000、1M NaCl和50mM Tris(pH 8.0)的干净缓冲液替换。去除流体并且用含有19％PEG-6000和50mM Tris(pH 8.0)的干净缓冲液替换。重复这个步骤，然后通过过滤去除流体。用50mM Tris(pH 8.0)替换流体。宿主细胞蛋白质从原始样品中的142,000百万分率(ppm)被减少到约120ppm。

实施例5.SXC与正电性粒子的组合。重复实施例4的形式，例外是在用19％PEG-6000和50mM Tris(pH 8.0)洗涤淀粉粒子之后，才加入正电性粒子。去除流体，然后用50mM Tris(pH 8.0)替换以从SXC粒子中分离IgG。宿主细胞蛋白从原始样品中的142,000百万分率(ppm)被减少到约小于1ppm。

实施例6.SXC与正电性粒子的组合。重复实施例5的形式，例外是使用UNOsphere Q粒子代替Dowex粒子。在宿主细胞蛋白质减少方面的结果是相等的，但是IgG回收率更高。

实施例7.SXC与正电性粒子的组合。重复实施例6的形式，其中在IgG从SXC粒子分离之后粒子暴露的持续时间以增量方式变化以便确定实现最佳结果需要多少时间。在30和60分钟下的结果实质上相同，但是在更短暴露时间下的结果次之。

实施例8.通过加入1％尿囊素、然后加入0.025％依沙吖啶、然后混合15分钟来调节包含275,357ppm宿主细胞蛋白质、5283ppmDNA和13.96％聚集体的含IgG的细胞培养收获物。MacroPrep HighQ、MacroPrep HighS、Macroprep tButyl和Chelex-100(Bio-Rad Laboratories)的均等混合物通过用50mM HEPES、100mM NaCl、pH 7.0洗涤来预先平衡。将经过平衡的混合粒子以2％(v:v)的量加入到不纯的IgG制品中，然后在4-8℃下混合过夜。通过微滤去除固体。将1.25mg包被淀粉的200nm磁性粒子加入到20mL被调节的不纯的IgG制品中。在涡旋混合器上在500rpm下混合的同时，逐渐加入20ml的36％PEG-6000于1.6M NaCl、50mM HEPES、pH 7.0中的溶液，以产生18％PEG-6000和0.8M NaCl的最终浓度。涡旋混合继续30分钟，然后用磁性方式收集负载有IgG的粒子。用新鲜的50mM HEPES、0.8M NaCl、pH 7.0洗涤负载有IgG的粒子，并且去除洗液。去除洗涤缓冲液并且以相同方式再次洗涤粒子。去除洗涤缓冲液，并且将抗体再溶解于50mM HEPES、1M NaCl、pH 7中。装填有正电性疏水色谱介质(Captoadhere，GE Healthcare)并且被平衡到相同条件的1mL柱。将溶解的IgG施加到柱上，其中IgG结合和一些污染物被认为已经结合，同时残余PEG也结合。然后用平衡缓冲液施加5倍柱体积的洗液以更彻底地从系统上除去未结合的组分。用以50mM HEPES、300mM NaCl、pH 7.0结束的10倍柱体积的线性梯度洗脱IgG。以下表格说明纯化性能，其中post-con指示条件后，post-NP指示纳米粒子后，并且post-CA指示Capto adhere后。回收率中左侧的值指示该步骤的回收率，而右侧的值指示先前步骤加该步骤的累积回收率。bld表示检测极限以下。更多细节请参考Gagnon等人,2014,上述：

实施例9.通过加入1％尿囊素、4％正电性的金属亲和性粒子(TREN 40high,Bio-Works)、在室温下混合4小时来调节含有176,244ppm宿主蛋白质污染物和19％聚集体的含IgG的细胞培养收获物。被去除的用于分析的样品显示宿主蛋白质被减少到90,259ppm并且聚集体被减少到1.2％。将pH降低到5.2，加入0.5％辛酸，并且将混合物孵育2小时。被去除的用于分析的样品显示宿主蛋白质为1,758ppm并且聚集体为约0.4％。经由正电性的深层过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白质被减少到135ppm并且聚集体被减少到小于0.05％。通过在pH 7.0的18％PEG-6000中沉淀来纯化抗体。然后用1.8M硫酸铵洗涤沉淀物以去除PEG，然后将抗体再溶解于50mM Hepes(pH 7.0)中。宿主蛋白质被减少到32ppm。在施加于在50mM Tris(pH 8.0)下以空隙排阻模式工作的阴离子交换色谱柱(UNOsphere Q,Bio-Rad)之后，宿主蛋白质被减少到小于1ppm。不同之处仅在于PEG沉淀在800mM NaCl的存在下进行的平行实验将宿主蛋白质减少到小于1ppm。阴离子交换步骤将宿主蛋白质和聚集体减少到无法检测的水平。

实施例10.通过加入1％尿囊素和0.025％依沙吖啶，并且在室温搅拌下孵育1小时来调节含有286,010ppm宿主蛋白质污染物和23％聚集体的含IgG的细胞培养收获物。混合1:1:1粒子混合物(Chelex-100、MacroPrep tButyl、Macroprep HighQ，Bio-Rad)，平衡到生理条件，并且将沉降的混合粒子以5％的组合量加入到收获物中，然后在室温下混合2小时。宿主蛋白质被减少到43,058ppm并且聚集体被减少到3.4％。在以pH 8.0执行的一系列实验中，通过用PEG-6000沉淀来分级分离样品，所述沉淀在浓度为600mM、800mM、900mM和1000mM(1M)的不同实验中进行。随后在PEG、50mM Tris、pH 8.0中洗涤沉淀物，此后将抗体再溶解于50mM Tris(pH 8.0)中。该系列中的宿主蛋白质被分别减少到51、55、45和41ppm。以5％v/v的量将Dowex AG1X2(Bio-Rad)形式的阴离子交换粒子加入到每个样品中，并且混合60分钟。该系列中的宿主蛋白质被减少到16、17、15和13ppm。执行另一系列的实验，除了初始PEG沉淀在pH 7.0下进行之外，所有其它细节都相同。PEG步骤之后的宿主蛋白质在600mM NaCl途径下为44ppm，在800mM途径下为43ppm，在900mM途径下为29ppm，并且在1000mM途径下为31ppm。在Dowex处理之后，宿主蛋白质分别被减少到20、17、12和16ppm。

实施例11.通过加入1％尿囊素和0.025％依沙吖啶，并且在室温搅拌下孵育1小时来调节含有286,010ppm宿主蛋白质污染物和23％聚集体的含IgG的细胞培养收获物。混合1:1:1:1的粒子(Chelex-100，MacroPrep tButyl，MacroPrep High Q，购自Bio-Rad)与正电性的金属亲和性粒子(TREN 40high，购自Bio-Works)的混合物，平衡到生理条件，并且将沉降的混合粒子以5％的组合量加入到收获物中，然后在室温下混合2小时。宿主蛋白质被减少到38,061ppm并且聚集体被减少到1.4％。在以pH 8.0执行的一系列实验中，通过用PEG-6000沉淀来分级分离样品，所述沉淀在NaCl的浓度为600mM、800mM、900mM和1000mM(1M)的不同试验中进行。随后在PEG、50mM Tris、pH 8.0中洗涤沉淀物，此后将抗体再溶解于50mM Tris(pH 8.0)中。宿主蛋白质分别被减少到79、69、56和57ppm。以5％v/v的量将Dowex AG1X2(Bio-Rad)形式的阴离子交换粒子加入到每个样品中，并且混合60分钟。该系列中的宿主蛋白质被减少到18、17、16和13ppm。执行另一系列的实验，除了初始PEG沉淀在pH 7.0下进行之外，所有其它细节都相同。PEG步骤之后的宿主蛋白质在600mM NaCl途径下为94ppm，在800mM途径下为62ppm，在900mM途径下为67ppm，并且在1000mM途径下为46ppm。在Dowex处理之后，宿主蛋白质分别被减少到28、9、23和17ppm。

实施例12.通过加入1％尿囊素、0.025％依沙吖啶和产生25mS/cm的电导率的NaCl来调节含有321,483ppm宿主蛋白质和26％聚集体的含IgM的细胞培养收获物。将混合物孵育1小时，通过离心去除固体，并且使液体流过填充有相等比例的MacroPrep tButyl、Macroprep HighQ、Macroprep HighS和Chelex 100的柱，其中柱与收获物的体积比为5％。宿主蛋白质被减少到73,663ppm并且聚集体被减少到0.8％。在平行但独立的实验中分级分离样品，这两个独立实验都使用pH 7的13％PEG-6000，但一个实验使用100mM NaCl，另一个实验使用800mM NaCl。然后用13％PEG、50mM Hepes、pH 7.0洗涤沉淀物以去除过量的盐，然后将IgM再溶解于50mM Hepes(pH 7.0)中。100mM NaCl下的宿主蛋白质被减少到7,411ppm。800mM NaCl下的宿主蛋白质被减少到417ppm。聚集体含量增加到1.1％。将样品施加到处于pH 7.0下的阴离子交换整体柱(CIM QA，BIA Separations)上并且用氯化钠梯度洗脱。就100mM NaCl下的PEG沉淀来说，样品中的宿主蛋白质被减少到1,424ppm。就800mM NaCl下的PEG沉淀来说，样品中的宿主蛋白质被减少到63ppm。两种制品中的聚集体都小于0.01％。

本文中所公开的本发明方法可以与其它纯化方法组合以实现更高程度的纯化。所述其它纯化方法的实例包括但不限于通常用于纯化IgG的其它方法，例如蛋白A和其它形式的亲和性色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、固定化金属亲和性色谱和另外的混合模式色谱方法，以及沉淀、结晶和液液萃取方法。所属领域的普通技术人员有能力设计用于各种方法的适当条件并且将它们与本文中所公开的方法整合以实现对特定抗体的必需纯化。

本文中引用的所有参考文献都以全文引用的方式并入，并且用于所有目的，其引用的程度就如同每个单独公开或专利或专利申请被具体地和单独地表明以全文引用的方式并入以用于所有目。如果通过引用并入的公开和专利或专利申请与本说明书中包括的公开内容相矛盾，那么本说明书应当代替和/或优先于任何所述矛盾的内容。

在本说明书和权利要求中使用的表示成分数量、色谱条件等的所有数字都被理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非相反地指示，否则在本说明书和随附权利要求中阐述的数字参数是约数，其可以根据想要通过本文中所公开的本发明方法获得的期望性能而变化。

本文中所公开的这种方法可以作出许多修改和变化而不会脱离其精神和范围，这对于所属领域的技术人员将是显而易见的。本文中所描述的具体实施方案是仅仅以实例的方式提供的并且不打算以任何方式构成限制。本说明书和实施例应该被理解成仅仅是示例性的，其中本文中所公开的方法的真实范围和精神由下列权利要求指定。

Claims (12)

1.一种从制品中纯化期望蛋白质的方法，其包括：

提供所述制品，所述制品处于具有小于约5％的存在于原始生产基质中的染色质的形式；

将所述制品与足以引起所述期望蛋白质沉淀或吸附在非离子性亲水表面上的量的非离子性有机聚合物接触；和

在所述接触步骤之前或期间调节盐浓度，所述调节步骤提供足以产生大于生理电导率的电导率的盐浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将沉淀的期望蛋白质保留在多孔薄膜上，从而允许可溶性污染物通过所述薄膜。

3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括通过借助于离心来沉降沉淀物而分离沉淀的期望蛋白质与可溶性污染物。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子性亲水表面包括选自由以下各项组成的群组中的一种：薄膜、整体柱、粒子，所述粒子任选地为磁性的、和其组合。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法在单个集成装置中执行。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子性有机聚合物是聚乙二醇(PEG)。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述非离子性有机聚合物的平均聚合物尺寸处于选自由以下各项组成的群组的范围：(a)约1,500道尔顿到约15,000道尔顿，(b)约2,000道尔顿到约12,000道尔顿，(c)约3,000道尔顿到约10,000道尔顿，(d)约4,000道尔顿到约8,000道尔顿，和(f)约5,000道尔顿到约6,000道尔顿。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述电导率比生理电导率大至少1mS/cm。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述盐选自由以下各项组成的群组：氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸钾、盐酸胍和其组合。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述盐是氯化钠，其浓度选自由以下各项组成的群组：(a)约0.5M到约1.5M、(b)约2.0M到约3.0M、和其中间范围。

11.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将pH调节到选自由以下各项组成的群组的范围：(a)约5到约9、(b)约6到约8、(c)约6.5到约7.5、(d)约7.5到约8.5、和其中间范围。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述制品是从选自由以下各项组成的群组的生物来源获得的：细胞培养基、来自所培养有机体的提取物、和体液。