JP6410734B2 - タンパク質調製物の凝集体含有量を低減する方法 - Google Patents
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Description
本願は、2013年2月6日に出願された米国仮特許出願第61/761,646号の優先権を主張するものであり、参照によりその全体を本明細書に援用する。
HER2抗原に特異的なIgGモノクローナル抗体約1g/Lを含む細胞培養収集物1Lを1%アラントインで処理した。伝導率は約13mS/cmであり、pHは約6.8であった。添加剤は、沈降を加速する効果があった。固体材料をろ過除去し、光沢のある透明(sparking clear)抗体含有ろ液を得た。抗体回収率は99%であった。20mLのBioWorks TREN hi−sub、アガロース多孔質粒子系電気陽性金属親和性材料をカラム(1.6×10cm)に充填し、50mM Hepes、150mM NaCl、pH7.0で平衡にした。精製ろ液をカラムに線流速200cm/hで通した。最初の収集物は、特に少なくとも10%のいわゆる高分子量凝集体を含む、20%を超える凝集体を含んだ。処理試料は、0.05%未満の高分子量凝集体及び4%未満の全凝集体を含んだ。蛍光色素アッセイによって測定されたDNAは98%超低減したが、qPCRによれば、減少は実際に99.999%を超えた。ヒストンタンパク質は少なくとも98%減少し、Cygnus ELISAで測定した一般宿主タンパク質レベルは62%減少した。抗体回収率は99%であった。
TRENと疎水性電気陽性粒子材料Dowex AG1x2の1:1混合物の代わりにTRENを用いた以外は実施例1の手順を繰り返した。抗体回収率が95%に低下し、実施例1後に明らかになった2種類の強い疎水性混入物が除去されたことが分析サイズ排除クロマトグラフィによって示された以外は、すべての結果が表面上同じであった。
1%アラントインに加えて0.05%オクタン酸で細胞含有収集物を処理した以外は、実施例2の手順を繰り返した。宿主タンパク質混入は70%超減少し、抗体回収率は90%に減少した。オクタン酸は処理試料中に検出されず、固体材料(単数又は複数)に結合していると考えられた。凝集体は3%未満に減少した。DNA及びヒストン含有量は99%減少した。
伝導率20mS/cmになる濃度までNaClを細胞含有収集物に添加し、pHを6.0に調節した以外は、IgMモノクローナル抗体を用いて実施例2の手順を繰り返した。未処理収集物の凝集体含有量は30%を超えた。カラムを50mM MES、200mM NaCl、pH6.0で平衡にした。DNA及びヒストンの99%をすべての高分子量凝集体と一緒に除去した。総凝集体含有量は約2%に減少した。抗体回収率は84%であった。全宿主タンパク質は67%減少した。伝導率20mS/cmを得るのに添加した濃度に加えて50mM増分の塩化ナトリウムの添加に対応する伝導率25mS/cmで実験を繰り返した。抗体回収率が98%に増加し、他の測定値はすべて同じであった。伝導率40mS/cmで実験を繰り返した。宿主タンパク質の減少は約47%に低下したが、他の性能測定値はすべて不変であった。
オクタン酸の代わりに0.025%エタクリジンを用い、金属親和性リガンドイミノ二酢酸を有するアクリル酸系多孔質粒子(Profinity、Bio−Rad)とスチレンジビニルベンゼン粒子(Chelex 100、Bio−Rad)の1:1混合物を充填したカラムを使用した以外は、実施例3の手順を繰り返した。処理試料は黄色味がなく、クロマトグラフィ媒体は濃い黄色であり、エタクリジンが除去されたことを示した。DNA、ヒストン及びヌクレオソームは99%減少し、抗体回収率は99%であった。高分子量凝集体は完全に除去され、全凝集体は2%未満に減少した。分析SECによっても強い疎水性混入物の除去が実証された。全宿主タンパク質混入は63%減少した。
Profinity及びChelexと1:1:1比で混合した負に帯電した疎水性相互作用粒子(Macroprep T−butyl、Bio−Rad)を含むこと以外は実施例5の形態を繰り返した。処理試料は黄色味がなく、クロマトグラフィ媒体は濃い黄色であり、エタクリジンが除去されたことを示した。DNA、ヒストン及びヌクレオソームは99%減少し、抗体回収率は99%であった。高分子量凝集体は完全に除去され、全凝集体は2%未満に減少した。分析SECによっても強い疎水性混入物の除去が実証された。全宿主タンパク質混入は64%減少した。
動的結合実験を固定化プロテインA(rAFプロテインA Toyopearl 650M、東ソー)上で実施し、遠心分離及び精密ろ過によって精製された収集物を実施例2の処理と比較した。精密ろ過材料上の動的結合能は28mg/mLであった。実施例3の材料上の動的結合能は35mg/mLであった。プロテインA精製後の精密ろ過材料の宿主タンパク質含有量は792ppmであった。実施例3処理材料の宿主タンパク質含有量は1ppm未満であった。したがって、開示した方法を実施すると、IgG結合能が約20%、IgG純度がほぼ800倍増加した。
作用pHを8.0に上げ、試料を水2部で希釈して細胞培養上清の伝導率を4.7に下げ、50mM Tris、50mM NaCl、pH8.0を含むように緩衝剤を再処方した以外は、実施例2の手順を再現した。性能は、一般宿主タンパク質除去率が83%であった以外は実施例2と表面上同じであった。
粒子の全割合を2%から5%に増加させた以外は実施例2の手順を再現した。結果は、抗体回収率が84%に減少した以外は表面上不変であった。全粒子の割合が2%であり、Dowex AG1x2で表される割合がTREN含有量のそれぞれ25%及び12.5%に減少した後続の実験においては、抗体回収率がそれぞれ97及び98%に増加した。疎水性混入物の除去は、低Dowexレベルでも依然効果的であった。他の結果はすべて実施例2と表面上同じであった。
水2部で希釈して試料の伝導率を約5に低下させた以外は実施例1の形態を繰り返した。すべてのサイズの凝集体の割合は、ほぼ2倍になった。
Dowex AG1x2をUNOsphere Qで置き換えた以外は実施例2の手順を繰り返した。UNOsphere Qは、残留エタクリジンをより効果的に除去した。結果はその他の点では同様であった。
カプリル酸を0.4%に増加させ、作用pHを5.2に下げ、TREN粒子の添加前に2時間インキュベートし、次いで固体除去前に4時間インキュベートした以外は、実施例3の手順を繰り返した。凝集体含有量は0.1%未満に減少した。宿主タンパク質は99.9%減少した。
作用pH5.6を除いて、実施例12の材料及び条件をIgMモノクローナル抗体を含む細胞培養収集物に適用した。凝集体は非凝集抗体に比べて当初の22%から0.1%未満に減少した。宿主タンパク質は98%超減少した。
259,218ppm宿主タンパク質混入物及び21%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物に1%アラントイン、0.4%カプリル酸、pH5.2を添加してコンディショニングし、2時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を4%の量添加し、さらに4時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)によって固体を除去した。宿主タンパク質は308ppmに減少し、凝集体は0.05%未満に減少した。
243,997ppm宿主タンパク質混入物及び24%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物に1%アラントイン、0.4%カプリル酸、pH5.2を添加してコンディショニングし、2時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を4%の量添加し、さらに4時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)によって固体を除去した。宿主タンパク質は305ppmに減少し、凝集体は0.05%未満に減少した。
243,997ppm宿主タンパク質混入物及び24%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物に1%アラントイン、0.4%カプリル酸、pH5.6を添加してコンディショニングし、2時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を4%の量添加し、さらに4時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)によって固体を除去した。宿主タンパク質は3,551ppmに減少し、凝集体は0.5%未満に減少した。
319,230ppm宿主タンパク質混入物及び22%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物に1%アラントイン、0.4%カプリル酸、pH5.2を添加してコンディショニングし、2時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を4%の量添加し、さらに4時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)によって固体を除去した。宿主タンパク質は237ppmに減少し、凝集体は0.01%未満に減少した。試料を多モード疎水性カチオン交換体(Millipore、HCX)にpH7.0で載せ、漸増NaCl勾配で溶出させた。宿主タンパク質混入は37ppmに減少した。試料を多モード疎水性アニオン交換体に1M NaCl(Capto adhere、GE Healthcare)で載せ、漸減NaCl勾配で溶出させ、宿主タンパク質混入を1ppmに削減した。あるいは、50mM Tris、pH8.0で平衡にし、空隙排除モードで動作させたUNOsphere Q(Bio−Rad laboratories)のカラムにpost−HCX試料をかけて、宿主タンパク質混入を検出限界以下のレベルに削減した。
287,621ppm宿主タンパク質混入物及び19%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物に1%アラントイン、0.4%カプリル酸、pH5.2を添加してコンディショニングし、2時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を4%の量添加し、さらに4時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)によって固体を除去した。宿主タンパク質は510ppmに減少し、凝集体は0.1%未満に減少した。コンディショニングした収集物をカチオン交換体(UNOsphere HRSに載せ、漸増NaCl勾配で溶出させた。宿主タンパク質混入は1ppm未満に減少したが、凝集体は0.2%をわずかに超える量に増加した。続いて、試料をヒドロキシアパタイト(CHTタイプI、40ミクロン)のカラム上で分画し、リン酸勾配で溶出させ、凝集体を0.01%未満に、宿主タンパク質を検出限界以下のレベルに削減した。
206,994ppm宿主タンパク質混入物及び18%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物をプロテインAカラム(Toso BioScience)にかけ、50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.2で洗浄し、次いで100mM酢酸で溶出させた。宿主タンパク質は1,917ppmに減少し、凝集体は1.8%に減少した。カラムを50mMリン酸塩、1.0M NaCl、pH7.2で洗浄した以外はすべての詳細が同じ平行実験において、宿主タンパク質は527ppmに減少し、凝集体は1.6%に減少した。287,661ppm宿主タンパク質混入物及び19%凝集体を含む別のIgG含有細胞培養収集物をプロテインAカラム(Toso BioScience)にかけ、50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.2で洗浄し、次いで100mM酢酸で溶出させた。宿主タンパク質混入は1,337ppmに減少し、凝集体は2.1%に減少した。
287,621ppm宿主タンパク質混入物及び19%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物を2つの部分に分割した。第1の部分に1%アラントイン、0.4%カプリル酸、pH5.2を添加してコンディショニングし、2時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を4%の量添加し、さらに4時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)によって固体を除去した。宿主タンパク質は167ppmに減少し、凝集体は0.01%未満に減少した。コンディショニングした収集物をプロテインAカラム(Toso BioScience)にかけ、50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.2で洗浄し、次いで100mM酢酸で溶出させた。宿主タンパク質は検出限界以下のレベルに減少した。カラムを50mMリン酸塩、1.0M NaCl、pH7.2で洗浄した以外はすべての詳細が同じ平行実験において、宿主タンパク質はやはり検出限界以下のレベルに減少した。第2の部分に1%アラントイン及び0.025%エタクリジンを添加してコンディショニングし、2時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を4%の量添加し、さらに4時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)によって固体を除去した。宿主タンパク質は2,985ppmに減少し、凝集体は0.1%未満に減少した。コンディショニングした収集物をプロテインAカラム(Toso BioScience)にかけ、50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、pH7.2で洗浄し、次いで100mM酢酸で溶出させた。宿主タンパク質は1ppmに減少した。カラムを50mMリン酸塩、1.0M NaCl、pH7.2で洗浄した以外はすべての詳細が同じ平行実験において、宿主タンパク質はやはり1ppmに減少した。
251,852ppm宿主タンパク質混入物及び18%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物に1%アラントイン、0.4%カプリル酸、pH5.2を添加してコンディショニングし、2時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を4%の量添加し、さらに4時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)によって固体を除去した。宿主タンパク質は131ppmに減少し、凝集体は0.01%未満に減少した。試料をCapto adhereにかけると、宿主タンパク質は3ppmに減少した。試料をCapto adhere ImpResにかけると、宿主タンパク質は1pmに減少した。
191,180ppm宿主タンパク質混入物及び16%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物に1%アラントイン、0.4%カプリル酸、pH5.2を添加してコンディショニングし、2時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を4%の量添加し、さらに4時間インキュベート混合し、次いで0.45ミクロン膜上の精密ろ過によって固体を除去して、宿主タンパク質を2,063ppmに、凝集体を1.2%に削減した。次いで、試料を電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)に通して、宿主タンパク質を196ppmに、凝集体を0.01%未満に削減した。空隙排除モードで動作させたUNOsphere Qのカラムに試料をかけて、宿主タンパク質を1ppmに削減した。あるいは、空隙排除モードで動作させたNuvia Qのカラムに試料をかけて、宿主タンパク質を1ppmに削減した。0.4%カプリル酸の代わりに0.2%カプリン酸を用いた以外はすべての詳細が同じ平行シリーズの実験において、宿主タンパク質は膜ろ過後に1,920ppmに減少し、深層ろ過後に132ppmに減少し、両方のアニオン交換ステップ後に1ppm未満に減少した。
176,244ppm宿主タンパク質混入物及び14%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物に1%アラントイン、0.4%カプリル酸、pH5.2を添加してコンディショニングし、2時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を4%の量添加し、さらに4時間インキュベート混合し、次いで0.45ミクロン膜上の精密ろ過によって固体を除去して、宿主タンパク質を2,063ppmに、凝集体を1.2%に削減した。次いで、試料を電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)に通して、宿主タンパク質を196ppmに、凝集体を0.01%未満に削減した。空隙排除モードで動作させたUNOsphere Qのカラムに試料をかけて、宿主タンパク質を1ppmに削減した。あるいは、空隙排除モードで動作させたNuvia Qのカラムに試料をかけて、宿主タンパク質を1ppmに削減した。0.4%カプリル酸の代わりに0.2%カプリン酸を用いた以外はすべての詳細が同じ平行シリーズの実験において、宿主タンパク質は膜ろ過後に1,920ppmに減少し、深層ろ過後に132ppmに減少し、両方のアニオン交換ステップ後に1ppm未満に減少した。
243,997ppm宿主タンパク質混入物及び24%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物に1%アラントイン、0.4%カプリル酸、pH5.6を添加してコンディショニングし、2時間インキュベートし、続いて電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を4%の量添加し、さらに4時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)によって固体を除去した。宿主タンパク質は3,551ppmに減少し、凝集体は0.5%未満に減少した。硫酸アンモニウム沈殿によって、宿主タンパク質含有量は1,423ppmに減少し、凝集体は0.1%未満に減少した。QAモノリス上の後続のアニオン交換クロマトグラフィステップによって、宿主タンパク質は2ppmに減少した。遠心分離及び精密ろ過によって精製された収集物に対して行われた硫酸アンモニウム沈殿によって宿主タンパク質は30,114ppmに減少した。アニオン交換によって更に411ppmに減少した。これらの結果は、クロマチン除去の利点が沈殿方法にも当てはまることを示し、その利点が第1のステップから後続のクロマトグラフィステップに波及することも示した。
256,482ppm宿主タンパク質混入物及び21%凝集体を含むIgG含有細胞培養収集物に4%の量の電気陽性金属親和性粒子(TREN 40 high、Bio−Works)を添加してコンディショニングし、4時間インキュベート混合し、次いで電気陽性デプスフィルタ(Sartorius PC1)によって固体を除去した。宿主タンパク質は1,183ppmに減少し、凝集体は0.4%未満に減少した。Capto adhereに試料をかけると、宿主タンパク質は147ppmに減少し、凝集体は0.05%未満に減少した。空隙排除モードで動作させたUNOsphere Q上の後続のアニオン交換クロマトグラフィステップによって宿主タンパク質は3ppmに減少した。
Claims (22)
- 所望のタンパク質を含むタンパク質調製物中の凝集体及び生成物−混入物複合体含有量を低減する方法であって、(i)0.5%(w/v)を超える量のアラントインと前記タンパク質調製物を接触させるステップ、(ii)トリス(2−アミノエチル)アミン(TREN)、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、デフェロキサミン(デスフェリオキサミン)、ヒスチジン、ヒスタミン、ポリヒスチジン、アルギニン、ポリアルギニン、リジン、ポリリジン、及びポリアリルアミンよりなる群から選択される少なくとも1種類の第1の表面結合リガンドを含む少なくとも1つの固体表面と前記タンパク質調製物を接触させるステップであって、前記第1の表面結合リガンドは最初に金属を実質的に含まず、操作条件は前記所望のタンパク質が前記少なくとも1つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択される、ステップ、及び(iii)前記タンパク質調製物を前記少なくとも1種類の第1の表面結合リガンドから分離するステップであって、1種類を超える表面結合リガンドが存在するとき、各表面結合リガンドは独立に同じ正味電荷又は電荷中性のどちらかである、ステップを含み、前記所望のタンパク質が抗体である、方法。
- 前記第1の表面結合リガンドが、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ相互作用、水素結合及びそれらの組合せからなる群から選択される更なる化学官能性を与える、請求項1に記載の方法。
- 前記(ii)の接触ステップが、さらに、静電相互作用、疎水性相互作用、パイ−パイ結合、水素結合及びそれらの組合せよりなる群から選択される化学官能性を与える少なくとも1種類の追加の表面結合リガンドと前記タンパク質調製物を接触させるステップを含む、請求項1又は2のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の表面結合リガンド上の正味電荷が正である、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の表面結合リガンドが、トリス(2−アミノエチル)アミン(TREN)、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリプロピレンイミンテトラミン、及びデフェロキサミン(デスフェリオキサミン)からなる群から選択される一つを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記タンパク質調製物が(a)約0.6から約1%、(b)約1から約2%、(c)約2から約5%、(d)約5から約10%、(e)約10から約25%及び(f)約25から約50%からなる群から選択される過飽和濃度で前記アラントインと接触する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質調製物の伝導率が約0.1mS/cmから約40mS/cmの範囲を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質調製物の伝導率が約40mS/cmから約200mS/cmの範囲を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記所望のタンパク質が前記少なくとも1つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された前記操作条件が、前記少なくとも1種類の表面結合リガンドの各々への前記所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに十分高く前記タンパク質調製物の伝導率を選択することを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記所望のタンパク質が前記少なくとも1つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された前記操作条件が、前記少なくとも1種類の表面結合リガンドの各々への前記所望のタンパク質の実質的な結合を防止するのに必要な値よりも約0.001%から約400%高い前記タンパク質調製物の伝導率を選択することを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記操作条件のpHが、前記所望のタンパク質が前記少なくとも1つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択された、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの固体表面が粒子又は粒子の複合体を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの固体表面が繊維又は繊維の複合体を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの固体表面が膜又は膜の複合体を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの固体表面がモノリス又はモノリスの複合体を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質調製物が細胞培養収集物を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質調製物が精製細胞培養収集物を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質調製物が組換えタンパク質を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法後、前記タンパク質調製物が、低下した凝集体含有量を有する、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記凝集体含有量が、(a)約50%から約99%、(b)約25%から約50%、(c)約10%から約25%、(d)約5%から約10%、(e)約1%から約5%、及び(f)約0.1%から約1%からなる群から選択される範囲の量だけ低下する、請求項19に記載の方法。
- さらに、前記調製物中の凝集体混入物を低減する少なくとも1種類の有機添加剤と前記タンパク質調製物を接触させるステップを含み、前記有機添加剤が、正イオン、負イオン、有機溶媒、有機ポリマー及び界面活性剤からなる群から選択される、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
- 所望のタンパク質を含むタンパク質調製物中の凝集体及び生成物−混入物複合体含有量を低減する方法であって、(i)0.5%(w/v)を超える量のアラントインと前記タンパク質調製物を接触させるステップ、(ii)イミノ二酢酸(2−(カルボキシメチルアミノ)酢酸)、エチレングリコール(アミノエチルエーテル)二酢酸、ジエチルアミントリアミンペンタ酢酸、ニトリロ酢酸(2,2’,2”−ニトリロ三酢酸)、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びポリアスパラギン酸よりなる群から選択される少なくとも1種類の表面結合リガンドを含む少なくとも1つの固体表面と前記タンパク質調製物を接触させるステップであって、前記表面結合リガンドは最初に金属を実質的に含まず、操作条件は前記所望のタンパク質が前記少なくとも1つの固体表面に結合するのを実質的に防止するように選択される、ステップ、及び(iii)前記タンパク質調製物を前記少なくとも1種類の表面結合リガンドから分離するステップであって、1種類を超える表面結合リガンドが存在するとき、各表面結合リガンドは独立に同じ正味電荷又は電荷中性のどちらかである、ステップを含み、前記所望のタンパク質が抗体である、方法。
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