KR101431856B1 - 항체의 고분자전해질 침전 및 정제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 고분자전해질을 수확된 세포 배양 유체와 같은 세포 배양 유체에 첨가하고, 항체-고분자전해질 착체 또는 불순물과 고분자전해질의 착체를 침전시켜 항체를 단리 및 정제하기 위한 방법을 제공한다.
고분자전해질, 침전, 정제, 항체, 세포 배양 유체, 불순물
Description
<관련 출원의 상호 참조>
37 CFR §1.53(b) 하에 출원된 본 비-가특허출원은 2007년 1월 22일에 출원된 미국 가특허출원 일련번호 제60/886068호 및 2007년 12월 13일에 출원된 미국 가특허출원 일련번호 제61/013446호 (전문이 본원에 포함됨)의 35 USC §119(e) 하의 이익을 주장한다.
본 발명은 단백질의 정제 방법에 관한 것이다.
경제적인 대규모 단백질 정제는 생물공학 산업에서 점점 중요한 문제가 되고 있다. 일반적으로, 단백질은 목적 단백질의 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 삽입시켜 목적 단백질을 생산하도록 조작된 포유동물 또는 박테리아 세포주를 사용하여 세포 배양에 의해 생산된다. 사용된 세포주는 살아있는 생물체이기 때문에, 이들에게 통상적으로 동물 혈청 제제로부터 공급되는 당, 아미노산 및 성장 인자를 함유하는 복합 성장 배지가 공급되어야 한다. 목적 단백질을 세포에 공급된 화합물의 혼합물 및 세포 자체의 부산물로부터 인간 치료제로서 사용하기에 충분한 순도로 분리하는 것은 만만치 않은 일이다.
재조합 치료용 단백질은 통상적으로 뮤린(murine) 골수종 NS0 및 차이니스 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포를 포함한 여러 포유동물 숙주 세포주에서 생산된다 (문헌 [Anderson, D.C and Krummen, L. (2002) Curr. Opin. Biotech. 13:117-123]; [Chu, L. and Robinson, D.K. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:180-187] 참조). 각각의 세포주는 세포에 의해 생산된 단백질의 생산성 및 특성의 관점에서 장단점을 갖는다. 시판용 세포주의 선택은 종종 높은 생산성과 해당 제품에 요구되는 제품 품질 속성의 전달력 사이에서 균형을 맞춘다. 종종 높은 역가 방법을 요구하는 치료용 재조합 단백질의 한 중요한 부류는 모노클로날 항체이다. 일부 모노클로날 항체는 이들의 생물학적 기능을 이끌어내기 위해 Fc 영역을 통해 매개된 이펙터 기능을 필요로 한다. 한 예는 세포 표면 CD-20에 결합하여 B-세포 결핍을 초래하는 키메라 모노클로날 항체인 리툭시맙 (리툭산(RITUXAN)®, 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 및 바이오젠-이덱(Biogen-Idec))이다 (문헌 [Cartron et al (2002) Blood 99:754-758]; [Idusogie et al (2000) J. Immunol. 164:4178-4184] 참조). 다른 항체, 예를 들어 인간화 항-VEGF (혈관 내피 성장 인자) 항체인 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)TM, 제넨테크, 인크.)은 이들의 활성을 위해 Fc 이펙터 기능을 요구하지 않는다.
발효 및 세포 배양 기술의 진보는 배양 유체에서 표적 단백질의 역가를 매우 증가시켰다. 이러한 상류 효율의 증가는 세포-수확 단계에서의 하류 처리에 병목 현상을 유도하였다. 세포 수확, 또는 수확된 세포 배양 유체의 정화는 생물공학계 생성물의 거의 모든 하류 정제에 중요한 방법이다. 생성물이 세포내에 있는 경우, 세포 수확은 생성물 추출 단계에서 처리될 세포의 액체 부피를 감소시키는데 사용된다. 생성물이 세포외에 있는 경우, 세포 수확은 세포 및 세포 파편으로부터 생성물을 분리시키는데, 예를 들어 포유동물 세포 배양물로부터 세포외 항체를 단리시키는데 사용된다 (문헌 [Anthony S. Lubiniecki, Ed. (1990) Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology, Marcel Dekker]; [Hansjoerg Hauser, Roland Wagner, Eds. (1997) Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production, Walter Gruyter Publishing] 참조).
세포 파편으로부터 단백질을 정제하는 방법은 처음에는 단백질의 발현 부위에 좌우된다. 일부 단백질은 세포로부터 주위 성장 배지로 직접 분비되도록 할 수 있고, 일부 단백질은 세포내에서 만들어진다. 후자 단백질의 경우, 정제 방법의 제1 단계는 기계적 전단, 삼투압 충격 또는 효소 처리를 비롯한 각종 방법에 의해 수행될 수 있는 세포의 용해 단계를 포함한다. 이러한 파열로 세포의 전체 내용물이 균질화액으로 방출되고, 또한 작은 크기로 인해 제거하기 어려운 하위세포 단편들이 생산된다. 이들은 일반적으로 분별 원심분리 또는 여과에 의해 제거된다. 정도는 덜 하지만, 세포의 자연사 및 단백질 생성 과정 중 세포내 숙주 세포 단백질의 방출로 인해 직접 분비된 단백질에 있어서도 동일한 문제가 일어난다.
치료용 항체의 정제 동안, 숙주 세포 단백질, 생성물 변형체, 숙주 세포 DNA, 소분자, 방법 관련 오염물, 엔도톡신 및 바이러스 입자를 포함한 불순물이 제 거되어야 한다 (문헌 [Fahrner, R.L. et al (2001) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18:301-327] 참조). 사용된 정제 기술은 측정가능하고, 효율적이고, 경제적이고, 신뢰할 수 있어야 하며, 최종 생성물의 엄격한 순도 요건을 충족하여야 한다. 현재의 정제 기술은 전형적으로 직교 분리 방식을 사용하는 다중 크로마토그래피 분리법을 포함한다. 전형적인 방법은 하기 단계 중 일부를 포함한다: 침전 (US 7169908), 투석, 전기영동, 초여과, 친화성 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피. 전형적인 컬럼 크로마토그래피 단계가 효과적이고 신뢰할 만 하지만, 일반적으로 생성물 처리량 (시간 당 처리된 kg)이 낮다. 모노클로날 항체가 보다 폭넓게 사용될수록, 보다 효율적인 방법-규모의 생산이 필요하다.
크로마토그래피 기술은 고도의 정제를 달성하기 위해 단백질의 화학적 및 물리적 성질을 이용한다. 이들 화학적 및 물리적 성질은 전형적으로 크기, 등전점, 전하 분포, 소수성 부위 및 리간드에 대한 친화성을 포함한다 (문헌 [Janson, J.C. and L. Ryden (eds.). (1989) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications. VCH Publishers, Inc., New York] 참조). 크로마토그래피의 다양한 분리 방식으로는 이온 교환, 크로마토포커싱(chromatofocusing), 겔 여과 (크기 배제), 소수성 상호작용, 역상 및 친화성 크로마토그래피가 포함된다. 음이온 교환 및 양이온 교환 크로마토그래피를 비롯한 이온 교환 크로마토그래피 (IEX)는 분석물질 (예를 들어, 단백질)을 이들의 전체 표면 전하의 차이에 의해 분리한다. IEX는 발현된 단백질을 세포 파편 및 다른 불순물로부터 분리하기 위한 주요한 도구이다. 오늘날, IEX는 단백질, 펩티드, 핵산 및 다른 하전된 생체분자의 정제에 가장 흔히 사용되는 기술 중 하나이며, 높은 분해 및 높은 로딩(loading) 용량에서의 군 분리를 제공한다. 이 기술은 단지 전하 성질에 있어서 최소의 차이만을 갖는 분자종, 예를 들어 하나의 하전된 아미노산이 상이한 2개의 단백질을 분리할 수 있다. 이들 특징으로 인해 IEX가 정제 프로토콜에서 포획, 중간체 정제 또는 연마 단계에 매우 적합하며, 이 기술은 마이크로규모의 정제 및 분석에서부터 수 킬로그램의 생성물의 정제에 사용된다.
크로마토그래피 기술은 신뢰할 수 있지만, 대규모 응용에서 용량 및 처리량이 문제될 수 있다. 전형적인 컬럼 크로마토그래피 단계는 효과적이고 신뢰할 수 있지만, 일반적으로 생성물 처리량 (시간 당 처리된 kg)이 낮다. 재조합 단백질이 보다 폭넓게 사용될수록, 보다 효율적인 방법-규모의 생산이 필요하다. 크로마토그래피 단계의 처리량은 전형적으로 목적 단백질에 대한 크로마토그래피 수지의 용량에 의해 제한된다. 컬럼에 단백질 로드(load)가 증가하면, 불순물로부터 목적 단백질의 분해가 종종 감소한다.
고분자전해질은 가용성 착체 (문헌 [Dellacherie, E. (1991) Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem. Prepr. 32(1):602] 참조), 비정질 침전물 (문헌 [Mattiasson et al (1998) Polym. Plast. Technol. Eng. 37(3):303-308]; [Clark et al (1987) Biotech. Progress 3(4):241]; [Fisher et al (1988) Biotechnol. Bioeng. 32:777]; [Shieh et al (1991) Am. Chem. Soc., Div. Polym. Chem. Prepr. 32(1)606]; [Sternberg et al (1974) Biochimica et Biophysica Acta 342:195- 206]; WO 2004/014942 참조) 또는 코아세르베이트 (문헌 [Wang et al (1996) Biotechnol. Prog. 12:356-362]; [Veis, A. (1991) Am. Chem. Soc. Div. Polym. Chem. Prepr. 32(1) 596] 참조)의 형태를 취하는 단백질과 착체를 형성하는 것으로 알려져 있다. 항원-폴리양이온 (폴리메타크릴산)의 존재 하에서 모노클로날 항체를 파파인 단백질분해하여 Fab 단편을 생성한다 (문헌 [Dainiak et al (2000) Analytical Biochem. 277:58-66] 참조).
단백질-고분자전해질 착체는 코아세르베이트를 형성하며, 즉 2개의 다른 액체상으로 분리되며, 코아세르베이트 상은 착체의 대부분을 함유하고 다른 상은 평형상태의 상이다 (문헌 [Burgess, D.J. "Complex Coacervation: Microcapsule Formation" in Macromolecular Complexes in Chemistry and Biology, Dubin, P.L., et al Eds. (1994) Springer-Verlag, Berlin]; [Dubin et al (1994) Sep. Purif. Methods 23:1-16] 참조). 단백질의 고분자전해질 코아세르베이션은 복잡한 과정이며 광범위한 범위의 단백질에 유용하지는 않다. 단백질-고분자전해질 착체에서 분자간 결합은 정전기적 상호작용, 수소 결합 및 소수성 힘에 기인한다 (문헌 [Cooper et al (2005) Current Opinion in Colloid ＆ Interface Science 10:52-78]; [Mattison et al (1999) Macromol. Symp. 140:53-76] 참조). 단백질 용액에 고분자전해질을 첨가함으로써 단백질-고분자전해질 착체 및 보다 큰 클러스터를 형성하고 결국 코아세르베이트 및/또는 침전을 유도할 수 있다고 알려져 있지만, 고분자전해질의 추가 첨가시 반대 과정이 일어나며 이에 의해 단백질의 재용해가 일어나 단백질 단리 또는 정제의 시도가 무산될 수 있다 (문헌 [Carlsson et al (2003) J. Am. Chem. Soc. 125:3140-3149] 참조). 고분자전해질을 사용한 단백질의 침전은 크로마토그래피 분리에 대한 경제적인 대안을 제공할 수 있다. 이러한 기술을 사용하여, 크로마토그래피 기술의 기능적 화학을 이용함으로써 용액 중 유사한 수준의 단백질 정제를 달성하는 것이 가능할 수 있다. 특히, 침전 단계의 처리량은 특정 크로마토그래피 수지의 용량에 의해 더이상 제한되지 않을 것이다.
<발명의 요약>
본 발명은 세포 배양 유체에서 유도된 단백질의 단리 및 정제에 관한 방법을 제공한다.
본 발명의 한 측면은 단백질을 고분자전해질, 예를 들어 폴리음이온 고분자전해질로 침전시키는 단백질 정제 방법이다.
본 발명은 또한 세포 배양 유체 불순물을 폴리양이온 고분자전해질로 침전시키는 단백질 정제 방법을 제공한다. 침전 단계에 이어서 양이온 교환 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 및 다른 침전 단계가 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 항체 정제에 대한 비친화성 방법을 포함한다.
본 발명의 한 측면은
(a) 수확된 세포 배양 유체에서 유도된 항체를 함유하는 혼합물의 산도 또는 염 농도를 조정하는 단계;
(b) 음으로 하전된 고분자전해질을 첨가하여 단백질-고분자전해질 침전물을 형성하는 단계;
(c) 단백질 응집물, 단백질 단편, 숙주 세포 단백질, 인슐린, 젠타마이신, DNA 및 침출된 단백질 A에서 선택된 불순물로부터 단백질-고분자전해질 침전물을 분리하는 단계;
(d) 단백질-고분자전해질 침전물을 단리하는 단계; 및
(e) 단백질-고분자전해질 침전물을 수용액 중에 재현탁시키는 단계
를 포함하는, 항체의 정제 방법이다.
본 발명의 또다른 측면은
(a) 세포 배양 유체에서 유도된 항체를 함유하는 혼합물의 산도 또는 염 농도를 조정하는 단계;
(b) 양으로 하전된 폴리양이온 고분자전해질을 혼합물에 첨가하여, 양으로 하전된 폴리양이온 고분자전해질 및 단백질 응집물, 단백질 단편, 숙주 세포 단백질, 인슐린, 젠타마이신 및 DNA에서 선택된 불순물을 포함하는 침전물을 형성하는 단계; 및
(c) 항체를 포함하는 혼합물로부터 침전물을 분리하는 단계
를 포함하는, 항체의 정제 방법이다.
도 1은 수확된 세포 배양 유체 (HCCF)로부터 정제된 단백질 A 풀(pool)의 정제 방법 단계를 도시한다: 왼쪽 열 - 양이온 교환 크로마토그래피 (세파로스(Sepharose)TM 패스트 플로우, SPSFF)에 이어서 음이온 교환 크로마토그래피 (QSFF); 중간 열 - QSFF; 또는 오른쪽 열 - pH 7에서의 폴리비닐술폰산 (PVS) 침전 에 이어서 QSFF.
도 2는 수확된 세포 배양 유체 (HCCF)로부터 정제된 SPSFF 풀의 정제 방법 단계를 도시한다: 왼쪽 열 - QSFF; 또는 오른쪽 열 - pH 7에서의 PVS 침전에 이어서 QSFF.
도 3은 HCCF로부터 항체의 직접적인 포획 및 정제 방법 단계를 도시한다: 왼쪽 열 - pH 5에서의 PVS 침전, 이어서 QSFF, 그다음 SPSFF; 또는 pH 7에서의 PVS 침전, 이어서 QSFF, 그다음 SPSFF.
도 4는 pH 5, 3.0 및 5.6 mS/cm에서 PVS (1800 Da) 중 rhuMab 2H7 용해도 곡선을 도시한다 (단백질 A 풀). mS = 밀리시멘스, 전도율 단위
도 5는 pH 7, 0.7, 1.5, 3.0 및 4.7 mS/cm에서 PVS (1800 Da) 중 rhuMab 2H7 용해도 곡선을 도시한다 (단백질 A 풀).
도 6은 pH 7, 0.8 및 1.5 mS/cm에서 PVS (1800 Da) 중 rhuMab 2H7 용해도 곡선을 도시한다 (SPSFF 포획 풀).
도 7은 pH 5, 3.0 mS/cm에서, 및 pH 7, 0.7 mS/cm에서 PVS (1800 Da) 중 rhuMab 2H7 용해도 곡선을 도시한다 (HCCF).
도 8은 pH 5, 5 mS/cm에서 PVS (1800 Da) 침전과 PAA (1200 및 8000 Da) 침전을 비교한, 항-CD20 항체, 2H7의 용해도 곡선을 도시한다.
도 9는 pH 7, 1.5 mS/cm에서 PVS (1800 Da) 침전과 PAA (1200 및 8000 Da) 침전을 비교한, 항-CD20 항체, 2H7의 용해도 곡선을 도시한다.
도 10은 pH 7, 1.5 mS/cm에서 분자량 범위 1200 내지 1,100,000 Da인 PAA를 비교한, 항-CD20 항체 (리툭시맙) 용해도 곡선을 도시한다.
도 11은 항-CD20 rhuMab 2H7에 대한 요약적인 하류 처리 결과의 표를 도시한다: (a) 단백질 A를 통해 처리된 HCCF; (b) SPSFF를 통해 처리된 HCCF; (c) HCCF의 PVS 침전.
도 12는 pH 5.5, 5.1 mS/cm에서; pH 6.0, 3.0 mS/cm에서; pH 6.0, 5.5 mS/cm에서 PVS (1800 Da) 중 Apomab 용해도 곡선을 도시한다.
도 13은 pH 6.5, 1.5 mS/cm에서; pH 6.5, 3.2 mS/cm에서; pH 7.0, 0.7 mS/cm에서 PVS (1800 Da) 중 Apomab 용해도 곡선을 도시한다.
도 14는 (왼쪽) PVS 무함유 (0％), (중간) 0.1％ PVS (w/v), 및 (오른쪽) 1％ PVS (w/v)를 함유하는, pH 5.5에서 Apomab의 단백질 A 풀을 함유하는 플라스크 사진을 도시한다.
도 15는 pH 4, 2 mS/cm에서; pH 5, 1 mS/cm에서; pH 5, 2.4 mS/cm에서; pH 6, 0.5 mS/cm에서; pH 7, 0.5 mS/cm에서 PVS (1800 Da) 중 항-cMet 용해도 곡선을 도시한다.
도 16은 CCF로부터 rhuMab 2H7 항체의 직접적인 포획 및 정제 방법 단계를 도시한다: 왼쪽 열 - HCCF 원심분리, 이어서 PVS를 이용한 항체 침전, 이어서 QSFF; 오른쪽 열 - 폴리아르기닌 플록형성(flocculation)/불순물 침전, HCCF 원심분리, PVS를 이용한 항체 침전, 이어서 QSFF.
도 17은 수확된 세포 배양 유체 (HCCF)로부터 rhuMab 2H7 항체의 정제 방법 단계를 도시한다: 왼쪽 열 - Prosep vA, 양이온 교환 크로마토그래피 (세파로스TM 패스트 플로우, SPSFF), 이어서 음이온 교환 크로마토그래피 (QSFF); 오른쪽 열 - 폴리아르기닌 침전, Prosep vA, SPSFF, 이어서 QSFF.
도 18은 도 17과 동일하되 Prosep vA 단계가 배제된, 수확된 세포 배양 유체 (HCCF)로부터 rhuMab 2H7 항체의 정제 방법을 도시한다: 왼쪽 열 - SPSFF, 이어서 QSFF; 오른쪽 열 - 폴리아르기닌 침전, SPSFF, 이어서 QSFF.
도 19는 수확된 세포 배양 유체 (HCCF)로부터 rhuMab 2H7 항체의 정제 방법 단계를 도시한다: 왼쪽 열 - PVS를 이용한 항체 침전, 이어서 QSFF; 오른쪽 열 - 폴리아르기닌 침전, PVS를 이용한 항체 침전, 이어서 QSFF.
도 20은 110 kDa 폴리아르기닌을 이용한 rhuMab 2H7 CCF 용해도 곡선을 도시한다.
도 21은 rhuMab 2H7 HCCF 용해도 곡선 - 42 kDa 폴리아르기닌을 도시한다.
도 22는 rhuMab 2H7 HCCF 용해도 곡선 - 110 kDa 폴리아르기닌을 도시한다.
도 23은 rhuMab 2H7, 항-CD22, rhuMab C2B8 HCCF 용해도 곡선 - 42 kDa 폴리아르기닌을 도시한다.
도 24는 rhuMab 2H7, 항-CD22, rhuMab C2B8 HCCF 용해도 곡선 - 110 kDa 폴리아르기닌을 도시한다.
도 25는 0.075％ w/v 110 kDa 폴리아르기닌에 의해 플록형성된 rhuMab 2H7 CCF의 PVS 침전의 용해도 곡선을 도시한다.
도 26은 로드로서, 폴리아르기닌 침전된 HCCF로부터 생성된 단백질 A 풀을 이용한 SPSFF의 파과(breakthrough) 곡선을 도시한다.
도 27은 로드로서, 침전된 폴리아르기닌으로부터 생성된 HCCF를 이용한 SPSFF의 파과 곡선을 도시한다.
도 28은 2H7 MAb에서 항체 감소 억제의 겔 전기영동을 도시한다. HCCF 4 - 12％ BT, MOPS 완충액, 스피로(Sypro) 루비 착색, 2 μg HCCF 로드, 5분 70℃, 9초 노출, 2 F/T 실행 7, SS 미니-캔에서의 실온 인큐베이션, -70℃에서 즉시 냉동된 500 μl (마이크로리터) 샘플.
도 29는 rhuMab C2B8 단백질 A 풀 용해도 곡선 - 2.5kDa 폴리리신을 도시한다.
도 30은 rhuMab C2B8 단백질 A 풀 용해도 곡선 - 50 kDa 폴리리신을 도시한다.
도 31은 rhuMab C2B8 HCCF 용해도 곡선 - 50 kDa 폴리리신을 도시한다.
도 32는 rhuMab C2B8 HCCF 용해도 곡선 - 225 kDa 폴리리신을 도시한다.
도 33은 pH 7 및 12 mS/cm 전도율에서 0.00％ 내지 0.20％ 폴리스티렌 술포네이트 (PSS)의 1800 Da 내지 1132 kDa 샘플을 이용한 인간화 항-CD20 용해도 곡선을 도시한다.
도 34는 각각의 필터 매체 A1HC, B1HC, C0HC, 45CE, 20CE, 30CE에 대해 용량 (필터 면적 당 항체 그램으로 측정됨) 대 압력 강하의 Vmax 플롯을 도시한다.
도 35는 C0HC 밀리스탁(MILLISTAK)+® 필터 매체로부터 2H7-PVS 단백질-고분 자전해질 침전물의 완전한 재가용화에 도달하는데 필요한 완충액 부피의 관점에서, 수율에 대한 유속 변화의 효과를 도시한다. LMH = 시간 당 평방 미터 당 리터, 유속 척도.
도 36은 C0HC 밀리스탁+® 필터로부터 단백질의 재가용화에 대한 2가지 범위의 유량 (완충액 재가용화 유량 (LMH)) 의 효과를 도시한다.
도 37은 인라인(inline) HCCF 컨디셔닝/PVS 침전 설비의 공정 개략도를 도시한다.
도 38은 연속 공급물 컨디셔닝/침전의 항체 회수율을 도시한다.
지금부터 본 발명의 특정 실시양태를 보다 상세하게 언급할 것이며, 이의 실시예는 구조식 및 화학식을 수반하면서 예시된다. 본 발명은 열거되는 실시양태와 함께 기재될 것이지만, 본 발명을 이들 실시양태로 제한하고자 함은 아니라는 것을 이해할 것이다. 대조적으로, 본 발명은 특허청구범위에 의해 한정된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 별법, 변형 및 동등물을 포함하는 것으로 의도된다. 당업자는 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 다수의 방법 및 물질을 인식할 것이다. 본 발명은 기재된 방법 및 물질로 한정되지 않는다. 포함된 문헌, 특허 및 유사 자료 중 하나 이상이 본원 (한정된 용어, 용어 사용법, 기재된 기술 등을 포함하지만 이에 한정되지 않음)과 상이하거나 본원에 모순되는 경우, 본원이 우선한다.
정의
달리 언급하지 않는다면, 본원에 사용된 하기 용어들 및 구절들은 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다:
용어 "수확된 세포 배양 유체"는 또한 HCCF로도 표시되며 원심분리 또는 여과를 비롯한 수단에 의해 세포를 제거하여 얻은 원핵 또는 진핵 세포 배양 유체를 의미한다. 세포 배양은 원핵 또는 진핵 세포를 조절된 조건 하에서 성장시키는 공정이다. 용어 "세포 배양"은 동물 세포를 비롯한 다세포의 진핵세포 또는 박테리아 및 효모를 비롯한 단세포의 원핵세포로부터 유도된 세포의 배양을 지칭한다. 진핵 세포 배양물은 포유동물 세포, 예를 들어 차이니스 햄스터 난소 세포, 하이브리도마, 및 곤충 세포를 포함한다. 적절한 세포 배양 용기를 사용해서, 분비된 단백질을 고정(anchorage) 의존 세포 또는 현탁 세포주로부터 얻을 수 있다. 포유동물 세포 배양물은 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포를 포함한다.
용어 "미생물 발효"는 단백질과 같은 화학물질을 생산하도록 유전자 조작된 박테리아 또는 효모의 세포 배양을 의미한다. 발효는 클로닝된 박테리아 및 효모 및 다른 미생물을 증식시키고 유용한 단백질을 생산하는데 사용된다. 이들 생물체의 세포 생산성 및 성장은 특정 성장 배지를 공급하고 다양한 환경 인자 (예를 들어, pH, 온도, 및 통기(aeration))를 조절함으로써 최대화된다. 박테리아 발효 유체는 이. 콜라이(E. Coli)로부터 유도될 수 있다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 구체적으로는 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다면 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함한다. 항체는 뮤린, 인간, 인간화, 키메라 항체일 수 있거나, 또는 다른 종으로부터 유도될 수 있다.
항체는 특정 항원에 결합하여 이를 인식할 수 있는 면역계에 의해 생성된 단백질이다 (문헌 [Janeway, et al (2001) "Immunobiology", 5th Ed., Garland Publishing, New York] 참조). 표적 항원은 일반적으로 다중 항체 상의 CDR에 의해 인식되는 다수의 결합 부위 (에피토프라고도 부름)를 갖는다. 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 각 항체는 상이한 구조를 갖는다. 따라서, 하나의 항원은 하나보다 많은 상응하는 항체를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "항체"는 또한 전장 이뮤노글로불린 분자 또는 전장 이뮤노글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부위, 즉 목적 표적 또는 그의 부분의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭하며, 상기 표적으로는 암세포 또는 자가면역 질환과 관련된 자가면역 항체를 생산하는 세포가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 본원에 개시된 이뮤노글로불린은 이뮤노글로불린 분자의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, 및 IgA), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류 중 어느 것일 수 있다. 이뮤노글로불린은 임의의 종으로부터 유도될 수 있다. 그러나, 한 측면에서, 이뮤노글로불린은 인간, 뮤린 또는 토끼 기원의 이뮤노글로불린이다.
"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항-개별특이형 (항-Id) 항체, CDR (상보성 결정 영역), ECD (세포외 도메인), 및 이들 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편을 들 수 있으며, 이는 암세포 항원, 바이러스 항원 또는 미생물 항원, 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체에 면역특이적으로 결합한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어진 항체를 지칭하며, 즉 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 소량 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적인 돌연변이를 제외하면 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지시된다. 또한, 여러 결정자 (에피토프)에 대해 지시되는 여러 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 모노클로날 항체는, 이들의 특이성에 더하여, 다른 항체에 의한 오염 없이 합성될 수 있다는 점에서 유리하다. "모노클로날"이라는 수식어구는 실질적으로 균일한 항체 집단으로부터 얻어지는 것으로서의 항체 특징을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산이 필요한 것으로 이해되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al (1975) Nature 256:495]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (US 4816567)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 예를 들어 문헌 [Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628]; [Marks et al (1991) J. Mol. Biol, 222:581-597]에 기재된 기술을 이용해서 파아지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
유용한 모노클로날 항체는 특정 항원 결정자 (예를 들어, 암세포 항원, 바이러스 항원, 미생물 항원, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 화학물질, 핵산, 또는 이들의 단편)에 대한 균일한 항체 집단이다. 목적 항원에 대한 모노클로날 항체 (MAb)는 배양 중의 연속 세포주에 의해 항체 분자를 생산하는, 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용해서 제조할 수 있다. 이들로는 문헌 [Koehler and Milstein (1975) Nature 256:495-497]에 최초로 기재된 하이브리도마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술 (문헌 [Kozbor et al (1983) Immunology Today 4:72] 참조), 및 EBV-하이브리도마 기술 (문헌 [Cole et al (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96] 참조)을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 비롯한 임의의 이뮤노글로불린 부류 및 이들의 임의의 하위부류 중 어느 것일 수 있다. 본 발명에 사용되는 MAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양될 수 있다.
본 발명의 방법에 유용한 치료 모노클로날 항체로는 트라스투주맙 (허셉틴(HERCEPTIN)®, 제넨테크, 인크., 문헌 [Carter et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289]; US 5,725,856); 항-CD20 항체, 예를 들어 키메라 항-CD20 "C2B8" (US 5736137); 리툭시맙 (리툭산®), 오크렐리주맙, 2H7 항체의 키메라 또는 인간화 변이체 (US 5721108; WO 04/056312) 또는 토시투모맙 (벡사르(BEXXAR)®); 항-IL-8 (문헌 [St John et al (1993) Chest, 103:932] 및 WO 95/23865); 인간화 및/또는 친화성 성숙된 항-VEGF 항체를 비롯한 항-VEGF 항체, 예를 들어 인간화 항-VEGF 항체 huA4.6.1 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®, 제넨테크, 인크., 문헌 [Kim et al (1992) Growth Factors 7:53-64], WO 96/30046, WO 98/45331); 항-PSCA 항체 (WO 01/40309); S2C6 및 그의 인간화 변이체를 비롯한 항-CD40 항체 (WO 00/75348); 항-CD11a (US 5622700; WO 98/23761; 문헌 [Steppe et al (1991) Transplant Intl. 4:3-7]; [Hourmant et al (1994) Transplantation 58:377-380]); 항-IgE (문헌 [Presta et al (1993) J. Immunol. 151:2623-2632]; WO 95/19181); 항-CD18 (US 5622700; WO 97/26912); E25, E26 및 E27을 비롯한 항-IgE (US 5714338; US 5091313; WO 93/04173; US 5714,338); 항-Apo-2 수용체 항체 (WO 98/51793); cA2 (레미케이드(REMICADE)®), CDP571 및 MAK-195를 비롯한 항-TNF-알파 항체 (US 5672347; 문헌 [Lorenz et al (1996) J. Immunol. 156(4):1646-1653]; [Dhainaut et al (1995) Crit. Care Med. 23(9):1461-1469]); 항-조직 인자 (TF) (EP 0 420 937 B1); 항-인간 알파 4 베타 7 인테그린 (WO 98/06248); 항-EGFR, 키메라 또는 인간화 225 항체 (WO 96/40210); 항-CD3 항체, 예를 들어 OKT3 (US 4515893); 항-CD25 또는 항-tac 항체, 예를 들어 CHI-621 시물렉트(SIMULECT)® 및 제나팍스(ZENAPAX)® (US 5693762); 항-CD4 항체, 예를 들어 cM-7412 항체 (문헌 [Choy et al (1996) Arthritis Rheum 39(1):52-56]); 항-CD52 항체, 예를 들어 CAMPATH-1H (문헌 [Riechmann et al (1988) Nature 332:323-337]); 항-Fc 수용체 항체, 예를 들어 Fc 감마 RI에 대해 지시되는 M22 항체 (문헌 [Graziano et al (1995) J. Immunol. 155(10):4996-5002]); 항-암배아 항원 (CEA) 항체, 예를 들어 hMN-14 (문헌 [Sharkey et al (1995) Cancer Res. 55(23 Suppl):5935-5945]); huBrE-3, hu-Mc 3 및 CHL6을 비롯하여 유방 상피 세포에 대해 지시되는 항체 (문헌 [Ceriani et al (1995) Cancer Res. 55(23):5852-5856]; 및 [Richman et al (1995) Cancer Res. 55(23 Supp):5916-5920]); 결장암 세포에 결합하는 항체, 예를 들어 C242 (문헌 [Litton et al (1996) Eur J. Immunol. 26(1):1-9]); 항-CD38 항체, 예를 들어 AT 13/5 (문헌 [Ellis et al (1995) J. Immunol. 155(2):925-937]); 항-CD33 항체, 예를 들어 Hu M195 (문헌 [Jurcic et al (1995) Cancer Res 55(23 Suppl):5908-5910]) 및 CMA-676 또는 CDP771; 항-CD22 항체, 예를 들어 LL2 또는 림포사이드(LymphoCide) (문헌 [Juweid et al (1995) Cancer Res 55(23 Suppl):5899-5907]); 항-EpCAM 항체, 예를 들어 17-IA (파노렉스(PANOREX)®); 항-GpIIb/IIIa 항체, 예를 들어 아브식시맙 또는 c7E3 Fab (레오프로(REOPRO)®); 항-RSV 항체, 예를 들어 MEDI-493 (시나기스(SYNAGIS)®); 항-CMV 항체, 예를 들어 프로토버(PROTOVIR)®; 항-HIV 항체, 예를 들어 PRO542; 항-간염 항체, 예를 들어 항-Hep B 항체 오스타버(OSTAVIR)®; 항-CA 125 항체 오바렉스(OvaRex); 항-개별특이형 GD3 에피토프 항체 BEC2; 항-알파 v 베타3 항체 비탁신(VITAXIN)®; 항-인간 신세포암 항체, 예를 들어 ch-G250; ING-1; 항-인간 17-1A 항체 (3622W94); 항-인간 결장직장 종양 항체 (A33); GD3 강글리오시드에 대해 지시되는 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평세포암종 (SF-25); 및 항-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체, 예를 들어 스마트(Smart) ID1O 및 항-HLA DR 항체 옹코림(Oncolym) (Lym-1)을 들 수 있다.
유용한 모노클로날 항체로는 인간 모노클로날 항체, 인간화 모노클로날 항체, 항체 단편, 또는 키메라 인간-마우스 (또는 다른 종) 모노클로날 항체를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 인간 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 다수의 기술들 중 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다 (문헌 [Teng et al (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7308-7312]; [Kozbor et al (1983) Immunology Today 4:72-79]; 및 [Olsson et al (1982) Methods in Enzymology 92:3-16] 참조).
항체는 또한 이중특이적 항체일 수 있다. 이중특이적 항체는 하나의 아암(arm)에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄 및 다른 아암에서 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)을 가질 수 있다. 이러한 비대칭 구조는 원하는 이중특이적 화합물이 원치 않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 분리되는 것을 촉진시키는데, 그 이유는 이중특이적 분자 중 하나의 절반에만 존재하는 이뮤노글로불린 경쇄가 용이한 분리 방식을 제공하기 때문이다 (WO 94/04690; 문헌 [Suresh et al (1986) Methods in Enzymology, 121:210]; [Rodrigues et al (1993) J. of Immunology 151:6954-6961]; [Carter et al (1992) Bio/Technology 10:163-167]; [Carter et al (1995) J. of Hematotherapy 4:463-470]; [Merchant et al (1998) Nature Biotechnology 16:677-681] 참조). 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Milstein et al (1983) Nature 305:537-539]; WO 93/08829; [Traunecker et al (1991) EMBO J. 10:3655-3659] 참조). 이러한 기술을 이용해서, 이중특이적 항체는 본원에 정의된 질환의 치료 또는 예방에서 ADC로서의 접합을 위해 제조될 수 있다.
다른 접근법에 따르면, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합 단백질은 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는 것일 수 있으며, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)은 융합 단백질들 중 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유할 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합물 및 필요하다면, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 서열을 갖는 핵산을 별도의 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 생물체를 공동-형질감염시킨다. 이는, 구성에 사용된 동등하지 않은 비율의 세가지 폴리펩티드 쇄가 최적의 수율을 제공하는 경우의 실시양태에서 세가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 적어도 두가지 폴리펩티드 쇄의 동등한 비율의 발현이 높은 수율을 나타내거나 또는 상기 비율이 특별히 유의하지 않은 경우 두가지 또는 세가지 모든 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터내에 삽입할 수 있다.
하이브리드 또는 이관능성 항체는 생물학적으로, 즉 세포 융합 기술에 의해, 또는 화학적으로, 특히 가교결합제 또는 디술피드-브리지 형성 시약을 이용해서 유도될 수 있으며, 전체 항체 또는 그의 단편을 포함할 수 있다 (EP 105360; WO 83/03679; EP 217577).
항체는 암세포 항원, 바이러스 항원, 또는 미생물 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 종양 세포 또는 매트릭스에 결합된 다른 항체의 기능적으로 활성인 단편, 유도체 또는 유사체일 수 있다. 이에 대해, "기능적으로 활성인"이란 단편, 유도체 또는 유사체가, 단편, 유도체 또는 유사체를 유도하는 항체가 인식하는 항원과 동일한 항원을 인식하는 항-항-개별특이형 항체를 유도할 수 있음을 의미한다. 특히, 예시적인 실시양태에서, 이뮤노글로불린 분자의 개별특이형의 항원성은 항원을 특이적으로 인식하는 CDR 서열에 대해 C-말단인 CDR 서열 및 프레임워크의 결실에 의해 증진될 수 있다. 항원과 결합하는 CDR 서열을 결정하기 위해, CDR 서열을 함유하는 합성 펩티드를 당업계에 공지된 임의의 결합 분석 방법, 예를 들어 BIA 코어 분석에 의해 항원과의 결합 분석에 사용할 수 있다 (문헌 [Kabat et al, (1991) in Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md; Kabat et al (1980) J. of Immunology 125(3):961-969] 참조).
다른 유용한 항체로는 항체의 단편, 예를 들어 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CH1 도메인 (항체 분자의 펩신 절단에 의해 생산될 수 있음)을 함유하는 F(ab')2 단편, 및 F(ab')2 단편의 디술피드 브리지를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편을 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 다른 유용한 항체로는 항체의 중쇄 및 경쇄 이량체, 또는 그의 임의의 최소 단편, 예를 들어 Fvs 또는 단일쇄 항체 (SCA) (예를 들어, US 4946778; 문헌 [Bird (1988) Science 242:423-42]; [Huston et al, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 및 [Ward et al (1989) Nature 334:544-54]에 기재됨), 또는 항체와 동일한 특이성을 갖는 임의의 다른 분자가 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 특히 "키메라" 항체를 포함하며, 여기서 키메라 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유도되거나 또는 특정 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이며, 쇄(들)의 나머지는 이들이 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다면 다른 종으로부터 유도되거나 또는 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 및 이러한 항체의 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이다 (US 4816567; 및 문헌 [Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855] 참조). 키메라 항체는 상이한 일부가 상이한 동물 종으로부터 유도되는 분자, 예를 들어 뮤린 모노클로날로부터 유도된 가변 영역 및 인간 이뮤노글로불린 불변 영역을 갖는 것이다 (US 4816567; US 4816397). 키메라 항체로는 비-인간 영장류 (예를 들어, 구세계 원숭이(Old World Monkey), 원숭이(ape) 등)로부터 유도된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화(primatized)" 항체를 들 수 있다.
인간 일부 및 비-인간 일부를 둘 다 포함하는 키메라 및 인간화 모노클로날 항체는 표준 재조합 DNA 기술 (WO 87/02671; EP 184,187; EP 171496; EP 173494; WO 86/01533; US 4816567; EP 12023; [Berter et al (1988) Science 240:1041-1043]; [Liu et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443]; [Liu et al (1987) J. Immunol. 139:3521-3526]; [Sun et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218]; [Nishimura et al (1987) Cancer. Res. 47:999-1005]; [Wood et al (1985) Nature 314:446-449]; 및 [Shaw et al (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559]; [Morrison (1985) Science 229:1202-1207]; [Oi et al (1986) BioTechniques 4:214]; US 5225539; [Jones et al (1986) Nature 321:552-525]; [Verhoeyan et al (1988) Science 239:1534]; 및 [Beidler et al (1988) J. Immunol. 141 :4053-4060] 이들 문헌 각각은 전체 개시내용이 본원에 참고로 도입됨)을 이용해서 제조할 수 있다.
완전한 인간 항체는 내인성 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자는 발현시킬 수 없지만 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현시킬 수 있는 트랜스제닉 마우스를 이용해서 생산할 수 있다. 트랜스제닉 마우스는 선택된 항원, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 전체 또는 일부를 이용한 통상의 방식으로 면역화된다. 항원에 대해 지시되는 모노클로날 항체는 통상의 하이브리도마 기술을 이용해서 얻을 수 있다. 트랜스제닉 마우스에 의해 보유된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진은 B 세포 분화 동안 재배열되며, 이후 부류 전환 및 체세포 돌연변이를 수행한다. 따라서, 이러한 기술을 이용해서, 치료상 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산할 수 있다. 인간 항체를 생산하는 이러한 기술의 개요에 대해서는, 문헌 [Lonberg and Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93]; 미국 특허 5625126; 동 5633425; 동 5569825; 동 5661016; 동 5545806을 참조한다. 다른 인간 항체는 시판 공급원, 예를 들어 아브제닉스, 인크.(Abgenix, Inc.) (캘리포니아주 프리몬트 소재) 및 젠팜(Genpharm) (캘리포니아주 산호세 소재)으로부터 입수할 수 있다.
선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 "가이드 선택(guided selection)"이라 언급되는 기술을 이용해서 생성시킬 수 있다. 이 접근법에서 선택된 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들어 마우스 항체를 사용해서 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 가이드한다 (문헌 [Jespers et al (1994) Biotechnology 12:899-903] 참조). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리 (문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991)]; [Marks et al (1991) J. MoI. Biol. 222:581] 참조)를 비롯한 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용해서 생산할 수 있다.
항체는 항체 또는 그의 기능적 활성 단편의 융합 단백질일 수 있으며, 예를 들어 항체는 N-말단 또는 C-말단에서 공유 결합 (예를 들어, 펩티드 결합)을 통해 항체가 아닌 다른 단백질 (또는 그의 일부, 예를 들어 단백질 중 적어도 10, 20 또는 50 개의 아미노산 일부)의 아미노산 서열과 융합된다. 항체 또는 그의 단편은 불변 도메인의 N-말단에서 다른 단백질과 공유적으로 연결될 수 있다.
항체는 (공유 부착으로 항체가 그의 항원 결합 면역특이성을 보유하기만 하면) 변형된, 즉 임의의 유형의 분자의 공유 부착에 의해 변형된 유사체 및 유도체를 포함한다. 예를 들어, 항체의 유도체 및 유사체는 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포의 항체 단위 또는 다른 단백질에 대한 결합 등에 의해 추가로 변형된 것들을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 다수의 화학적 변형들 중 임의의 것은 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 투니카마이신 존재하의 대사적 합성 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 공지된 기술에 의해 수행할 수 있다. 추가로, 유사체 또는 유도체는 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유할 수 있다.
CD20 항체의 예로는 다음과 같은 것들을 들 수 있다: "C2B8," 현재는 리툭시맙 (리툭산®/맙테라(MABTHERA)®)(US 5736137)라고 함; 이트륨-[90]-표지된 2B8 뮤린 항체 Y2B8 또는 이브리투모맙 티욱세탄 (제발린(ZEVALIN)®, 바이오젠 이덱, 인크., US 5736137); 1993년 6월 22일자로 ATCC에 기탁 번호 HB11388로 기탁된 2B8; 뮤린 IgG2a "B1," 또한 토시투모맙이라고도 하며, 임의로 131I로 표지되어 "131I-B1" 또는 "요오드 I131 토시투모맙" 항체 (벡사르®) (코릭사 (US 5595721)에서 시판함)를 생성함; 뮤린 모노클로날 항체 "1F5" (예를 들어, 문헌 [Press et al (1987) Blood 69(2):584-591]) 및 그의 변이체 ("프레임워크 패치화(framework patched)" 또는 인간화 1F5 (WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC 기탁 HB-96450) 포함); 뮤린 2H7 및 키메라 2H7 항체 (US 5677180); 오크렐리주맙, 2H7의 인간화 변이체 및 다른 2H7 변이체 (WO 2004/056312; US 5721108); B-세포의 세포막내의 CD20 분자에 표적화되는 HUMAX-CD20™ 완전 인간, 고-친화성 항체 (젠맙, 덴마크), 예를 들어, 문헌 [Glennie and van de Winkel, (2003) Drug Discovery Today 8:503-510] 및 [Cragg et al (2003) Blood 101:1045-1052] 참조; WO 2004/035607 및 WO 2005/103081 (Teeling et al, GenMab/Medarex)에 기재된 인간 모노클로날 항체; US 2004/0093621 (Shitara et al.)에 기재된 Fc 영역에 결합된 복잡한 N-글리코시드-연결된 당 쇄를 갖는 항체; CD20에 결합하는 모노클로날 항체 및 항원-결합 단편 (WO 2005/000901, Tedder et al), 예를 들어 HB20-3, HB20-4, HB20-25, 및 MB20-11; CD20에 결합하는 단일쇄 단백질 (US 2005/0186216; US 2005/0202534; US 2005/0202028; US 2005/0202023); CD20-결합 분자, 예를 들어 항체의 AME 시리즈, 예를 들어 AME-133™ 항체 (WO 2004/103404; US 2005/0025764); 및 Fc 돌연변이를 갖는 CD20 항체 (WO 2005/070963); CD20-결합 분자 (WO 2005/016969; US 2005/0069545); 이중특이적 항체 (WO 2005/014618); 인간화 LL2 모노클로날 항체 (US 2005/0106108); CD20에 대한 키메라 또는 인간화 B-Ly1 항체 (WO2005/044859; US 2005/0123546); =A20 항체 또는 그의 변이체, 예를 들어 키메라 또는 인간화 A20 항체 (각각 cA20, bA20) 및 IMMUN-106 (US 2003/0219433); 및 인터네셔날 류코사이트 타이핑 워크샵(International Leukocyte Typing Workshop)으로부터 이용가능한 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 (문헌 [Valentine et al (1987) In: Leukocyte Typing III, McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press] 참조). 예시적인 CD20 항체로는 키메라, 인간화, 또는 인간 CD20 항체, 예를 들어 리툭시맙, 인간화 2H7, 키메라 또는 인간화 A20 항체, 예를 들어 휴맥스(HUMAX)-CD20™, 인간 CD20 항체 (젠맙), 및 CD20에 결합하는 이뮤노글로불린/단백질 (트루비온 팜 인크.(Trubion Pharm Inc.))이 포함된다.
"원형(intact)" 항체는 항원-결합 가변 영역, 및 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체이다. 불변 도메인은 천연 서열 불변 도메인 (예를 들어, 인간 천연 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.
원형 항체는 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하는 하나 이상의 "이펙터 기능"을 가질 수 있다. 항체 이펙터 기능의 예로는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 들 수 있다.
원형 항체는 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 다른 "부류"로 배정될 수 있다. 원형 항체의 다섯가지 주요 부류로는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있으며, 이들 중 여럿은 "하위부류" (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 항체의 다른 부류에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라고 불리운다. 이뮤노글로불린의 여러 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 배열은 잘 알려져 있다.
용어 "아미노산 서열 변이체"는 천연 서열 폴리펩티드와 어느 정도 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 통상적으로, 아미노산 서열 변이체는 천연 항체의 하나 이상의 수용체 결합 도메인과 또는 천연 수용체의 하나 이상의 리간드 결합 도메인과 약 70％ 이상의 서열 동일성을 보유할 것이며, 바람직하게는 상기 변이체는 상기 수용체 또는 리간드 결합 도메인을 갖는 서열과 약 80％ 이상, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상 상동성일 것이다. 아미노산 서열 변이체는 천연 아미노산 서열의 아미노산 서열내의 특정 위치에서 치환, 결실, 및/또는 삽입을 보유한다. 아미노산은 통상의 명칭, 1-문자 코드 및 3-문자 코드에 의해 표시된다.
"서열 동일성"은 아미노산 서열 변이체에서 최대 비율의 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬시키고 필요하다면 갭을 도입한 후 동일한 잔기의 비율로서 정의된다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 하나는 "Align 2" (저자: 제넨테크, 인크., 1991년 12월 10일 미국 저작권청(United States Copyright Office; Washington, DC 20559)에 사용자 문서와 함께 제출됨)이다.
단백질 발현 및 생산
재조합 단백질은 당업계에 공지된 방법으로 벡터로부터 DNA를 클로닝하여 발현된다. 본 발명의 고분자전해질 정제 방법을 위한 단백질은 적합한 숙주 세포, 예를 들어 원핵생물, 효모, 및 고등 진핵생물 세포로부터 생산될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물로는 유박테리아, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 생물체, 예를 들어 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae), 예를 들어 에세리키아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 및 바실러스, 예를 들어 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리체니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 들 수 있다. 한가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들어 이. 콜라이 비, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이들 예는 한정적이라기 보다는 예시적이다.
원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모는 CD20 결합 항체-코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반적인 제빵용 효모는 저급 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종, 및 균주가 본원에서 일반적으로 이용가능하며 유용한데, 예를 들어 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위케라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마르시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다; 트리코더마 리시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈바니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 슈바니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스페르길루스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니게르(A. niger)가 있다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 진핵 생물체로부터 유도될 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 배큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(모충), 애데스 애집티(Aedes aegypti)(모기), 애데스 알보피크투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(광대파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 상응하는 허용되는 곤충 숙주 세포가 동정되어 왔다. 형질감염을 위한 다수의 바이러스 종, 예를 들어 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주는 공개적으로 이용할 수 있으며, 이러한 바이러스는 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 사용할 수 있다.
배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 절차가 되었다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (현탁액 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al (1977) J. Gen Virol. 36:59]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 차이니스 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216) Mather (1980) Biol. Reprod. 23:243-251; 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부암 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); TRI 세포 (Mather et al (1982) Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주 (Hep G2)가 있다.
숙주 세포는 항체 생산을 위한 상기 기재된 발현 또는 클로닝 벡터에 의해 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선택하거나 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하게 개질된 전형적인 영양 배지에서 배양된다.
본 발명의 방법을 위한 항체를 생산하는데 사용된 숙주 세포는 각종 배지에서 배양될 수 있다. 시판되는 성장 배지, 예를 들어 햄(Ham)'s F10 (시그마(Sigma)), 최소 필수 배지 (MEM), (시그마), RPMI-1640 (시그마), 및 둘베코 개질된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ((DMEM), 시그마)가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al (1979) Meth. Enz. 58:44, Barnes et al (1980) Anal. Biochem. 102:255]; US 4767704; US 4657866; US 4927762; US 4560655; US 5122469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국특허 Re. 30,985호에 기재된 임의의 배지가 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 임의의 배지는 필요한 경우 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 (예를 들어 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트), 완충액 (예를 들어 MES 및 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어 젠타마이신™ 약물), 미량 원소 (통상 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 또한, 당업자에게 알려져 있는 임의의 다른 필요한 보충물이 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 사전에 사용된 것이며, 통상의 숙련자에게 분명할 것이다.
목적 단백질을 함유하는 수확된 세포 배양 유체를 수득한 경우, 이를 세포에 의해 생산된 다른 단백질로부터 분리하는 것은 통상적으로 상이한 크로마토그래피 기술의 조합을 사용하여 시도된다. 이들 기술은 단백질의 혼합물을 이들의 전하, 소수성 정도, 또는 크기를 기준으로 분리한다. 이들 기술 각각에 대해 여러 상이한 크로마토그래피 수지를 이용할 수 있으며, 포함된 특정 단백질에 대한 정제 설계를 정확하게 제작할 수 있다. 이들 분리 방법 각각의 본질은, 단백질이 긴 컬럼 아래로 상이한 속도로 이동하여 컬럼의 더 아래쪽으로 통과할 때 증가하는 물리적 분리를 달성하거나, 또는 분리 배지에 선택적으로 부착하여 상이한 용매에 의해 차별적으로 용리되도록 할 수 있다는 것이다. 일부 경우, 원하는 단백질은 불순물이 컬럼에 특이적으로 부착하고 목적 단백질이 부착하지 않는 경우 불순물로부터 분리되며, 즉 목적 단백질은 "통과된(flow-through)" 상태로 존재한다.
재조합 기술을 사용하는 경우, 항체는 세포내 페리플라스믹(periplasmic) 공간에서 생산되거나 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내 생산되는 경우, 제1 단계로서 미립자 파편인 숙주 세포 또는 용해된 단편, 예를 들어 이. 콜라이의 페리플라스믹 공간에 분비된 항체가 예를 들어 원심분리 또는 초여과에 의해 제거된다 (문헌 [Carter et al (1992) Bio/Technology 10:163-167] 참조). 세포 페이스트는 아세트산나트륨 (pH 3.5), EDTA, 및 페닐메틸술포닐플루오라이드 (PMSF)의 존재 하에 약 30분에 걸쳐 해동될 수 있다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현계로부터의 상청액은 일반적으로 먼저 시판용 단백질 농축액 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 초여과 장치를 사용하여 농축된다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 상기 단계 중 임의의 단계에 포함되어 단백질 가수분해를 억제할 수 있고, 항생제가 포함되어 우연히 얻은 오염물의 성장을 방지할 수 있다.
세포로부터 발현된 단백질을 정제하는 전형적인 방법으로는 수산화인회석 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 이들의 조합이 포함된다 (문헌 [Fahrner, R.L. et al (2001) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 18:301-327]). 단백질 A는 다양한 지지체 상에 고정될 수 있는 친화성 리간드로서 통상적으로 사용되며, 발현된 단백질을 함유하는 수확된 세포 배양 유체 (HCCF)의 초기 단계 농축을 허용한다. 단백질 A는 단백질, 예를 들어 Fc 영역을 함유하는 항체의 친화성 크로마토그래피를 위한 유용한 흡착제이다. 단백질 A는 항체의 Fc 영역에 높은 친화도 (인간 IgG에 약 10-8 M)로 결합하는 스타필로코쿠스 아우레아스(Staphylococcus aureas)로부터 얻은 41 kD 세포벽 단백질이다 (문헌 [Sulkowski, E. (1987) Protein Purification: Micro to Macro, pgs 177-195]; [Chadha et al. (1981) Preparative Biochemistry 11(4):467-482]; [Reifsnyder et al (1996) J. Chromatography 753:73-80]; US 6127526; US 6333398 참조). 단백질 A는 고체상, 예를 들어 유리, 실리카, 아가로스 또는 폴리스티렌 상에 고정될 수 있다. 고체상은 정제 컬럼 또는 분리된 입자의 불연속상, 예를 들어 조절된 기공 유리 컬럼 또는 규산 컬럼이거나, 또는 고체상에 대한 오염물의 비특이적 부착을 방지하도록 의도된 시약 (예를 들어 글리세롤)으로 코팅될 수 있다 (US 6870034). 바이오프로세싱 리미티드(Bioprocessing Limited)에서 시판하는 PROSEP ATM 컬럼은 글리세롤로 코팅된 단백질 A 조절된 기공 유리 컬럼의 한 예이다. 본원에서 고찰된 컬럼의 다른 예로는 POROS 50 ATM (폴리스티렌) 컬럼 또는 r단백질 A 세파로스 패스트 플로우TM (아가로스) 컬럼이 포함된다. 단백질 A 크로마토그래피에 대한 고체상은 적합한 완충액으로 평형화될 수 있다. 예를 들어, 평형상태 완충액은 25 mM 트리스, 25 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7.1일 수 있다.
단백질 A는 크로마토그래피 배지 상에 고정되는 경우, 재조합 항체를 정제하는 기술을 제공하는데, 이는 착체 용액 중 항체에 선택적으로 결합하여 숙주 세포 단백질 및 소분자와 같은 불순물이 통과할 수 있도록 하기 때문이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 좌우된다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2, 또는 γ4 중쇄를 기재로 하는 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (문헌 [Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13] 참조). 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대해 단백질 G가 추천된다 (문헌 [Guss et al (1986) EMBO J. 5:15671575] 참조). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔히는 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 조절된 기공 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 보다 빠른 유속 및 보다 짧은 처리 시간을 허용한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 바커본드 ABX(Bakerbond ABX)™ 수지 (제이.티. 바커(J.T. Baker), 뉴저지주 필립스버그 소재)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온 교환 컬럼 상의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상의 크로마토그래피, 헤파린 세파로스™ 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들어 폴리아스파르트산 컬럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 황산암모늄 침전이 또한 회수될 항체에 따라 이용가능하다.
고분자전해질
고분자전해질은 하전된 단량체 단위로 구성된 수용성 중합체이다. 본 발명의 고분자전해질의 단량체 단위는 산도 (pH)에 따라 수용액에서 양성자 용해 (이온화)되는 전해질기 (하전된 관능기)를 갖는다. 고분자전해질의 하전된 관능기 예로는 술폰산, 포스폰산, 카르복실산 및 아민, 및 이들 각각의 이온: 술포네이트, 포스포네이트, 카르복실레이트 및 암모늄이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 용해는 용액의 이온 농도 및 전기 전도율에 영향을 미친다.
본 발명의 방법에 유용한 고분자전해질의 분자량은 약 천 (1000) 달톤 (Da) 내지 약 백만 (1,000,000) 달톤일 수 있다. 본 발명의 고분자전해질은 넓은 범위의 쇄 길이, 즉 약 1200 달톤 (Da) 내지 약 백만 (1,000,000) 달톤의 분자량 범위를 갖는 특정 유형의 반복 단량체 단위의 혼합물로서 사용될 수 있다. 혼합물은 좁은 범위, 예를 들어 약 1200 Da 내지 약 2400 Da, 또는 약 4000 Da 내지 약 8000 Da일 수 있다. 평균 분자량 및 분자량 분포 프로파일은 단량체 단위의 특정 중합 조건, 예를 들어 농도, 중합 개시제 또는 촉매, 온도, 또는 시간 하에서 조절될 수 있다. 고분자전해질의 평균 분자량 및 분자량 분포 프로파일은 또한 특정 예비 정제 방법 하에서 선택될 수 있다.
음으로 하전된 음이온 고분자전해질 및 양으로 하전된 양이온 고분자전해질은 침전 반응에 사용될 수 있다. 용액의 pH가 특정 항체의 pI 미만인 경우, 항체는 양전하를 띤다. 이들 조건 하에서, 양이온 고분자전해질은 불순물을 침전시키고, 용액에 목적 항체를 남길 수 있다. 역으로, 음이온 고분자전해질은 항체를 침전시켜 단백질-고분자전해질 침전물을 형성하고, 용액에 불순물을 남길 수 있다. 본 발명의 방법에서 고분자전해질의 선택시 다른 인자에는 관능기 안정성 및 반응성, 분자량, 전하 밀도 및 쇄 강성도가 포함된다.
본 발명의 고분자전해질은 양이온 및 음이온 하전된 관능기 둘 다를 갖는 양쪽성고분자전해질(polyampholyte)을 포함한다.
본 발명의 폴리음이온 고분자전해질 예에는 폴리아크릴산 (PAA), 폴리비닐술포네이트 (PVS), 폴리스티렌술폰산 (PSS, 폴리(4-비닐벤젠술포네이트 금속염)), 폴리메타크릴레이트 (PMA), 폴리아크릴아미도메틸프로판술포네이트 (PAMPS), 카르복시메틸셀룰로스 (CMC), 말레산 무수물-스티렌 공중합체 (MAS, 말레산 무수물-비닐메틸 에테르 공중합체 (MAVE), 폴리아스파르테이트, 폴리글루타메이트, 덱스트란 술페이트, 펙틴, 알기네이트, 및 글리코사미노글리칸, 예를 들어 콘드로이틴 술페이트, 헤파린/헤파린 술페이트 및 히알루론산; 및 이들의 모든 염 및 공중합체가 포함된다.
폴리아크릴산 (PAA) 및 폴리비닐술폰산 (PVS), 및 이들의 음이온, 폴리아크릴레이트 및 폴리비닐술포네이트 각각은 본 발명의 방법을 유용한 고분자전해질이다. PAA는 PVS와 유사한 구조적 성질을 갖는다. 둘 다 중합체이며, 선형 탄소 골격을 갖는다. 두 고분자전해질은 관능기가 상이하다. PVS는 술폰산 관능기를 가지며 pKa가 대략 1이다. 대조적으로 PAA는 카르복실산 관능기를 가지며 pKa가 대략 5이다. PVS는 크기 배제에 의해 평균 1800 Da으로 측정된 단일 분자량으로 입수가능하며, 여기서 평균 n은 동적 광산란 검출에 의해 약 10 내지 20이다. PAA는 평균 n이 각각 약 15 내지 20 및 100 내지 120인 1200 및 8000 Da을 비롯한 다수의 분자량으로 시판된다. PAA 및 PVS는 미주리주 세인트루이스 소재 시그마-알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Co.), 펜실베니아주 와링톤 소재 폴리사이언시즈 인코포레이티드(Polysciences Inc.), 및 캘리포니아주 샌디에고 소재 카르보머 인코포레이티드(Carbomer, Inc.)에서 구입하였다.
본 발명의 양으로 하전된 폴리양이온 고분자전해질 예에는 폴리아르기닌 (PLA, 폴리-L-아르기닌 히드로클로라이드: 시그마-알드리치 P-4463 MW 5-15 kDa, P-7762 MW 15-70 kDa, P-3892, MW >70 kDa, CAS No. 26982-20-7, 및 폴리-L-아르기닌 술페이트: 시그마-알드리치 P-7637 MW 15-50 kDa, CAS No. 26700-68-5 포함); 폴리리신 (예를 들어 폴리-L-리신 히드로클로라이드 CAS No. 26124-78-7, 시그마-알드리치 P-2658 MW 15-30 kDa, CAS No. 26124-78-7, PLL, 문헌 [Jacobson, B.S. and Branton, D. (1977) Science 195, 302]), 폴리오르니틴 (예를 들어 폴리-L-오르니틴, 시그마-알드리치 P-2533 MW 15-30 kDa, CAS No. 26982-21-8), 폴리비닐구아니딘 (폴리(비닐구아니딘), US 6087448), 폴리디알릴디메틸암모늄 클로라이드, 폴리(N-에틸-4-비닐피리디늄 브로마이드), 폴리메틸아크릴아미도프로필트리메틸암모늄 클로라이드, 폴리비닐벤질트리메틸암모늄 클로라이드, 및 폴리히스티딘이 포함된다.
모노클로날 항체의 정제에서 고분자전해질 침전
고분자전해질 침전을 사용하여 정제 동안 불순물로부터 항체를 분리할 수 있다. 이들 불순물에는 숙주 세포 불순물, 예를 들어 CHO 단백질 (CHOP) 및 이.콜라이(E.coli) 단백질 (ECP), 세포 배양 성분, 예를 들어 인슐린, 젠타마이신 및 DNA, 공정내(in-process) 불순물, 예를 들어 침출된 단백질 A, 및 생성물-관련 불순물, 예를 들어 항체 응집물 및 단편이 포함된다. 침전 단계는 존재하는 크로마토그래피 분리 대신 사용될 수 있다. 별법으로, 단백질의 고분자전해질 침전은 진핵생물 또는 원핵생물 배양에서 수확된 세포 배양 유체 (HCCF)로부터 직접적인 포획 단계로서, 또는 중간체 정제 단계로서 사용될 수 있다. 또한, 고분자전해질 침전은 단백질 정제에서 정화 단계로서 사용되어, HCCF를 비롯한 세포 배양 유체를 정화할 수 있다. 고분자전해질은 세포 배양 유체에서 플록형성 물질을 형성할 수 있으며, 이는 침강하여 원핵생물 또는 진핵생물 세포 배양물에서 발현된 항체와 같은 단백질을 함유하는 혼합물의 신속하고 효율적인 정화, 농축, 침전 또는 정제를 허용한다. 본 발명의 고분자전해질 정제 방법은 수확 작업, 예를 들어 원심분리, 여과 및 크로마토그래피 작업을 대신할 수 있다. 본 발명의 고분자전해질 정제 방법은 항체와 같은 단백질의 정제에 놀랍고도 예기치 못한 이익을 제공한다.
고분자전해질 침전에 최적화되는 조건에는 용액 pH, 전도율, 완충액, 단백질 농도, 고분자전해질 농도 뿐만 아니라 교반 속도 및 유형, 및 고분자전해질 첨가 속도가 포함된다.
침전은 교반과 함께 반응기에서 수행될 수 있다. 항체 풀의 pH 및 전도율은 용해도 곡선에서 확인된 최적 조건을 기준으로 한 표적 조건으로 조정될 수 있다. 고분자전해질은 첨가 및 혼합된다. 교반 속도 및 유형은 침전 효율 및 침전 시간에 영향을 미칠 수 있다. 침전 후 고분자전해질이 첨가된다. 침전물은 여과 또는 원심분리에 의해 상청액으로부터 분리된다. 여과가 사용되는 음이온 고분자전해질 침전의 경우, 침전물은 세척 완충액으로 세척된다. 항체를 포함하는 침전물은 이후 재현탁되고 하류 처리될 것이다. 또한, 침전을 인라인(in-line)으로, 즉 혼합 용기 없이 수행할 수 있으며, 여기서 항체 풀은 표적 pH로 조정될 것이고, 이어서 고분자전해질이 첨가될 것이다. 풀이 희석되어 여과 장치 또는 원심분리기로 인라인으로 수행될 수 있을 때까지 완전한 침전은 일어나지 않을 것이다. 별법으로, 항체 풀을 표적 pH로 조정한 후, 희석을 인라인으로 수행하고, 이어서 여과 장치 또는 원심분리기 전에 고분자전해질을 인라인 첨가할 것이다.
한 예시에서, 인간 성장 호르몬 (pI 5.2)은 pH 7의 완충액에서 결정화 또는 침전될 경우 음으로 하전되어 양이온 고분자전해질과 상호작용하거나 착체를 형성할 것이다. 유사하게, pI 9 초과의 리툭시맙 및 트라스투주맙과 같은 모노클로날 항체는 중성 완충액에서 음이온 고분자전해질과 착체를 형성할 수 있을 것이다. 단백질 총 전하의 평가는 아미노산 서열이 공개적으로 입수가능한 프로그램에 의해 확인되는 경우 계산될 수 있다. 보다 높은 함량의 아스파르트산 (pKa 4.5) 및 글루탐산 (pKa 4.5)을 갖는 산성 단백질은 전형적으로 pI가 6 내지 6.4보다 낮다. 반면, 보다 높은 함량의 히스티딘 (pKa 6.2), 리신 (pKa 10.4) 및 아르기닌 (pKa 12)을 갖는 염기성 단백질은 전형적으로 pI가 약 7.5 내지 8보다 높다. 이들과 대조적으로, 전형적으로 유사한 양의 산성 및 염기성 아미노산 잔기를 갖는 중성 단백질은 pI가 중성이다 (pI가 전형적으로 약 6.5 내지 7.4이다).
포괄적인 목록은 아니지만, 다양한 치료용 단백질에 대한 pI의 일부 예는 하기와 같다: 재조합 인간 에리트로포이에틴 (pI 4); 도나제 알파, rhDNase (풀모자임(PULMOZYME)®) (pI 5); 에타너셉트 (엔브렐(ENBREL)TM) (pI 5.1); 인슐린 (pI 5.4); 과립구 콜로니 자극 인자 (pI 5.5-5.9); TNF 알파 (pI 5.6); 피브롤라제 (pI 6.7); IL-1 베타 (pI 6.9); 재조합 조직 플라스미노겐 활성제 (pI 6.5-8.5); 오르토클론(Orthoclone) OKT3 (pI 6.7-7.2); 인자 VIII (pI 7-7.6); 보빈 소마토트로핀 (pI 7.4); 인터루킨 2 (pI 7.44); 인슐린-유사 성장 인자-1 (pI 8.4) 및 아프로티닌 (pI 10.5).
음이온 고분자전해질 침전 방법을 여러 예시적인 항체 (항-CD20 rhuMab 2H7, rhuMab DR5 Apomab, 및 항-cMet)에 대해 양이온 교환 (SPSFF) 단계의 대체로서, 또한 rhuMab 2H7 (오크렐리주맙)에 대해 단백질 A (Prosep vA) 단계의 대체로서 평가하였다. 다른 항체 및 다른 단백질은 본원에 기재된 고분자전해질 침전 방법에 의해 정제될 수 있다. 용해도 곡선을 사용하여 세가지 항체에 대해 효과적인 또는 최적의 침전 조건 (pH, 전도율 및 중합체 농도)을 확인하였다. 고분자전해질 침전 단계는 숙주 세포 단백질, 예를 들어 차이니스 햄스터 난소 단백질 (CHOP) 및 이.콜라이 단백질 (ECP), 침출된 단백질 A, 소분자, 예를 들어 인슐린 및 젠타마이신 뿐만 아니라 항체 단편 및 응집물의 감소능을 입증하였다. 고분자전해질 침전 단계는 CDC 활성에 의해 측정된 바와 같은 2H7의 생물학적 활성에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 고분자전해질 PVS는 음이온 교환 (QSFF) 크로마토그래피를 사용하여 1μg/mL 미만의 수준으로 침전된 단백질로부터 제거되었다.
다양한 계열의 방법 단계가 도 1 내지 3의 흐름도에 예시되어 있다. 단계들을 조합하고 생략하여 단백질 정제 및 방법 효율에 대한 결과를 판단하였다. 당업계에서 현재 실시되는 수확된 세포 배양 유체 (HCCF)로부터 발현된 단백질 정제를 위한 하나의 표준 방법은 세가지 크로마토그래피 단계를 사용한다: 도 1에서 왼쪽 열에 도시된 바와 같은, (1) 단백질 A 포획 (Prosep vA), (2) 양이온 교환 (SPSFF) 및 (3) 음이온 교환 (QSFF). 단백질 A 포획에 이어서 바로 음이온 교환하여 정제를 시도하였다 (중간 열, 도 1). 양이온 교환 단계를 pH 7에서의 PVS 침전 단계로 대체할 수 있다 (오른쪽 열, 도 1). 수확된 세포 배양 유체를 단백질 A 포획없이 먼저 양이온 교환에 이어서 바로 음이온 교환하거나 (왼쪽 열, 도 2), 또는 pH 7에서의 PVS 침전 단계에 이어서 음이온 교환하여 처리할 수 있다 (오른쪽 열, 도 2). 고분자전해질 침전을 HCCF로부터 직접 포획, 이어서 음이온 교환, 그다음 양이온 교환 크로마토그래피로서 수행할 수 있다 (도 3). 고분자전해질 침전을 pH 5 (왼쪽 열, 도 3) 및 pH 7 (오른쪽 열, 도 3)에서 수행하였다.
항-CD20 항체, rhuMab 2H7에 대한 침전 조건의 선택
이온 농도의 범위에 걸쳐 재조합 인간화 항-CD20 모노클로날 항체, rhuMab 2H7에 대한 용해도 곡선을 생성하였다. 용해도 곡선은 침전 후의 상청액에 남아있는 잔류 단백질 (％로서 표시) 대 항체 몰수 당 PVS 몰수로 표시되는 PVS의 농도의 플롯이다. pH 5 및 pH 7에서 단백질 A 풀에 대해 (도 4 및 5), pH 7에서 직접 포획 단계로서 사용되는 경우 SPSFF 풀에 대해 (도 6), 및 pH 5 및 pH 7에서 HCCF에 대해 (도 7) 용해도 곡선을 생성하였다. 이들 곡선을 사용하여 예비 규모 침전을 수행할 pH, 이온 농도 및 PVS 농도를 선택하였다.
단백질 A 풀의 침전 (도 4 및 도 5)
PVS 농도를 증가시키자, 용액에 남아있는 ％ 항체 - C/Co (즉, 용액 중 항체의 농도를 총 항체로 나눈 것)의 감소에 의해 나타나는 바와 같이 pH 5에서 중간체 침전이 일어났다 (도 4). C/Co (％)는 침전되지 않은 퍼센트(％) 단백질을 초기 단백질로 나눈 것이다. C/Co (％)가 0％인 경우 완전한 침전이 일어났다.
이온 농도를 감소시킴으로써, 보다 많은 양의 침전을 달성할 수 있었다 (4.7 mS/cm 대 3.0 mS/cm (여기서 mS는 전도율 단위인 밀리시멘스임)). pH 7에서, 유의한 침전을 달성하는데 희석이 필요하였다 (도 5). 전도율을 증가시키자, 침전이 증가하였다. 완전한 침전은 전도율 0.7 mS/cm에서 관찰되었다. 특정 전도율에서, 최대량의 침전이 관찰된 경우, 추가 PVS를 첨가하여 침전물을 재용해시켰다.
SPSFF 풀 (도 6) 및 HCCF (도 7)의 침전: SPSFF 풀 및 HCCF에서 유사한 경향을 관찰하였다. 전도율을 감소시키자, 침전이 증가하였다. 특정 전도율에서, 최대량의 침전이 관찰된 경우, 추가 PVS를 첨가하여 침전물을 재용해시켰다.
고분자전해질 분자량 영향의 평가
또한, PVS를 PAA와 비교한 용해도 곡선을 생성하였다. 용해도 곡선은 침전 후의 상청액에 남아있는 잔류 단백질 (％로서 표시) 대 항체 몰수 당 고분자전해질 몰수로 표시되는 고분자전해질의 농도의 플롯이다. 항-CD20 항체 (rhuMab-2H7, pI 9.0, 150 kDa)에 대한 고분자전해질의 당량의 범위에 걸쳐서 PAA (1200 ＆ 8000 Da) 및 PVS (1800 Da)에 대한 용해도 곡선을 pH 5 (도 8) 및 pH 7 (도 9)에서 측정하였다. 보다 높은 분자량 형태 (8000 Da)의 PAA는, 보다 낮은 분자량 형태 (1200 Da)의 PAA 및 (1800 Da)의 PVS 고분자전해질에 비해, pH 5 및 전도율값 5 mS/cm에서 보다 많은 침전을 일으켰다 (도 8). 유사한 경향을 pH 7, 1.5 mS/cm에서 관찰하였다 (도 9). 보다 높은 분자량 8000 Da PAA는, 보다 낮은 분자량 1200 Da PAA 및 1800 Da PVS 고분자전해질에 비해, pH 7 및 전도율값 1.5 mS/cm에서 보다 많은 침전을 일으켰다. 전도율의 기본 단위는 시멘 (S)이며, 공식적으로는 mho라 칭한다. 전도율 측정은 온도에 좌우된다. 전도율값은 mS/cm로서 표시된다. 두가지 경우에서, PAA 고분자전해질이 클수록, 고분자전해질을 추가 첨가하여 침전물을 재용해시키기 전에 최대 침전을 달성하는데 필요한 고분자전해질의 농도의 관점에서 작업 범위가 좁아졌다. 고분자전해질 분자량을 증가시킴으로써 보다 높은 전도율에서 침전을 수행할 수 있다.
pH 7 및 1.5 mS/cm에서 항-CD20 항체 (리툭시맙) 침전에 대한 고분자전해질 분자량의 효과를 1200 Da 내지 1,100,000 Da의 분자량 범위 내의 PAA로 조사하였다 (도 10). 분자량 증가는 이들 조건 하에서 침전 증가를 초래하였다. pH 7 및 1.5 mS/cm에서 완전한 침전은 35,000 Da (35 kDa) 초과의 분자량을 갖는 PAA를 사용하고 나서야 달성되었다.
또한, pH 7 및 12 mS/cm에서 인간화 항-CD20 항체의 침전에 대한 고분자전해질 분자량의 효과를 1800 Da 내지 1,132,000 Da의 분자량 범위 내의 폴리스티렌 술포네이트 (PSS)로 조사하였다 (도 33). 이러한 분자량 범위에 걸쳐 인간화 항-CD20 항체의 PSS 침전에 대한 용해도 곡선을 생성하였다. 분자량 증가는 이들 조건 하에서 침전 증가를 초래하였다. pH 7 및 12 mS/cm에서 완전한 침전은 220,000 Da (220 kDa) 초과의 분자량을 갖는 PSS를 사용하고 나서야 달성되었다. PSS를 사용함으로써 보다 높은 전도율에서 침전을 수행하며, 완전한 침전을 달성하기 위해 풀의 이온 농도에 대한 전도율을 낮출 필요성을 최소화한다.
불순물 제거에 대한 고분자전해질 분자량의 효과를 하기 표 1의 조건 하에서 측정하고, 하류 처리 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 침전 단계 후, PAA 8000 Da는 PAA 1200 Da 또는 PVS보다 높은 수준의 차이니스 햄스터 난소 단백질 (CHOP)을 가졌다 (표 2). QSFF 풀에서, 정제에 사용된 고분자전해질의 분자량에 상관없이 모든 풀에 대해 유사한 CHOP 수준을 관찰하였다. 두가지 분자량의 PAA는 침출된 단백질 A 및 항체 단편을 유사한 수준으로 감소시키며, 응집물 수준에 대해 부정적인 영향을 미치지 않았다.
항-CD20 항체 정제
고분자전해질 침전을 먼저 양이온 교환 크로마토그래피 단계에 대한 대체로서 평가하였다. 양이온 교환 단계의 주요 기능은 숙주 세포 불순물을 감소시키고, 침출된 단백질, 젠타마이신, DNA를 제거하고, 존재하는 경우 항체 응집물을 감소시키는 것이다 (도 11). 인슐린은 이전 단백질 A 단계에 의해 제거된다. PVS 침전 단계는 SPSFF 단계와 유사한 수준으로 CHOP를 감소시켰다. 또한, 침출된 단백질 A 및 항체 단편을 감소시켰다. SPSFF 단계와 동일한 정도는 아니지만, 침전 단계를 통해 젠타마이신이 감소하였다. DNA 분석은 PVS의 존재 하에서는 기능하지 않으므로 침전 단계를 통한 PVS 제거는 평가할 수 없었다. 침전 단계의 추가는 항체 응집물을 증가시키거나 CDC 활성에 의해 측정된 바와 같은 생물학적 활성에 영향을 미치지 않았다 (도 11 및 표 3).
보다 흥미로운 공급물을 제공하기 위해, HCCF를 SPSFF 컬럼을 통해 직접 처리하였다. SPSFF 풀은 초기 포획 단계로서 사용되는 경우 단백질 A 풀보다 4배 높은 CHOP를 가졌다 (도 11). 또한 ％ 단편도 단백질 A 포획 과정보다 높았다 (9.24％ 대 0.24％). 양이온 교환 단계를 거친 항체로 공-정제된 프로테아제는 항체의 클립핑(clipping)을 초래하는 것 같다. PVS 침전 단계는 단편을 5.63％로 감소시켰다. CHOP는 침전 단계 부재시 71 ng/mg으로 감소한 것과 비교하여, 상기 과정을 통해 4.1 ng/mg으로 감소하였다. 또한 젠타마이신도 침전 단계에 의해 유의하게 감소하였다 (146 ng/mg에서 8 ng/mg로). 인슐린 및 DNA는 초기 SPSFF 포획 단계에 의해 낮은 수준으로 감소하였으므로 이들의 제거율은 평가할 수 없었다. 대조군 실행 (SPSFF-QSFF)에서 높은 단편 수준은 87％의 감소된 CDC 활성을 초래하였다 (표 3). 대조적으로, PVS 침전 실행은 100％ CDC 활성을 가졌다.
또한, PVS 단계를 HCCF로부터 직접적인 포획 단계로서 평가하였다. pH 7에서의 PVS 침전 단계는 인슐린을 제거하였다 (도 11). 대조적으로, pH 5에서의 PVS 침전 단계는 인슐린 수준을 단지 부분적으로 감소시켰다. pH 7에서의 PVS 침전은 pH 5에서의 침전보다 3배 많은 숙주 세포 단백질을 제거하였다. 최종 SPSFF 단계를 소수성 상호작용 단계와 같은 직교 크로마토그래피 방법으로 대체함으로써 숙주 세포 불순물을 더 감소시킬 수 있다. pH 5 포획에서, 양이온 교환 단계를 거친 항체 단편이 4.66％ 증가하였다. 이는 pH 7 포획 단계에서는 일어나지 않았다. 이는 pH 5 (SPSFF 포획 단계와 매우 유사함)에서 산성 프로테아제가 공-정제되어 항체 단편을 증가시켰음을 제시할 수 있다. 침전 단계의 추가는 CDC 활성에 의해 측정된 바와 같은 생물학적 활성에 영향을 미치지 않았다 (표 3). 보체 의존성 세포독성 (CDC) 분석을 사용하여 Q 풀을 생물학적 활성/효능에 대해 분석하였다. 이러한 분석은 rhuMAb 2H7의 인간 보체 존재 하에서의 WIL2-S 세포 용해능을 측정하는 것을 기준으로 한다.
RNAse A의 억제를 기준으로 한 FRET (형광 공명 에너지 전이) 분석을 사용하여 고분자전해질 제거율 (재현탁된 항체로부터 고분자전해질의 제거)을 측정하였다. PVS는 RNase A의 잠재적 억제제이다. 상기 분석은 한쪽 말단에 형광 라벨을 갖고 다른쪽 말단에는 소광체(quencher)를 갖는 RAN 유사체를 사용한다. RNA 유사체가 RNase A에 의해 절단되면, 형광 라벨은 소광체로부터 방출되어 발광한다. PVS의 존재는 RNase A 활성을 억제하여 형광 발광을 제한한다. 이어서, 시험 샘플로부터 관찰된 형광을 표준 곡선에 비교하여 PVS의 양을 결정할 수 있다. 모든 경우, PVS는 QSFF 크로마토그래피 상에서 1 μg/μl 미만으로 제거되었다 (표 4).
rhuMab DR5 Apomab 정제
고분자전해질 침전 방법을 개발하여 항체 rhuMab DR5 Apomab (pI 8.0, 150 kDa)의 정제에 적용하였다. 사멸 도메인 함유 수용체-5(Death Domain Containing Receptor-5, DR5) 단백질은 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체군에 속한다 (US 6872568; US 6743625). 표준 크로마토그래피 방법은 Prosep vA, SPSFF 및 QSFF 수지를 사용한다. 고분자전해질 침전 방법을 변형시켜 문제되는 숙주 세포 단백질 불순물인 글루타치온-s-트랜스퍼라제 (GST)를 제거하였다. Prosep vA 단계는 0.4 M 인산칼륨 세척 (pH 7)이 아닌 0.5 M TMAC 세척 (pH 5)을 수행한다. SPSFF 단계는 대략 12 컬럼 부피의 풀 부피를 제공하는 얕은 구배로 용출된다. PVS 침전을 SPSFF 단계에 대한 대체로서 평가하였다. pH 범위 5.5 내지 7.0에 걸쳐서 용해도 곡선을 생성하였다. pH를 증가시키자, 완전한 침전을 달성하기 위해 이온 농도를 감소시키는 희석이 필요하였다 (도 12 및 13). 도 12에서, 완전한 침전을 달성하기 위해 pH를 증가시키는 경우 이온 농도를 감소시키는 희석이 필요하였다. pH 5.5 및 전도율 5.1 mS/cm에서 완전한 침전이 관찰되었다. 그러나, pH 6에서는 완전한 침전을 달성하기 위해 풀을 3 mS/cm로 희석하는 것이 필요하였다. 도 13에서, 완전한 침전을 달성하기 위해 pH를 증가시키는 경우 이온 농도를 감소시키는 희석이 필요하였다. pH 6.5에서는 완전한 침전이 1.5 mS/cm에서 관찰되었다. pH 7에서는 완전한 침전을 달성하기 위해 풀을 0.7 mS/cm로 희석하는 것이 필요하였다.
완전한 침전이 달성되면, 추가 PVS를 첨가하여 침전물을 재용해시켰다. 이러한 효과는 도 14의 사진에 예시되어 있다. 도 14는 용액 중의 Apomab의 플라스크에서 0.1％ PVS (w/v)의 침전 효과 및 1％ PVS (w/v)에서의 재용해를 예시한다. 용해도 곡선을 사용하여 표 5에 약술된 침전 조건을 선택하였다. pH 5.5 내지 pH 7.0에서 PVS 침전을 수행하였다. pH를 증가시키자, 수율은 약간 감소하였지만, CHOP 및 침출된 단백질 A 제거율은 향상되었다 (표 6). 이후, 이들 풀을 QSFF 컬럼을 통해 처리하고 대조군 실행과 비교하였다 (표 6). SPSFF 단계 또는 PVS 침전 단계는 CHOP를 0.79 ng/mg 미만으로, 침출된 단백질 A를 2 ng/mg 미만으로 제거하는데 필요하였으며, 이에 반해 SPSFF 또는 침전 단계가 없는 대조군 실행에서는 CHOP 17 ng/mg 및 침출된 단백질 A 4 ng/mg이 제거되었다. PVS 침전은 또한 SPSFF 단계와 동일한 수준은 아니지만 GST 감소능을 입증하였다.
항-cMet 정제
항-cMet에 대해 pH 범위에 걸쳐 용해도 곡선을 생성하고, 제한된 물질 입수성으로 인해 이온 농도를 선택하였다. 용해도 곡선은 pH 4 내지 pH 7로 조정된 단백질 A 풀로부터 생성되었다 (도 15). 이들 곡선을 사용하여 예비 규모 침전을 수행할 pH, 이온 농도 및 농도를 선택하였다. pH 4 및 전도율 2 mS/cm에서 항-cMet는 40 초과의 PVS:Ab 몰비에서 용액으로부터 완전히 침전되었다 (도 15). pH 5에서, 용해도 곡선을 전도율 1 mS/cm 및 2.4 mS/cm에서 얻었다. 보다 높은 전도율에서 항-cMet는 용액으로부터 완전히 침전되지 않았다. 용액 전도율을 1 mS/cm로 낮춤으로써, 항-cMet는 용액으로부터 보다 용이하게 침전되었다. 이러한 전도율에서 최대 침전은 PVS:Ab 몰비 100에서 일어났다. 100 초과의 몰비에서 고분자전해질 착체는 아마도 고분자전해질 전하-전하 반발 효과로 인해 용해도를 증가시켰다. pH 4 및 pH 5, 전도율 ~2 mS/cm에서 용해도 곡선의 비교는, 용액 반대 이온에 의한 정전 차폐 효과는 대량 상분리가 일어나는 pH에 영향을 미치며 용액 이온 농도의 감소는 pH 증가에 필수적이라는 것을 제시한다. pH 6 및 pH 7 및 용액 전도율 0.5 mS/cm에서, 항-cMet 시험된 PVS의 농도에 걸쳐서 용액으로부터 완전히 침전되지 않았다. pH 6 및 pH 7에서 각각 21％ (C/Co = 0.79) 및 12％ (C/Co = 0.88)의 최대 침전이 일어났다. pH 6 및 pH 7에서 항-cMet의 용해도 곡선은 유사한 단백질 pI 8.3을 갖는 전체 길이 인간화 항체와 비교하여 현저히 상이하였다. 예를 들어, 유사한 조건, pH 7.0 및 용액 전도율 0.7 mS/cm을 사용하여, Apomab이 이들 실험에서 사용된 동일한 R 값으로 완전히 침전된다 (C/Co = 0).
PVS 침전을 이용한 항-cMet (pI 8.3, 100 kDa)에 대한 정제 방법을, 4 크로마토그래피 단계, 단백질 A 포획 단계에 이어서 결합 및 용리 방식으로 실행되는 2 양이온 교환 단계, 및 최종적으로 통과 방식으로 수행되는 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계를 사용한 표준 방법과 비교하였다 (표 7). 양이온 교환 단계 및 소수성 상호작용 단계 둘 다를 PVS 침전에 이어서 통과 방식으로 실행되는 음이온 교환 크로마토그래피로 대체하였다. pH 4에서, 침전 반응은 보다 높은 이온 농도에서 수행될 수 있다. 그러나, pH 5에서의 침전은, 이 pH에서 보다 많은 숙주 세포 불순물이 음으로 하전되어 용액에 남아야 하므로 보다 많은 불순물을 제거할 수 있다. 용해도 곡선에서 결정된 바와 같이, pH 5.0, 전도율 0.6 mS/cm 및 PVS 몰비 100 (0.1％ w/v)의 조건을 선택하여 항체 침전을 최대화하였다. 항-cMet의 PVS 침전에 대한 회수율은 PVS:항체 펠렛의 가용화에 의해 영향받았다. PVS:항체 펠렛은 겔과 유사하며, 가용화하기 어려웠다. QSFF 평형상태 완충액 중 펠렛의 가용화 후, 용액은 미립자에 의해 흐릿하였다. 0.4 μM 진공 필터를 사용하여 용액을 용이하게 여과함으로써, Q-세파로스 음이온 교환 크로마토그래피 상에서 처리된 맑은 용액을 수득하였다.
pH 5, 0.5 mS/cm 및 0.1％ PVS (w/v)에서 수행된 PVS 침전 단계는 CM-세파로스 단계와 유사한 수준으로 ECP를 감소시켰다 (표 7). 침전 과정 내내, 침출된 단백질 A의 유의한 감소 또는 ％ 단량체의 증가는 관찰되지 않았다.
침전물의 포획을 위한 여과 조건의 선택
세포 배양 유체에서 생물학적 오염물의 제거에 특히 적합한 흡착성 필터 매체를 갖는 심층 필터가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 심층 필터는 다양한 조 생성물 유액의 정화를 위해, 포유동물 세포 배양 유체에서 유도된 생물약제의 제조에 전형적으로 사용된다. 셀룰로스 심층 필터, 예를 들어 밀리포어 코포레이션(Millipore Corporation)에서 시판하는 밀리스탁+® 필터는 수불용성 열가소성 결합제에 포함된 과립 흡착제 같은 흡착성 물질의 다공성 고정층을 갖는다. 생성된 복합 필터는 전형적인 심층 필터보다 더 많이 보다 작은 흡착성 입자와 흡착한다. 이들 복합 필터는 조밀한 구조의 셀룰로스 심층 배지층을 포함하며, 특정 응용, 예를 들어 콜로이드 입자 및 세포 파편의 보유 또는 전체 세포 및 보다 큰 파편의 보유에 최적화될 수 있다. 이들은 예를 들어 단일 필터 카트리지 내에 멤브레인을 축적시켜 순차적 등급의 배지를 합한다. 이러한 심층 필터는 연마 또는 2차 정화 과정에 사용되어 소량의 현탁 물질을 수성 생성물 (단백질) 스트림으로부터 제거할 수 있다. 필터는 또한 콜로이드 오염물 및 다른 세포 파편을 제거함으로써 보다 고가인 하류 분리 과정, 예를 들어 무균 여과 및 친화성 크로마토그래피의 사용 기간을 보호 또는 연장할 수 있다. 또한, 상기 심층 필터는 미량의 응집 단백질을 제거함으로써 바이러스 제거 필터의 보호에도 유용하다.
특정 심층 필터는 또한 포유동물 세포 배양물에서 통상적으로 발견되는 일부 가용성 오염물, 예를 들어 핵산, 숙주 세포 단백질, 지질, 계면활성제 등을 다양한 정도로 보유할 수 있다. 이러한 특정 가용성 오염물 보유 용량은 심층 필터 매체의 흡착 성질을 기준으로 한다. 심층 필터에 전형적으로 사용되는 필터 매체에는 정련된 셀룰로스 섬유 (목재 펄프 및/또는 유도된 목화), 규조토, 또는 수용성 열경화성 수지 결합제가 포함된다 (US 2007/0193938). 이들 복합재 중 규조토 (미량의 다양한 실리케이트를 함유하는 천연 형태의 실리카)는 전형적으로 40 내지 60 중량％이며, 세포 단편, 세포 기관 및 응집 단백질 같은 콜로이드 크기의 생물학적 물질 뿐만 아니라 단백질, 지질 및 핵산 (DNA 및 RNA)과 같은 다양한 가용성 생화학물질을 흡착한다.
심층 여과를 PVS 항체 침전물에 대한 포획 단계로서 평가하였다. 넓은 크기 분포의 침전물은 여과를 사용하는 침전물의 포획에 난점을 제공한다. 각각의 필터 매체를 보통의 유동 여과 조건 하에서 침전된 항체로 시험하였다. 다양한 기공 크기를 갖는 심층 여과 매체를, 이들이 침전물을 전부 포획할 수 있는 능력에 대해 스크리닝하였다. 최적의 필터 매체를, 이들이 침전물을 전부 포획할 수 있는 능력 및 고용량으로 로딩될 수 있는 능력을 기준으로 선택하였다. Vmax를 사용하여 필터를 통한 압력 강하를 평가하였을 뿐만 아니라 최대 용량을 측정하였다. 표 8은 평가된 여과 매체를 나타낸다. 평가된 밀리스탁+® CE (단지 셀룰로스) 계열의 매체는 20CE, 35CE 및 45CE를 포함한다. 평가된 밀리스탁® HC (셀룰로스 및 무기 필터 보조제) 계열의 매체는 C0HC, B1HC 및 A1HC를 포함한다 (문헌 [Rathore et al (Aug 1, 2004) BioPharm Intl.]; US 2007/0193938 참조). 밀리스탁® 필터 카트리지 및 시트는 밀리포어 코포레이션 (매사추세츠주 베드포드 소재)에서 입수가능하다.
표 8에 나타낸 바와 같이, 20CE 배지는 35CE 및 45CE에 비해 보다 개방적이다. 20CE는 공칭 기공 크기 범위 5 내지 10 마이크로미터를 함유하는 반면, 35CE 및 45CE는 각각 공칭 기공 크기 범위 2 내지 4 마이크로미터 및 0.8 내지 2 마이크로미터를 함유한다. 이들 계열의 필터 매체를 선택하여 기공 크기 범위를 좁힘으로써 항체 (인간화 2H7 변이체)-PVS 침전물을 완전히 포획할 수 있었다. 20CE 배지는 침전물의 45％를 포획한 반면, 35CE는 침전물의 48％를 포획하였다. 비교하면, 45CE는 침전물의 97％를 포획하였다. 밀리스탁+ HC 계열의 매체는 밀리스탁+ CE 계열보다 조밀하다. C0HC 배지는 공칭 기공 크기 범위가 0.2 내지 2 마이크로미터인 반면, B1HC 및 A1HC는 각각 0.05 내지 0.7 마이크로미터 및 0.05 내지 0.4 마이크로미터 범위의 보다 조밀한 기공 크기를 갖는다. 세가지 모두 침전물의 99％를 포획하였다.
도 34는 각각의 필터 매체에 대한 용량 (필터 면적 당 항체 (2H7)의 그램으로 측정됨) 대 압력 강하의 Vmax 플롯을 도시한다 (표 8). 17 psi의 압력 한계는 필터 파울링(fouling)으로 인한 실험의 종료를 나타내도록 설정되었다. 125 g/m2의 표적 용량은 필터 파울링이 없는 경우 실험의 종료를 나타내도록 설정되었다. A1HC 및 B1HC 필터 매체 둘 다는 17 psi에 도달하여 최저 용량을 제공하였다. A1HC 배지를 사용한 여과의 종료시 용량은 40 g/m2인 반면, B1HC 배지를 사용한 여과의 종료시 용량은 68 g/m2이었다. C0HC는 3.5 psi의 최대 압력으로 125 g/m2의 종료 용량에 도달하였다. 상기에 언급된 바와 같이, 20CE 및 30CE는 침전물의 50％ 미만을 보유하므로 표적 용량에 이르지 않았다. 45CE는 7 psi의 최대 압력으로 표적 용량에 도달하였다.
심층 필터 내 침전물의 가용화를 위한 가용화 조건의 선택
심층 필터로부터 포획된 항체를 회수하기 위해 다수의 가용화 방법을 평가하였다. 이러한 단계의 목표는 높은 항체 회수율을 갖는 강한 방법을 개발하는 것이었다. 평가된 제1 방법은 고 pH에서 고 전도율 완충액을 사용하여 침전물로부터 항체를 재가용화하는 것이었다. 고 pH 및 고 전도율 조건 하에서, 항체는 덜 양성이며, 용액 중 보다 많은 이온이 PVS 및 항체를 차폐하여 침전을 방지한다. pH 범위 8 내지 8.5 및 전도율 ~6 mS/cm에서 50 mM 트리스 염기/50 mM 아세트산나트륨 완충액을 사용하여 항체를 가용화하였다. 심층 필터를 통해 완충액을 플러슁하고, 생성된 풀은 항체 및 PVS를 함유하였다. 항체를 완전히 가용화하는데 필요한 완충액의 부피 및 유속과 같은 변수를 평가하였다. 또한, 보다 농축된 풀을 생성하는 방법으로서 심층 필터를 통한 완충액의 재순환을 평가하였다.
도 35는 C0HC 밀리스탁+® 필터 매체로부터 2H7-PVS 단백질-고분자전해질 침전물의 완전한 재가용화에 도달하는데 필요한 완충액 부피의 관점에서 수율에 대한 유속 변화의 효과를 도시한다. 52-130 LMH (시간 당 평방 미터 당 리터, 유속 척도) 및 130-261 LMH 범위의 유량은 600 ml의 완충액에서와 유사한 최종 수율을 생성하는 두 곡선과 유사한 경향을 보여준다. 130 LMH 유량의 곡선은 동일한 경향을 포함하며, 또한 600 ml의 완충액에서와 유사한 수율을 나타낸다. 유속을 변화시키는 것은 수율 대 완충액 부피 비를 개선시키지 않았다. 이러한 방법을 사용하여 수득된 최고 항체 농도는 1 g/L이었다.
잠재적으로 보다 농축된 풀을 생성할 수 있는 방법으로서 심층 필터를 통한 완충액의 재순환을 평가하였다. 완충액을 함유하는 저장소가 입구 완충액 및 출구 풀 용기 둘 다로서의 역할을 수행하였다. 도 36에 도시된 바와 같이, 2가지 범위의 유량 (완충액 재가용화 유량 (LMH))을 시험하여, 2H7-PVS 단백질-고분자전해질 침전물로서 필터로부터 본 단백질의 대부분을 회수하는 최적 처리 시간을 결정하였다. 130-261 LMC 범위의 유량은 60분 후 261-522 LMH 범위의 유량과 동일한 수율 84％에 도달하였다. 풀 농도의 관점에서, 재순환 방법은 심층 필터를 통한 완충액의 단일 통과와 비교시 보다 농축된 풀을 생성하였다. 재순환 방법을 사용하여 수득된 최고 항체 농도는 2 g/L이었다.
연속 방식으로 침전 반응 및 심층 여과 포획의 작업
PVS 침전은 용액 중 강한 음이온성 PVS 분자와 단지 약간 양이온성인 항체 분자 사이의 이온 상호작용에 좌우된다. PVS 침전에 대해 허용가능한 범위로 용액의 전도율을 낮추기 위해서 단백질 공급물을 희석하는 것은 공급물 부피를 매우 증가시킬 수 있다. 제조 규모에서 가능한 부피 제한을 피하기 위해, 공급물 인라인을 컨디셔닝 하기 위한 설계를 개발하는 것이 필요하다. 인라인 희석을 사용하여 혼합용 탱크 필요없이 공급물 스트림의 전도율을 낮출 수 있다. PVS 스트림과 컨디셔닝된 공급물 스트림을 합함으로써, PVS-항체 침전이 인라인으로 일어날 수 있으며, 대규모 침전 탱크에 대한 필요성을 배제시킬 수 있다. 공정 개략도는 (i) PVS-MAb 입자 응집을 촉진하기 위한 긴 체류 시간 및 낮은 유속; (ii) 높은 공정 처리량을 유지하기 위한 인라인 반응기의 큰 횡단면적; 및 (iii) 실험실-규모의 실시를 목적으로 하는 인라인 HCCF 컨디셔닝/PVS 침전 설비의 개요를 도시한다.
PVS-항체 침전이 PVS와 컨디셔닝된 공급물 스트림의 인라인 혼합시 용이하게 일어날 수 있지만, PVS-항체 침전물 입자 응집 과정은 스트림 난류, 정지 시간 및 평균 선형 유속에 매우 민감하다. 여과 매체에 의해 포획되기에 충분히 큰 침전물 입자를 형성하기 위해 필요한 샘플 입자 응집에 짧은 교반 정지 시간이 요구된다. 높은 스트림 속도는 PVS-Ab 침전물이 보다 큰 응집물을 형성하는 것을 방지하여, 여과 매체에 의해 포획하기 어려울 수 있는 매우 작은 침전물 입자의 스트림을 생성할 수 있다.
연속적으로 침전된 공급물 스트림을 처리하는 심층 여과 포획 방법과 함께 인라인 연속 공급물 컨디셔닝/PVS 침전 파이프라인이 실험실-규모로 제공된다. 71 내지 60％ 범위의 항체 회수율이 인라인 PVS 침전 단계보다 9배 CHOP 제거율로 도 37에 도시된 공정 개략도에 의해 관찰되었다 (항체 수율 플롯에 대한 도 38).
양이온 고분자전해질 침전 조건의 선택
CCF 및 HCCF에서 두가지 분자량의 폴리아르기닌 (폴리-L-아르기닌)을 사용하여 용해도 곡선을 생성하였다. 용해도 곡선은 침전 후 상청액에 남아있는 잔류 단백질 (％로 표시) 대 고분자전해질 중량 (g)/용액 부피 (mL)로서 표시되는 고분자전해질의 농도의 플롯이다.
rhuMab 2H7 CCF (도 20) 및 HCCF (통상 pH 7)에 대해 이온 농도의 범위에서 용해도 곡선을 생성하였다 (도 21 및 22). 이들 곡선을 사용하여 예비 규모 침전을 수행할 최적 CHOP 침전 조건, 즉 이온 농도, 폴리아르기닌 농도 및 분자량을 선택하였다. 또한, 침전 기술의 강건성 및 일관성을 보장하기 위해 항-CD22 및 rhuMab C2B8 HCCF (도 23 및 24)를 이용하여 용해도 곡선을 생성하였다. 두 침전 단계, 양이온 고분자전해질 침전에 이어서 음이온 고분자전해질 침전을 통한 항체 정제의 실행가능성을 평가하기 위해, 0.075％ w/v 110 kDa 폴리아르기닌에 의한 CCF의 플록형성으로부터 생성된 rhuMab HCCF의 PVS 침전에 대해 용해도 곡선을 생성하였다 (도 25). 폴리아르기닌 농도를 증가시키자, 상청액에서 잔류 CHOP (ng/mg) 감소로 나타나는 CHOP 침전이 일어났다. 최적 CHOP 침전은 95％ 수율로 CHOP 22배 감소와 함께 폴리아르기닌 0.2％ w/v 농도에서 일어났다. 폴리아르기닌 농도를 더 증가시키는 것은 유의한 CHOP 감소를 초래하지 않았지만, 수율이 감소하였다.
CHOP 침전은 rhuMab 2H7 HCCF 용해도 곡선 (도 21 및 22)에서 도시된 바와 같이, 고분자전해질의 이온 농도 및 분자량의 함수인 것처럼 보인다. 전도율을 감소시키자, 침전이 증가하였다. 일반적으로, 고분자전해질의 분자량을 증가시키는 것은 CHOP 침전에 영향을 미치는 것처럼 보였다. 폴리아르기닌의 유사한 농도에서, 고분자량 고분자전해질 (110 kDa)은 저분자량 고분자전해질 (42 kDa)에 비해 많은 CHOP를 침전시켰다. 특정 전도율 (3 mS/cm 제외)에서, 0.1％ w/v 초과의 폴리아르기닌의 첨가는 더 유의한 CHOP 감소를 일으키지 않았다. 폴리아르기닌 0.1％ w/v 농도에서, 42 kDa 및 110 kDa 분자량 각각에 대해 10배 및 13배 CHOP 감소를 얻었으며, 두 분자량에 대한 수율은 95％ 초과이었다.
rhuMab 2H7, 항-CD22, rhuMab C2B8 HCCF 용해도 곡선 (도 23 및 24)에서 도시된 바와 같이, 항-CD22 및 rhuMab C2B8 HCCF에 대해 유사한 경향을 관찰하였다. 0.1％ w/v 110 kDa 폴리아르기닌에 의한 항-CD22 HCCF의 침전은 25배 CHOP 침전 및 95％ 수율을 생성하였다. rhuMab C2B8에 대한 최적 CHOP 침전은 0.15％ w/v 110 kDa 폴리아르기닌의 농도에서 일어났으며, 20배 CHOP 감소 및 95％ 수율을 생성하였다.
PVS 농도를 증가시키자, 시험된 pH 및 전도율 둘 다에서 폴리아르기닌에 의해 플록형성된 공급물 중 항체의 완전한 침전 (수율 (％) 감소로 나타남)이 일어났다 (도 25). 이는 시험된 조건 하에서 항체의 PVS 침전에 대한 폴리아르기닌 존재의 최소 방해를 나타낸다. pH 7 및 전도율 1.5 mS/cm에서, 최대 수준의 침전이 관찰된 경우, 추가 PVS를 첨가하여 침전물을 재용해시켰다.
rhuMab 2H7의 하류 처리
표준 방법은 현재 3개의 크로마토그래피 단계, 단백질 A 포획 단계에 이어서 양이온 및 음이온 교환 단계를 사용한다. 0.075％ w/v 110 kDa 폴리아르기닌에 의한 CCF 플록형성 및 PVS를 이용한 항체 침전으로 HCCF 처리, 이어서 QSFF 단계가 표 9 공정 흐름 a)에 도시된다. 이러한 플록형성 단계의 주요 기능은 고체 (세포 파편)을 제거하여 혼탁도를 감소시킴으로써 CCF를 정화하고, CHOP 및 DNA와 같은 숙주 세포 불순물을 침전시키는 것이다. 폴리아르기닌은 고체 및 세포 배양 배지 성분을 플록형성시킬 수 있으며, CHOP를 23480 ng/mg로 감소 (4배 감소)시키고, DNA를 완전히 제거하였다. 110 kDa 폴리아르기닌의 농도가 0.2％ w/v로 증가한 경우, 용해도 곡선 (도 20)에 의해 나타난 바와 같이 22배 이하의 CHOP 감소를 얻었다. 플록형성된 HCCF의 PVS 침전은 CHOP를, 대조군 HCCF-PVS 풀에서의 CHOP 보다 유의하게 적은 212 ng/mg으로 더 감소시시켰다. 대조군 HCCF-PVS-Q 풀은 폴리(Arg) HCCF-PVS-Q 풀의 거의 2배량의 CHOP를 함유하였다. DNA 분석은 PVS의 존재 하에서는 기능하지 않으므로 침전 단계를 통한 PVS 제거율을 평가할 수 없다. 모든 단계를 통한 수율은 PVS 침전 단계를 제외하고 95％ 초과이었다 (표 9). PVS 단계에 대한 이들 낮은 수율은 침전 절차, 및 침전 메카니즘 및 조건에 반대되는 예비 규모에서의 취급에 기인할 수 있다 (도 25). SEC에 의한 ％ 단량체, 인슐린 및 젠타마이신은 이들 풀에 대해 평가하지 않았다.
하류 공정에 대한 영향을 연구하기 위해, HCCF를 0.1％ w/v 110 kDa 폴리아르기닌으로 침전시키고, 다양한 정제 설계를 수행하였다. 항체에 대한 수율은 97％이었고, CHOP는 18배 감소하였으며, DNA는 폴리아르기닌 침전에 의해 완전히 제거되었다. 인슐린 및 젠타마이신은 이러한 침전 단계에 의해 제거되지 않았다. 침전된 HCCF 하류 처리 전에, SPSFF 수지의 로드 용량에 대한 폴리아르기닌의 영향을 평가하기 위해 파과 곡선을 생성하였다. 두 로드, 폴리아르기닌 침전된 HCFF 및 후 침전 단백질 A 풀에 대해, 대조군 (폴리아르기닌 침전 부재)과 유사한 수지 ml 당 항체 60 mg에서 SPSFF 상의 5％ 파과가 일어났다. 이는 폴리아르기닌이 SPSFF의 결합 용량에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 나타낸다 (도 26 및 27).
표준 항체 방법 (공정 흐름 b), 표 9): 폴리아르기닌 침전된 HCCF를 단백질 A에 이어서 이온 교환 크로마토그래피를 통해 처리하였다. 폴리아르기닌-단백질 A 풀은, 로드 공급물 중 CHOP 수준과는 매우 상이하지만 대조군 단백질 A와 유사한 CHOP 수준을 가졌다. 젠타마이신 및 인슐린은 단백질 A 단계에 의해 낮은 수준으로 감소하였다. CHOP는 침전 단계의 부재 하에서 307 ng/mg으로 감소한 것과 비교하여, SPSFF 상에서 3 ng/mg으로 490배 감소하였다. DNA, 침출된 단백질 A, 인슐린 및 젠타마이신은 또한 대조군 방법 (단백질 A - SPSFF - QSFF)에 필적하게, 폴리아르기닌-단백질 A-SP 방법에 의해 허용가능한 수준으로 감소하였다 (표 9). 불순물 수준이 폴리아르기닌 침전 후 SPSFF 풀에서 허용가능하기 때문에, QSFF 상에서 이들을 처리하는 것은 필요하지 않다.
비 친화성 항체 정제 방법 (공정 흐름 c), 표 9): 폴리아르기닌 침전된 HCCF를 SPSFF에 이어서 QSFF를 통해 처리하였다. 후 침전 SPSFF 풀은 침전의 부재 하에서 6731 ng/mg과 비교하여 63 ng/mg (76배 감소)의 CHOP를 함유하였다. SPSFF는 인슐린을 완전히 제거하고, 젠타마이신을 부분적으로 감소시켰다. CHOP 제거율은 폴리아르기닌-SP 방법에서 보다 양호하였으며, DNA, 인슐린 및 젠타마이신 제거율은 대조군 방법 (SPSFF-QSFF)에 필적하였다 (도 28). 폴리아르기닌 침전 후, SPSFF 풀에서의 CHOP 수준은 QSFF 풀과 유사하였으며, 이는 QSFF 단계가 이 방법에서 중복된다는 것을 제시한다.
2 단계 침전/크로마토그래피 정제 방법
폴리아르기닌 침전된 HCCF를 이후 PVS에 의해 항체 침전시킨 다음 QSFF 상에서 처리하였다 (공정 흐름 d), 표 9). PVS 풀은 폴리아르기닌 침전의 부재 하에서 1517 ng/mg과 비교하여 49 ng/mg (99배 감소)의 CHOP를 함유하였다. PVS 침전 단계는 인슐린을 완전히 제거하고, 젠타마이신을 부분적으로 감소시켰다. CHOP 제거율은 폴리아르기닌-PVS 방법에서 보다 양호하였으며, DNA 및 인슐린 제거율은 대조군 방법 (SPSFF-QSFF)에 필적하였다. 젠타마이신 제거율은 QSFF 단계의 존재 하의 대조군 방법에서 2배 더 낮았다. 폴리아르기닌 침전 후, SPSFF 풀에서의 CHOP 수준은 QSFF 풀과 유사하였으며, 이는 QSFF 단계가 이 방법에서 중복된다는 것을 제시한다.
항체 감소의 억제
rhuMAb 2H7를 함유하는 HCCF를 폴리아르기닌으로 처리하고, 스테인레스강 미니캔에 48시간 동안 보관하고, 샘플을 규칙적인 시점에서 취하고 분석하였다. 항체는 원형이며, 항체가 10시간에 감소하기 시작한 대조군과 대조적으로, 폴리아르기닌 침전된 HCCF에서는 전시간에 걸쳐 항체가 감소하지 않았다 (도 28). 폴리아르기닌은 다른 음으로 하전된 불순물과 함께 항체-감소제를 침전시켜 이를 억제한다.
다른 양이온 고분자전해질의 평가
불순물의 제거를 더 향상시키기 위한 침전 조건의 최적화는 다른 고분자전해질의 사용 뿐만 아니라 교반 속도 및 유형, 및 고분자전해질 첨가 속도와 같은 다른 조건의 최적화를 포함할 수 있다. 또다른 염기성 폴리(아미노산)인 폴리리신을 폴리아르기닌에 대한 초기 비교를 위해 선택하였다. 폴리아르기닌은 구아니디늄 양이온 관능기를 가지며 pKa가 대략 12.5이다. 폴리리신은 관능기로서 아민 양이온을 가지며 pKa가 대략 10.5이다. 폴리아르기닌 및 폴리리신 둘 다 다수의 분자량으로 시판된다.
rhuMab C2B8 단백질 A 풀 용해도 곡선
양으로 하전된 폴리양이온 고분자전해질에 의한 CHOP 침전은 고분자전해질의 이온 농도 및 분자량과 상관된다 (도 29 및 30). 저분자량 폴리리신 (2.5 kDa)은 전도율 범위 3 내지 12 mS/cm에서 CHOP를 침전시키지 않았다. 그러나, 50kDa 폴리리신은 3 mS/cm 및 6 mS/cm에서 각각 4배 및 2배 CHOP 감소를 초래하였다. 12 mS/cm에서는 어떤 유의한 CHOP 침전도 관찰되지 않았다. 일반적으로, 전도율을 감소시키면, CHOP 침전이 증가하고, 고분자전해질의 분자량을 증가시키는 것은 CHOP 침전에 영향을 미치는 것 같았다. 보다 낮은 전도율에서, 최대 CHOP 침전을 얻은 경우, 폴리리신을 더 첨가하여 침전물을 재가용화시켰다. 수율은 시험된 모든 조건에서 95％를 초과하였다.
rhuMab C2B8 HCCF 풀 용해도 곡선
rhuMab C2B8 HCCF에 대해 유사한 경향을 관찰하였다 (도 31 및 32). 3 mS/cm 및 6 mS/cm 전도율에서, 50 kDa 및 225 kDa 폴리리신 둘 다 9배 CHOP 감소를 초래하였다. 그러나, 225 kDa 폴리리신을 이용하더라도 12 mS/cm에서는 어떤 유의한 CHOP 감소도 얻지 못했다. 이는 고전도율에서의 CHOP 침전이 이온 방해를 극복하기 위해 폴리아르기닌과 같은 고도로 하전된 고분자전해질을 필요로 한다는 것을 나타낸다. 수율은 시험된 모든 조건에서 90％를 초과하였다.
폴리아르기닌을 사용하여 세가지 항체 (rhuMab 2H7, 항-CD22 및 rhuMab C2B8)에 대해 용해도 곡선을 생성하였다 (도 20-25, 29-32). CHOP 침전은 고분자전해질의 pKa, 분자량 및 농도 뿐만 아니라 용액의 이온 농도의 함수이었다. 전하 밀도 및 등전점과 같은 항체 성질이 또한 항체로부터 불순물의 분리에 역할을 할 수 있다. CHOP 및 DNA와 같은 불순물은 고분자전해질 농도 및 이온 농도를 조작하여 제거된다. 관능기, 분자량, 전하 밀도 및 소수성과 같은 고분자전해질 성질은 변할 수 있다. 폴리아르기닌은 CCF에서 플록형성제로서 또는 HCCF에서 불순물 침전제로서 사용될 수 있다. 침전은 전도율에 의존한다. 10 내지 25배 CHOP 제거되었으며, DNA는 감지할 수 없었다 (표 9). 폴리아르기닌은 SPSFF의 결합 용량에 부정적인 영향을 미치지 않았으며, 음이온 고분자전해질 및 양이온 교환체 수지에 의한 항체 침전에 적합하다. 또한, HCCF에 폴리아르기닌을 첨가하는 것은, 아마도 다른 불순물과 함께 감소제를 침전시킴으로써 항체 감소를 억제시키는 것을 포함한 놀랍고도 예기치 못한 추가 이익을 갖는다.
본 발명을 예시하기 위해, 하기 실시예가 포함된다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 제한하지 않으며 단지 본 발명의 실시 방법을 제시하는 것을 의미한다고 이해될 것이다. 당업자는 기재된 예시 방법, 프로토콜, 공정, 시약 및 장치가 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 생각되는 본 발명의 별법을 실시하기 위해 용이하게 채택될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
실시예 1 단백질 A 크로마토그래피
단백질 A 컬럼은 Prosep vA 수지를 사용하며, HCCF에 존재하는 rhuMab 2H7을 정제하는데 사용되었다. 컬럼 직경은 2.5 cm이고, 층 높이는 14 cm이었다. 컬럼을 유속 40 CV/h (시간 당 컬럼 부피)로 작동시켰다. Prosep vA 컬럼를 수회 사이클 (2 사이클)로 실행하였다. 평형상태 후, HCCF를 컬럼에 적용하고, rhuMab 2H7를 컬럼 상에 보유시켰다. 이어서, 컬럼을 평형상태 완충액, 이후 세척 완충액, 그다음 다시 평형상태 완충액으로 세척하였다. 이들 세척을 완료한 후, 용리 완충액을 컬럼에 적용하였다. 280 nm에서의 흡광도 (0.5 OD)를 기준으로 풀링(pooling)을 개시하고, 2 컬럼 부피 후 종료하였다. 이후 재생 완충액을 컬럼에 적용하였다. 완충액 조성 및 상 지속기간을 하기 표 10에 나타내었다.
재조합 숙주 세포에서 유도된 수확된 세포 배양 유체 (HCCF)를, 평형상태 완충액과 동일할 수 있는 로딩 완충액을 사용하여 평형화된 고체상에 로딩할 수 있다. 오염된 제제가 고체상을 통해 흐를 때, 단백질은 고정된 단백질 A에 흡착되고, 다른 오염물 (예를 들어 차이니스 햄스터 난소 단백질 (CHOP), 단백질이 CHO 세포에서 생산됨)은 고체상에 비특이적으로 결합할 수 있다. 순차적으로 수행된 다음 단계는 중간체 세척 단계에서 고체상을 세척하여 고체상, 항체 및/또는 단백질 A에 결합된 오염물을 제거하는 것을 수반한다. 로딩 후, 중간체 세척 단계의 시작 전에 평형상태 완충액으로 고체상을 평형화시킬 수 있다. 중간체 세척 완충액은 염 및 추가 화합물을 포함할 수 있으며, 여기서 추가 화합물은 (a) 세제, 예를 들어 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; (b) 용매 (예를 들어 헥실렌 글리콜); 및 (c) 중합체 (예를 들어 PEG)이다. 사용된 염은 목적 단백질을 기준으로 선택될 수 있지만, 바람직하게는 아세테이트 (예를 들어 아세트산나트륨)이다. 조성물 내 염 및 추가 화합물의 양은 합한 양이 목적 단백질의 실질적 제거 없이 오염물(들)을 용리시키도록 하는 양이다. 이러한 세척 완충액 내 염 농도는 약 0.1 내지 약 2 M, 또는 약 0.2 M 내지 약 0.6 M일 수 있다. 유용한 세제, 예를 들어 폴리소르베이트 농도는 약 0.01 내지 약 5％, 또는 약 0.1 내지 1％, 또는 약 0.5％이다. 예시적인 용매 농도는 약 1％ 내지 40％, 또는 약 5 내지 약 25％이다. 추가 화합물이 중합체 (예를 들어 PEG 400 또는 PEG 8000)인 경우, 이의 농도는 예를 들어 약 1％ 내지 약 20％, 바람직하게는 약 5％ 내지 약 15％일 수 있다.
또다른 실시양태에서, 중간체 세척 단계는 매우 진한 완충액, 예를 들어 약 0.8 M 초과, 예를 들어 약 2 M 이하의 농도, 및 바람직하게는 약 0.8 M 내지 약 1.5 M 범위, 가장 바람직하게는 약 1 M의 완충액의 사용을 포함한다. 이 실시양태에서, 완충액은 바람직하게는 트리스 아세테이트와 같은 트리스 완충액이다. 중간체 세척 완충액의 pH는 약 4 내지 약 8, 또는 약 4.5 내지 약 5.5, 또는 약 5.0일 수 있다. 또다른 실시양태에서, pH는 약 7.0이다. 선행 문단의 중간체 세척 단계 후, 목적 단백질을 컬럼으로부터 회수한다. 이는 통상적으로 적합한 용리 완충액을 사용하여 달성된다. 단백질을 예를 들어 약 2 내지 약 5의 범위, 바람직하게는 약 2.5 내지 약 3.5 범위의 낮은 pH를 갖는 용리 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 용리시킬 수 있다. 이러한 목적을 위한 용리 완충액의 예에는 시트레이트 또는 아세테이트 완충액이 포함된다. 단백질 A의 용리 단계 동안, 임의의 비특이적으로 결합된 CHOP를 생성물 풀의 순도를 잃지 않으면서 목적 단백질과 함께 용리시킬 수 있다. 용리 단계 전 CHOP를 제거하기 위해, 예를 들어 테트라메틸암모늄 클로라이드 (TMAC)를 사용하는 중간체 세척 단계를 수행하여 CHOP를 제거할 수 있다 (US 6870034; US 6127526; US 6333398).
실시예 2 SPSFF 크로마토그래피
양이온 교환 컬럼은 SP 세파로스 패스트 플로우 (SPSFF) 수지를 구배 용리되는 용리 및 결합 방식으로 사용하였다. SPSFF 컬럼을 유속 150 cm/h로 작동시켰다. 모든 경우 층 높이는 30 cm이었다. 중간체 크로마토그래피 풀 (Prosep vA 및 QSFF 풀)을 처리하는 경우, 0.66 cm i.d. 컬럼을 사용하고, 컬럼을 40 g/L로 로딩하였다. HCCF를 처리하는 경우, 0.6 내지 2.2 cm 직경 컬럼을 사용하고, 컬럼을 10 내지 40 g/L로 로딩하였다. 모든 경우, 로드를 pH 5.0 및 전도율 약 5.5 mS/cm로 컨디셔닝하였다. 로드 후, 컬럼을 평형상태 완충액, 이어서 세척 완충액, 그다음 다시 평형상태 완충액으로 세척하였다. 이들 세척을 완료한 후, rhuMab 2H7을 15 컬럼 부피에 걸쳐 50 mM 아세테이트에서 350 mM 아세테이트의 구배로 용리시켰다. 풀링을 개시하고, 280 nm에서의 흡광도 (0.5 OD)를 기준으로 종결하였다. 컬럼을 재생시키고, 0.5 N 수산화나트륨으로 살균하고, 0.1 N 수산화나트륨 중에 저장하였다. 완충액 조성 및 상 지속기간을 하기 표 11에 나타낸다.
실시예 3 음이온 교환 크로마토그래피
음이온 교환 컬럼은 Q 세파로스 패스트 플로우 (QSFF) 수지를 사용하며, 통과 방식으로 작동하였다. QSFF 컬럼을 유속 150 cm/h로 작동시켰다. 컬럼 직경은 0.66 cm이고, 층 높이는 20 cm이었다. 컬럼을 평형화시키고, pH 8.0에서 로딩하였다. RhuMab 2H7 항체를 컬럼을 통해 유동시킨 다음, 평형상태 완충액으로 세척하였다. 풀링을 개시하고, 280 nm에서의 흡광도 (0.5 OD)를 기준으로 종결하였다. 컬럼을 재생시키고, 0.5 N 수산화나트륨으로 살균하고, 0.1 N 수산화나트륨 중에 저장하였다. 완충액 조성 및 상 지속기간을 하기 표 12에 나타낸다.
실시예 4a 음이온 고분자전해질 정제
항체 풀을 하기 표 13에 약술된 pH 및 전도율로 조정하였다. HCCF를 1 M 아세트산에 의해 pH 6으로 조정하고, WFI (관개용수)에 의해 전도율 2.0 mS/cm로 조정하였다. PVS를 컨디셔닝된 HCCF에 인라인 첨가하여 20분의 기간에 걸쳐 최종 농도 0.05％ w/v에 도달하였다. 혼합 동안, PVS를 컨디셔닝된 풀에 첨가하여 하기 표 13에 약술된 최종 농도에 도달하였다. PVS 침전된 풀을 소발(Sorval) R3-CB 원심분리기를 사용하여 30분 동안 10℃에서 4000 rpm (4657 g)으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 25 mM MOPS (pH 7.1)로 세척하였다. 펠렛을 50 mM 트리스, 50 mM 아세테이트, 및 pH 8.0 (약 6.5 mS/cm)에서 재현탁시켰다. 이후 재현탁된 펠렛을 QSFF 크로마토그래피를 통해 처리하였다.
실시예 4b 양이온 고분자전해질 정제
세포 배양 유체 (CCF) 침전: 분자량 110 kDa의 폴리아르기닌으로 불순물 침전을 수행하였다. 100 rpm으로 혼합하면서, 폴리아르기닌을 5분의 기간에 걸쳐 생물반응기 내 CCF에 첨가하여 최종 농도 0.075％ w/v에 도달하였다. 이어서, 플록형성된 CCF를 10000 g으로 원심분리하고, 0.2 μm 여과기를 통해 무균 여과하였다.
수확된 세포 배양 유체 (HCCF) 침전: 100 rpm으로 혼합하면서, 폴리아르기닌 (폴리-L-아르기닌)을 5분의 기간에 걸쳐 생물반응기 내 HCCF에 첨가하여 최종 농도 0.1％ w/v에 도달하였다. 이어서, 침전된 HCCF를 5000 g으로 원심분리하고, 0.2 μm 여과기를 통해 무균 여과하였다. 여과된 공급물을 상이한 정제 방법을 통해 처리하였다.
실시예 5 단백질 농도 측정:
풀 중 항체 농도를 10 mm 경로 길이 유동 셀 (애질런트(Agilent))이 장착된 8453 분광계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도 (광산란에 대해 보정하기 위해 320 nm에서의 흡광도가 차감됨)에 의해 측정하였다. 1.75 ml/(mg cm)의 소광 계수를 사용하였다. 하기 식을 사용하여 항체 농도를 계산하였다:
실시예 6 크기 배제 크로마토그래피
본래의 조건 하에서 rhuMAb 2H7의 크기 이종성을 모니터링하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 사용하였다. 이 분석은 TSK-GEL G3000SWXL 컬럼 (7.8 mm x 300 mm, 토소하스(Tosohaas))을 사용하여 응집물, 단량체 및 단편을 분리하였다. 컬럼을 0.20 M 인산칼륨, 0.25 M 염화칼륨, pH 6.2를 사용하여 유속 0.3 mL/분으로 작동시켜 완충액을 진행시켰다. 컬럼을 주변 온도에서 작동시켰다. 샘플을 진행하는 완충액 중에서 희석하고, 20 μg을 각각의 샘플에 대해 주입하였다. 280 nm에서의 흡광도를 사용하여 응집물, 단량체 및 단편의 양을 모니터링하였다.
실시예 7 CHOP ELISA - Y:42
염소 항-CHOP 항체를 사용하는 효소-결합 면역흡수 분석 (ELISA)을 이용하여 모든 풀에서 CHOP 농도를 측정하였다. ELISA의 경우, 친화성 정제된 염소 항-CHOP 항체를 마이크로티터 플레이트 웰 상에 고정시켰다. 풀 샘플의 희석물을 웰에서 인큐베이션하고, 이어서 퍼옥시다제-접합된 항-CHOP 항체와 함께 인큐베이션하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제 효소 활성을 o-페닐렌디아민으로 정량하여 색 신호를 생성하였다. 흡광도 판독이 분석 범위 (5-320 ng/ml) 내에 속하도록 샘플을 분석 희석액 중에서 일련으로 희석하였다.
실시예 8 단백질 A ELISA - Y:80
단백질-A의 양을 샌드위치 단백질-A ELISA에 의해 측정하였다. 치킨 항-스타필로코칼 단백질 A 항체를 마이크로티터 플레이트 웰 상에 고정시켰다. 샘플을 0.2 mg/ml 항체로 희석하고, 웰에 적용하였다. 단백질 A는 샘플에 존재하는 경우 염소 항체에 결합하였다. 결합된 단백질 A를 서양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항-단백질 항체로 검출하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제 효소 활성을 o-페닐렌디아민으로 정량하여 색 신호를 생성하였다.
실시예 9 인슐린 ELISA - Y:64
기니아 피그(guinea pig) 항-인슐린 폴리클로날 항체를 사용하는 ELISA를 이용하여 모든 풀에서 인슐린 농도를 측정하였다. ELISA의 경우, 친화성 정제된 항-인슐린 항체를 마이크로티터 플레이트 웰 상에 고정시켰다. 풀 샘플의 희석물을 웰에서 인큐베이션하고, 이어서 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 기니아 피그 항-인슐린 항체와 함께 인큐베이션하였다. 서양고추냉이 퍼옥시다제 효소 활성을 테트라메틸 벤지딘으로 정량하였다. 흡광도 판독이 분석 범위 (0.094-3.000 ng/ml) 내에 속하도록 샘플을 분석 희석액 중에서 일련으로 희석하였다.
실시예 10 젠타마이신 ELISA - Y: 81
경쟁적 ELISA를 사용하여 모든 풀에서 젠타마이신 농도를 측정하였다. 젠타마이신-BSA에 대한 염소 폴리클로날 항체를 마이크로티터 플레이트 웰 상에 고정시켰다. 젠타마이신을 바이오티닐화된-젠타마이신과 항체 결합에 대해 경쟁시켰다. 결합된 바이오틴-표지된 젠타마이신의 양을 서양고추냉이 퍼옥시다제-스트렙타비딘 및 o-페닐렌디아민 기질을 첨가하여 검출하였다. 흡광도 판독이 분석 범위 (0.37-90 ng/ml) 내에 속하도록 샘플을 분석 희석액 중에서 일련으로 희석하였다.
실시예 11 CHO DNA PCR 분석 - Y:77
DNA를 CHO DNA의 PCR 증폭에 의해 정량하였다. 샘플 및 대조군으로부터의 DNA를 먼저 키아젠(Qiagen)의 바이럴 RAN 미니 키티(Viral RNA Mini kit)를 사용하여 추출하였다. 이어서, 프라이머 및 프로브를 함유하는 PCR 마스터 혼합물과 함께 추출물 및 표준 곡선을, 시판용 서열 검출 시스템 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)) 상의 96-웰 플레이트 포맷에 로딩하여, CHO DNA를 실시간 PCR을 사용하여 정량하였다. 태크만(TaqMan)® PCR은 표적 CHO DNA 서열에 특이적으로 디자인된 프라이머 및 프로브를 사용한다. 5' 말단에 리포터 다이(reporter dye)로 표지되고 3' 말단에 켄처 다이(quencher dye)에 의해 억제되는 형광생성 프로브를 사용하여 생성물 증폭을 측정하였다. Taq 폴리머라제는 표적 DNA의 증폭을 개시하고, 프로브에 도달시 그의 5' 뉴클레아제 활성이 프로브를 대체하여 리포터 다이를 방출시킨다. 리포터 다이가 더이상 켄처 다이에 근접하지 않는 경우, 리포터가 형광을 발하고, 방출 강도의 증가를 측정하였다. DNA가 역치를 넘어 증폭하는 사이클 수 (Ct)를 표준 곡선에 대해 계산하고, 미지의 샘플 농도를 정량하였다.
실시예 12 rhuMAb 2H7 효능
rhuMAb 2H7 효능을 보체 의존성 세포독성 (CDC) 분석을 사용하여 측정하였다. 이 분석은 rhuMAb 2H7의 인간 보체 존재 하에서의 WIL2-S 세포 용해능 측정을 기준으로 한다.
실시예 13 PVS에 대한 RNase A 억제 분석
PVS는 RNase A의 잠재적 억제제이다. 분석은 한쪽 말단에 형광 라벨을 갖고 다른쪽 말단에 소광제를 갖는 RNA 유사체를 사용한다. RNA 유사체가 RNase A에 의해 절단되면, 형광 라벨은 소광체로부터 방출되어 발광한다. PVS의 존재는 RNase A 활성을 억제하여 형광 발광을 제한할 것이다. 이어서, 시험 샘플로부터 관찰된 형광을 표준 곡선에 비교하여 PVS의 양을 결정할 수 있다.
상기 설명은 단지 본 발명의 원리를 예시하는 것으로 간주된다. 또한, 다수의 변형 및 변화가 당업자에게 자명할 것이므로, 본 발명을 상기 기재된 바와 같이 나타난 정확한 구성 및 방법으로 제한하는 것은 바람직하지 않다. 따라서, 모든 적합한 변형 및 동등물은 하기 특허청구범위에 한정된 바와 같은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 간주될 수 있다.
단어 "포함하다", "포함하는"은 본 명세서 및 하기 특허청구범위에 사용되는 경우 기재된 특징, 정수, 성분 또는 단계의 존재를 특정하는 것으로 의도되지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 성분, 단계 또는 이들의 군의 존재 또는 첨가를 배제하지는 않는다.
Claims (27)
- (a) 수확된 세포 배양 유체에서 유도된 항체를 함유하는 혼합물의 산도 또는 염 농도를 조정하는 단계;(b) 폴리비닐술폰산, 폴리비닐술포네이트, 및 폴리스티렌술폰산에서 선택되며 분자량이 1.2 내지 1100 kDa인 음으로 하전된 고분자전해질을 항체 함유 혼합물에서 0.01 내지 1.0 중량/부피 ％의 농도로 첨가하여 단백질-고분자전해질 침전물을 형성하는 단계;(c) 단백질 응집물, 단백질 단편, 숙주 세포 단백질, 인슐린, 젠타마이신, DNA 및 침출된 단백질 A에서 선택되는 불순물로부터 단백질-고분자전해질 침전물을 분리하는 단계;(d) 단백질-고분자전해질 침전물을 단리하는 단계;(e) 단백질-고분자전해질 침전물을 수용액 중에 재현탁시키는 단계; 및(f) 재현탁된 단백질-고분자전해질 침전물에 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 정제된 항체로부터 고분자전해질을 분리하는 단계를 포함하는, 항체의 정제 방법.
- 제1항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 항체 단편 및 융합 단백질에서 선택된 것인 방법.
- 제2항에 있어서, 항체가 항-CD20 항체, 항-DR5 항체, 및 항-CMET 항체에서 선택된 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 항-CD20 항체가 2H7인 방법.
- 제1항에 있어서, 수확된 세포 배양 유체가 포유동물 세포 배양물에서 유도된 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 포유동물 세포 배양물이 차이니스 햄스터 난소(chinese hamster ovary) 세포 배양물인 방법.
- 제1항에 있어서, 수확된 세포 배양 유체가 미생물 발효로부터 유도된 것인 방법.
- 제7항에 있어서, 미생물 발효가 이. 콜라이(E. coli)의 발효인 방법.
- 제1항에 있어서, 항체가, 단백질 A 흡착제 상의 항체의 고정에 의해 수확된 세포 배양 유체에서 유도되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 항체가 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 수확된 세포 배양 유체에서 유도된 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 하나 초과의 음으로 하전된 고분자전해질을 혼합물에 첨가하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단백질-고분자전해질 침전물을 원심분리에 의해 단리하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단백질-고분자전해질 침전물을 여과에 의해 단리하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 단백질-고분자전해질 침전물을 심층 필터 상에서의 심층 여과에 의해 단리하는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 단백질-고분자전해질 침전물을 심층 필터를 통한 재가용화 완충액의 단일 통과 또는 심층 필터를 통한 재가용화 완충액의 재순환에 의해 재현탁시키는 것인 방법.
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| WO (1) | WO2008091740A2 (ko) |
| ZA (1) | ZA200904482B (ko) |
Families Citing this family (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7132100B2 (en) | 2002-06-14 | 2006-11-07 | Medimmune, Inc. | Stabilized liquid anti-RSV antibody formulations |
| FR2902799B1 (fr) | 2006-06-27 | 2012-10-26 | Millipore Corp | Procede et unite de preparation d'un echantillon pour l'analyse microbiologique d'un liquide |
| AU2007272494B2 (en) | 2006-07-14 | 2011-07-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Adsorptive membranes for trapping viruses |
| US8362217B2 (en) | 2006-12-21 | 2013-01-29 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| US8163886B2 (en) | 2006-12-21 | 2012-04-24 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| US8569464B2 (en) | 2006-12-21 | 2013-10-29 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| WO2009151514A1 (en) | 2008-06-11 | 2009-12-17 | Millipore Corporation | Stirred tank bioreactor |
| US8592555B2 (en) | 2008-08-11 | 2013-11-26 | Emd Millipore Corporation | Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity |
| US20110144311A1 (en) * | 2008-08-14 | 2011-06-16 | Rebecca Chmielowski | Methods for purifying antibodies using protein a affinity chromatography |
| JP5626526B2 (ja) * | 2008-09-25 | 2014-11-19 | Jsr株式会社 | アフィニティークロマトグラフィー用充填剤 |
| GB0818228D0 (en) * | 2008-10-06 | 2008-11-12 | Avecia Biolog Ltd | Purification process |
| CN105037535A (zh) | 2008-12-16 | 2015-11-11 | Emd密理博公司 | 搅拌槽反应器及方法 |
| BRPI0923541A2 (pt) | 2008-12-22 | 2016-01-26 | Hoffmann La Roche | purificação de imunoglobulina |
| SG195555A1 (en) | 2008-12-24 | 2013-12-30 | Emd Millipore Corp | Caustic stable chromatography ligands |
| AU2010205007A1 (en) * | 2009-01-13 | 2011-07-07 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Precipitation of biomolecules with negatively charged polymers |
| WO2011028753A1 (en) | 2009-09-01 | 2011-03-10 | Genentech, Inc. | Enhanced protein purification through a modified protein a elution |
| SG10201407983VA (en) | 2009-12-18 | 2015-01-29 | Csl Ltd | Method of purifying polypeptides |
| US8377672B2 (en) | 2010-02-18 | 2013-02-19 | 3M Innovative Properties Company | Ligand functionalized polymers |
| EP2889625B1 (en) | 2010-03-03 | 2016-09-14 | 3M Innovative Properties Company | Ligand guanidinyl functionalized polymers |
| EP3597671B1 (en) | 2010-05-17 | 2022-09-21 | EMD Millipore Corporation | Stimulus responsive polymers for the purification of biomolecules |
| US20130289247A1 (en) * | 2010-11-01 | 2013-10-31 | Dsm Ip Assets B.V. | Single unit ion exchange chromatography antibody purification |
| CN107915769A (zh) * | 2011-03-29 | 2018-04-17 | 葛兰素史密斯克莱有限责任公司 | 用于蛋白纯化的缓冲液体系 |
| IL212911A0 (en) | 2011-05-16 | 2011-07-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Immunoglobulin reduced in thrombogenic contaminants and preparation thereof |
| SG10201604554WA (en) | 2011-06-08 | 2016-07-28 | Emd Millipore Corp | Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands |
| US9534037B2 (en) | 2011-08-02 | 2017-01-03 | Baxalta GmbH | Systems and methods to increase protein yield from recombinant manufacturing processes |
| CN103732253A (zh) * | 2011-08-19 | 2014-04-16 | Emd密理博公司 | 小分子在纯化生物分子的方法中的用途 |
| EP2578286A1 (en) | 2011-10-04 | 2013-04-10 | Merck Patent GmbH | Method and apparatus for chromatographic purification |
| EP2656892A1 (en) | 2012-04-23 | 2013-10-30 | Merck Patent GmbH | Chromatography method |
| EP2855504B1 (en) * | 2012-05-31 | 2018-10-24 | Agency For Science, Technology And Research | Chromatographic purification of immunoglobulin g preparations with particles having multimodal functionalities |
| SG11201407801VA (en) | 2012-05-31 | 2014-12-30 | Agency Science Tech & Res | Methods for use of mixed multifunctional surfaces for reducing aggregate content in protein preparations |
| EP2855502B1 (en) | 2012-05-31 | 2019-06-26 | Agency For Science, Technology And Research | Methods for reducing levels of protein-contaminant complexes and aggregates in protein preparations by treatment with electropositive organic additives |
| WO2014003137A1 (ja) * | 2012-06-27 | 2014-01-03 | 旭化成メディカル株式会社 | 高アフィニティー抗体、及びその製造方法 |
| EP2682168A1 (en) | 2012-07-02 | 2014-01-08 | Millipore Corporation | Purification of biological molecules |
| PT2890710T (pt) * | 2012-08-28 | 2017-11-14 | Novartis Ag | Métodos para purificação de anticorpos usando álcoois alifáticos |
| WO2014071344A2 (en) * | 2012-11-05 | 2014-05-08 | Medimmune, Llc | Method of isolating synagis® in the absence of benzonase |
| ES2721155T3 (es) * | 2012-12-20 | 2019-07-29 | Merck Patent Gmbh | Copolímeros para precipitación de proteínas |
| KR20150115745A (ko) | 2013-02-06 | 2015-10-14 | 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 | 단백질 제제로부터 응집체 함량을 감소시키는 방법 |
| EP2961759A4 (en) * | 2013-02-26 | 2016-09-28 | Agency Science Tech & Res | PROTEIN CLEANING IN THE PRESENCE OF NON-ORGANIC POLYMERS AND ELECTROPOSITIVE SURFACES |
| US9850512B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-12-26 | The Research Foundation For The State University Of New York | Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield |
| PL3022301T3 (pl) | 2013-07-18 | 2018-12-31 | Chr. Hansen A/S | Kompozycja ścinającego mleko enzymu proteazy asparaginowej |
| AU2014310479B2 (en) | 2013-08-23 | 2020-01-30 | Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg | Novel adsorbent composition and use thereof |
| KR20160050062A (ko) * | 2013-09-05 | 2016-05-10 | 제넨테크, 인크. | 크로마토그래피 재사용 방법 |
| RU2733495C2 (ru) * | 2013-09-24 | 2020-10-02 | Аллерган Фармасьютикалз Интернэшнл Лимитед | Способ экстракции белка |
| GB201318840D0 (en) * | 2013-10-24 | 2013-12-11 | Univ Leeds | Method and device for protein preparation |
| US20160298072A1 (en) * | 2013-11-20 | 2016-10-13 | Cmc Biologics A/S | A bioreactor system and method for producing a biopol ymer |
| ES2864721T3 (es) | 2014-02-07 | 2021-10-14 | Cmc Biologics As | Disposición y proceso continuo de un biorreactor para la producción y captura de un biopolímero |
| US9951363B2 (en) | 2014-03-14 | 2018-04-24 | The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry | Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects |
| NZ724826A (en) | 2014-04-16 | 2022-07-29 | Cmc Biologics As | A high cell density fill and draw fermentation process |
| SI3215614T1 (sl) | 2014-11-03 | 2019-11-29 | Merck Patent Gmbh | Topni fuzijski proteini inteina in postopki za čiščenje biomolekul |
| SI3265557T1 (sl) * | 2015-03-06 | 2020-02-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Ultraprečiščena DsbA in DsbC ter postopki njune izdelave in uporabe |
| JP6823596B2 (ja) | 2015-07-31 | 2021-02-03 | 中外製薬株式会社 | アニオン性ポリマーによる抗体を含有する組成物の精製方法 |
| SG11202005235WA (en) * | 2018-01-31 | 2020-07-29 | Regeneron Pharma | System and method for characterizing size and charge variant drug product impurities |
| EP3816177A4 (en) * | 2018-06-29 | 2021-12-01 | Mitsubishi Chemical Corporation | POLYPEPTIDE ISOLATION PROCESS, POLYPEPTIDE PRODUCTION PROCESS AND POLYPEPTIDE PURIFICATION APPARATUS |
| JP6564539B1 (ja) * | 2018-09-14 | 2019-08-21 | 長瀬産業株式会社 | スルホン酸化合物によるペプチド精製方法 |
| HU231498B1 (hu) | 2019-04-04 | 2024-05-28 | Richter Gedeon Nyrt | Immunglobulinok affinitás kromatográfiájának fejlesztése kötést megelõzõ flokkulálás alkalmazásával |
| TW202112799A (zh) * | 2019-06-05 | 2021-04-01 | 美商建南德克公司 | 過載層析管柱之再生方法 |
| KR102612555B1 (ko) * | 2020-12-18 | 2023-12-11 | 한국세라믹기술원 | 항체결합단백질 및 칼시퀘스트린 융합단백질을 이용한 면역침강 방법 |
| WO2023068999A1 (en) * | 2021-10-21 | 2023-04-27 | Nyctea Technology Ab | Device for separating an analyte from other components in an electrolytic solution |
| CN114574457A (zh) * | 2022-01-25 | 2022-06-03 | 华东理工大学 | 一种快速分离纯化蛋白质的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004092393A1 (en) * | 2003-01-09 | 2004-10-28 | Genentech, Inc. | Purification of polypeptides |
Family Cites Families (91)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3252961A (en) | 1961-04-03 | 1966-05-24 | Foremost Dairies Inc | Whey process and product |
| US3737377A (en) * | 1971-01-27 | 1973-06-05 | Miles Lab | Purification of lactase |
| US4055469A (en) | 1976-12-10 | 1977-10-25 | Eastman Kodak Company | Purification of microbial enzyme extracts using synthetic polyelectrolytes |
| USRE30985E (en) | 1978-01-01 | 1982-06-29 | Serum-free cell culture media | |
| GB2036891B (en) | 1978-12-05 | 1983-05-05 | Windsor Smith C | Change speed gear |
| US4515893A (en) | 1979-04-26 | 1985-05-07 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Hybrid cell line for producing complement-fixing monoclonal antibody to human T cells |
| ES521370A0 (es) | 1982-04-12 | 1985-04-16 | Hybritech Inc | Un procedimiento para obtener un polidoma. |
| US4560655A (en) | 1982-12-16 | 1985-12-24 | Immunex Corporation | Serum-free cell culture medium and process for making same |
| US4657866A (en) | 1982-12-21 | 1987-04-14 | Sudhir Kumar | Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media |
| GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| DD266710A3 (de) | 1983-06-06 | 1989-04-12 | Ve Forschungszentrum Biotechnologie | Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase |
| US4767704A (en) | 1983-10-07 | 1988-08-30 | Columbia University In The City Of New York | Protein-free culture medium |
| US4533496A (en) * | 1984-05-08 | 1985-08-06 | Monsanto Company | Method of isolating monoclonal antibodies from hybridoma cultures |
| US5672347A (en) | 1984-07-05 | 1997-09-30 | Genentech, Inc. | Tumor necrosis factor antagonists and their use |
| JPS6147500A (ja) | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
| GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
| US4879231A (en) | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
| JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
| GB8516415D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Celltech Ltd | Culture of animal cells |
| CA1282069C (en) | 1985-09-12 | 1991-03-26 | Damon L. Meyer | Antibody complexes of hapten-modified diagnostic or therapeutic agents |
| JPS63501765A (ja) | 1985-11-01 | 1988-07-21 | インタ−ナショナル、ジェネティック、エンジニアリング インコ−ポレ−テッド | 抗体遺伝子のモジュ−ル組立体、それにより産生された抗体及び用途 |
| US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| US4927762A (en) | 1986-04-01 | 1990-05-22 | Cell Enterprises, Inc. | Cell culture medium with antioxidant |
| GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
| US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| IL85035A0 (en) | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
| US5091313A (en) | 1988-08-05 | 1992-02-25 | Tanox Biosystems, Inc. | Antigenic epitopes of IgE present on B cell but not basophil surface |
| US5720937A (en) | 1988-01-12 | 1998-02-24 | Genentech, Inc. | In vivo tumor detection assay |
| EP0420937B1 (en) | 1988-06-21 | 1994-11-09 | Genentech, Inc. | Therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction |
| EP0435911B1 (en) | 1988-09-23 | 1996-03-13 | Cetus Oncology Corporation | Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression |
| US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| EP0402226A1 (en) | 1989-06-06 | 1990-12-12 | Institut National De La Recherche Agronomique | Transformation vectors for yeast yarrowia |
| US5545806A (en) | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| US5625126A (en) | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| US5661016A (en) | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
| DK0546073T3 (da) | 1990-08-29 | 1998-02-02 | Genpharm Int | Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer |
| US5633425A (en) | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US5122469A (en) | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
| ES2193136T3 (es) | 1991-08-14 | 2003-11-01 | Genentech Inc | Variantes de inmunoglubina para receptores especificos de fc epsilon. |
| WO1993008829A1 (en) | 1991-11-04 | 1993-05-13 | The Regents Of The University Of California | Compositions that mediate killing of hiv-infected cells |
| US5525519A (en) * | 1992-01-07 | 1996-06-11 | Middlesex Sciences, Inc. | Method for isolating biomolecules from a biological sample with linear polymers |
| CA2140280A1 (en) | 1992-08-17 | 1994-03-03 | Avi J. Ashkenazi | Bispecific immunoadhesins |
| MX9305070A (es) | 1992-08-21 | 1994-04-29 | Genentech Inc | Compocicion farmaceutica que contiene un antagonista de lfa-1 para el tratamiento de transtornos o desordenes mediados por el lfa-1 |
| US5736137A (en) | 1992-11-13 | 1998-04-07 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma |
| US5595721A (en) | 1993-09-16 | 1997-01-21 | Coulter Pharmaceutical, Inc. | Radioimmunotherapy of lymphoma using anti-CD20 |
| ATE157455T1 (de) | 1993-12-10 | 1997-09-15 | Genentech Inc | Methoden zur diagnose von allergie und prüfung anti-allergischer therapeutika |
| EP0739214B1 (en) | 1994-01-18 | 1998-03-18 | Genentech, Inc. | A METHOD OF TREATMENT OF PARASITIC INFECTION USING IgE ANTAGONISTS |
| EP0749488A1 (en) | 1994-03-03 | 1996-12-27 | Genentech, Inc. | Anti-il-8 monoclonal antibodies for treatment of inflammatory disorders |
| US5922531A (en) | 1994-06-21 | 1999-07-13 | Advanced Research And Technology | Polyelectrolyte treated glass for enzyme immobilization and protein purification |
| AU3272695A (en) | 1994-08-12 | 1996-03-07 | Immunomedics Inc. | Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells |
| DE69535433T2 (de) * | 1994-09-21 | 2007-06-28 | Kanegafuchi Kagaku Kogyo K.K. | Verwendung eines Adsorptionsmittels für Interleukine, Verfahren zu deren Entfernung |
| IL117645A (en) | 1995-03-30 | 2005-08-31 | Genentech Inc | Vascular endothelial cell growth factor antagonists for use as medicaments in the treatment of age-related macular degeneration |
| US5641870A (en) * | 1995-04-20 | 1997-06-24 | Genentech, Inc. | Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification |
| AU6267896A (en) | 1995-06-07 | 1996-12-30 | Imclone Systems Incorporated | Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth oftumors |
| DK0877626T3 (da) | 1996-01-23 | 2002-12-30 | Univ Vermont | Anti-CD18 antistoffer til anvendelse mod slagtilfælde |
| US7147851B1 (en) | 1996-08-15 | 2006-12-12 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin |
| PT950067E (pt) | 1996-11-27 | 2007-12-06 | Genentech Inc | Purificação por afinidade de um polipéptido numa matriz de proteína a. |
| DK1516629T3 (da) | 1996-11-27 | 2013-06-03 | Genentech Inc | Humaniseret anti-CD-11a antibodies |
| US6872568B1 (en) | 1997-03-17 | 2005-03-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Death domain containing receptor 5 antibodies |
| AU743758B2 (en) | 1997-04-07 | 2002-02-07 | Genentech Inc. | Anti-VEGF antibodies |
| ES2293682T5 (es) | 1997-05-15 | 2011-11-17 | Genentech, Inc. | Anticuerpo anti-apo2. |
| US6265542B1 (en) | 1997-10-24 | 2001-07-24 | Genentech, Inc. | Purification of molecules |
| US6087448A (en) | 1997-11-19 | 2000-07-11 | Amcol International Corporation | Solid superabsorbent material containing a poly(vinylguanidine) and an acidic water-absorbing resin |
| US6489447B1 (en) | 1998-05-06 | 2002-12-03 | Genentech, Inc. | Protein purification |
| US6217926B1 (en) * | 1998-06-30 | 2001-04-17 | Michael Foods, Inc. | Aqueous extraction process to selectively remove phospholipid from egg yolks |
| US6307013B1 (en) | 1998-07-21 | 2001-10-23 | Monsanto Technology Llc | Clarification of protein precipitate suspensions using anionic polymeric flocculants |
| US6946129B1 (en) | 1999-06-08 | 2005-09-20 | Seattle Genetics, Inc. | Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof |
| BR0015224A (pt) | 1999-10-29 | 2002-07-09 | Genentech Inc | Anticorpo anti-antìgeno de célula estaminal prostática (psca) isolado, anticorpo monoclonal anti-psca, ácido nucleico isolado, vetor de expressão, célula, célula hospedeira, método de produção de anticorpo, composição método in vitro para matar uma célula cancerosa que expresse psca, uso de uma anticorpo monoclonal anti-psca e artigo industrializado |
| US20030133939A1 (en) | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US7321026B2 (en) | 2001-06-27 | 2008-01-22 | Skytech Technology Limited | Framework-patched immunoglobulins |
| EP1444249B1 (en) | 2001-11-16 | 2008-12-10 | Norgen Biotek Corporation | Method of protein purification |
| US20040093621A1 (en) | 2001-12-25 | 2004-05-13 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd | Antibody composition which specifically binds to CD20 |
| US6870034B2 (en) | 2002-02-05 | 2005-03-22 | Genentech, Inc. | Protein purification |
| CA2476166C (en) | 2002-02-14 | 2011-11-15 | Immunomedics, Inc. | Anti-cd20 antibodies and fusion proteins thereof and methods of use |
| WO2004014942A1 (en) | 2002-08-09 | 2004-02-19 | Selborne Biological Services (Australia) Pty Limited | A method for preparing lipoprotein from a blood source |
| ES2744275T3 (es) | 2002-10-17 | 2020-02-24 | Genmab As | Anticuerpos monoclonales humanos contra CD20 para su uso en el tratamiento de esclerosis múltiple |
| SI1572744T1 (sl) | 2002-12-16 | 2010-09-30 | Genentech Inc | Imunoglobulinske variante in njihove uporabe |
| US20040121339A1 (en) * | 2002-12-19 | 2004-06-24 | Jizhong Zhou | Special film-coated substrate for bio-microarray fabrication and use thereof |
| AU2004252067B2 (en) | 2003-05-09 | 2012-04-12 | Duke University | CD20-specific antibodies and methods of employing same |
| AR044388A1 (es) | 2003-05-20 | 2005-09-07 | Applied Molecular Evolution | Moleculas de union a cd20 |
| AU2004265253B2 (en) | 2003-07-28 | 2011-09-01 | Genentech, Inc. | Reducing protein A leaching during protein A affinity chromatography |
| WO2005014618A2 (en) | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Immunomedics, Inc. | Bispecific antibodies for inducing apoptosis of tumor and diseased cells |
| US8147832B2 (en) | 2003-08-14 | 2012-04-03 | Merck Patent Gmbh | CD20-binding polypeptide compositions and methods |
| TR201809892T4 (tr) | 2003-11-05 | 2018-07-23 | Roche Glycart Ag | Fc reseptörüne bağlanma afinitesi ve artırılmış efektör fonksiyonu bulunan antijen bağlayan moleküller. |
| US20050147581A1 (en) * | 2003-11-19 | 2005-07-07 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Macromolecular drug complexes having improved stability and therapeutic use of the same |
| US20080089892A1 (en) | 2004-01-12 | 2008-04-17 | Eli Lilly And Co. | Fc Region Variants |
| US7850962B2 (en) | 2004-04-20 | 2010-12-14 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against CD20 |
| US7673757B2 (en) | 2006-02-17 | 2010-03-09 | Millipore Corporation | Adsorbent filter media for removal of biological contaminants in process liquids |
| US8163886B2 (en) * | 2006-12-21 | 2012-04-24 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
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-
2010
- 2010-03-16 HK HK10102711.2A patent/HK1135920A1/xx unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004092393A1 (en) * | 2003-01-09 | 2004-10-28 | Genentech, Inc. | Purification of polypeptides |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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