JP6823596B2 - アニオン性ポリマーによる抗体を含有する組成物の精製方法 - Google Patents

Description

本発明はアニオン性ポリマーによる、抗体を含有する組成物の精製方法、抗体を含有する組成物の製造方法、医薬組成物の製造方法、および抗体を含有する組成物に関する。

遺伝子組換え技術の発達によって、種々のタンパク質製剤が安定した供給量で提供されるようになった。特に、近年通常の医薬品に比べて選択性の高い様々な抗体医薬品が遺伝子組換え技術によって開発されており、臨床試験に入っている。

このような遺伝子組換え技術によって産生された生理活性タンパク質を含有する製剤においては、宿主細胞由来のタンパク質（Host cell proteins、以下「ＨＣＰ」。）やＤＮＡ、精製原材料の一つである樹脂リガンド断片、目的タンパク質由来の会合体や断片などの不純物を除去する必要がある。現在、バイオ医薬品におけるＤＮＡの許容量は１０ｎｇ／一投与量以下であることが、世界保健機構（ＷＨＯ）により示されている。この基準を満たすために、一般には、宿主細胞から得られる生理活性タンパク質を含有する水性培地をアフィニティクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーもしくはこれらの組合せで処理することにより不純物を除去している。また、近年は新たな精製リガンドの開発が進み、イオン交換作用に加えて疎水性相互作用の両作用を有するマルチモードクロマトグラフィーも精製に用いられるようになった。

特に、生理活性タンパク質が哺乳動物細胞を宿主として得られる抗体であるときには、プロテインＡもしくはプロテインＧがＩｇＧのＦｃ鎖に結合する性質を利用して、プロテインＡもしくはプロテインＧのアフィニティカラムクロマトグラフィーによる処理を行った後に種々のクロマトグラフィーで抗体を精製している。
例えば、特表平５−５０４５７９号（特許文献１）では、哺乳動物細胞培養から得られた抗体含有水性培地をプロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィーに適用して抗体をカラムに吸収させ、次いで酸性溶液（濃度約０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ３．０−３．５）を用いて抗体を溶出させ、得られる酸性溶出液をイオン交換カラムクロマトグラフィー、サイズ排除カラムクロマトグラフィーに順次適用して精製している。

一方、これらのカラム技術を使った抗体精製は、コストがかかること、設備が大規模となること、またカラムサイズに処理量の上限があるため抗体精製のボトルネックとなること、などの問題があった。特にプロテインＡもしくはプロテインＧカラムクロマトグラフィーのようなアフィニティカラムクロマトグラフィーは、抗体精製に要する費用の大きな部分を占めており、コスト削減の観点から課題となっていた。

近年、これら従来のカラム技術に代わる手法として、沈殿技術を使った抗体精製が注目されている。沈殿技術は溶液の組成を変化させるだけの比較的簡易なタンパク質の精製技術であるため、低コストかつハイキャパシティーな精製工程を実現し得るものとして期待される。
沈殿技術を使った抗体精製としては、例えばＷＯ２００８／０９１７４０（特許文献２）がある。この文献では、抗体培養溶液にアニオン性ポリマーを加えて抗体を沈殿させた後に、この抗体をフィルターで回収することにより不純物を除去する方法が記載されている。また別の態様として、カチオン性ポリマーを加えて不純物を沈殿させた後に、この不純物を分離して除去する方法が記載されている。
別の例として、Ｙｕｎ Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ（非特許文献１）に記載の方法もある。この文献では、カチオン性ポリマーを用いて抗体溶液中の不純物を沈殿させて除去する方法が記載されている。

特表平５−５０４５７９号 ＷＯ２００８／０９１７４０

Biotechnology and Bioengineering 110(11), P2928, 2013

上述の特許文献２のように、沈殿技術を使って抗体自体を沈殿させる方法では、十分なＨＣＰやＤＮＡの除去能を達成できないという問題がある。さらに、多量の沈殿物としての抗体を分離回収しなければならないため、フィルターによる回収が困難であるという問題がある。また特許文献２又は非特許文献１のように、カチオン性ポリマーを使って不純物を沈殿させる方法では、不純物の除去率が必ずしも十分ではない。また、カチオン性ポリマーを用いた不純物沈殿技術を等電点（以下「ｐＩ」という）の低い抗体に適用した例は、いまだ報告されていない。これは、ｐＩの低い抗体はカチオン性ポリマーによって沈殿され易く、高い収率と不純物除去能を両立できないためであると考えられる。
したがって、従来のカラムクロマトグラフィー、特にプロテインＡカラムクロマトグラフィーまたはプロテインＧカラムクロマトグラフィーの代替となり、かつ比較的簡易な手法で高い不純物除去能を達成できる抗体の精製方法が期待される。
本発明の目的は、沈殿技術を用いた新しい抗体の精製方法を提供することである。

上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは、抗体の精製工程で抗体を含有する組成物を所定のｐＨに調整し、アニオン性ポリマーを用いて不純物を沈殿させて除去することにより、ＨＣＰとＤＮＡの両方において高い除去能を達成できることを見出した。驚くべきことに、マイナスに帯電したアニオン性ポリマーによって、マイナスに帯電したＤＮＡを沈殿させて除去することが可能であることが明らかとなった。通常、抗体のｐＩ未満のｐＨに調整した溶液中では、抗体がプラスの電荷を帯びることから、アニオン性ポリマーを添加すると電荷の中和により抗体自身が沈殿することが予想される。しかしながら、本発明者らは、抗体のｐＩ未満のｐＨに調整した場合でも抗体を沈殿させることなく、抗体を含有する組成物からアニオン性ポリマーによって不純物（ＨＣＰとＤＮＡ）を沈殿させて除去することが可能であることを見出した。

すなわち、本発明は以下〔１〕〜〔２１〕を提供する。
〔１〕
抗体を含有する組成物の精製方法であって、
(a)抗体を含有する組成物を、抗体のｐＩ未満のｐＨにおいてアニオン性ポリマーを含む状態に調整する工程、および
(b)前記組成物から、前記アニオン性ポリマーにより不溶化された不純物を除去する工程、を含む方法。
〔２〕
工程(a)が、抗体のｐＩ−１以下のｐＨにおいてアニオン性ポリマーを含む状態に調整する工程である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
工程(a)が、３．５〜抗体のｐＩ未満のｐＨにおいてアニオン性ポリマーを含む状態に調整する工程である、〔１〕に記載の方法。
〔４〕
工程(a)が、３．５〜抗体のｐＩ−１以下のｐＨにおいてアニオン性ポリマーを含む状態に調整する工程である、〔１〕に記載の方法。
〔５〕
抗体を含有する組成物の精製方法であって、
(a)抗体を含有する組成物を、３．５〜５．０のｐＨにおいてアニオン性ポリマーを含む状態に調整する工程、および
(b)前記組成物から、前記アニオン性ポリマーにより不溶化された不純物を除去する工程、を含む方法。
〔６〕
工程(a)が、３．８〜５．０のｐＨにおいてアニオン性ポリマーを含む状態に調整する工程である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕
前記抗体のｐＩが３．０〜８．０である、〔１〕乃至〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕
前記抗体のｐＩが５．０〜７．０である、〔１〕乃至〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕
前記アニオン性ポリマーがポリビニルスルホン酸（ＰＶＳ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、又はポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ）である、〔１〕乃至〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕
工程(b)が、アニオン性ポリマーにより不溶化された不純物をフィルターにより除去する工程である、〔１〕乃至〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕
前記抗体がＣＨＯ細胞で産生されたものである、〔１〕乃至〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕
前記抗体がモノクローナル抗体であり、かつヒト化抗体またはヒト抗体である、〔１〕乃至〔１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕
前記抗体が、抗組織因子抗体、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、HM1.24抗原モノクローナル抗体、抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗PTHrP抗体）、抗グリピカン-3 抗体、抗ガングリオシドGM3抗体、抗TPO受容体アゴニスト抗体、凝固第VIII因子機能代替抗体、抗IL-31レセプター抗体、抗HLA抗体、抗AXL抗体、抗CXCR4抗体、抗NR10抗体、またはファクターIX若しくはファクターIXAとファクターXとのBi-specific抗体である、〔１２〕に記載の方法。
〔１４〕
前記不純物が宿主細胞由来のタンパク質（ＨＣＰ）および／またはＤＮＡである、〔１〕乃至〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕
〔１〕乃至〔１４〕のいずれかに記載の方法を用いて抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）から不純物を除去する方法。
〔１６〕
前記アニオン性ポリマーがポリビニルスルホン酸（ＰＶＳ）であり、
前記工程(a)が、抗体に対する質量比で０．０１〜０．１のポリビニルスルホン酸（ＰＶＳ）を含む状態に調整する工程である、〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕
〔１〕乃至〔１４〕のいずれかに記載の方法を用いてプロテインＡ溶出画分またはプロテインＧ溶出画分から不純物を除去する方法であって、前記プロテインＡ溶出画分またはプロテインＧ溶出画分は、抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）のプロテインＡカラムクロマトグラフィーおよび／またはプロテインＧカラムクロマトグラフィーによる精製処理物である、方法。
〔１８〕
更に陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィーのいずれか１つ又はこれらの組合せによる精製を行う工程を含む、〔１５〕乃至〔１７〕のいずれかに記載の方法。
〔１９〕
〔１〕乃至〔１６〕のいずれかに記載の方法により不純物を除去する工程を含み、
プロテインＡカラムクロマトグラフィーおよび／またはプロテインＧカラムクロマトグラフィーによる精製工程を含まない、
抗体に対する不純物が質量比で０．２以下に低減されている、抗体を含有する組成物を製造する方法。
〔２０〕
〔１９〕に記載の方法により抗体を含有する組成物を製造する工程と、
当該組成物を医薬的に許容される担体および/または添加剤と混合して製剤化する工程とを含む、医薬組成物を製造する方法。
〔２１〕
〔１〕乃至〔１６〕のいずれかに記載の方法によって製造され、
ｐＩが５．０〜７．０の抗体を含有し、
抗体に対する不純物の含有割合が質量比で０．２以下であり、
不純物としてプロテインＡおよび／またはプロテインＧを含まない、
抗体を含有する組成物。

本発明により、従来のカラムクロマトグラフィーの代替となり得る新規な抗体の精製方法が提供された。

各ｐＨにおける抗体の収率を示すグラフである。縦軸のC/C₀はアニオン性ポリマーを用いて沈殿による不純物の除去を行う前後のMab1の割合を表す。 各精製プロセスにおけるＨＣＰとＤＮＡの除去結果を示すグラフである(PVS：0.01)。 PVSによる不純物の沈殿におけるPVS濃度の最適化の検討結果を示すグラフである。 各ｐＨにおける抗体の収率を示すグラフである。 本発明を使った抗体の精製プロセスを示すフローチャートである。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、抗体を含有する組成物からアニオン性ポリマーを用いて不純物を除去する方法に関する。具体的には本発明は、抗体を含有する組成物の精製方法であって、
(a)抗体を含有する組成物を、抗体のｐＩ未満のｐＨにおいてアニオン性ポリマーを含む状態に調整する工程、および
(b)前記組成物から、前記アニオン性ポリマーにより不溶化された不純物を除去する工程、を含む方法に関する。

工程（a）において、抗体のｐＩ未満のｐＨでアニオン性ポリマーを含む状態とするためには、例えば室温において、抗体を含有する溶液を所望のｐＨに調整した後、アニオン性ポリマーを添加した後に撹拌し、組成物内でのアニオン性ポリマーをほぼ均一となるように調整することにより達成される。組成物の撹拌には例えばスターラーバーを用い、一定時間撹拌することが挙げられるがこれに限定されない。撹拌する時間としては、例えば5分〜1時間、好ましくは15分〜30分が挙げられるがこれらに限定されない。またｐＨの調整は、組成物にアニオン性ポリマーを添加した後に行うこともでき、更にアニオン性ポリマー添加の前後の両方で行うこともできる。特にアニオン性ポリマーを比較的多量加える場合は、アニオン性ポリマーの添加の前後におけるｐＨが変化する可能性がある。このような場合には、添加の前後の両方においてｐＨの調整および撹拌を行うことが有効である。

したがってより詳細な一例として、工程(a)は以下の工程(a1)‐(a3)を含むことができる。
(a1) 抗体を含有する組成物を、抗体のｐＩ未満のｐＨに調整する工程
(a2) 前記組成物へアニオン性ポリマーを添加する工程
(a3) 前記組成物を撹拌し、当該組成物内のアニオン性ポリマーをほぼ均一にする工程。
本発明においては、組成物内のアニオン性ポリマーが完全に均一であることまでは要求されない。本発明において「ほぼ均一」とは、アニオン性ポリマーにより不純物が不溶化されるのに十分な程度に均一性が確保された状態を意味する。
また本発明においては、「添加」は「混合」と言い換えることもできる。したがって本発明においては、アニオン性ポリマーを含む抗体含有溶液の調製を、抗体含有溶液とアニオン性ポリマーを混合することにより行うこともできる。

また抗体を含有する組成物のｐＨの調整、特に酸性条件に調整する方法としては、塩酸、クエン酸、リン酸、酢酸など公知の酸を、添加する方法が挙げられる。同様に組成物をアルカリ性条件に調整する方法としても、公知の塩基を添加することが挙げられる。以上、工程(a)を実施するための手法は無数にあるが、抗体を含有する組成物内においてアニオン性ポリマーが目的のｐＨに調整される限りにおいて、特にこれらの手法は限定されない。

本発明において、アニオン性ポリマーを含む状態とする際の組成物のｐＨは、抗体のｐＩ未満の値に調整される。例えば、抗体のｐＩとの差が、3以下（例えば3.0、2.9、2.8、2.7、2.6、2.5、2.4、2.3、2.2、2.1以下）、2以下（例えば2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1以下）、1以下（例えば1.0、0.9．0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1以下）であって、抗体のｐＩよりも小さい値が挙げられるがこれらに限定されない。
また後述のように、好ましくはｐＨはｐＩ−１以下の値、または３．５〜抗体のｐＩ未満の値に調整することができ、更に好ましくは３．５〜抗体のｐＩ−１以下の値に調整することができる。また、ｐＨは３．５〜５．０、より好ましくは３．８〜５．０の値に調整することができる。本発明において「ｐＩ−１」以下の値とは、好ましくは「ｐＩと同じ値とそれよりも１小さい値の範囲にある値」以下の値、より好ましくは「ｐＩよりも１小さい値」以下の値をいう。

本発明においては、アニオン性ポリマーは、単独もしくは組成物または溶液の形態で使用することができる。本発明で用いるアニオン性ポリマーとしては、例えばポリビニルスルホン酸（Polyvinylsulfonic acid、以下「PVS」。）、ポリアクリル酸（Polyacrylic acid、以下「ＰＡＡ」。）、ポリスチレンスルホン酸（Polystyrenesulfonic acid、以下「ＰＳＳ」。）、又はこれらの混合物もしくは組み合わせが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
アニオン性ポリマーとしてＰＶＳを使用する場合、その重合度、分子量、直鎖状であるか分岐状であるかの構造は問わない。これらのアニオン性ポリマーの合成方法は、当業者に周知である。あるいは、これらのアニオン性ポリマーは、供給者を通して入手することもできる。

本発明においては、抗体を含有する組成物と混合されるアニオン性ポリマーの量は、抗体の質量とアニオン性ポリマーの質量の比(g_polymer/g_antibody)で表すことができる。例えば、ＰＶＳを用いて抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）中の不純物を沈殿させる場合、質量比で０．０１〜０．１とすることができる。

また本発明において、上記工程(b)のアニオン性ポリマーにより不溶化された不純物の除去は、例えばPolyethersulfone(以下、「PES」)等のフィルターを使用し、当業者に周知の方法でろ過することにより行うことができる。沈殿量が多い場合は、Grassfiber filterを用いることもできる。あるいは、製造等のスケールが大きい場合は、Depth filterを使用することもできる。Depth filterの材質としては、ガラス繊維、セルロース、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）等を挙げることができるが、これらに限定されない。あるいは本発明においては、フィルター除去の方法に代えて、遠心分離による方法を用いることができる。本発明においては、アニオン性ポリマーにより不溶化された不純物を除去した後、抗体を回収する工程を含むことができる。

本発明で除去される不純物は、目的の抗体以外の物質であれば、いかなる物質でもよい。不純物の例としては、HCPやDNA、プロテインＡカラムクロマトグラフィーからの溶出物、目的タンパク質由来の会合体や断片、ウィルス、エンドトキシン、培地成分であるタンパク質加水分解物、IGF、インスリン、抗生物質、消泡剤などを挙げることができるがこれらに限定されない。本発明の実施例では特に、ＣＨＯ宿主細胞により産生された抗体を含有する組成物から、該宿主細胞に由来するＨＣＰ、及びＤＮＡの除去率を評価している。

不純物が除去されたか否かの判定は、不純物が抗体のサイズ違い（二量体、三量体、半量体等）の場合はサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により行うことができるがこれに限定されない。
またDNA夾雑物の場合はqPCR法、スレッシュホールド法などにより行うことができるがこれらに限定されない。
細胞由来タンパク質（Host cell protein/HCP)の場合は、抗HCP抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれに限定されない。
プロテインAの場合は抗プロテインA抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれに限定されない。
ウィルスの場合はqPCR法、組織感染法、プラーク法などにより行うことができるがこれらに限定されない。
IGFの場合は抗IGF抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれに限定されない。
インスリンの場合は抗インスリン抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれに限定されない。
タンパク質加水分解物の場合は抗タンパク質加水分解物抗体を用いるELISA法により行うことができるがこれに限定されない。
消泡剤の場合はNMRにより行うことができるがこれに限定されない。
エンドトキシンの場合は、カブトガニの血球抽出成分LAL（Limulus Amebocyte Lysate）を活性化する反応に基づき、比色法や比濁法により測定されるがこれらに限定されない。
抗生物質の場合はゲンタマイシンなどの抗生物質を特異的に認識する抗体を用いたELISA法により、その濃度を測定することができるがこれに限定されない。

本発明における「抗体を含有する組成物」は、本発明による不純物除去方法を適用する前、適用した後、または適用する過程における組成物をいう。抗体を含有する組成物は、抗体を含有した溶液、抗体産生細胞の培養液（Harvest cell culture fluid、以下「ＨＣＣＦ」）、抗体産生細胞の培養培地などと表現することもでき、またＨＣＣＦに対し従来のカラム技術を用いた精製工程を経た後の培養液とすることもでき、例えばProtein A溶出画分とすることもできる。本発明においては、ろ過の前に、抗体を含有する組成物を遠心分離し、得られる上清をろ過に供することもできる。

本発明で使用される抗体は、所望の抗原と結合する限り特に制限はなく、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、均質な抗体を安定に生産できる点でモノクローナル抗体が好ましい。また本発明では、組成物のｐＨを調整する際に抗体のｐＩが参酌されるため、ｐＩ値を特定しやすいモノクローナル抗体が好ましい。

本発明で使用される抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ラクダ、サル等の動物由来の抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体の他、bispecific抗体など人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体、抗体様分子も含まれる。さらに、血中滞留性や体内動態の改善を目的とした抗体分子の物性の改変（具体的には、等電点（ｐＩ）改変、Fc受容体の親和性改変等）を行うために抗体の定常領域等を人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。

また、本発明で使用される抗体の免疫グロブリンクラスは特に限定されるものではなく、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのIgG、IgA、IgD、IgE、IgMなどいずれのクラスでもよいが、IgG及びIgMが好ましい。

さらに本発明で使用される抗体には、定常領域と可変領域を有する抗体（wholeの抗体）だけでなく、Fv、Fab、F(ab)₂などの抗体断片や、抗体の可変領域をペプチドリンカー等のリンカーで結合させた1価または2価以上の一本鎖Fv（scFv、sc(Fv)₂）やscFvダイマーなどのDiabody等などの低分子化抗体なども含まれるが、wholeの抗体が好ましい。

上述した本発明で使用される抗体は、当業者に周知の方法により作製することができる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞（ハイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製することができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46 ）等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。

また、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた遺伝子組換え型抗体を用いることができる（例えば、Carl, A. K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 参照）。具体的には、ハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域（V領域）のcDNAを合成する。目的とする抗体のV領域をコードするDNAを得たら、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のV領域をコードするDNAを、抗体C領域のDNAを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。

本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。

ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号EP 239400、WO 96/02576 参照）。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。

抗体の活性、物性、薬物動態、安全性等を改善するために抗体のアミノ酸を置換する技術としては、例えば以下に述べる技術も知られており、本発明で使用される抗体には、このようなアミノ酸の置換（欠損や付加も含む）を施された抗体も含まれる。

IgG抗体の可変領域にアミノ酸置換を施す技術は、ヒト化（Tsurushita N, Hinton PR, Kumar S., Design of humanized antibodies: from anti-Tac to Zenapax., Methods. 2005 May;36(1):69-83.）をはじめとして、結合活性を増強させるための相補性決定領域(CDR)のアミノ酸置換によるaffinity maturation（Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14;102(24):8466-71.）、フレームワーク(FR)のアミノ酸置換による物理化学的安定性の向上（Ewert S, Honegger A, Pluckthun A., Stability improvement of antibodies for extracellular and intracellular applications: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering., Methods. 2004 Oct;34(2):184-99. Review）が報告されている。また、IgG抗体のFc領域のアミノ酸置換を施す技術として、抗体依存性細胞障害活性(ADCC活性)や補体依存性細胞障害活性(CDC活性)を増強させる技術が知られている（Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31;20(1):17-29. Review.）。さらに、このようなエフェクター機能を増強させるだけではなく、抗体の血中半減期を向上させるFcのアミノ酸置換の技術が報告されている（Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56., Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul;15(7):637-40.）。さらには抗体の物性改善を目的とした定常領域の種々のアミノ酸置換技術も知られている（WO 09/41613）。

また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平1-59878 参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（WO 93/12227, WO 92/03918，WO 94/02602, WO 94/25585，WO 96/34096, WO 96/33735参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。本発明で使用される抗体には、このようなヒト抗体も含まれる。

抗体遺伝子を一旦単離し、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いることができる。動物細胞としては、(1) 哺乳類細胞、例えば、CHO, COS，ミエローマ、BHK （baby hamster kidney），HeLa，Vero，(2) 両生類細胞、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞、あるいは(3) 昆虫細胞、例えば、sf9, sf21, Tn5などが知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Nicotiana)属、例えばニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えばアスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが知られている。原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli）、枯草菌が知られている。これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。

さらに、本発明で使用される抗体には、抗体断片や低分子化抗体、並びに抗体修飾物が含まれる。例えば、抗体断片や低分子化抗体としてはFab、F(ab')2、Fv又はH鎖とL鎖のFvを適当なリンカーで連結させた一価又は二価以上のシングルチェインFv(scFv、sc(Fv)₂など) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976 ; Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496 ; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515 ; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663 ; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669 ; Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137参照)。

抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（PEG）や細胞障害性薬剤等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる（Farmaco. 1999 Aug 30;54(8):497-516.、Cancer J. 2008 May-Jun;14(3):154-69.）。本発明で使用される抗体にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。

本発明の精製方法を利用することにより、例えば、活性を有する抗体を効率的に作製することができる。該活性としては、例えば、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、酵素活性等を挙げることができる。アゴニスト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性等を挙げることができるが、これらに限定されない。

また本発明の精製方法によって、所望の抗原を認識する、または所望の抗原と結合する抗体を効率的に取得することができる。本明細書において抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよい。抗原の例としては、例えば、リガンド（サイトカイン、ケモカインなど）、受容体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンを一部に含む免疫複合体が好適に挙げられる。
サイトカインの例としては、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦなど）、インターフェロン（ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、など）、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β）、リンホトキシン、エリスロポエチン、レプチン、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＭＣＡＦ、ＢＭＰを挙げることができる。
ケモカインの例としては、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８などのＣＣケモカイン、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７などのＣＸＣケモカイン、ＸＣＬ１〜ＸＣＬ２などのＣケモカイン、ＣＸ３ＣＬ１などのＣＸ３Ｃケモカインを挙げることができる。

受容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体ファミリー、TNF受容体ファミリー、Gタンパク質共役型受容体ファミリー、GPIアンカー型受容体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては、多数の文献、例えば、Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive BiochemistryVol.18B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV.、Patthy（Cell (1990) 61 (1), 13-14）、Ullrichら（Cell (1990) 61 (2),203-212）、Massague（eにはアキュート・アクセント記号が付く）（Cell (1992) 69 (6), 1067-1070）、Miyajimaら（Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331）、Tagaら（FASEB J. (1992) 6, 3387-3396）、Fantlら（Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481）
、Smithら（Cell (1994) 76 (6) 959-962）、Flower DR. (Biochim. Biophys. Acta (1999)1422(3)207-234)等に記載されている。

上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスエリスロポエチン（EPO）受容体（Blood (1990) 76 (1), 31-35、Cell (1989) 57 (2), 277-285）、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61 (2), 341-350）、ヒト又はマウストロンボポイエチン（TPO）受容体（Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12), 5640-5644、EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53）、ヒト又はマウスインスリン受容体（Nature (1985) 313 (6005), 756-761）、ヒト又はマウスFlt-3リガンド受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463）、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（PDGF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439）、ヒト又はマウスインターフェロン（IFN）-α、β受容体（Cell (1990) 60 (2), 225-234.及びCell (1994) 77 (3), 391-400）、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト又はマウス成長ホルモン（GH）受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（IL）-10受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子（IGF）-I受容体、ヒト又はマウス白血病抑制因子（LIF）受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子（CNTF）受容体等が好適に例示される。

癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれる。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌抗原であり、癌糖鎖抗原とも呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、上記の受容体としてGPIアンカー型受容体ファミリーに属し肝癌を初めとする幾つかの癌において発現しているGPC3（Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65）、肺癌を初めとする複数の癌で発現するEpCAM（Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31）、CA19-9、CA15-3、シリアルSSEA-1（SLX）等が好適に挙げられる。

MHC抗原は、主にMHC class I抗原とMHC class II抗原に分類され、MHC class I抗原には、HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-Hが含まれ、MHC class II抗原には、HLA-DR、-DQ、-DPが含まれる。

分化抗原には、CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130が含まれ得る。

本発明で使用される抗体としては、例えば抗組織因子抗体、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、HM1.24抗原モノクローナル抗体、抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗PTHrP抗体）、抗グリピカン-3 抗体、抗ガングリオシドGM3抗体、抗TPO受容体アゴニスト抗体、凝固第VIII因子機能代替抗体、抗IL-31レセプター抗体、抗HLA抗体、抗AXL抗体、抗CXCR4抗体、抗NR10抗体、ファクターIX若しくはファクターIXaとファクターXとのBi-specific抗体などを挙げることができるが、これらに限定されない。

本発明で使用する好ましい再構成ヒト化抗体としては、ヒト化抗インターロイキン６（IL-6）レセプター抗体（トシリツマブ、hPM-1あるいはMRA）（WO92/19759参照）、ヒト化抗HM1.24抗原モノクローナル抗体（WO98/14580参照）、ヒト化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗PTHrP抗体）（WO98/13388を参照）、ヒト化抗組織因子抗体（WO99/51743参照）、抗グリピカン-3 ヒト化IgG1κ抗体（PCT/JP05/013103参照）、抗NR10ヒト化抗体（WO2009/072604参照）、ファクターIX若しくはファクターIXaとファクターXとのBi-specificヒト化抗体などが挙げられるがこれらに限定されない。

ヒトIgM抗体としては、抗ガングリオシドGM3組み換え型ヒトIgM抗体（WO05/05636参照）などが好ましい。
低分子化抗体としては、抗TPO受容体アゴニストDiabody（WO02/33072参照）、抗CD47アゴニストDiabody（WO01/66737参照）などが好ましい。

本発明による精製方法は、ヒト化抗IL-6レセプター抗体、抗NR10ヒト化抗体、及びファクターIX若しくはファクターIXaとファクターXとのBi-specificヒト化抗体などのｐＩの低い抗体でより高い効果が期待できる。これは、以下の実施例で詳述するように、ｐＩの低い抗体の方が、不純物の沈殿率が高く、かつ抗体の沈殿率が低い条件となるようなｐＨの最適値を見出しやすいためである。

本発明においてｐＩの低い抗体（以下「低ｐＩ抗体」）とは、特に天然では存在し難い、低い等電点を有する抗体をいう。このような抗体の等電点としては例えば３．０〜８．０、好ましくは５．０〜７．０、より好ましくは５．５〜７．０の抗体、特に好ましくは５．６〜６．９や５．６〜５．８の抗体が挙げられるがこれらに限定されない。なお、天然の（または通常の）抗体は、通常7.5〜9.5の範囲の等電点を有すると考えられる。

さらに本発明で使用される抗体としては、抗体の表面に露出しているアミノ酸残基を改変することにより抗体のｐＩを低下させた、ｐＩ改変抗体が好ましい。このようなｐＩ改変抗体とは、改変前の抗体のｐＩよりも1以上、好ましくは2以上、さらに好ましくは3以上、ｐＩを低下させた抗体をいう。後述のように実施例１，２で使用されるMab1のｐＩ（理論等電点）は５．６であり、実施例３，４で使用されるMab2のｐＩ（理論等電点）は５．８であり、実施例５で使用されるMab3のｐＩ（理論等電点）は６．９である。

抗体の表面に露出しているアミノ酸残基としては、H鎖可変領域の場合、Kabatナンバリングに基づくアミノ酸残基であるH1, H3, H5, H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H26, H31, H39, H42, H43, H44, H46, H61, H62, H64, H65, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83, H85, H86, H97,H105, H108, H110, H112の中から選択されるアミノ酸残基が挙げられるがこれらに限定されない。またＬ鎖可変領域の場合、Kabatナンバリングに基づくアミノ酸残基であるL1, L3, L7, L8, L9, L11, L12, L16, L17, L18, L20, L22, L24, L27, L38, L39, L41, L42, L43, L45, L46, L49, L53, L54, L55, L57, L60, L63, L65, L66, L68, L69, L70, L74, L76, L77, L79, L80, L81, L85, L100, L103, L105, L106, L107の中から選択されるアミノ酸残基が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明において「改変」とは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新たなアミノ酸残基を付加すること等をいうが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することを指す。

アミノ酸の中には、電荷を帯びたアミノ酸が存在することが知られている。一般的に、正の電荷を帯びたアミノ酸（正電荷アミノ酸）としては、リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）が知られている。負の電荷を帯びたアミノ酸（負電荷アミノ酸）としては、アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）等が知られている。これら以外のアミノ酸は電荷を有さないアミノ酸として知られている。

本発明において改変後のアミノ酸残基は、好ましくは、以下の（ａ）または（ｂ）いずれかの群に含まれるアミノ酸残基から適宜選択されるが、特にこれらのアミノ酸に制限されない。
（ａ）グルタミン酸（E）、アスパラギン酸（D）
（ｂ）リジン（K）、アルギニン（R）、ヒスチジン（H）

また、改変前のアミノ酸残基が既に電荷を有する場合、電荷を有さないアミノ酸残基となるように改変することも好ましい態様の一つである。
すなわち、本発明における改変としては、（１）電荷を有するアミノ酸から電荷を有さないアミノ酸への置換、（２）電荷を有するアミノ酸から当該アミノ酸とは反対の電荷を有するアミノ酸への置換、（３）電荷を有さないアミノ酸から電荷を有するアミノ酸への置換が挙げられる。

ｐＩの値は、当業者公知の等電点電気泳動により測定することが可能である。また、理論等電点の値は、遺伝子およびアミノ酸配列解析ソフトウェア（Genetyx等）を用いて計算することができる。

アミノ酸残基の電荷が改変された抗体は、抗体をコードする核酸を改変し、当該核酸を宿主細胞で培養し、宿主細胞培養物から抗体を精製することによって取得することができる。本発明において「核酸を改変する」とは、改変によって導入されるアミノ酸残基に対応するコドンとなるよう核酸配列を改変することをいう。より具体的には、改変前のアミノ酸残基のコドンが改変によって導入されるアミノ酸残基のコドンになるように、核酸の塩基配列を改変することを言う。即ち、改変されるアミノ酸残基をコードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換される。このような核酸の改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発法、PCR変異導入法等を用いて、適宜行うことが可能である。

本発明の精製方法は、カラム技術を使った精製方法に代替して、またはカラム技術を使った精製方法と組み合わせて使用することができる。具体的には、抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）に対し、アニオン性ポリマーを用いた精製方法を適用することができる。この場合、本発明によるアニオン性ポリマーを用いた精製工程を、従来のプロテインＡカラムクロマトグラフィーおよび／またはプロテインＧカラムクロマトグラフィーによる精製工程に代替することができ、これらカラムクロマトグラフィーを用いずに精製を行うことが可能となる。

また別の手法として、抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）に対しプロテインＡカラムクロマトグラフィーおよび／またはプロテインＧカラムクロマトグラフィーによる精製を行ったプロテインＡ溶出画分またはプロテインＧ溶出画分に対し、アニオン性ポリマーを用いた精製方法を適用することができる。プロテインＡカラムクロマトグラフィーおよび／またはプロテインＧカラムクロマトグラフィーによる精製と、アニオン性ポリマーによる精製との順番は適宜変更することができる。好ましくは、アニオン性ポリマーによる精製工程は、複数あるポリッシングカラムクロマトグラフィーによる精製工程のいずれかに代替するようにすることができる。

本発明において、プロテインＡカラムクロマトグラフィーは、例えばMab Select SuRe(GE Healthcare社)を用いることができ、プロテインＧカラムクロマトグラフィーとしては、例えばProteinG Sepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare社)を用いることができる。

ポリッシングカラムクロマトグラフィーは、中間精製工程及びポリッシング工程に用いるカラムクロマトグラフィーと定義される。中間精製工程及びポリッシング工程は、Protein A及びProtein Gカラムクロマトグラフィー工程とカラムクロマトグラフィーのキャプチャー工程の後段のカラムクロマトグラフィー工程を指す。ポリッシングカラムクロマトグラフィーとしては、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィーのいずれか１つまたはこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。

本発明において陰イオン交換カラムは、陰イオン交換作用を示す限り限定されないが、例えば、
YMC-BioPro（ワイエムシィ社）、
Q Sepharose High Performance（GE Healthcare社）、
Q Sepharose Fast Flow（GE Healthcare社）、
Q Sepharose XL（GE Healthcare社）、
Capto Q ImpRes（GE Healthcare社）、
Capto Q（GE Healthcare社）、
Capto DEAE（GE Healthcare社）、
SOURCE 30Q（GE Healthcare社）、
SOURCE 15Q（GE Healthcare社）、
POROS HQ（Life technologies社）、
POROS D（Life technologies社）、
POROSPI（Life technologies社）、
Eshumuno Q（Merck Millipore社）、
Fractogel TMAE（Merck Millipore社）、
Fractogel DEAE（Merck Millipore社）、
Macro-Prep Q（Bio-Rad Laboratories社）、
Macro-Prep DEAE（Bio-Rad Laboratories社）、
Giga Cap Q-650M（TOSOH社）、
Giga Cap DEAE-650M（TOSOH社）、
Q HyperCel（PALL社）
などを挙げることができる。

本発明において陽イオン交換カラムは、陽イオン交換作用を示す限り限定されないが、例えば、
POROS 50HS (Applied Biosystem)
POROS XS (Applied Biosystem)
Eshumuno S (Merk-Millipore)
Fractogel SO3- (M) (Merk-Millipore)
Fractogel COO- (M) (Merk-Millipore)
Fractogel SO3- (S) (Merk-Millipore)
Fractogel COO- (S) (Merk-Millipore)
MacroPrep High S (Bio-Rad)
MacroPrep CM (Bio-Rad)
UNO sphare S (Bio-Rad)
GigaCap S 650M (TOSOH)
GigaCap CM 650M (TOSOH)
TOYOPERAL SP 650 M (TOSOH)
TOYOPERAL CM 650 M (TOSOH)
TOYOPERAL SP 650 S (TOSOH)
TOYOPERAL CM 650 S (TOSOH)
SP sepharose FF (GE Healthcare)
SP sepharose HP (GE Healthcare)
Capto S (GE Healthcare)
ProRes S (Merk-Millipore)
Capt S Impres (GE Healthcare)
SOURCE 30S (GE Healthcare)
Eshumuno CPX (Merk-Millipore)
Nuvia S (Bio-Rad)
Nuvia HRS (Bio-Rad)
などを挙げることができる。

また疎水性相互作用クロマトグラフィーのためのカラムとしては、例えば、
Phenyl Sepharose High Performance（GE Healthcare社）、
Butyl Sepharose High Performance（GE Healthcare社）、
Phenyl Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare社）、
Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow（GE Healthcare社）、
Butyl Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare社）、
Octyl Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare社）、
Capto Phenyl ImpRes（GE Healthcare社）、
Capto Phenyl（GE Healthcare社）、
Capto Butyl（GE Healthcare社）、
Capto Octyl（GE Healthcare社）、
Fractogel Phenyl（Merck Millipore社）、
Fractogel Propyl（Merck Millipore社）、
TOYOPEARL Butyl（TOSOH社）、
TOYOPEARL Ether（TOSOH社）、
TOYOPEARL Hexyl（TOSOH社）、
TOYOPEARL Phenyl（TOSOH社）、
TOYOPEARL PPG（TOSOH社）、
TOYOPEARL SuperButyl（TOSOH社）、
TOYOPEARL Butyl-600（TOSOH社）、
Macro-Prep HIC（Bio-Rad Laboratories社）
などを例示することができるがこれらに限定されない。

またマルチモードクロマトグラフィーのためのカラムとしては、例えば、
CHT TypeI 40um (Bio-Rad)
CHT TypeI 80um (Bio-Rad)
CHT TypeII 40um (Bio-Rad)
CHT TypeII 80um (Bio-Rad)
CFT TypeI 40um(Bio-Rad)
CFT TypeII 40um (Bio-Rad)
Capto MMC (GE Healthcare)
Capto Adhere (GE Healthcare)
"TryptoｐＨan Immobilized Resin" (TOSOH)
MEP HyperCel (PALL)
などを例示することができるがこれらに限定されない。
また、精製工程において、本発明の沈殿技術を使った精製工程の後、ポリッシングカラムクロマトグラフィーによる精製工程を行う前に、ウィルス不活化および濾過の工程を行うことができる。

本発明ではまた、抗体を含有する組成物の精製方法の他に、本発明の精製方法によって得られる精製された抗体を含む組成物または不純物が除去された抗体含有組成物を製造する方法、これらの組成物を用いて医薬組成物を製造する方法、これらの製造方法によって得られる抗体を含有する組成物及び医薬組成物が提供される。
本発明による精製された抗体を含有する組成物の製造方法あるいは不純物が除去された抗体を含有する組成物の特徴としては、例えばアニオン性ポリマーを用いた精製工程を従来のプロテインＡカラムクロマトグラフィーおよび／またはプロテインＧカラムクロマトグラフィーに代替することにより、これらカラムクロマトグラフィーを用いることなく、高い不純物除去率を達成した点が挙げられる。この場合、全ての精製工程を経た後の組成物内における不純物の含有割合は、抗体に対する質量比としてあらわすことができ、好ましくはこの質量比は０．２以下、より好ましくは０．１以下、更に好ましくは０．０５以下とすることができる。具体的には、本発明における抗体を含有する組成物として、
ｐＩが５．０〜７．０の抗体を含有し、
抗体に対する不純物の含有割合が質量比で０．２以下であり、
不純物としてプロテインＡおよび／またはプロテインＧを含まない、
抗体を含有する組成物。
を例示することができるがこれに限定されない。
質量比の測定は、例えばHCP分析法、DNA分析法に加えて、SEC(size extrusion chromatography)でMonomer, HMW, LMW（Monomer以外のHMW, LMWが不純物）を用いて測定することができる。

本発明の精製された抗体または当該抗体を含む組成物を含む医薬組成物は、溶液製剤（抗体含有溶液製剤）、あるいは凍結乾燥剤であることができる。本発明の溶液製剤には、凍結乾燥製剤の製造工程における凍結乾燥処理前の溶液または再溶解後の溶液も含まれる。本発明の溶液製剤は、製造過程に凍結乾燥工程を含むことなく製造される溶液製剤（凍結乾燥製剤の再溶解液ではない溶液製剤）であることが好ましい。また本発明の凍結乾燥剤は、本発明の溶液製剤を当業者に公知の手法により凍結乾燥させることにより得ることができる。

また本発明の製剤には、医薬的に許容される担体および/または添加剤として、凍結保護剤、懸濁剤、溶解補助剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化防止剤等の添加材や担体を含むことができる。

凍結保護剤として例えば、トレハロース、ショ糖、ソルビトール等の糖類を挙げることができるがこれらに限定されない。

溶液補助剤として例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができるがこれらに限定されない。

等張化剤として例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を挙げることができるがこれらに限定されない。

保存剤として例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができるがこれらに限定されない。

吸着防止剤として例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキサイド・プロピレンオキサイド共重合体、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を挙げることができるがこれらに限定されない。

含硫還元剤として例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられるがこれらに限定されない。

酸化防止剤として例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明の医薬組成物や製剤は、経口または非経口のいずれでも投与可能であるが、通常、非経口経路で投与される。具体的には、注射、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などにより投与される。注射剤型の例としては、例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射などにより全身又は局所的に投与することができる。皮下注射の場合、注射液量の制限があるが1回あたりの抗体投与量を大量(100〜200 mg程度)とすることができる。そのため、本発明の製剤は皮下投与（注射）用として特に適している。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、本実施例において供した抗体は以下の通りである。
Mab1：WO2009/072604の実施例12に記載の方法で作製した完全ヒト化NS22抗体である抗NR10（IL-31レセプター）抗体である。抗体クラスはIgG2で、アミノ酸配列を改変してpI値を5.6に低下させた抗体である。Mab1抗体のアミノ酸配列はH鎖／配列番号：３、L鎖／配列番号：４で表される。
Mab2： WO 2009/041621に記載された抗IL-6レセプター抗体で、トシリツマブ（H鎖／配列番号：５、L鎖／配列番号：６）のアミノ酸を改変してpI値5.8とした抗体である。Mab2抗体のアミノ酸配列はH鎖／配列番号：１、L鎖／配列番号：２で表される。
Mab3（ACE910）：WO2012/067176に記載された二重特異性抗体Q499-z121/J327-z119/L404-kである。F.IX/F.IXa及びF.Xの双方に特異的に結合し、F.IXaによるF.X活性化を促進する機能を代替する機能（F.Xa産生促進機能）を有し、そのpIは6.9である。一般名EmicizumabとしてINN（International Nonproprietary Name）の登録がなされている（chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/rn/1610943-06-0参照）。

実施例１-１．Mab1を含有する組成物（ＨＣＣＦ）のアニオン性ポリマーによる不純物除去（pH 4.0および4.2）
実施例１-１では、ＣＨＯ細胞を用いた抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）に対し、アニオン性ポリマーによる精製方法を適用した実験を行った（以下実施例1-2〜1-4も同様）。
Mab1のHCCF10 mLに酢酸溶液を加えて、pH4.0及び4.2に調整した。HCCFは、CHO細胞安定発現株を用いて当業者に公知の方法で抗体を発現させ、抗体産生細胞培養液から細胞を公知の方法で除去することによって得た。
アニオン性ポリマーとして、以下に示すPVSを抗体質量g_antibodyとPVS質量g_polymerの比(g_polymer/g_antibody)が0.1になるように加え、15分間以上スターラーバーで撹拌した。
名称：Poly(vinylsulfonic acid, sodium salt) solution
濃度：25 wt% (= 316.8 mg/mL)
型番：278424-250ML
Lot：02220LDV
メーカー：Sigma-Aldrich
得られた、PVSによって沈殿した不純物を含む溶液を、遠心分離機を使用して10分間、3000 rpmで遠心分離した。上清を回収し、これを0.22 μmの口径を持つPESのフィルターでろ過した。得られたろ液のHCP濃度とDNA濃度を測定した。表1にHCP濃度とDNA濃度の測定結果及び当操作による収率を示した。収率は、溶液量が殆ど変化しないことからインプット濃度とアウトプット濃度の比から算出した（収率 ＝ アウトプット濃度/インプット濃度×100、以下特別に記載がなければ、収率は当該手法を用いて算出した）。

表1の"ＨＣＣＦ"の行は、ＰＶＳを用いて沈殿による除去を行う前の、ＨＣＰ及びＤＮＡの含有率をそれぞれng/mg, pg/mgで表したものである。（1.5E+06は1.5×10⁶ng/mgを表す。）また"PVS pool(ｐＨ4.0)"及び"PVS pool(ｐＨ4.2)"の行は、それぞれpH 4.0及び4.2の条件下でＰＶＳを用いて沈殿による除去を行った後の、ＨＣＰ及びＤＮＡの含有率を表したものである。また収率は、ＰＶＳを用いる沈殿による除去の前後の抗体の収率を％で表したものである（以下同様）。
表１より、pH 4.0又は4.2の条件下でアニオン性ポリマーにより不純物を沈殿させて除去することによって、Mab1のHCCFからHCPを1.6〜1.8 Log、DNAを4Log以上除去できることが明らかになった。またpH 4.0で収率79.3％、pH 4.2で収率95.6％と、アニオン性ポリマーによる不純物除去の後でも、抗体の高い収率が確保されることが明らかとなった。

実施例１-２．Mab1の含有する組成物（ＨＣＣＦ）のアニオン性ポリマーによる不純物除去（各ｐＨ）
実施例1-1で明らかとなった効果のpH依存性を確認するため、Mab1のHCCF10 mLに酢酸溶液を加えて、それぞれpH 3.0、3.5、3.8、4.0、4.2、4.4、4.5、5.0に調整した。PVS(Catalog No.: 278424-250ML)を抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比(g_polymer/g_antibody)が0.1になるように加え、15分間以上スターラーバーで撹拌した。得られた、PVSによって沈殿した不純物を含む溶液を、遠心分離機を使用して10分間、3000 rpmで遠心分離した。上清を回収し、これを0.22 μmの口径を持つPolyethersulfone(PES)のフィルターでろ過した。得られたろ液のHCP濃度とDNA濃度を測定した。表２および図１に抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比が0.1の場合のHCP濃度とDNA濃度の測定結果及び当操作による収率を示した。

表２から、３．８〜４．４のｐＨにおいてＨＣＰ、ＤＮＡの高い除去率が確認された。また図１から、３．５以上、特に３．８以上のｐＨにおいて、アニオン性ポリマーの添加後でも抗体の一部が沈殿せず残存することが確認された。

実施例１-３．Mab1含有する組成物（ＨＣＣＦ）のアニオン性ポリマーによる不純物除去（各ｐＨ、ＰＶＳの質量比0.01）
実施例1-1、1-2で明らかとなった効果のアニオン性ポリマー添加量の影響を検討するため、Mab1のHCCF10 mLに酢酸溶液を加えて、pH 3.8、4.0、4.2、4.4に調整し、PVS(Catalog No.: 278424-250ML)を抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比(g_polymer/g_antibody)が0.01になるように加え、15分間以上スターラーバーで撹拌した。得られた、PVSによって沈殿した不純物画分を、遠心分離機を使用して10分間、3000 rpmで遠心分離した。上清を回収し、これを0.22 μmの口径を持つPESのフィルターでろ過した。得られたろ液のHCP濃度とDNA濃度を測定した。表３に抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比が0.01の場合のHCP濃度とDNA濃度の測定結果及び当操作による収率を示した。また図２には、InputのＨＣＰ／ＤＮＡ含有率および抗体の収率を、本実施例によるＰＶＳを用いる沈殿による除去の実施後のもの、及びプロテインＡカラムクロマトグラフィーによる精製後のものとの比較を示した。

表３から、ＰＶＳの添加量を０．０１とした場合においても、３．８〜４．２のｐＨにおいてＨＣＰ、ＤＮＡの高い除去率が確認された。また、広いｐＨ範囲で高い収率を維持できることが判った。
また図２から、アニオン性ポリマーを用いた沈殿による除去により、プロテインＡカラムクロマトグラフィーを用いた精製工程と同等、或はこれ以上の高いＨＣＰとＤＮＡ除去率と抗体収集率とを達成することを確認した。

実施例１-４．Mab1含有する組成物（ＨＣＣＦ）のアニオン性ポリマーによる不純物除去（ＰＶＳの各質量比）
実施例１−３で行ったＰＶＳ添加量による影響を詳細に検討するため、Mab1のHCCF10 mLに酢酸溶液を加えて、pH 4.0または4.2に調整し、PVS(Catalog No.: 278424-250ML)を抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比(g_polymer/g_antibody)がそれぞれ0.01、0.04、0.06、0.08、0.10になるように加え、15分間以上スターラーバーで撹拌した。得られた、PVSによって沈殿した不純物を含む溶液を、遠心分離機を使用して10分間、3000 rpmで遠心分離した。上清を回収し、これを0.22 μmの口径を持つPolyethersulfone(PES)のフィルターでろ過した。得られたろ液のHCP濃度とDNA濃度を測定した。表４および図３に、pHが4.0の場合における、PVS濃度とHCP濃度とDNA濃度の測定結果及び当操作による収率と、プロテインＡカラムクロマトグラフィーによる精製方法との比較を示した。また、表５および図３に、pHが4.2の場合における、PVS濃度とHCP濃度とDNA濃度の測定結果及び当操作による収率と、プロテインＡカラムクロマトグラフィーによる精製方法との比較を示した。尚、図３における"PA"はプロテインＡカラムクロマトグラフィーによる不純物除去工程の収率と、この工程画分のHCP, DNA残存量をしめす。

表４、表５、図３から、Mab1に対するPVSの質量比が０．０８〜０．１の範囲、ｐＨが４．０、もしくは、Mab1に対するPVSの質量比が０．１、ｐＨが４．０〜４．２の範囲において、プロテインＡカラムクロマトグラフィーによる精製方法と同等もしくはそれ以上のＨＣＰ除去能とＤＮＡ除去能を達成できることが明らかとなった。
以上、実施例1-1〜1-4ではアニオン性ポリマーとしてＰＶＳを用いてｐＨ、質量比との関係を検討したが、これらの結果はＰＶＳに限定されるものではなく、アニオン性ポリマーとして同様の機能を有するポリマー、例えばＰＳＳやＰＡＡ等においても同様の効果を期待できる。

実施例2-1．Mab1を含有する組成物（プロテインＡ溶出画分）のアニオン性ポリマーによる不純物除去
実施例２-１では、ＣＨＯ細胞を用いた抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）に、プロテインＡカラムクロマトグラフィーによる精製工程を行った後の溶出画分に対し、アニオン性ポリマーによる精製方法を適用した実験を行った。
Mab1のProtein A溶出画分10 mLに2 M Tris溶液を加えて、pH 4.5に調整した。PVSを抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比(g_polymer/g_antibody)が0.008または0.006となるように加え、15分間以上スターラーバーで撹拌した。得られた、PVSによって沈殿した不純物を含む溶液を、遠心分離機を使用して10分間、3000 rpmで遠心分離した。上清を回収し、これを0.22 μmの口径を持つPESのフィルターでろ過した。得られたろ液(PVS pool)のHCP濃度とDNA濃度を測定した。表６にHCP濃度とDNA濃度の測定結果及び当操作による収率を示した。また、併せてPVS poolの単量体量をサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を用いて面積百分率法により算出した。

表６より、PVSで不純物を沈殿させることによってProteinAの溶出画分からHCPを2.2〜2.9 Log、DNAを3Log以上除去できることが明らかになった。また、単量体量も増加させることができることが判った。

実施例2-2．Mab1を含有する組成物（プロテインＡ溶出画分）のアニオン性ポリマーによる不純物除去（PVS-Low pH-中和画分とAEX溶出画分の不純物の沈殿結果）
実施例２-２では、ＣＨＯ細胞を用いた抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）に、プロテインＡカラムクロマトグラフィーによる精製工程を行った後の溶出画分に対し、アニオン性ポリマーによる精製方法を適用し、更にウィルス不活化／フィルター処理及び陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムクロマトグラフィーにより精製する実験を行った。
Mab1のプロテインＡ溶出画分約100 mLに2 M Tris溶液を加えて、pH 4.5に調整した。PVSを抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比(g_polymer/g_antibody)が0.01になるように加え、15分間以上スターラーバーで撹拌した。得られた、PVSによって沈殿した不純物を含む溶液を、ガラス繊維ろ紙と0.22 μmの口径を持つPESのフィルターでろ過した。得られたろ液を実生産精製工程におけるウィルス不活化工程を模して、1 mol/L 塩酸を添加してpH 3.6に1時間以上保持した。保持した抗体溶液を2 mol/L トリスにてpH 7.0に中和処理し、6時間以上静置した。静置後0.22μmの口径を持つPESのフィルターでろ過し、PVS-Low pH-中和画分を得た。PVS-Low pH-中和画分のHCP、DNA、プロテインA濃度を測定した。PVS-Low pH-中和工程の収率は、（インプット濃度×インプット容量）/（アウトプット濃度×アウトプット容量）×100より算出した。得られたPVS-Low pH-中和画分を陰イオン交換(AEX)クロマトグラフィーを含む当業者公知の方法で精製し、AEX溶出画分を得た。AEX溶出画分のHCP、DNA、プロテインA濃度を測定した。

表７より、PVS-Low pH-中和の一連の操作でHCPを2.9Log、DNAを2.9Log除去できることが判った。また、AEX溶出画分ではHCP、DNA、Protein Aの不純物をすべて定量限界以下にできることが判った。
以上、実施例2-1、2−2ではアニオン性ポリマーとしてＰＶＳを用い、プロテインＡカラムクロマトグラフィー等のカラム技術との併用について検討したが、これらの結果はＰＶＳに限定されるものではなく、アニオン性ポリマーとして同様の機能を有するポリマー、例えばＰＳＳやＰＡＡ等においても同様の効果を期待できる。

実施例3-1．Mab2を含有する組成物（HCCF）のアニオン性ポリマーによる不純物除去
実施例３−１では、ＣＨＯ細胞を用いた抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）に対し、アニオン性ポリマーによる精製方法を適用した実験を行った（以下実施例３−２も同様）。
Mab2のHCCF 10 mLに酢酸溶液を加えて、pH 4.6に調整した。PVSを抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比(g_polymer/g_antibody)が0.04になるように加え、15分間以上スターラーバーで撹拌した。得られた、PVSによって沈殿した不純物を含む溶液を、遠心分離機を使用して10分間、3000 rpmで遠心分離した。上清を回収し、口径0.22 μmの PESのフィルターでろ過した。得られたろ液のHCP濃度とDNA濃度を測定した。表８にHCP濃度とDNA濃度の測定結果及び当操作による収率を示した。

表８より、アニオン性ポリマーで不純物を沈殿させることによってMab2のHCCFからHCPを1.1 Log、DNAを5.0 Log除去でき、かつ高い収率を達成することが明らかになった。
以上から、Mab2においても、pH 4.0（すなわちMab2のpI-1.8）において、ＨＣＰ／ＤＮＡの高い除去率と抗体の高収集率が確認された。

実施例3-2．Mab2を含有する組成物（ＨＣＣＦ）のアニオン性ポリマーによる不純物除去（各ｐＨ）
実施例３−１で明らかとなった効果のｐＨ依存度を確認するため、Mab2のHCCF 10mLに酢酸溶液を加えて、pH 3.0、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、5.0、5.5に調整した。PVSを抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比(g_polymer/g_antibody)が0.04になるように加え、15分間以上スターラーバーで撹拌した。得られた、PVSによって沈殿した不純物を含む溶液を、遠心分離機を使用して10分間、3000 rpmで遠心分離した。上清を回収し、口径0.22 μmの PESのフィルターでろ過した。得られたろ液のHCP濃度とDNA濃度を測定した。表９および図４に、各種ｐＨにおけるHCP濃度とDNA濃度の測定結果及び当操作による収率を示した。

表９から、３．０〜５．０のｐＨ、好ましくは３．６〜４．６、より好ましくは３．８〜４．４のｐＨにおいてＨＣＰ、ＤＮＡの高い除去率が確認された。また図４から、３．５以上、特に３．８以上のｐＨにおいて、アニオン性ポリマーの添加後でも抗体の一部が沈殿せず残存することが確認された。

実施例4-1．Mab2を含有する組成物（プロテインＡ溶出画分）のアニオン性ポリマーによる不純物除去
実施例４−１では、ＣＨＯ細胞を用いた抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）に、プロテインＡカラムクロマトグラフィーによる精製工程を行った後の溶出画分に対し、アニオン性ポリマーによる精製方法を適用した実験を行った。
Mab2のプロテインＡ溶出画分 10 mLに2 M Tris溶液を加えて、pH4.7に調整した。PVSを抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比(g_polymer/g_antibody)が0.008になるように加え、15分間以上スターラーバーで撹拌した。得られた、PVSによって沈殿した不純物を含む溶液を、遠心分離機を使用して10分間、3000 rpmで遠心分離した。上清を回収し、これを0.22 μmの口径を持つPolyethersulfone(PES)のフィルターでろ過した。得られたろ液のHCP濃度とDNA濃度を測定した。表１０にHCP濃度とDNA濃度の測定結果及び当操作による収率を示した。

表１０より、PVSで不純物を沈殿させることによってMab2のProtein A溶出画分からHCPを0.9 Log、DNAを1.8 Log除去できることが明らかになった。

実施例4-2．Mab2を含有する組成物（プロテインＡ溶出画分）のアニオン性ポリマーによる不純物除去（各ｐＨ）
Mab2のプロテインＡ溶出画分 10 mLに2 M Tris溶液を加えて、pH 4.1、4.3、4.5、4.7に調整した。PVSを抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比(g_polymer/g_antibody)が0.008になるように加え、15分間以上スターラーバーで撹拌した。得られた、PVSによって沈殿した不純物を含む溶液を、遠心分離機を使用して10分間、3000 rpmで遠心分離した。上清を回収し、これを0.22 μmの口径を持つPolyethersulfone(PES)のフィルターでろ過した。得られたろ液のHCP濃度とDNA濃度を測定した。表１１に、各種pHにおけるHCP濃度とDNA濃度の測定結果及び当操作による収率を示した。

表１１より、４．５〜４．７のｐＨにおいてＨＣＰ、ＤＮＡの除去が確認された。

実施例5．Mab3を含有する組成物（プロテインＡ溶出画分）のアニオン性ポリマーによる不純物除去（各ｐＨ）
Mab3(pI：6.9)のLow pH /中和画分 10 mLに酢酸を加えて、pH 4.0に調整した。PVSを抗体重量g_antibodyとPVS重量g_polymerの比(g_polymer/g_antibody)が0.015になるように加え、15分間以上スターラーバーで撹拌した。得られた、PVSによって沈殿した不純物を含む溶液を、遠心分離機を使用して10分間、3000 rpmで遠心分離した。上清を回収し、これを0.22 μmの口径を持つPolyethersulfone(PES)のフィルターでろ過した。得られたろ液のHCP濃度とDNA濃度を測定した。表１２に、各種pHにおけるHCP濃度とDNA濃度の測定結果及び当操作による収率を示した。

表１２より、pH 4.0の条件下でアニオン性ポリマーにより不純物を沈殿させて除去することによって、Mab3のHCCFからHCPを1.8 Log、DNAを2.5Log以上除去できることが明らかになった。またpH 4.0で収率70.1％とアニオン性ポリマーによる不純物の除去の後でも、一定の抗体の収率が確保されることが明らかとなった。

[考察]
実施例１〜５の結果から、アニオン性ポリマーは、抗体のｐＩ未満のｐＨにおいて、より好ましくは抗体のｐＩ−１以下のｐＨにおいて加えることが望ましいと考えられる。ｐＨが高すぎるとアニオン性ポリマーによる不純物の不溶化が十分に行われず、ＨＣＰ／ＤＮＡの除去率が低下することとなる。またアニオン性ポリマーは、３．５以上、より好ましくは３．８以上のｐＨにおいて加えることが望ましいと考えられる。ｐＨがこれよりも下回ると、アニオン性ポリマーにより抗体も沈殿され易くなり、抗体の収率が低下する傾向となる。
また実施例の結果を考慮すると、アニオン性ポリマーは、３．５〜５．０のｐＨ、より好ましくは３．８〜５．０のｐＨの範囲内おいて加えることができる。アニオン性ポリマーを加える際の最適なｐＨを調整するためには、抗体のｐＩは低いことが望ましく、一般的な低ｐＩ抗体として３．０〜８．０のｐＩ、より現実的には５．０〜７．０のｐＩであることが望ましい。
更に、ＨＣＣＦに対しアニオン性ポリマー（ＰＶＳ）を用いた精製を行う場合には、ＰＶＳの添加量は抗体に対する質量比で０．０１〜０．１の範囲内とすることができる。

[適用例]
本発明の適用例としては、例えばアニオン性ポリマーによる精製を従来のカラム技術に代替し、または従来のカラム技術と共に用いることができる。
図５（Ａ）に示すように、従来の抗体の精製では、例えば
１）CHO細胞の培養液を遠心分離（centrifugation）した後にデプスフィルターや滅菌フィルター等のフィルターを使用して濾過しHCCFを得る工程、
２）HCCFをプロテインＡカラムクロマトグラフィーにより精製しプロテインＡ溶出画分を得る工程、
３）プロテインＡ溶出画分に対しLow pHによりウィルス不活化処理を行い、中和後にデプスフィルター及び滅菌フィルター等により濾過しLow pH/中和画分を得る工程(virus inactivation & filtration)、
４）Low pH/中和画分を、ポリッシングカラムカラムクロマトグラフィーにより精製しポリッシングカラム１工程画分を得る工程、
５）ポリッシングカラム１工程画分を次のポリッシングカラムクロマトグラフィーにより精製し、ポリッシングカラム２工程画分を得る工程、
６）ポリッシングカラム２工程画分をUltrafiltration/Diafiltrationにより濃縮しバッファーを交換して、処方濃度かつ処方バッファー成分の抗体溶液を得る工程、
７）これを滅菌フィルターにより濾過した後に分注してBulk(API: Active Pharmaceutical Ingredient)を得る工程、
を順に行うことによりなされる。

一方、図５（Ｂ）に示すように、本発明のアニオン性ポリマー（例えばPVS）による沈殿技術をプロテインAカラムクロマトグラフィーの代替として用いることができる。この場合、例えば次のようなフローで抗体を精製することができる。
例えば
１'）CHO細胞の培養液を遠心分離した後にデプスフィルター及び滅菌フィルター等のフィルターにより濾過しHCCFを得る工程、
２'）HCCFにアニオン性ポリマー（例えばPVS）を加えて不純物を沈殿させた後にデプスフィルター等により濾過し、アニオン性ポリマー不純物沈殿画分を得る工程、
３'）当該画分に対しLow pHによりウィルス不活化処理を行い、中和後に滅菌フィルター等により濾過し、Low pH /中和画分を得る工程、
４'）Low pH /中和画分をポリッシングカラムクロマトグラフィーにより精製し、ポリッシングカラム１工程画分を得る工程、
５'）ポリッシングカラム１工程画分を次のポリッシングカラムクロマトグラフィーにより精製し、ポリッシングカラム２工程画分を得る工程、及び
６'）図５（Ａ）と同様の方法により上記工程６）および７）を順に行う
ことによりなされる。アニオン性ポリマーを除去するため、ポリッシングカラム１工程，２工程の少なくとも一方は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いたものであることが望ましい。

あるいは図５（Ｃ）に示すように、本発明のアニオン性ポリマー（例えばPVS）による沈殿技術をポリッシングカラムクロマトグラフィーの代替として用いることもできる。この場合、例えば、次のようなフローで抗体を精製することができる。
例えば図５（Ａ）と同様の方法により上記工程１）および２）を行いプロテインＡ溶出画分を得、
３"）この溶出画分にアニオン性ポリマー（例えばPVS）を加えて不純物を沈殿させた後に、デプスフィルター等により濾過し、アニオン性ポリマー不純物沈殿画分を得る工程、
４"）当該画分に対しLow pHによりウィルス不活化処理を行い、中和後に滅菌フィルターにより濾過し、Low pH/中和画分を得る工程、
５"）Low pH/中和画分をポリッシングカラムクロマトグラフィーにより精製し、ポリッシングカラム１工程画分を得る工程、
６"）ポリッシングカラム１工程画分をUltrafiltration/Diafiltrationにより濃縮し、バッファーを交換して、処方濃度かつ処方バッファー成分の抗体溶液を得る工程、及び
７"）図５（Ａ）と同様の方法により上記工程７）を順に行う
ことによりなされる。アニオン性ポリマーを除去するため、ポリッシングカラム１工程は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いたものであることが望ましい。

本発明により、抗体を含有する組成物に含まれる抗体の会合体や不純物を効率よく除去できる精製法が提供された。本発明の精製方法は、高い純度が求められるバイオ医薬品の製造において有用である。

Claims (16)

1. 抗体を含有する組成物の精製方法であって、
   (a)抗体を含有する組成物を、３．５以上であり、かつ抗体のｐＩ−１以下のｐＨを有する組成物であって、アニオン性ポリマーを含む組成物に調整する工程、および
   (b)前記組成物から、前記アニオン性ポリマーにより不溶化された不純物を除去する工程、を含む方法。
2. 工程(a)が、３．８以上であり、かつ抗体のｐＩ−１以下のｐＨを有する組成物であって、アニオン性ポリマーを含む組成物に調整する工程である、請求項１に記載の方法。
3. 工程(a)が、４．０以上であり、かつ抗体のｐＩ−１以下のｐＨを有する組成物であって、アニオン性ポリマーを含む組成物に調整する工程である、請求項１に記載の方法。
4. 前記抗体のｐＩが５．０〜７．０である、請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
5. 前記アニオン性ポリマーがポリビニルスルホン酸（ＰＶＳ）、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、又はポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳ）である、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
6. 工程(b)が、アニオン性ポリマーにより不溶化された不純物をフィルターにより除去する工程である、請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
7. 前記抗体がＣＨＯ細胞で産生されたものである、請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
8. 前記抗体がモノクローナル抗体であり、かつヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
9. 前記抗体が、抗組織因子抗体、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、HM1.24抗原モノクローナル抗体、抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗PTHrP抗体）、抗グリピカン-3 抗体、抗ガングリオシドGM3抗体、抗TPO受容体アゴニスト抗体、凝固第VIII因子機能代替抗体、抗IL-31レセプター抗体、抗HLA抗体、抗AXL抗体、抗CXCR4抗体、抗NR10抗体、またはファクターIX若しくはファクターIXAとファクターXとのBi-specific抗体である、請求項８に記載の方法。
10. 前記不純物が宿主細胞由来のタンパク質（ＨＣＰ）および／またはＤＮＡである、請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
11. 請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法を用いて抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）から不純物を除去する方法。
12. 前記アニオン性ポリマーがポリビニルスルホン酸（ＰＶＳ）であり、
    前記工程(a)が、抗体に対する質量比で０．０１〜０．１のポリビニルスルホン酸（ＰＶＳ）を含む組成物を調整する工程である、請求項１１に記載の方法。
13. 請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法を用いてプロテインＡ溶出画分またはプロテインＧ溶出画分から不純物を除去する方法であって、前記プロテインＡ溶出画分またはプロテインＧ溶出画分は、抗体産生細胞の培養液（ＨＣＣＦ）のプロテインＡカラムクロマトグラフィーおよび／またはプロテインＧカラムクロマトグラフィーによる精製処理物である、方法。
14. 更に陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水性相互作用カラムクロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィーのいずれか１つ又はこれらの組合せによる精製を行う工程を含む、請求項１１乃至１３のいずれかに記載の方法。
15. 請求項１乃至１４のいずれかに記載の方法により不純物を除去する工程を含み、
    プロテインＡカラムクロマトグラフィーおよび／またはプロテインＧカラムクロマトグラフィーによる精製工程を含まない、
    抗体に対する不純物が質量比で０．２以下に低減されている、抗体を含有する組成物を製造する方法。
16. 請求項１５に記載の方法により抗体を含有する組成物を製造する工程と、
    当該組成物を医薬的に許容される担体および/または添加剤と混合して製剤化する工程とを含む、医薬組成物を製造する方法。

Images