CN102256993A - 蛋白的纯化 - Google Patents

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CN102256993A CN2009801508210A CN200980150821A CN102256993A CN 102256993 A CN102256993 A CN 102256993A CN 2009801508210 A CN2009801508210 A CN 2009801508210A CN 200980150821 A CN200980150821 A CN 200980150821A CN 102256993 A CN102256993 A CN 102256993A
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/32—Extraction; Separation; Purification by precipitation as complexes

Abstract

本发明涉及双模式(bimolar)聚合物如可溶性聚合物，其能够在含有未澄清的生物材料的流(stream)中不可逆地结合不可溶的粒子以及可溶性杂质的亚集，并且还能可逆地结合一或多种期望的生物分子；以及涉及使用此种材料来从此种流中纯化一或多种期望的生物分子而无需预先澄清的方法。此种聚合物包含带电侧基的域如伯胺、仲胺、叔胺或季胺，例如季铵化的胺、吡啶、咪唑和三嗪(第一模式)，并且仅仅在与足以形成聚集体的量的带相反电荷的固体粒子和部分可溶杂质复合后，变得不可溶并从溶液中沉淀出来，其中所述聚集体不能继续被维持在溶液中。该聚合物还包含其它的侧基，所述侧基是带电或不带电的、亲水的或疏水的、或者具有配体，所述配体依赖于过程中的条件如pH、离子强度、盐等而对于感兴趣的生物分子是选择性的(第二模式)。当以一种形式存在时，例如不带电的形式，所述侧基能够结合未澄清的细胞培养液中的所述流内的一或多种期望的生物分子(蛋白、多肽等)。继而可将沉淀从所述流中去除，如通过从所述流的残余物中过滤出来，并回收期望的生物分子，如通过选择性洗脱。

Description

蛋白的纯化
对相关申请的交叉参考
本申请要求2008年12月16日提交的U.S.Provisional Patent ApplicationNo.：61/201,880的权益，其全部内容援引加入本文。
本发明涉及生物分子的纯化。更具体地，其涉及如蛋白、多肽、抗体、等生物分子的纯化，由聚合物如经增溶的或可溶的聚合物，通过沉淀机制从未经澄清的细胞培养液中捕捉期望的生物分子，然后将其进一步纯化。
发明背景
用于制备生物分子如蛋白、抗体、抗体片段、肽、多肽等，特别是重组蛋白的一般方法，通常包括两个步骤：(1)蛋白在宿主细胞中的表达，随后的(2)生物分子的纯化。第一步包括使期望的宿主细胞在生物反应器和发酵罐中生长以实现蛋白的表达。用于此目的的细胞系的一些例子包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤(NSO)细菌细胞如大肠杆菌和昆虫细胞。
一旦蛋白表达至期望的水平，将生物分子从宿主细胞中移除并收获。在一些系统中生物分子从细胞表达并处于培养液中。在另外的系统中，生物分子是未表达的并留在细胞内，或者事实上是细胞的一部分因而该细胞需要被胞溶以及在一些情况中需要被进一步加工从而能够回收生物分子。悬浮的粒子如细胞、细胞碎片、脂质和其它可溶的物质通常通过过滤或离心而从含有生物分子的液体中去除，得到澄清的液体，其在溶液中含有感兴趣的生物分子以及其它可溶的杂质和较小的粒子。
第二个步骤包括收获的生物分子的纯化以去除该方法中固有的杂质。杂质的例子包括宿主细胞蛋白(HCP，期望的蛋白或靶蛋白之外的蛋白)、核酸、内毒素、病毒、生物分子变体和生物分子聚集体。
这种纯化通常包括若干层析的步骤，其可包括亲和、离子交换疏水相互作用等在固体基质上(如多孔琼脂糖、聚合物或玻璃)的层析。
用于纯化蛋白的层析方法队列的例子包括蛋白-A亲和层析，随后的阳离子交换层析，以及随后的阴离子交换层析。蛋白-A柱通过亲和机制捕捉感兴趣的蛋白或靶蛋白而大量的杂质穿过该柱而被弃去。然后通过从柱洗脱来回收蛋白。由于大部分的感兴趣蛋白具有位于碱性范围(8-9)的等电点(PI)并因而在正常加工和条件下带正电(pH值低于该蛋白的PI)，因此它们在第二个柱中结合至阳离子交换树脂。其它带正电的杂质也结合至此树脂。继而在蛋白被洗脱但杂质仍旧结合至该树脂的条件下(pH、盐浓度)，通过洗脱从此柱回收感兴趣的蛋白。阴离子交换柱通常以流通模式操作，从而使任何带负电的杂质结合至树脂而使带正电的感兴趣蛋白从流通流中回收。此方法导致了高度纯化并且浓缩的蛋白溶液。
近年来已研究了其它可选择的用于纯化蛋白的方法；一种此类方法涉及絮凝技术。在此技术中，将可溶的聚电解质加入到未澄清的细胞培养液以捕捉悬浮的粒子而可溶的杂质由此形成絮凝物。随后通过过滤或离心将后者从含有生物分子的溶液中去除，得到在溶液中含有感兴趣蛋白以及其它可溶杂质和一些较小粒子的澄清的液体。
或者，将可溶的聚电解质加入到澄清的细胞培养液中以捕捉感兴趣的生物分子，由此形成絮凝物，使该絮凝物沉降并且随后能够将其与溶液的其它成分分离。通过洗涤沉淀以去除松散附着的杂质。之后，溶液中条件的改变(pH或离子强度)使得絮凝物解离并随后洗脱靶生物分子。
此絮凝技术的主要缺点在于其需要以去除杂质或捕捉感兴趣生物分子所需的确切量来加入聚电解质。如果加入了太少的絮凝剂，杂质或部分的靶蛋白将留在溶液中。另一方面，如果加入了太多的絮凝剂，则需要从所得的溶液中去除过量的聚电解质。杂质的确切水平极其难以预计，这是由于该方法中相对较大的可变度(批次和批次之间)以及产生不同生物分子的方法之间巨大的差异。去除过量的聚电解质实际上不太可能，因为其是可溶的材料因而整个过程中一直带有这种不期望的杂质。
在2007年12月20日提交的共同待审理申请USSN 12/004,314中，一种在特定条件(如温度、光、盐水平和/或pH)可溶的聚合物，在其处于可溶状态时被用于结合杂质，并继而经过改变条件(pH或温度等)而被沉淀出来以去除与其一起的杂质。然后用传统的层析或膜吸附器等来进一步处理感兴趣的生物分子。
在2007年12月20日提交的共同待审理申请USSN 12/004,319中，其建议由上述申请的澄清化方法和化学过程来提供澄清的原料，然后用2007年12月20日提交的USSN 12/004,319中的不同的化学过程和方法来纯化感兴趣的生物分子。
上面讨论的所有的蛋白纯化技术具有共同的方案，此方案是首先去除悬浮的粒子并在第二步中将感兴趣的生物分子与该方法中固有的可溶性杂质分离。
用衍生化的磁颗粒原位回收产物是可以将感兴趣的生物分子直接从未澄清的细胞培养液中纯化出来的蛋白纯化技术的一个例子。在此技术中，包囊了磁珠的聚合物壳被搜寻并结合靶蛋白的亲和性配体所功能化。然后施加磁场以收集珠-蛋白复合物，留下可溶的杂质和不可溶的粒子。
此技术的缺点在于其需要投入可观的资本用于高梯度磁分离器的设计、构建和审批。并且，此技术不能用于一次性的应用，而一次性应用已经要成为生物加工产业中用于蛋白纯化的标准规范。
在本日提交的共同待审理申请中，已建议将2007年12月20日提交的USSN 12/004,314和2007年12月20日提交的USSN 12/004,319中的刺激物改变聚合物(stimulus changing polymer)用于未澄清的培养液或液体并在处于溶液中时结合杂质，而在该聚合物从溶液中沉淀出来时结合或带走感兴趣的生物分子。然后将沉淀物从其它材料中分离，任选经洗涤并且以纯化的形式回收期望的生物分子(如通过选择性洗脱)而留下该聚合物及任何杂质。
此发明的主要缺点在于仍旧需要刺激以使聚合物沉淀并捕捉生物分子用于进一步的加工和纯化。
已发现新的双模式(bimodal)聚合物可用于未澄清的原料，并能以纯化的形式回收感兴趣的生物分子且无需经历刺激的改变以沉淀，由此提供了另一种新的方法用于简易地并以比传统方法少的步骤来回收生物分子。
发明概述
本发明涉及双模式聚合物如可溶性聚合物，其能够在含有未澄清的生物材料的流(stream)中不可逆地结合不可溶的粒子以及可溶性杂质的亚集，并且还能可逆地结合一或多种期望的生物分子；以及涉及使用此种材料来从此种流中纯化一或多种期望的生物分子而无需预先澄清的方法。
此种聚合物包含带电侧基的域如伯胺、仲胺、叔胺或季胺，例如季铵化的胺、吡啶、咪唑和三嗪(第一模式)，并且仅仅在与足以形成聚集体的量的带相反电荷的固体粒子和部分可溶杂质复合后，变得不可溶并从溶液中沉淀出来，其中所述聚集体不能继续被维持在溶液中。该聚合物还包含其它的侧基，所述侧基是带电或不带电的、亲水的或疏水的、或者具有配体，所述配体依赖于过程中的条件如pH、离子强度、盐等而对于感兴趣的生物分子是选择性的(第二模式)。当以一种形式存在时，例如不带电的形式，所述侧基能够结合未澄清的细胞培养液中的所述流内的一或多种期望的生物分子(蛋白、多肽等)。继而可将沉淀从所述流中去除，如通过从所述流的残余物中过滤出来，并回收期望的生物分子，如通过选择性洗脱。
可将含有聚合物、杂质和靶生物分子的沉淀洗涤一或多次，以确保去除液体中的任何杂质或者被俘获至该聚合物内或其上的任何杂质。可回收感兴趣的生物分子，如通过将靶分子从沉淀中选择性洗脱而杂质包括可溶的和不可溶的材料保持与沉淀的聚合物复合，所述选择性洗脱是通过改变溶液的离子强度和/或pH条件。纯化的靶生物分子被回收至洗脱池，而沉淀的聚合物-杂质复合物则被弃去。
本发明的目的是提供可溶的聚合物，其包含永久带电的侧基和可逆地带电的侧基的混合，并且当与可溶的和不可溶的杂质及期望的生物分子复合时，其变得不可溶并形成沉淀。
本发明的目的是提供双模式聚合物，其能够在特定条件下选择性地可溶于一种液体，并且在与可溶的和不可溶的杂质及期望的生物分子复合时，其能够变得不可溶并从溶液中沉淀出来。
目的是使用一或多种聚合物或共聚物，如聚乙烯胺、聚烯丙基、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(甲基丙烯酰丙基三甲基氯化铵)、聚(N-乙烯基己内酰胺)、聚(N-丙烯酰基哌啶)、聚(N-乙烯基异丁酰胺)、聚(N-取代丙烯酰胺)包括[聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)、和聚(N-丙烯酰基-N-烷基哌嗪)]、羟烷基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、2或4-乙烯基吡啶的聚合物、含有2或4-乙烯基吡啶以及至少一个额外的单体和壳聚糖的聚合物；其附着有配体或官能团，用来选择性的捕捉并可逆地结合期望的生物分子以将生物分子从含有该生物分子连同一或多种杂质或其它实体的流中纯化。
目的是使用一或多种季铵化的N-乙烯胺、N-乙烯基吡啶、或N-乙烯咪唑的聚合物或共聚物；其附着有配体或官能团，用来选择性的捕捉并可逆地结合期望的生物分子以将生物分子从含有该生物分子连同一或多种杂质或其它实体的流中纯化。
本发明的目的是提供选自聚(N-烷基2或4-乙炔基吡啶盐)、聚(N-烷基乙炔基咪唑盐)、聚(N-烷基乙炔基三嗪盐)、聚季铵化的胺、和聚季铵化的环胺的共聚物，其包括可变比率的N-乙烯基吡啶、N-丙烯酰基哌啶、N-乙烯基异丁酰胺或N-取代丙烯酰胺。
本发明的另外目的是提供选自聚(N-烷基2或4-乙炔基吡啶盐)、聚(N-烷基乙炔基咪唑盐、聚(N-烷基乙炔基三嗪盐、聚季铵化的胺、和聚季铵化的环胺的聚合物，其中所述聚合物具有附着至该聚合物的选择性地结合感兴趣生物分子的配体，如巯基乙基吡啶(MEP)、巯基乙基吡嗪、MEB、2-氨基苯并咪唑(ABI)、AMBI、2-巯基-苯甲酸(MBA)、4-氨基-苯甲酸(ABA)、2-巯基-苯并咪唑(MBI)、蛋白A或G等。
本发明的另外目的是提供用于将选定的生物分子从含有生物分子的未澄清的流中纯化的方法，该方法是通过使所述流处于给定的条件下或者更改所述流至给定的条件，并加入在该给定条件下可溶于所述流中的双模式聚合物，使被增溶的双模式聚合物循环遍及所述流，从而第一模式可以结合一或多种粒子如细胞成分和可溶杂质，而第二模式可以可逆地结合期望的生物分子，形成沉淀并变得不溶于所述流，将所述流与沉淀的聚合物分离并进一步加工聚合物以通过洗脱回收期望的生物分子，而使聚合物与其捕捉的杂质保持其沉淀(固态)形式。
本发明另外的目的是提供基于聚合物的方法，所述聚合物基于选自温度、盐、温度和盐含量或pH的条件是可溶的。
本发明的另一个目标是提供选自如下的聚合物：聚(2或4-乙烯基吡啶)聚(2或4-乙烯基吡啶-co-苯乙烯)、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸甲酯)、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸丁酯)、聚(2或4-乙烯基吡啶)接枝的羟烷基纤维素、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-N-异丙基丙烯酰胺)、和聚(甲基丙烯酸-co-甲基丙烯酸甲酯)。
本发明的另外的目的是通过选自如下的聚合物：聚(2或4-乙烯基吡啶)、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-苯乙烯)、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸甲酯)、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸丁酯)、聚(2或4-乙烯基吡啶)接枝的羟烷基纤维素、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-N-异丙基丙烯酰胺)、和聚(甲基丙烯酸-co-甲基丙烯酸甲酯)，且其中所述聚合物具有官能团如羧基或吡啶基，或者配体如蛋白A，附着于所述聚合物，其选择性的结合感兴趣的生物分子。
本发明的另外的目的是提供静态混合器用于使所述混合物和经增溶的聚合物混合以允许该聚合物结合一或多种实体。
本发明的里一个目的是提供所述一或多种实体是混合物中的生物分子的情况。
本发明另外的目的是提供用于在单一的步骤中纯化生物学组分的混合物的方法。
本发明的另一个目的是提供用于纯化生物学组分的混合物的方法，其中所述生物学组分选自蛋白、多肽、单克隆抗体、人源化的、嵌合的或动物单克隆抗体多克隆抗体、抗体片段、多特异性抗体、免疫粘附素、和含有CH2/CH3区域的蛋白。
本发明的另外的目的是提供一种方法，使含有生物分子的混合物处于一组范围的条件下，引起一或多种选择的聚合物进入溶液，将一或多种聚合物加入以及使一或多种聚合物进入溶液引起所述聚合物的第一模式结合粒子和其它杂质而允许第二模式可逆地结合感兴趣的生物分子，引起该一或多种聚合物与杂质和感兴趣的生物分子从溶液中沉淀出来，然后将沉淀与混合物的剩余物分离而保留混合物的一或多种实体至沉淀中用于进一步的加工。
本发明的另外的目的是提供从未澄清的混合物中回收感兴趣的生物分子的方法，其中所述混合物得自其被制备的发酵罐或生物反应器。
本发明的另外的目的是提供过滤的步骤以将沉淀从混合物的剩余物中分离。
本发明的另一个目的是提供常态流过滤步骤以将沉淀从混合物的剩余物中分离。
本发明另外的目的是提供切向流过滤步骤以将沉淀从混合物的剩余物中分离。
本发明另外的目的是提供离心步骤以将沉淀从混合物的剩余物中分离。
本发明的另一个目的是提供倾析的步骤以将沉淀从混合物的剩余物中分离。
本发明另外的目的是提供另外的步骤以在保持聚合物处于其沉淀形式的条件下通过洗脱而将混合物的一或多种生物分子从沉淀的聚合物分离。
本发明另外的目的是给感兴趣的生物分子提供额外的加工。
本发明另外的目的是另外的步骤将生物分子配制到药物可接受的载体中并将其用于各种诊断、治疗或其它的此生物分子已知的用途。
本发明的目的是在一个步骤中直接于生物反应器中或生物反应器外提供纯化的生物分子。
本发明另外的目的是使用UF步骤以在由沉淀技术将生物分子纯化和回收后对其进行浓缩。
本发明另外的目的是由使用增强的UF(带电UF)方法的额外的加工来实现生物分子的纯化和回收。
附图简述
图1显示了根据本发明的第一个方法的方框示意图。
发明详述
本发明是使用一或多种液相或经增溶的双模式聚合物(即使沉淀时也具有如亲和性或电荷或疏水性等的性能)，以其第一模式来结合粒子和杂质并以其第二模式来选择性地和可逆地结合一或多种感兴趣的生物分子。优选的聚合物具有静电的和疏水的性能。继而将感兴趣的生物分子从所述聚合物洗脱(优选在该聚合物保持处于其固体或沉淀形式的时候)，并回收用于进一步的加工。
更具体地，此构思涉及使用可溶于一种液相的一或多种聚合物的方法，在液体中使用所述聚合物的第一模式结合粒子和杂质并通过其第二模式选择性地结合溶液中的一或多种期望的生物分子，以形成沉淀并从沉淀中回收该生物分子。例如，此构思在蛋白纯化的背景下可得到最好的描述，尽管其可用于从复合的混合物中纯化任何溶质，只要所述移除的机理适用于此特定的感兴趣的溶质。
一些聚合物，如聚(N-乙烯基己内酰胺)、聚(N-丙烯酰基哌啶)、聚(N-乙烯基异丁酰胺)、聚(N-取代丙烯酰胺)包括[聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(N，N-二乙基丙烯酰胺)、和聚(N-丙烯酰基-N-烷基哌嗪)]以及羟烷基纤维素是因温度变化而展现出可溶性变化的聚合物的例子。另外的聚合物，如丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、2或4-乙烯基吡啶的聚合物和共聚物以及壳聚糖因pH或盐的变化而展现出可溶性的变化。一些聚合物，如聚(N-烷基2或4-乙炔基吡啶盐)、聚(N-烷基乙炔基咪唑盐)、聚(N-烷基乙炔基三嗪盐)、聚季铵化的胺、和聚季铵化的环胺是可溶于水成溶液并能够与带相反电荷的杂质复合的聚合物的例子。
由于某些此类聚合物可能不具有固有的第二模式的性能以选择性地结合或洗脱期望的感兴趣生物分子，需要用配体或化学基团来修饰它们，所述配体或化学基团会与期望的分子复合并将其保持在复合物中并在适当的洗脱条件下释放该期望的分子。适宜的化学基团可包括但不限于羧基和胺基，如形成该聚合物的一部分或附着于该聚合物的吡啶基。可使用的配体如亲和性配体的化学模拟物。此类配体包括但不限于天然配体或合成配体如巯基乙基吡啶(MEP)、巯基乙基吡嗪、MEB、2-氨基苯并咪唑(ABI)、AMBI、2-巯基-苯甲酸(MBA)、4-氨基-苯甲酸(ABA)、2-巯基-苯并咪唑(MBI)等。
取决于所使用的聚合物，所述方法可以变化。
与先前的发明不同，在本发明中可使用含有感兴趣的生物分子连同细胞、细胞碎片、宿主细胞蛋白、DNA、病毒等的未澄清的细胞培养液。此外，所述方法可对收获的细胞培养液(未澄清的细胞培养液，如从生物反应器中收获的)执行，或者若需要的话可以在生物反应器本身内执行。
所述液体可预先设置为期望的pH、温度或其它条件特征以使所述聚合物进入溶液并使两个模式均执行其功能，或者可在加入所述聚合物后设置液体的条件，或者可将所述聚合物加入到适当地设置为所需参数条件的载液中使得该聚合物在液体中增溶并且有活性。使聚合物循环遍及所述液体并结合杂质和期望的生物分子以形成会沉淀出溶液的聚集物。将聚合物、杂质和期望的生物分子与所述液体的其余部分分离并任选地洗涤一或多次以去除任何截留的或松散结合的污染物。继而将期望的生物分子从聚合物中回收，例如通过洗脱等。优选地，洗脱在一组条件下完成从而聚合物在期望的生物分子洗脱期间保持其固体(沉淀)形式，虽然二者在新液体如水和缓冲的溶液中均可被增溶，并通过某方式回收生物分子，如亲和、离子交换、疏水作用、或一些其它类型的层析，所述层析对所述生物分子具有超过聚合物或杂质的偏好和选择性。然后回收洗脱的生物分子并在需要时进行另外的加工步骤。
具有双模式特性的聚合物包括但不限于季铵化的聚乙烯基吡啶(QPVP)。特别是，优选季铵化为50％或更低的QPVP。其它聚合物可包括聚乙烯胺、聚烯丙基胺、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(甲基丙烯酰丙基三甲基氯化铵)、季铵化的聚乙烯基咪唑、季铵化的聚乙烯基三嗪、季铵化的聚胺和季铵化的聚环胺。这些具有亲水和/或疏水的第一模式。它们具有可以是化学的如官能团的第二模式机制，所述官能团如羧基或吡啶基如季铵化的胺基，或者其可以是配体如蛋白A、蛋白G、蛋白A的合成模拟物如MEP或MAB。
所述方法通常包括使混合物的液体的一或多个条件处于正确的pH、温度或盐浓度或者其它条件用于使聚合物变得可溶并执行其双模式的功能，以及继而将聚合物直接加入至混合物或者将已在载液中增溶的聚合物加入至混合物，所述载液如水或缓冲的溶液。在某些情况下，所述混合物会处于适当的条件下以允许简单地将聚合物加入至该混合物。
在另外的情况中，可能需要将混合物设置为或者修改为处于期望的条件。此种修改或设置可通过首先修改混合物然后加入聚合物，或者可以将聚合物加入到设置为期望的状态的载液中并简单地将其加入到混合物中从而所述载液即足以使混合物达到该条件，或者两种方式都进行。
所述聚合物的第一和第二模式结合其选择性的靶标并形成聚集物，其使得该聚合物变得不可溶并从溶液中沉淀出来成为分散的固体悬浮物而无需刺激的改变。
分离沉淀，如通过离心或过滤或重力和时间(液体部分被倾析)。将回收的聚合物/期望的生物分子沉淀洗涤一或多次以去除任何残留的杂质或污染物，继而在使得所述生物分子实体选择性地从聚合物释放的条件下将该生物分子从聚合物洗脱，从而可以将其回收并进行进一步的加工。优选地，洗脱条件使得聚合物保持其固体或沉淀形式并也保留着杂质。通过允许生物分子通过却将聚合物保留在上游的简单的过滤而将洗脱的生物分子与聚合物分离。
本发明中可使用一种聚合物或者掺和的多种聚合物，并且下文无论使用术语聚合物、多种聚合物或者一或多种聚合物均应当涵盖上述的两种实施方案。
如上文所述，可以将聚合物按原样直接加入到混合物中，或者可以是经设置的状态以在加入时增强聚合物第一和第二模式的可溶性和结合性能。或者，可将其加入其可溶的载液中，且该载体优选也与混合物相容。一种此载液是水，用酸或碱调节至特定pH的水，另一种是基于水的溶液如盐水、生理缓冲液或者掺和了有机溶剂的水如水/乙醇掺和物。载液的选择取决于其要加入的混合物以及要偏好和耐受什么。聚合物所要加入其中的载液可以是已经设置好条件的(如调节了pH、或者加热至期望的温度、或者加热至期望的温度并加入一或多种盐、或者冷却至期望的温度且有或没有一或多种盐)，或者可以将聚合物加入然后将载液设置为使聚合物在该载液中增溶的条件。然后将载体/可溶的聚合物的掺和物加入到混合物中。
可将混合物容纳在混合容器中，如锥形底的金属(优选不锈钢更优选304或306L不锈钢)或玻璃或塑料的袋、缸(vat)、或槽(tank)。或者，特别是对于细胞培养物或微生物或酵母培养物，可以是所述细胞在其中生长的生物反应器或发酵罐。也可以是一次性的生物反应器或发酵罐或者一次性的混合袋如可得自Millipore Corporation of Billerica，Massachusetts的塑料袋。通过混合的操作使所述混合物与聚合物密切接触，所述混合操作可由以下方式来进行，磁搅拌棒、磁力混合器如可得自Millipore Corporation ofBillerica，Massachusetts的NovAseptic
Figure BPA00001389462900101
混合器、闪电型混合器(Lightning-type mixer)、回流泵、或摇摆型闭合混合袋或生物反应器或发酵罐，如2005/0063259A1和US 7,377,686所示的，或者空气推升混合器或反应器(其中液体中升起的气泡使得形成循环的模式)。
或者，混合物和聚合物(独自或者于载液中)可以处于分离的容器中并在静态混合器中流线混合。然后掺和物可进入容器中或离心机中或者过滤器中，在其中将沉淀的聚合物及其结合的一或多种生物分子实体与混合物的剩余物分离并进行进一步的加工。
在另一个实施方案中，将混合物和聚合物(独自或者于载液中)在容纳所示混合物的容器中掺和到一起，然后在静态混合器中流线混合。然后掺和物可进入容器或者离心机或者过滤器中，在其中将沉淀的聚合物及其结合的一或多种实体与混合物的剩余物分离。然后进一步加工沉淀的聚合物以回收感兴趣的生物分子。
利用离心，可容易且快捷地将沉淀的聚合物与液体混合物的剩余物分离。在离心后，上清，通常是混合物的剩余物被提出。沉淀的聚合物被进一步加工以回收生物分子。
如果需要的话，可对上清进行一或多次额外的聚合物沉淀步骤以回收更多的期望的生物分子。
需要的话也可使用简单的倾析。
可以多种方式来完成过滤。取决于聚合物沉淀时的大小，可使用不同大小和非对称性的一或多种过滤器。过滤器类型和大小的选择取决于要捕捉的沉淀的体积。
本发明可使用基于膜的过滤器，优选微孔膜。此类过滤器通常其性质是聚合物并可由聚合物制成，例如但不限于烯烃如聚乙烯包括超高分子量的聚乙烯、聚丙烯、EVA共聚物和α烯烃、茂金属烯烃聚合物、PFA、MFA、PTFE、聚碳酸酯、乙烯基共聚物如PVC、聚酰胺如尼龙、聚酯、纤维素、醋酸纤维素、再生纤维素、纤维素合成物、聚砜、聚醚砜、聚芳砜、聚苯砜、聚丙烯腈、聚偏氟乙烯(PVDF)、和其掺和物。所选择的膜取决于应用、期望的过滤特性、要过滤的颗粒类型和大小以及期望的流。优选的基于膜的过滤器包括可得自Millipore Corporation of Billerica Massachusetts的DURAPORE PVDF膜、可得自Millipore Corporation of BillericaMassachusetts的MILLIPORE EXPRESS
Figure BPA00001389462900112
和MILLIPORE EXPRESS
Figure BPA00001389462900113
 PLUS或者SH PES膜。这些实施方案中也可使用预滤器、厚度过滤器等如可得自Millipore Corporation of Billerica Massachusetts的Polygard
Figure BPA00001389462900114
预滤器(Polygard CE预滤器)和厚度过滤器(Polygard CR厚度过滤器)。
取决于混合物、聚合物和生物分子的性质，过滤器可以使亲水的或疏水的。优选的过滤器是亲水的并且是低蛋白结合的。
所述过滤器(膜的或其它的)的孔大小可以在其整个厚度上是对称的，如可得自Millipore Corporation of Billerica Massachusetts的DURAPORE
Figure BPA00001389462900115
PVDF膜；或者其孔大小可以在其整个厚度上是非对称的如可得自MilliporeCorporation of Billerica Massachusetts的MILLIPORE EXPRESS
Figure BPA00001389462900116
和MILLIPORE EXPRESS
Figure BPA00001389462900117
 PLUS或者SH PES膜。如果需要其可含有预过滤器层，作为分离的上游层或者作为整合的所述膜的上游部分。
所述过滤器、预过滤器或厚度过滤器可以有非膜材料形成，如连续缠绕纤维、纤维垫(Millistak+
Figure BPA00001389462900121
衬垫)和/或非针织材料如Tyvek
Figure BPA00001389462900122
塑料纸。
膜的孔大小可以根据所选择的聚合物和混合物而改变。通常其具有平均孔大小从约0.05微米至5微米，优选从约0.05微米至约1微米，更优选从约0.05至约0.65微米。
预过滤器和厚度过滤器常常不以孔大小而是以其程度(extent)来评定，它们可以具有从约0.22微米至约10微米的孔大小。
所述过滤器(膜的或其它的)能以闭合端(deadend)或常态流(NF)形式或者切向流(TFF)形式来运行。该选择取决于多个因素，首要的是用户的偏好或者所装配的过滤设备对本发明有效。当需要回收大量的聚合物和分子时，优选TFF方法和设备，因为TFF比起NF方法更少遭受堵塞和污垢。
图1显示了根据本发明的第一个方法的方框示意图。在第一个步骤2中，未澄清的混合物被设置为正确的条件从而将所选择的捕捉聚合物保持在溶液中并允许两个模式在加入时发挥功能，或者如果所述混合物的条件可以使聚合物在该混合物中变得可溶且具有双功能，则不再需要对条件进行设置。或者，可将作为固体的聚合物加入到未经条件设置的混合物中，然后可以对含有所述固体聚合物的混合物进行条件设置以达到正确的参数来将所述聚合物溶解到该混合物中，并使得其双模式的功能可以发生。类似地，可将聚合物加入到载液中并在正确的条件下加入到混合物中。所述混合物本身也可预先设置条件或者可在引入载体后依赖于载体而进行条件设置。在第二个步骤4中，将聚合物与混合物在流中混合理想长度的时间以建立适宜的分布使得其可以与混合物的所有组分实现紧密接触。在第三个步骤6中，聚合物形成聚集物且在保留结合的杂质和生物分子的同时从溶液中沉淀出来成为分散的固体悬浮物。然后在第四个步骤8中将混合物的其余组分和沉淀的聚合物彼此分离。如上所述，可通过离心、倾析、或过滤来分离沉淀和余留的混合物。
任选地，如本领域所熟知的那样，可进一步用水、缓冲液或中间产物洗涤溶液将沉淀物洗涤一或多次，以从沉淀中去除杂质或者从沉淀中去除任何非特异性结合的杂质。
然后回收期望的生物分子。优选地，其从所述聚合物洗脱，例如通过在某pH值(酸性或碱性，取决于该分子和所使用的聚合物)加入缓冲液，并且该溶液的盐浓度和温度被改变以使得在步骤10中可以回收无所述聚合物的期望的分子。优选地，洗脱的条件可以使得聚合物保持其固体(沉淀)的形式并保留其结合的杂质，尽管期望或者需要时可以使其再度可溶，继而可以使从聚合物中解络的生物分子和所述聚合物沉淀，从而使第一模式发挥作用并去除杂质，但是第二模式不运作从而使生物分子与液体保持在一起。
由于生物分子与沉淀一起回收，任何过量的聚合物被留在从沉淀分离的液体中，由此减少了是否有残余的聚合物保留在液体流中的问题。
如果期望的话，可将额外的聚合物加入到余留的液体中以确保尽可能多的生物分子被回收。
感兴趣的生物分子在被回收后，可以进行一或多个已知的额外加工步骤如层析步骤，例如但不限于离子交换、疏水相互作用或亲和层析，各种过滤步骤如微滤、超滤、有或没有带电UF膜的高效切向流过滤(HPTFF)，病毒去除/失活步骤，最终的过滤步骤等。或者，洗脱的感兴趣的生物分子可无需进一步的纯化步骤而被使用。感兴趣的生物分子还可以经过无需层析步骤的进一步纯化。
在另外的实施方案中，排除了细胞收获物通过亲和层析的处理步骤。在此实施方案中的生物学方法将由如下组成：通过基于聚合物的纯化步骤直接从未澄清的混合物中捕捉生物分子，将生物分子与聚合物以及混合物的剩余物分离，2个或更多个步骤的病毒去除或失活例如通过病毒过滤器去除或者通过用热、化学物质或光的处理而失活，调配步骤达到正确的配制，以及在将经调配的生物分子装入其最终容器(小瓶、注射器等)待用之前最后的过滤步骤。
在本发明的任何实施方案中，经如此回收的生物分子可以被配制到药物可接受的载体中，并用于各种诊断、治疗或其它此分子已知的用途。
作为所述方法中起始材料的所述混合物会发生改变，这取决于其所生长的细胞系以及生长和收获的条件。例如在大部分的CHO细胞的方法中，该分子在细胞壁外表达并进入培养基。在收获期间会尝试避免使细胞破裂以减少混合物中杂质的量。然而，某些细胞在生长和收获期间会因为切力或其它操作条件而破裂或者死亡或溶解，将其内含物溢出至混合物中。在细菌细胞系统中，生物分子常被保持在细胞壁中或者其本身就可以是细胞壁的一部分(蛋白A)。在这些系统中，需要破坏或溶解细胞壁以回收感兴趣的生物分子。
要纯化的靶分子可以是任何生物分子，优选是蛋白，特别是，任何宿主细胞产生的重组蛋白，包括但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、可得自荷兰Crucell的Per.C6
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细胞系、骨髓瘤细胞如NSO细胞、其它动物细胞如小鼠细胞、昆虫细胞、或微生物细胞如大肠杆菌或酵母。此外，所述混合物可以是源自动物的液体，所述动物经改造以产生含有感兴趣生物分子的转基因液体如奶或者血液。较佳的靶蛋白是抗体、免疫粘附素和其它抗体样分子，如包括CH2/CH3区域的融合蛋白。特别是，此产物和方法可用于从有条件地收获的细胞培养液(HCCF)中纯化重组的人源化单克隆抗体如(RhuMAb)，所述细胞培养液是由表达RhuMAb的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养的。
本发明范围内的抗体包括但不限于：抗-HER2抗体包括曲妥珠单抗(Trastuzumab，HERCEPTIN)(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)，U.S.Pat.No.5,725,856)；抗-CD20抗体如嵌合的抗-CD20″C2B8″如U.S.Pat.No.5,736,137(RITUXAN.
Figure BPA00001389462900143
)中的，2H7抗体的嵌合或人源化的变体如U.S.Pat.No.5,721,108，B1中的，或者托西莫单抗(Tositumomab，BEXXAR.
Figure BPA00001389462900144
)；抗-IL-8(St John et al.，Chest，103：932(1993)，和国际公开No.WO 95/23865)；抗-VEGF抗体包括人源化的和/或亲和力成熟的抗-VEGF抗体如人源化的抗-VEGF抗体huA4.6.1 AVASTIN
Figure BPA00001389462900145
.(Kim etal.Growth Factors，7：53-64(1992)，国际公开No.WO 96/30046，和WO98/45331，发表于1998年10月15日)；抗-PSCA抗体(WO01/40309)；抗-CD40抗体，包括S2C6及其人源化的变体(WO00/75348)；抗-CD11a(U.S.Pat.No.5,622,700，WO 98/23761，Steppe et al.Transplant Intl.4：3-7(1991)，和Hourmant et al.Transplantation 58：377-380(1994))；抗-lgE(Presta et al.，JImmunol.151：2623-2632(1993)，和国际公开No.WO 95/19181)；抗-CD18(U.S.Pat.No.5,622,700，1997年4月22日发表，或者在1997年7月31日发表的WO 97/26912中)；抗-lgE(包括E25、E26和E27；1998年2月3日发表的U.S.Pat.No.5,714,338，或者1992年2月25日发表的U.S.Pat.No.5,091,313，1993年3月4日发表的WO 93/04173，或1998年6月30日提交的国际申请No.PCT/US98/13410，U.S.Pat.No.5,714,338)；抗-Apo-2受体抗体(1998年11月19日发表的WO 98/51793)；抗-TNF-α抗体包括cA2(REMICADE)，CDP571和MAK-195(参见1997年9月30日发表的U.S.Pat.No.5,672,347，Lorenz et al.J.Immunol.156(4)：1646-1653(1996)，和Dhainaut et al.Crit.Care Med.23(9)：1461-1469(1995))；抗-组织因子(TF)(1994年11月9日授权的European Patent No.0420937B1)；抗-人α4β7整联蛋白(WO 98/06248 published Feb.19，1998)；抗-EGFR(嵌合的或人源化的225抗体如WO 96/40210published Dec.19，1996中的)；抗-CD3抗体如OKT3(U.S.Pat.No.4,515,893issued May 7，1985)；抗-CD25或抗-tac抗体如CHI-621(SIMULECT
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)和(ZENAPAX
Figure BPA00001389462900153
)(参见U.S.Pat.No.5,693,762issued Dec.2，1997)；抗-CD4抗体如cM-7412抗体(Choy et al.Arthritis Rheum39(1)：52-56(1996))；抗-CD52抗体如CAMPATH-1H(Riechmann et al.Nature 332：323-337(1988))；抗-Fc受体抗体如针对FcγRI的M22抗体如Graziano et al.J.Immunol.155(10)：4996-5002(1995)中的；抗-癌胚抗原(CEA)抗体如hMN-14(Sharkey et al.Cancer Res.55(23Suppl)：5935s-5945s(1995)；针对乳腺上皮细胞的抗体包括huBrE-3、hu-Mc3和CHL6(Ceriani et al.Cancer Res.55(23)：5852s-5856s(1995)；和Richman et al.Cancer Res.55(23Supp)：5916s-5920s(1995))；结合结肠癌细胞的抗体如C242(Litton et al.Eur J.Immunol.26(1)：1-9(1996))；抗-CD38抗体，例如AT 13/5(Ellis et al.JImmunol.155(2)：925-937(1995))；抗-CD33抗体如HuM195(Jurcic et al.Cancer Res 55(23Suppl)：5908s-5910s(1995)和CMA-676或CDP771；抗-CD22抗体如LL2或LymphoCide(Juweid et al.Cancer Res 55(23Suppl)：5899s-5907s(1995))；抗-EpCAM抗体如17-1A(PANOREX
Figure BPA00001389462900154
)；抗-GpIIb/IIIa抗体如阿昔单抗(abciximab)或c7E3Fab(REOPRO
Figure BPA00001389462900155
)；抗-RSV抗体如MEDI-493(SYNAGIS
Figure BPA00001389462900156
)；抗-CMV抗体如PROTOVIR
Figure BPA00001389462900157
；抗-HIV抗体如PRO542；抗-肝炎抗体如抗-Hep B抗体OSTAVIR
Figure BPA00001389462900158
；抗-CA 125抗体OvaRex；抗-个体基因型GD3表位抗体BEC2；抗-αvβ3抗体VITAXIN
Figure BPA00001389462900159
.；抗-人肾细胞癌抗体如ch-G250；ING-1；抗-人17-1A抗体(3622W94)；抗-人结肠直肠肿瘤抗体(A33)；抗-人黑色素瘤抗体R24针对GD3神经节苷脂；抗-人鳞状细胞癌(SF-25)；和抗-人白细胞抗原(HLA)抗体如Smart ID10和抗-HLA DR抗体Oncolym(Lym-1)。本文抗体的优选的靶抗原是：HER2受体、VEGF、IgE、CD20、CD11a、和CD40。
除了上述具体说明的抗体之外，本领域技术人员能够产生针对感兴趣抗原的抗体，例如用下面描述的技术。
本文的抗体是针对感兴趣的抗原。优选地，该抗原是生物学上重要的多肽，并且将所述抗体施用给患有疾病或病症的动物时可导致在该动物中的治疗性益处。然而，针对非多肽抗原的抗体(如肿瘤相关糖脂质抗原，参见U.S.Pat.No.5,091,178)也被涵盖。当抗原是多肽时，其可以是跨膜分子(例如受体)或配体如生长因子。示例性的抗原包括下文第(3)节描述的那些蛋白。本发明涵盖的示例性的抗体的分子靶标包括CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD22、CD34、CD40；ErbB受体家族的成员如EGF受体，HER2，HER3或HER4受体；细胞粘附分子如LFA-1，Mac1，p150，95，VLA-4，ICAM-1，VCAM和αv/β3整联蛋白包括其α或β亚单位(例如抗-CD11a，抗-CD18或抗-CD11b抗体)；生长因子如VEGF；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C，或者本文提及的任何其它抗原。上述所列举的抗体所结合的抗原明确地包括在本文范围之内。
可溶抗原或其片段(任选缀合至其它分子的)可被用作免疫原以产生抗体。对于跨膜分子如受体、其片段(例如受体的胞外结构域)，可被用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可被用作免疫原。此类细胞可源自天然来源(例如癌细胞系)或者是经重组技术转化以表达跨膜分子的细胞。
可用于制备抗体的其它抗原及其形式对于本领域技术人员是显见的。
本发明中也可以纯化多克隆抗体。多克隆抗体优选通过相关抗原和佐剂的多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射而在动物中产生。将抗原缀合至在要免疫的物种中具有免疫原性的蛋白会有用，例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、或大豆胰蛋白酶抑制剂，所述缀合使用双功能性的或衍生化的制剂，例如马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2、或者R1N-C-NR1，其中R和R1是不同的烷基。
将动物针对抗原、免疫原性缀合物、或衍生物进行免疫，其中将例如100μg或5μg的蛋白或缀合物(分别对于兔和小数)与3体积的弗氏完全佐剂组合并将该溶液皮内注射至多个位点。1个月后用抗原或缀合物原始量的1/5或1/10(于弗氏完全佐剂中)通过在多个位点皮下注射来对动物进行加强免疫。7至14天后，对动物取血并测定血清的抗体效价。对动物进行加强免疫直至效价达到平台期。优选地，用缀合至不同蛋白和/或通过不同交联剂缀合的相同抗原的缀合物来对动物进行加强免疫。缀合物也可在重组细胞的培养中制备成蛋白融合物。此外，聚集剂如明矾也适宜被用来增强免疫应答。
本发明也对单克隆抗体有兴趣，其可通过最早由Kohler et al.，Nature，256：495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法来制备(U.S.Pat.No.4,816,567)。
在杂交瘤方法中，如上文所述那样对小鼠或其它适当的宿主动物如仓鼠或猕猴进行免疫，以引发产生或能够产生抗体(其特异性地结合用于免疫的蛋白)的淋巴细胞。或者可以体外免疫淋巴细胞。继而用适宜的融合剂将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，所述适宜的融合剂如聚乙二醇，从而形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种于适宜的培养基并使其生长，所述培养基优选含有对未融合的亲代骨髓瘤细胞的生长或存活进行抑制的一或多种物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常要含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些有效融合的，支持通过选定的抗体表达细胞而稳定地高水平地表达抗体的，并且对培养基如HAT培养基敏感的。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如源自MOPC-2和MPC-1小鼠肿瘤的(可得自SaIk Institute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA)，和SP-2或X63-Ag8-653细胞(可得自American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA)。骨髓瘤细胞和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也被描述用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。
对杂交瘤细胞在其中生长的培养基进行测定，测定其中针对抗原的单克隆抗体的生产。优选地，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或者通过体外结合测定来确定，如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。
在鉴定出杂交瘤细胞产生具有期望的特异性、亲和性、和/或活性的抗体之后，可通过有限稀释过程对该克隆进行亚克隆并通过标准方法培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。适宜此目的的培养基包括，例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可将杂交瘤细胞作为腹水瘤而在动物体内生长。
通过常规的免疫球蛋白纯化过程将亚克隆所分泌的单克隆抗体适当地从培养基、腹水液、或血清中分离，所述纯化过程例如可得自MilliporeCorporation of Billerica，Massachusetts的Pro-Sep Protein A培养基、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析。优选使用本文所述的蛋白A层析过程。
通过常规过程轻易地分离并测序了编码单克隆抗体的DNA(例如通过使用能够特异性地结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是优选的此类DNA的来源。一旦被分离，可将所述DNA置于表达载体内，继而将该载体转染至宿主细胞内，如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞(这些不另外产生免疫球蛋白)，以获得单克隆抗体在这些重组宿主细胞内的合成。
也可对所述DNA进行修饰，例如通过用人重链和轻链恒定区结构域的编码序列取代同源的小鼠序列(U.S.Pat.No.4,816,567；Morrison，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984))，或者通过将免疫球蛋白编码序列与部分或全部的非免疫球蛋白多肽的编码序列连接起来。
通常此种非免疫球蛋白多肽被抗体的恒定结构域取代，或者它们被抗体的一个抗原结合位点的可变结构域所取代，以创建嵌合的二价抗体，其含有对抗原有特异性的一个抗原结合位点和对不同的抗原有特异性的另一个抗原结合位点。
在另外的实施方案中，可以从抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体，所述文库用McCafferty et al.，Nature，348：552-554(1990)中所描述的技术产生。Clackson et al.，Nature，352：624-628(1991)和Marks et al.，J.MoI.Biol.，222：581-597(1991)中分别描述了用噬菌体文库分离鼠和人抗体。下述的文献描述了通过链改组来产生高亲和性(nM范围的)人抗体(Marks et al.，Bio/Technology，10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids.Res.，21：2265-2266(1993))。因此，对于单克隆抗体的分离来说，这些技术是传统的杂交瘤技术的可行替代。
人源化的抗体具有一或多个来自非人来源的氨基酸残基被引入其中。这些非人氨基酸残基常被称作“输入”残基，其通常取自“输入”的可变结构域。人源化可基本上根据下述文献的方法进行(Jones et al.，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyenet al.，Science，239：1534-1536(1988))，通过用啮齿动物的CDR序列取代人抗体的相应序列。因此，此种“人源化”的抗体是嵌合抗体(U.S.Pat.No.4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列所取代。在实践中，人源化的抗体通常是人抗体，其中某些CDR残基和可能地某些FR残基被来自啮齿动物抗体同源位点的残基所取代。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最佳配适”法，将啮齿动物抗体的可变结构域的序列针对已知人可变结构域序列的整个文库进行筛选。与啮齿动物的序列最接近的人序列被接受作为用于人源化抗体的人FR(Sims et al.，J.Immunol.，151：2296(1993))。另一个方法使用源自特定亚组的轻链或重链的所有人抗体的共有序列的特定的框架。相同的框架可用于若干不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.，151：2623(1993))。
还很重要的是经人源化的抗体保留其对抗原的高亲和性和其它有用的性质。为实现此目的，根据优选的方法，通过如下方法制备人源化的抗体，即用亲代序列和人源化序列的三维模型来分析亲代序列和各种概念上的人源化的产物。三维免疫球蛋白模型通常可得并且是本领域技术人员所熟悉的。说明和演示选定的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序也是可得的。对这些演示的研究使得可以分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中所发挥的作用，也就是对影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的氨基酸的分析。以此种方式，可从受体和输入序列选出并组合FR残基，从而可以实现期望的抗体特性，如提高的针对靶抗原的亲和性。通常，CDR残基直接地并最实质地涉及对抗原结合的影响。
或者，现在可以产生转基因动物(例如小鼠)，其能够于免疫后，在不产生内源免疫球蛋白的情况下，产生全套抗体库的人抗体。例如，有报道表明在嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合子缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因列转移至此种系突变体小鼠中会导致在抗原攻击后产生人抗体。参见例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann et al.，Year In Immuno.，7：33(1993)；和Duchosal et al.Nature 355：258(1992)。人抗体也可以源自噬菌体文库(Hoogenboom et al.，J.MoI.Biol.，227：381(1991)；Marks et al.，J.MoI.Biol.，222：581-597(1991)；Vaughan et al.Nature Biotech 14：309(1996))。
已开发出各种技术用于产生抗体片段。传统上，这些片段是通过对完整抗体的蛋白水解消化而衍生出来的(参见例如.，Morimoto et al.，Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)和Brennan et al.，Science，229：81(1985))。然而，现在这些片段可以直接从重组宿主细胞中产生。例如，抗体片段可分离自上述的抗体噬菌体文库。或者，Fab′-SH片段可直接从大肠杆菌回收并化学偶联以形成F(ab′)2片段(Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。根据另一途径，F(ab′)2片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。其它的产生抗体片段的技术对本领域技术人员来说是显见的。在另外的实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185。
多特异性抗体具有对至少两个不同抗原的结合特异性。虽然此类分子一般仅结合两种抗原(即双特异性抗体BsAb)，但是在本文中此表述涵盖了具有额外的特异性例如三特异性的抗体。
制备双特异性抗体的方法是本领域公知的。全长双特异性抗体的传统生产是基于共表达两个免疫球蛋白重链-轻链对，其中所述两个链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature，305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机编配，这些杂交瘤(四源杂交瘤，quadroma)产生10种不同抗体分子的可能的混合物，其中仅有一种具有正确的双特异性结构。该正确分子的纯化，通常由亲和层析的步骤来完成，相当的麻烦并且产量低。类似的过程在WO 93/08829中以及Traunecker et al.，EMBO J.，10：3655-3659(1991)中有公开。
根据WO96/27011中描述的另一个途径，可以将一对抗体分子间界面改造以使从重组细胞培养物中回收的异源二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定结构域的至少一部分的CH3结构域。在此方法中，来自第一个抗体分子的界面的一或多个小氨基酸侧链被较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)所替换。与大侧链具有相同或类似大小的补偿性“空腔”，是通过用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大氨基酸侧链而在第二个抗体分子的界面上创建出来的。这提供了一种机制，用于提高异源二聚体相对于其它不期望的终产物如同源二聚体的产量。
双特异性抗体包括交联的或者“异源缀合的”抗体。例如，可将异源缀合物中的一个抗体偶合至抗生物素蛋白，另一个偶合至生物素。此类抗体例如已被认为是将免疫系统细胞导向不希望的细胞(U.S.Pat.No.4,676,980)，以及用于治疗HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373、和EP03089)。异源缀合抗体可以使用任何常规的交联方法制备。适宜的交联剂是本领域已知的，其与许多交联技术一起在U.S.Pat.No.4,676,980中公开。
文献中也描述了从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science，229：81(1985)描述了蛋白水解剪切完整的抗体以产生F(ab′)2片段的过程。这些片段在二硫醇复合剂亚砷酸钠存在时被还原以稳定邻近的二硫醇并阻止分子间二硫键的形成。所产生的F(ab′)2片段继而被转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。继而将Fab′-TNB衍生物之一通过用巯基乙胺还原而再转变为Fab′-thiol，并与等摩尔量的其它Fab′-TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可被用作酶的选择性免疫制剂。
近来的进展促进了Fab′-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可被化学偶合以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J Exp.Med，175：217-225(1992)描述了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)2分子的产生。每个Fab′片段单独从大肠杆菌分泌并接受体外的定向化学偶合以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发针对人乳腺肿瘤靶标的人细胞毒淋巴细胞的胞溶活性。
用于直接从重组细胞培养物中制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也有报道。例如，已用亮氨酸拉链产生了双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.，148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合而连接至两种不同抗体的Fab′部分。抗体同源二聚体在铰链区被还原以形成单体，继而有再被氧化以形成抗体异源二聚体。Hollinger etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)描述的“双抗体”技术已提供了制备双特异性抗体片段的可选机制。所述片段含有通过接头连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)，所述接头太短以至于不允许同一个链上的两个结构域之间的配对。因此一个片段的VL和VH结构域被迫使与另一个片段的互补的VL和VH结构域配对，由此形成了两个抗原结合位点。另一种使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体的策略也被报道。参见Gruber et al.，J.Immunol.，152：5368(1994)。或者，所述抗体可以是“线性抗体”，如Zapata et al.Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)中所述。简短来说，这些抗体包含一对前后串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其形成一对抗原结合区域。线性抗体可以是双特异性的或者单特异性的。
设想了具有超过二价的抗体。例如可以制备三特异性抗体。Tutt et al.J.Immunol.147：60(1991)
免疫粘附素最简单直接的设计将粘附素的结合结构域(例如受体的胞外结构域(ECD))与免疫球蛋白重链的铰链和Fc区组合。一般在制备本发明的免疫粘附素时，会将编码粘附素结合结构域的核酸融合至编码免疫球蛋白恒定结构域序列N-端核酸的C端，而N端融合也是可以的。
通常，在此类融合中，被编码的嵌合多肽将至少保留功能上具有活性的免疫球蛋白重链恒定区的铰链、CH2和CH3结构域。也有融合被连至恒定区Fc部分的C-末端、或者紧接着重链的CH1的N-末端或轻链相应区域的N-末端。进行融合的确切位点并不重要，具体的位点是公知的并且可以进行选择以优化免疫粘附素的生物学活性、分泌、或结合特性。
在优选的实施方案中，将粘附素序列融合至免疫球蛋白G1(IgG1)的Fc结构域的N-末端。可以将整个重链恒定区融合至粘附素序列。然而，更优选地是，在所述融合中使用铰链区中恰好从木瓜蛋白酶剪切位点(其从化学上定义了IgG Fc，即216位残基，其中以重链恒定区的第一个残基为114位)、或者免疫球蛋白的其它类似位点的上游开始的序列。在特别优选的实施方案中，粘附素氨基酸序列被融合至(a)铰链区和CH2与CH3或者(b)IgG重链的CH1、铰链、CH2与CH3结构域。
对于双特异性免疫粘附素，该免疫粘附素被组装为多聚体，特别是异二聚体或异四聚体。通常，这些组装的免疫球蛋白会具有已知的单位结构IgG、IgD、和IgE所存在的形式是基本的四链结构单位。在较高分子量的免疫球蛋白中四链单位被重复；IgM通常是作为通过二硫键保持在一起的4个基本单位的五聚体而存在的。IgA球蛋白和偶尔有时候的IgG球蛋白也可以在血清中以多聚体形式而存在。在多聚体的情况中，4个单位的每一个可以是相同的或不同的。
本文范围内的各种示例性组装的免疫粘附素如下所示：
(a)ACL-ACL；
(b)ACH-(ACH、ACL-ACH、ACL-VHCH、或VLCL-ACH)；
(c)ACL-ACH-(ACL-ACH、ACL-VHCH、VLCL-ACH、或VLCL-VHCH)
(d)ACL-VHCH-(ACH、或ACL-VHCH、或VLCL-ACH)；
(e)VLCL-ACH-(ACL-VHCH、或VLCL-ACH)；和
(f)(A-Y)n-(VLCL-VHCH)2，
其中每个A代表相同或不同的粘附素氨基酸序列；
VL是免疫球蛋白轻链可变结构域；
VH是免疫球蛋白重链可变结构域；
CL是免疫球蛋白轻链恒定结构域；
CH是免疫球蛋白重链恒定结构域；
n是大于等于1的整数；
Y表示共价交联剂的残基。
基于简短的目的，前述的结构仅仅显示出关键的特征；其并未表示出免疫球蛋白的连接(J)结构域或其它结构域，二硫键也未示出。然而，此类结构域是结合活性所需要的，它们应被构建而出现在其在免疫球蛋白分子中所占据的平常位置。
或者，可将粘附素序列插入到免疫球蛋白重链和轻链序列之间，从而获得含有嵌合重链的免疫球蛋白。在此实施方案中，粘附素序列被融合至免疫球蛋白每个臂中免疫球蛋白重链的3′末端，在铰链和CH2结构域之间或者在CH2和CH3结构域之间。类似的构建物在Hoogenboom，et al.，Mol.Immunol.28：1027-1037(1991)中已有报道
尽管在本发明的免疫粘附素中不要求存在免疫球蛋白的轻链，但是免疫球蛋白的轻链可以通过共价连接至粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽或者直接融合至粘附素而存在。在前一种情况中，编码免疫球蛋白轻链的DNA通常与编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。在分泌后，杂合重链和轻链将共价连接以提供包含两个二硫键连接的免疫球蛋白重链轻链对的免疫球蛋白样的结构。适用于制备此结构的方法在例如1989年3月28日发表的U.S.Pat.No.4,816,567中有公开。
免疫粘附素的构建最方便是通过将编码粘附素部分的cDNA序列符合读框地融合至免疫球蛋白cDNA序列。然而，也可使用对基因组免疫球蛋白片段的融合(参见例如Aruffo et al.，Cell 61：1303-1313(1990)；和Stamenkovic et al.，Cell 66：1133-1144(1991))。后者这种类型的融合需要Ig调节序列的存在用于表达。可基于源自脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库的公开的序列，通过杂交或聚合酶链反应(PCR)技术来分离编码IgG重链恒定区的cDNA。将编码“粘附素”和免疫粘附素的免疫球蛋白部分的cDNA前后串联地插入到在选定的宿主细胞中指引有效表达的质粒载体中。
在其另外的实施方案中，要纯化的蛋白是融合了或者缀合了CH2/CH3区域的蛋白。可产生此种融合蛋白以提高蛋白的血清半衰期。可以通过此方式缀合的生物学上重要的蛋白的例子包括：凝乳酶；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC；因子IX；组织因子，和冯维勒布兰德因子；抗凝血因子如蛋白C；心钠素；肺表面活性物质；纤溶酶原活化剂如尿激酶或人类尿液或组织型纤溶酶原活化剂(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(受激活调节正常T细胞表达和分泌的)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian-抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素关联肽；微生物蛋白如β-内酰胺酶；DNase；IgE、细胞毒T淋巴细胞关联抗原(CTLA)如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮细胞生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5、或-6(NT-3、NT-4、NT-5、或NT-6)，神经生长因子如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、和CD40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α、-β、和-γ；集落刺激因子(CSF)例如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF；白介素例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如例如AIDS包膜的一部分；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如CD11a、CD11b、CD11c、CD18，ICAM；VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2、HER3、或HER4受体；及任何上面所列多肽的片段
下面的实施例是以举例说明的方式来提供的，而并非以限制性的方式。说明书中所有引用的文献均援引加入本文。
实施例
实施例1.未澄清的细胞培养液的pH调节
使衍生自非表达中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系的细胞在生物反应器(NewBrunswick Scientific)中生长至10L培养基中2x106细胞/ml的密度并在64％生存力时收获。IgG峰值是0.8g/L的浓度并且宿主细胞(HCP)的浓度是4075ng/m。该液体的pH是7.2。在纯化过程开始前，用0.5ml的1.0M HCI将未澄清的细胞培养液的pH调至4.5。
实施例2.此实施例说明了从聚(4-乙烯基吡啶)去除残留的4-乙烯基吡啶单体。
将得自Scientific Polymer Products，Inc.的线性聚(4-乙烯基吡啶)，(PVP)MW 200,000，均匀地散布到玻璃皿上并置于真空烘箱中。用氩将烘箱内的气体清除若干次5分钟以去除氧气。用机械真空泵将烘箱中的压力降低到0.1in汞柱，随后将温度升至120℃。使聚合物处于这些条件下共24小时。在此期间，用氩将烘箱内的气体清除若干次5分钟。在加热阶段结束时，将烘箱的温度降低至室温，并在打开门之前用氩将烘箱内的气体清除若干次。所得的聚合物不具有可注意得到的气味，而未经处理的聚合物具有明显的4-乙烯基吡啶单体的气味。经处理的聚合物中所存在的残留4-乙烯基吡啶单体的量用凝胶渗透层析检测不到，而未经处理的聚合物具有0.05％(w/w)的残留4-乙烯基吡啶单体。
实施例3.此实施例说明了季铵化的的聚(4-乙烯基吡啶)，QPVP的合成。
如实施例2所述纯化PVP。碘乙烷、二甲基甲酰胺和甲苯得自并且随到随用。在氮气下将5g(基于单体重复单位为0.047mol)的PVP的溶液、30ml DMF中的2.6g(0.016mol)的碘乙烷在T＝80℃保持12hr。在冷却至室温后，在200ml甲苯中将该聚合物沉淀。所得的固体进一步用100ml甲苯洗涤并继而于烘箱中在70℃干燥24hr，其产率为95％。反应物的摩尔比率经过选择从而使产物含有35mol％的季铵化的吡啶环。
实施例4.此实施例说明了QVPV溶液的制备。
通过将10g来自实施例3的纯化的QPVP溶于70g蒸馏水和20g甲醇，并在室温连续的搅拌20分钟而制备10％(w/w)的QPVP溶液。所得的粘稠溶液的颜色是棕褐色(brown)。
实施例5.此实施例说明了用QPVP从未澄清的细胞培养液捕捉IgG。
一水高氯酸钠和盐酸(1.0M)得自Fisher Scientific。
将0.3g的来自实施例4的QPVP溶液加入到10ml的来自实施例1的未澄清的细胞培养液中。聚合物与不可溶的杂质(细胞和细胞碎片)、可溶杂质(HCP和DNA)以及IgG复合的结果是立即形成分散的固体悬浮形式的沉淀。将所得的溶液在加入0.75g的高氯酸钠后连续混合10以增强IgG与聚合物的结合。通过离心(4000rpm 1min)收集沉淀并用磷酸缓冲液(50mM，0.2M高氯酸钠，pH 7.5)洗涤以去除松散结合的杂质。在细胞、细胞碎片和部分的可溶杂质被沉淀结合时，在pH 4.0(10mM醋酸钠，0.1M)将IgG从沉淀的选择性洗脱，随后通过0.2μDurapore
Figure BPA00001389462900261
过滤器来过滤。在这些条件下，95％的原始液体中存在的IgG被结合至聚合物并且通过洗脱回收的IgG为85wt％。

Claims (26)

1.一种用于从含有杂质的未澄清的混合物中纯化生物分子的方法，包括：
a.在一组条件下提供该混合物，
b.加入一或多种聚合物，该聚合物在该组条件下于所述混合物中可溶并且具有结合一或多种所述混合物中杂质的第一模式和能够可逆地及选择性地结合所述生物分子的第二模式，
c.将所述一或多种经增溶的一或多种聚合物混合至遍及所述混合物，
d.将所述一或多种聚合物、一或多种杂质和被结合的生物分子从所述混合物的溶液中沉淀出来，以及
e.从所述混合物分离所述沉淀的聚合物和被结合的生物分子。
2.权利要求1的方法，其中在步骤b中，将所述聚合物在一种溶液内的一组条件下加入到该溶液中，并将含有经增溶的聚合物的该溶液加入到所述混合物中。
3.权利要求1的方法，进一步包括步骤(f)，其中从所述聚合物回收所述生物分子。
4.权利要求1的方法，其中在一种条件下对所述一或多种聚合物进行增溶，所述条件选自由以下组成的组：pH、温度、盐浓度、光、电荷及其组合。
5.权利要求1的方法，其中所述聚合物的第一模式选自带电侧基的域所组成的组，以及所述聚合物的第二模式选自由以下组成的组：带电侧基、不带电侧基、亲水侧基、疏水侧基、和对感兴趣的生物分子是选择性的配体。
6.权利要求1的方法，其中所述聚合物的第一模式选自由伯胺、仲胺、叔胺或季胺组成的组，以及第二模式选自由以下组成的组：带电侧基、不带电侧基、亲水侧基、疏水侧基、和对感兴趣的生物分子是选择性的配体。
7.权利要求1的方法，其中所述聚合物选自由以下组成的组：聚(2或4-乙烯基吡啶)、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-苯乙烯)、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸甲酯)、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-甲基丙烯酸丁酯)、聚(2或4-乙烯基吡啶)接枝的羟烷基纤维素、聚(2或4-乙烯基吡啶-co-N-异丙基丙烯酰胺)、和聚(甲基丙烯酸-co-甲基丙烯酸甲酯)，并且其中所述聚合物的第二模式选自由官能团和配体组成的组。
8.权利要求1的方法，其中所述生物分子选自由以下组成的组：蛋白、重组蛋白、抗体、单克隆抗体、重组单克隆抗体、多克隆抗体、人源化的抗体、和抗体片段。
9.权利要求1的方法，其中所述生物分子是抗体片段，其选自由以下组成的组：Fab、Fab′、f(ab′)2和Fv片段、单链抗体分子双抗体、线性抗体、由抗体片段形成的双特异性抗体和多特异性抗体。
10.权利要求1的方法，其中所述生物分子是特异性地结合抗原的抗体，所述抗原选自由以下组成的组：CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、CD40、EGF受体、HER2、HER3、HER4受体、LFA-1、Mac1、p150，95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、av/b3整联蛋白、CD11a、CD18、CD11b、VEGF、IgE、flk2/flt3受体、肥胖症(OB)受体、mpl受体、CTLA-4和多肽C。
11.权利要求1的方法，其中生物分子选自由以下组成的组：抗-HER2；抗-CD20；抗-IL-8；抗-VEGF；抗-PSCA；抗-CD 11a；抗-lgE；抗-Apo-2受体；抗-TNF-α、抗-组织因子(TF)；抗-CD3；抗-CD25；抗-CD34；抗-CD40；抗-tac；抗-CD4；抗-CD52；抗-Fc受体；抗-癌胚抗原(CEA)抗体；针对乳腺上皮细胞的抗体；结合直肠癌细胞的抗体；抗-CD33；抗-CD22；抗-EpCAM；抗-GpIIb/IIIa；抗-RSV；抗-CMV；抗-HIV；抗-肝炎；抗-αvβ3；抗-人肾细胞癌；抗-人17-1A；抗-人结肠直肠肿瘤；抗-人黑色素瘤；抗-人鳞状细胞癌；和抗-人白细胞抗原(HLA)抗体。
12.权利要求1的方法，其中生物分子是选自由以下组成的组的抗体：抗-HER2受体、抗-VEGF、抗-Ig、抗-CD20、抗-CD11a、和抗-CD40抗体。
13.权利要求1的方法，其中所述生物分子选自由免疫粘附素和抗体样分子组成的组。
14.权利要求1的方法，其中所述生物分子是抗体样分子，且所述抗体样分子是融合了或缀合了CH2/CH3区域的蛋白。
15.权利要求1的方法，其中所述生物分子是抗体样分子，且所述抗体样分子是融合了或缀合了CH2/CH3区域的蛋白，并且所述蛋白选自由以下组成的组：凝乳酶；生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；因子VIIIC；因子IX；组织因子；冯维勒布兰德因子；蛋白C；心钠素；肺表面活性物质；尿激酶；人类尿液和组织型纤溶酶原活化剂(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1α)；血清白蛋白；Muellerian-抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺素关联肽；β-内酰胺酶；DNase；IgE、细胞毒T淋巴细胞关联抗原(CTLA)；抑制素；活化素；血管内皮细胞生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；骨衍生神经营养因子(BDNF)；神经营养蛋白-3、-4、-5、和-6(NT-3、NT-4、NT-5、和NT-6)，神经生长因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)；CD蛋白；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素-α、-β、和-γ；集落刺激因子(CSF)；白介素IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原；运输蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白；肿瘤相关抗原；及其片段。
16.权利要求1的方法，进一步包括将回收的生物分子掺入药物配制物的步骤。
17.权利要求1的方法，其中所述一或多种聚合物通过第一模式与带相反电荷的固体粒子以及部分的可溶杂质复合而沉淀，其量足以形成不能再维持在溶液中的聚集物。
18.权利要求1的方法，其中所述一或多种聚合物选自由以下组成的组：聚乙烯基吡啶、乙烯基吡啶的共聚物、含伯胺的聚合物、含仲胺的聚合物和含叔胺的聚合物。
19.权利要求1的方法，进一步包括在使所述一或多种聚合物进入溶液的条件下将所述一或多种聚合物加入到载液中，并将该载液和溶液中的一或多种聚合物通过静态混合器而加入到所述混合物中。
20.权利要求1的方法，进一步包括将回收的生物分子配制到药物可接受的载体中。
21.权利要求1的方法，进一步包括将回收的生物分子配制到药物可接受的载体中以用于选自由研究、诊断和治疗目的组成的组的目的。
22.权利要求1的方法，进一步包括从所述聚合物回收所述生物分子并且所回收的生物分子相对于初始混合物其杂质具有至少1LRV的下降。
23.权利要求1的方法，其中通过在引起所述聚合物保持其沉淀状态而未结合所述生物分子的条件下洗脱所述生物分子并将沉淀的聚合物与所述生物分子分离，来将该生物分子从所述聚合物回收，。
24.权利要求1的方法，其中所述聚合物是季铵化的聚乙烯基吡啶，其中所述季铵化是50％或更低，第一模式选自亲水和疏水的部分组成的组，并且第二模式选自羧基、吡啶基和配体组成的组。
25.权利要求1的方法，其中所述聚合物选自季铵化的聚乙烯基吡啶、聚乙烯胺、聚烯丙基胺、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚(甲基丙烯酰丙基三甲基氯化铵)组成的组，第一模式选自亲水和疏水的部分组成的组，并且第二模式选自羧基、吡啶基和配体组成的组。
26.权利要求1的方法，其中所述聚合物选自季铵化的聚乙烯基吡啶、聚乙烯胺、聚烯丙基胺、聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和聚(甲基丙烯酰丙基三甲基氯化铵)组成的组，第一模式选自亲水和疏水的部分组成的组，并且第二模式选自羧基、吡啶基和配体组成的组，所述配体选自由蛋白A、蛋白G、MEP和MAB组成的组。
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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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