CN111333776B - 一种氮杂环类有机聚合物整体材料及制备与应用 - Google Patents

一种氮杂环类有机聚合物整体材料及制备与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111333776B
CN111333776B CN202010200243.5A CN202010200243A CN111333776B CN 111333776 B CN111333776 B CN 111333776B CN 202010200243 A CN202010200243 A CN 202010200243A CN 111333776 B CN111333776 B CN 111333776B
Authority
CN
China
Prior art keywords
organic polymer
nitrogen heterocyclic
pore
nitrogen
mass
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010200243.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111333776A (zh
Inventor
王启钦
江正瑾
雷雨田
刘潇
徐蓉蓉
沈媛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan University
Original Assignee
Jinan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan University filed Critical Jinan University
Priority to CN202010200243.5A priority Critical patent/CN111333776B/zh
Publication of CN111333776A publication Critical patent/CN111333776A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111333776B publication Critical patent/CN111333776B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F226/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • C08F226/06—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen by a heterocyclic ring containing nitrogen
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
    • B01J20/265—Synthetic macromolecular compounds modified or post-treated polymers
    • B01J20/267—Cross-linked polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J9/00—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof
    • C08J9/28—Working-up of macromolecular substances to porous or cellular articles or materials; After-treatment thereof by elimination of a liquid phase from a macromolecular composition or article, e.g. drying of coagulum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2339/00—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and at least one being terminated by a single or double bond to nitrogen or by a heterocyclic ring containing nitrogen; Derivatives of such polymers
    • C08J2339/04—Homopolymers or copolymers of monomers containing heterocyclic rings having nitrogen as ring member

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

本发明属于生物医用材料领域，公开了一种氮杂环类有机聚合物整体材料及制备与应用。所述制备方法为：将氮杂环类单体化合物、交联剂、致孔剂和引发剂混合，然后超声溶解、脱气后灌入容器内，在40～80℃温度或紫外光照条件下聚合反应，得到所述氮杂环类有机聚合物整体材料。本发明所得氮杂环类有机聚合物整体材料可用于复杂生物样本中单抗药物的捕获。具有制备策略简单快速、成本低、通透性好、理化性质稳定、使用寿命长、非特异性吸附少、洗脱条件温和不会对抗体蛋白的构象、活性等产生破坏的优点。

Description

一种氮杂环类有机聚合物整体材料及制备与应用
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种氮杂环类有机聚合物整体材料及制备与应用。
背景技术
单克隆抗体药物由于其出色的疗效，已经成为治疗各种癌症、传染性疾病、和自身免疫性疾病的发展最迅速的生物药物之一[Nature Reviews Immunology,2010,10(5):317.]。据统计，全球单克隆抗体市场在2018年达到1350亿美元，并且预计到2022年将达到2120亿美元，因此市场价值巨大，经济效益十分可观[MonoclonalAntibodies(MAbS)GlobalMarket Report 2020]。生物制药市场对单抗药物的急剧增长的需求推动了上游生产中药物滴度的增加，而这也给当前的下游纯化工艺增加了沉重的负担[ActaBiomaterialia 95(2019)73-90]。现如今，最常用的下游纯化技术仍然是基于蛋白质A/G的亲和色谱，其通过结合单抗的可结晶区域(Fc区)而具有出色的特异性和选择性，可以实现有效的单抗纯化。但是该技术通常具有相对高的成本，给下游纯化工艺甚至整个单抗药物制药过程带来了一定压力；此外，该技术的一些内在缺陷，如配体理化性质的不稳定、由于配体泄露而导致的免疫反应、所使用的琼脂糖基质带来的非特异性吸附等，均会对单抗的富集纯化效果产生影响[Biotechnol.Prog.2016,32,1193–1202.]。
为了克服基于蛋白质A/G的传统亲和色谱法面临的困境并提高下游纯化能力，各种新颖的纯化技术，包括基于仿生配体(肽，亲和体或适体)的亲和色谱法，基于伪生物特异性配体的色谱法和基于小分子的非亲和色谱法也陆续被开发出来[Acta Biomaterialia95(2019)73–90]。其中，仿生亲和配体与蛋白A/G相比，具有可比拟的亲和性和选择性。本课题组曾将DAAG肽仿生配体固定到有机聚合物整体材料上，并成功应用于复杂生物样本中单抗药物的纯化和富集[Analytica ChimicaActa 1017(2018)57e65]。然而，要设计并筛选出类似设计巧妙且效果优良的新型仿生配体通常是耗时耗力的，此外，配体的相对高昂合成成本也成为该技术发展的阻力[Journal ofChromatographyA,2009,1216(6):910-918.]。
与此同时，基于伪生物特异性配体的色谱法和基于小分子的非亲和色谱法也正在发展中。其中，以组氨酸为配体的伪特异性色谱法(HLAC)以其低成本且无毒的特性由于受到广泛研究[Bioseparation,1992,3(1):47-53.]。疏水电荷诱导层析(HCIC)作为一种新型的非亲和色谱法，以其盐不依赖性和温和的洗脱条件备受关注。4-巯基乙基吡啶(MEP)，一种典型的HCIC配体，被证明具有优异的富集纯化效果并用于商业化[BioconjugateChem.2017,28,2009-2030]。随后一些具有类似结构的HCIC配体，例如2-巯基-1-甲基咪唑(MMI)[Biochem.Eng.J.119(2017)34–41]，2-巯基苯并咪唑(MBI)[Industrial&Engineering Chemistry Research,2008,47(23):9566-9572.]和5-氨基吲哚(ABI)[J.Sep.Sci.38(2015)2387–2393.]等也在近些年陆续被开发出来。然而，无论是HLAC还是HCIC技术，它们也有着如下的缺陷：1.它们通常使用琼脂糖作为基质，因此可能会具有较差的传质和机械强度，进而影响富集纯化效果[Journal ofproteome research,2006,5(5):1186-1194.]；2.色谱材料的制备通常要经过基质的活化和配基的接枝等复杂步骤，不仅增加了制备工艺的复杂性也对技术的稳定性和可重复利用性带来了困难[JournalofChromatographyA,1369(2014)116–124]；3.由于特异性的缺乏会带来一定的非特异性吸附，因此很少有配体可以成功用于复杂生物样本中单抗药物的富集纯化。
仔细观察HLAC和HCIC配基的化学结构，不难发现其中均含有含氮杂环。且相应的文献也曾报道，这些氮杂环在抗体的识别和捕获中占有重要的位置。其他的辅助作用力则来源于配基中的其他化学基团与抗体之间的相互作用，如HCIC侧链的含硫基团[J.Chromatogr.A 1260(2012)143–153]，HLAC上的游离氨基或者羧基[J.Chromatogr.B1021(2016)129–136]，以及它们间隔臂上的一些基团。但是目前为止仍然没有研究来对单独的含氮杂环的小分子配基进行考察。
因此，开发具有低成本、高稳定性、良好的选择性、较好的结合力、较大的吸附容量和简便的制备策略的新型富集材料，对于复杂生物样品中的单抗的富集纯化具有重要意义。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种氮杂环类有机聚合物整体材料的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的氮杂环类有机聚合物整体材料。
本发明的再一目的在于提供上述氮杂环类有机聚合物整体材料在单抗药物富集中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种氮杂环类有机聚合物整体材料的制备方法，包括如下制备步骤：
将氮杂环类单体化合物、交联剂、致孔剂和引发剂混合，然后超声溶解、脱气后灌入容器内，在40～80℃温度或紫外光照条件下聚合反应，得到所述氮杂环类有机聚合物整体材料；
所述氮杂环类单体化合物是指具有如下式(1)结构的咪唑类氮杂环化合物，式(2)结构的吡咯类氮杂环化合物，式(3)结构的吡唑类氮杂环化合物，式(4)结构的吡啶类氮杂环化合物，式(5)结构的嘧啶类氮杂环化合物，式(6)结构的吡嗪氮杂环类化合物，式(7)结构的哒嗪氮杂环类化合物，式(8)结构的三嗪氮杂环类化合物中的至少一种；
Figure BDA0002419116050000041
其中，R1～R5各自独立的为氢或烃基取代基，且各化合物中至少一个取代基含有碳碳双键。
优选地，所述氮杂环类单体化合物是指1-乙烯基咪唑(1-Vinylimidazole,VIM)。
进一步地，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、3-(N-甲基-N,N-二甲基丙烯酰氧乙基氨)丙烷磺酸盐、2-(N-甲基-N,N-二甲基丙烯酰氧乙基氨)乙烷羧酸盐和2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-[N-(2-甲基丙烯酰氧基)乙基]磷酰胆碱中的任意一种；所述氮杂环类单体化合物与交联剂的质量比为35:65～65:35。
优选地，所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)。
进一步地，所述致孔剂为正丙醇、正癸醇、异丙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、甲醇、环己醇、1,4丁二醇、正十二醇、水中的任意一种或两种以上的混合；所述氮杂环类单体化合物与交联剂的质量之和，与致孔剂的质量比为17:83～32:68。
优选地，所述致孔剂由正丙醇、正癸醇和去离子水组成。
进一步地，所述引发剂为热引发剂偶氮二异丁腈或光引发剂安息香双甲醚，或2,2’-偶氮二异丁腈脒二盐酸盐、过氧化苯甲酰、过氧化双月桂酰中的任意一种，所述引发剂的加入量为氮杂环类单体化合物质量的1％。
进一步地，所述容器为不锈钢管、玻璃管、毛细管、固相萃取小柱、移液枪头、固相萃取吸头、磁性纳米颗粒、薄层板、滤纸、滤膜或玻璃单体瓶。
优选地，所述容器为移液枪头或经过γ-MAPs(3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷)预处理过的毛细管。
进一步地，所述聚合反应的时间为0.5～24h，所述聚合反应完成后，用甲醇进一步冲洗除去致孔剂、未反应的单体、交联剂和低聚物。
一种氮杂环类有机聚合物整体材料，通过上述方法制备得到。
上述氮杂环类有机聚合物整体材料在单抗药物富集中的应用。
进一步地，所述应用步骤为：将氮杂环类有机聚合物整体材料使用淋洗缓冲液平衡一段时间，再加入含单抗药物的样品溶液，接着利用淋洗缓冲液洗脱杂质，最后使用洗脱缓冲液洗脱被特异性吸附的单抗药物，即得到富集纯化后的单抗药物；所述淋洗缓冲液的组成为50mM磷酸盐，0～500mM氯化钠，pH＝6.0～9.0；所述洗脱缓冲溶液的组成为10mM甲酸钠，0～500mM氯化钠，pH＝2.7～5.0。
进一步地，所述淋洗缓冲液平衡时间为0～60min。
进一步地，所述含单抗药物的样品溶液是指含单抗药物的蛋白溶液、细胞培养液或血清。
优选地，所述单抗药物是指人免疫球蛋白(hIgG)、英夫利昔(Infliximab)、利妥昔(Rituximab)、曲妥珠(Transtuzumab)或贝伐珠(Bevacizumab)。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
(1)本发明首次报道了以氮杂环类功能单体制备的整体材料用于复杂生物样本中单抗药物的捕获。该氮杂环类功能单体与单抗有着较好的结合力，且简单易得、价格低廉、吸附量大，可与交联剂、生孔剂通过快速的一步聚合策略形成稳定有机聚合物整体富集材料。
(2)本发明制备的有机聚合物整体富集材料相比较于传统的基于蛋白质A/G亲和色谱法、基于仿生配基亲和色谱法、基于伪生物特异性配体的色谱法和基于氮杂环类小分子的非亲和配基的色谱法，其表现出诸多独特的优点：制备策略简单快速、成本低、通透性好、理化性质稳定、使用寿命长、非特异性吸附少、洗脱条件温和不会对抗体蛋白的构象、活性等产生破坏等。
(3)本发明制备的有机聚合物整体富集材料可应用于蛋白溶液、细胞培养液或血清样品中目标单抗药物的富集，有利于实现产业化，为单抗药物制备的下游的纯化工艺提供了一种有潜力的平台。
附图说明
图1为实施例1所得PVIM有机聚合物整体材料的扫描电镜图。
图2为实施例1所得PVIM有机聚合物整体材料的能量分布面扫描分析图。
图3为实施例1所得PVIM有机聚合物整体色谱柱结合人免疫球蛋白(human serumimmunoglobulin G,hIgG)、英夫利昔(Infliximab)、利妥昔(Rituximab)、曲妥珠(trastuzumab)和其他蛋白的色谱图。
图4为实施例2所得PVIM有机聚合物整体色谱柱对hIgG的静态吸附曲线图。
图5为实施例2所得PVIM有机聚合物整体色谱柱对hIgG和HSA的动态吸附曲线图。
图6为实施例2所得PVIM有机聚合物整体色谱柱对含有hIgG、HAS和MYO的蛋白模型中hIgG的富集所收集淋洗/洗脱组分的SDS-PAGE分析图。
图7为实施例2所得PVIM有机聚合物整体色谱柱对Bevacizumab CHO细胞培养液(a)、Trastuzumab CHO细胞培养液(b)、Rituximab加标的BT-474细胞培养液(c)、Infliximab加标的BT-474细胞培养液(d)所收集淋洗/洗脱组分的SDS-PAGE分析图。
图8为实施例2所得PVIM有机聚合物整体色谱柱对人血清中hIgG的富集所收集淋洗/洗脱组分的SDS-PAGE分析图。
图9为实施例2所得PVIM有机聚合物整体色谱柱对贝伐单抗细胞培养液和人血清的富集洗脱部分的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)谱图。
图10为实施例2所得PVIM有机聚合物整体色谱柱对贝伐单抗细胞培养液和人血清的富集洗脱部分的SEC-HPLC谱图。
图11为实施例2所得PVIM有机聚合物整体色谱柱重复利用率测试结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
将功能单体1-乙烯基咪唑(VIM)、交联剂EDMA、致孔剂(正丙醇、正癸醇和去离子水组成)和引发剂AIBN，按照优化比例配制成聚合反应混合溶液，超声溶解、脱气后灌入100μm经过γ-MAPs预处理过的毛细管内，于60℃水浴中反应1.5h；用甲醇冲洗掉未反应的溶液得到PVIM有机聚合物整体色谱柱。其中单体VIM与致孔剂的质量比为22:78，单体VIM与交联剂EDMA的质量比为50:50，致孔剂正丙醇、正癸醇和去离子水的质量比为52.9:11.8:35.3，引发剂AIBN的质量为单体VIM的1％。
本实施例中得到的PVIM有机聚合物整体材料内部形貌的扫描电镜图(SEM)及能量分布面扫描分析图(Elemental mapping)分别如图1、2所示。其中SEM图表明PVIM具有多种尺寸的孔径，且大孔孔径能够达到微米级，有利于生物大分子的捕获和流动相的快速渗透(图1)。此外，能量分布面扫描分析图中N、O元素的存在表明VIM功能单体与EDMA交联剂均成功的锚定在了聚合物基质上(图2)。
实施例2
将功能单体1-乙烯基咪唑(VIM)、交联剂EDMA、致孔剂(正丙醇、正癸醇和去离子水组成)和引发剂AIBN，按照优化比例配制成聚合反应混合溶液，超声溶解、脱气后灌入200μL密封好的移液枪头内，于60℃水浴中反应1.5h；反应完毕后解除枪头的封闭状态，并将移液枪头与注射器连接，用甲醇冲洗掉未反应的溶液得到PVIM有机聚合物整体色谱柱。其中单体VIM与致孔剂的质量比为22:78，单体VIM与交联剂EDMA的质量比为50:50，致孔剂正丙醇、正癸醇和去离子水的质量比为52.9:11.8:35.3，引发剂AIBN的质量为单体VIM的1％。
实施例3
将功能单体1-乙烯基咪唑(VIM)、交联剂EDMA、致孔剂(正丙醇、正癸醇和去离子水组成)和引发剂AIBN，按照优化比例配制成聚合反应混合溶液，超声溶解、脱气后灌入200μL密封好的移液枪头内，于60℃水浴中反应1.5h；反应完毕后解除枪头的封闭状态，并将移液枪头与注射器连接，用甲醇冲洗掉未反应的溶液得到PVIM有机聚合物整体色谱柱。其中单体VIM与致孔剂的质量比为27:73，单体VIM与交联剂EDMA的质量比为50:50，致孔剂正丙醇、正癸醇和去离子水的质量比为52.9:11.8:35.3，引发剂AIBN的质量为单体VIM的1％。
实施例4
将功能单体1-乙烯基咪唑(VIM)、交联剂EDMA、致孔剂(正丙醇、正癸醇和去离子水组成)和引发剂AIBN，按照优化比例配制成聚合反应混合溶液，超声溶解、脱气后灌入200μL密封好的移液枪头内，于60℃水浴中反应6h；反应完毕后解除枪头的封闭状态，并将移液枪头与注射器连接，用甲醇冲洗掉未反应的溶液得到PVIM有机聚合物整体色谱柱。其中单体VIM与致孔剂的质量比为32:78，单体VIM与交联剂EDMA的质量比为50:50，致孔剂正丙醇、正癸醇和去离子水的质量比为52.9:11.8:35.3，引发剂AIBN的质量为单体VIM的1％。
实施例5
将功能单体1-乙烯基咪唑(VIM)、交联剂EDMA、致孔剂(正丙醇、正癸醇和去离子水组成)和引发剂AIBN，按照优化比例配制成聚合反应混合溶液，超声溶解、脱气后灌入200μL密封好的移液枪头内，于60℃水浴中反应1h；反应完毕后解除枪头的封闭状态，并将移液枪头与注射器连接，用甲醇冲洗掉未反应的溶液得到PVIM有机聚合物整体色谱柱。其中单体VIM与致孔剂的质量比为17:83，单体VIM与交联剂EDMA的质量比为50:50，致孔剂正丙醇、正癸醇和去离子水的质量比为52.9:11.8:35.3，引发剂AIBN的质量为单体VIM的1％。
上述实施例的PVIM有机聚合物整体柱在mAbs纯化中的应用效果测试，具体步骤为：将氮杂环类有机聚合物整体色谱柱先使用淋洗缓冲液平衡一段时间，再加入含单抗的样品溶液，接着利用淋洗缓冲液洗脱杂质，最后使用洗脱缓冲液洗脱被特异性吸附的单抗药物，即得到纯化后的单抗药物。
(1)考察以实施例1所得有机聚合物色谱柱对单抗的特异性结合能力：
色谱条件为：
色谱柱：150mm×100μm i.d.；
样品：人免疫球蛋白(hIgG)、英夫利昔(Infliximab)、利妥昔(Rituximab)曲妥珠(Transtuzumab)、人血清白蛋白(HSA)、β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)、肌红蛋白(myoglobin)；
流动相A：50mM/L磷酸缓冲溶液(PB)，100mM/L氯化钠(NaCl)，pH＝7.4；
流动相B：10mM/L甲酸钠，100mM/L氯化钠(NaCl)，pH＝3.3；
流速：2μL/min；
检测波长：280nm；
进样量：1μL。
所得PVIM有机聚合物整体色谱柱结合hIgG、Infliximab和其他抗体的色谱图如图3所示。图3结果表明，在流动相A的冲洗过程中，HSA、β-lactoglobulin、和myoglobin都被快速冲洗出来，待6分钟时流动相由A转换成B后，hIgG、Infliximab、Rituximab和Trastuzumab才被洗脱下来，说明该柱对mAbs有一定的特异性结合能力。
(2)分别考察以实施例2所得有机聚合物整体材料对hIgG的静态吸附能力：
实验条件为：
吸附剂：PVIM有机聚合物整体材料粉末；
样品：hIgG(0.0625～3mg/mL)；
稀释缓冲液：50mM/L乙酸钠缓冲溶液，100mM/L氯化钠(NaCl)，pH＝5.0；50mM/L磷酸缓冲溶液(PB)，100mM/L氯化钠(NaCl)，pH＝6.0；50mM/L磷酸缓冲溶液(PB)，100mM/L氯化钠(NaCl)，pH＝7.0；50mM/L磷酸缓冲溶液(PB)，100mM/L氯化钠(NaCl)，pH＝8.0；
摇床转速：2000rpm；
混合时间：12h；
检测波长：280nm；
所得整体色谱柱对hIgG的静态吸附曲线图如图4所示。可见当缓冲液pH值为7.0–8.0时，可以得到最高的静态吸附容量。pH 7.0和pH 8.0下的平衡吸附容量(Qm)由朗缪尔曲线拟合得出分别是197.7和193.9mg/g聚合物。表明该材料对hIgG有较高的静态吸附能力。
(3)分别考察以实施例2所得有机聚合物整体材料对hIgG和HSA的动态吸附能力：
色谱条件为：
吸附剂：PVIM有机聚合物整体材料；
样品：hIgG、HSA；
淋洗液：50mM/L磷酸缓冲溶液(PB)，100mM/L氯化钠(NaCl)，pH＝7.4；
总流速：2μL/min；
检测波长：280nm；
进样量：200μL。
所得整体色谱柱对hIgG和HSA的动态吸附曲线图如图5所示。可见随着hIgG灌注的体积的增加，该柱对hIgG的动态吸附量逐渐增大；但是在极少量体积的HAS灌注时，PVIM对HAS就已经达到吸附饱和，表明该材料对HSA的非特异性吸附有着较低水平。
(4)以实施例2所得有机聚合物整体材料为吸附剂，考察其对人免疫球蛋白hIgG的特异选择性：
以含有人免疫球蛋白G(IgG)、人血清白蛋白(HSA)、肌红蛋白(Myoglobin)的蛋白模型为测试样品，考察该吸附剂对hIgG的特异选择性。
测试条件为：
吸附剂：PVIM有机聚合物整体材料；
样品：HSA、IgG、MYO；
淋洗液：50mM磷酸盐缓冲溶液(PB)，100mM氯化钠(NaCl)，pH＝7.4；
洗脱液：10mM甲酸钠，100mM氯化钠(NaCl)，pH＝3.3；
进样量：100μL。
流速：100μL/min。
得到的PVIM有机聚合物整体材料对含有hIgG、HAS和MYO的蛋白模型中hIgG的富集所收集淋洗/洗脱组分的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析图如图6所示。由图6结果可知，在淋洗步骤中杂蛋白都能被淋洗液冲洗完全，在洗脱液中只存在hIgG，这证明了PVIM有机聚合物整体材料对hIgG具有较好的特异选择性。
(5)考察以实施例2所得有机聚合物整体材料用于单抗细胞培养液中目标抗体的富集：
色谱条件为：
吸附剂：PVIM有机聚合物整体材料；
样品：Bevacizumab CHO细胞培养液、Trastuzumab CHO细胞培养液、Infliximab加标的BT-474细胞培养液、Rituximab加标的BT-474细胞培养液；
淋洗液：50mM磷酸盐缓冲溶液(PB)，100mM氯化钠(NaCl)，pH＝7.4；
洗脱液：10mM甲酸钠，100mM氯化钠(NaCl)，pH＝3.3；
流速：1μL/min；
检测波长：280nm；
进样量：100μL。
所得PVIM有机聚合物整体材料对Bevacizumab CHO细胞培养液(a)、TrastuzumabCHO细胞培养液(b)、Rituximab加标的BT-474细胞培养液(c)、Infliximab加标的BT-474细胞培养液(d)所收集淋洗/洗脱组分的SDS-PAGE分析如图7所示。图7结果显示，大量杂质在上样和淋洗时被淋洗缓冲液洗脱下来；当使用洗脱缓冲液时，目标单抗才逐渐被洗脱，且洗脱组分中几乎不存在其他的杂蛋白条带。同时，Bevacizumab CHO培养液洗脱组分的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析结果如图9所示。结果显示，洗脱液中的Bevacizumab(b)的谱图几乎与标准Bevacizumab单样(a)的一致，表明该材料有潜力用于细胞培养液中目标单抗的富集纯化。
(6)考察以实施例2所得有机聚合物整体材料用于人血清中hIgG的富集：
色谱条件为：
吸附剂：PVIM有机聚合物整体材料；
样品：稀释10倍的人血清；
淋洗液：50mM磷酸盐缓冲溶液(PB)，100mM氯化钠(NaCl)，0.05％吐温20，pH＝7.4；
洗脱液：10mM甲酸钠，100mM氯化钠(NaCl)，pH＝3.3；
流速：1μL/min；
检测波长：280nm；
进样量：100μL。
所得PVIM有机聚合物整体材料对人血清中所收集淋洗/洗脱组分的SDS-PAGE分析如图8所示。图8结果显示，大量杂质在上样和淋洗时被淋洗缓冲液洗脱下来；当使用洗脱缓冲液时，hIgG才逐渐被洗脱，且洗脱组分中几乎不存在其他的杂蛋白条带。同时，人血清洗脱组分的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析结果如图9所示。结果显示，洗脱液中的hIgG(d)的谱图几乎与标准hIgG(c)的一致，表明该材料有潜力用于人血清中hIgG的富集纯化。
(7)考察以实施例2所得的PVIM有机聚合物整体色谱柱对贝伐单抗细胞培养液和人血清的富集洗脱部分的分子尺寸排阻色谱(SEC-HPLC)分析：
色谱条件为：
吸附剂：分子尺寸排阻色谱柱(7.8×300mm,5μm)；
样品：Bevacizumab CHO细胞培养液纯化的洗脱组分、稀释10倍的人血清纯化的洗脱组分；
流动相：200mM磷酸盐缓冲溶液(PB)，1％异丙醇，pH＝7.4；
流速：0.8μL/min；
检测波长：280nm；
进样量：25μL。
所得PVIM有机聚合物整体材料对Bevacizumab CHO细胞培养液和人血清收集的洗脱组分的SEC-HPLC分析如图10所示。结果显示，Bevacizumab CHO细胞培养液的洗脱组分中几乎只有Bevacuzumab的色谱峰，通过面积归一化法计算得到的纯度约为95％；人血清的洗脱组分中几乎只有hIgG的色谱峰，通过面积归一化法计算得到的纯度约为93％。表明该材料有潜力用于真实生物样本中目标单抗的富集纯化。
(8)考察以实施例2所得的PVIM有机聚合物整体材料的重复利用率：
色谱条件为：
吸附剂：PVIM有机聚合物整体材料；
样品：Bevacizumab CHO细胞培养液；
淋洗液：50mM磷酸盐缓冲溶液(PB)，100mM氯化钠(NaCl)，pH＝7.4；
洗脱液：10mM甲酸钠，100mM氯化钠(NaCl)，pH＝3.3；
流速：1μL/min；
检测波长：280nm；
进样量：100μL。
所得PVIM有机聚合物整体材料的重复利用率结果如图11所示。可见经过连续10次的重生循环后，柱对Bevacizumab的纯度始终维持90％以上，回收率也始终维持80％以上，表明该材料稳定性好，可多次重复使用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种氮杂环类有机聚合物整体材料的应用，其特征在于将所述氮杂环类有机聚合物整体材料用于含单抗药物的蛋白溶液、细胞培养液或血清中对目标单抗药物富集；
所述氮杂环类有机聚合物整体材料的制备步骤包括：
将1-乙烯基咪唑、交联剂、致孔剂和引发剂混合，然后超声溶解、脱气后灌入容器内，在40~80℃温度或紫外光照条件下聚合反应，得到所述氮杂环类有机聚合物整体材料；
所述交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述氮杂环类单体化合物与交联剂的质量比为35:65～65:35；所述致孔剂为正丙醇、正癸醇、异丙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、甲醇、环己醇、1,4丁二醇、正十二醇、水中的任意一种或两种以上的混合；所述氮杂环类单体化合物与交联剂的质量之和，与致孔剂的质量比为17:83～32:68；所述引发剂为热引发剂偶氮二异丁腈或光引发剂安息香双甲醚 ，或2,2’-偶氮二异丁腈脒二盐酸盐、过氧化苯甲酰、过氧化双月桂酰中的任意一种，所述引发剂的加入量为氮杂环类单体化合物质量的1%。
2.根据权利要求1所述的一种氮杂环类有机聚合物整体材料的应用，其特征在于：所述容器为不锈钢管、玻璃管、毛细管、固相萃取小柱、移液枪头、固相萃取吸头、磁性纳米颗粒、薄层板、滤纸、滤膜或玻璃单体瓶。
3.根据权利要求1所述的一种氮杂环类有机聚合物整体材料的应用，其特征在于：所述聚合反应的时间为0.5~24 h，所述聚合反应完成后，用甲醇进一步冲洗除去致孔剂、未反应的单体、交联剂和低聚物。
CN202010200243.5A 2020-03-20 2020-03-20 一种氮杂环类有机聚合物整体材料及制备与应用 Active CN111333776B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010200243.5A CN111333776B (zh) 2020-03-20 2020-03-20 一种氮杂环类有机聚合物整体材料及制备与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010200243.5A CN111333776B (zh) 2020-03-20 2020-03-20 一种氮杂环类有机聚合物整体材料及制备与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111333776A CN111333776A (zh) 2020-06-26
CN111333776B true CN111333776B (zh) 2021-11-09

Family

ID=71180270

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010200243.5A Active CN111333776B (zh) 2020-03-20 2020-03-20 一种氮杂环类有机聚合物整体材料及制备与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111333776B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115253720B (zh) * 2022-08-24 2023-08-01 暨南大学 一种磁性纳米粒子复合膜装置及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102256993A (zh) * 2008-12-16 2011-11-23 米利波尔公司 蛋白的纯化
CN105797689A (zh) * 2016-03-15 2016-07-27 厦门大学 一种基于两种交联剂多孔吸附剂的制备方法
CN105859962A (zh) * 2016-06-12 2016-08-17 中南大学 一种咪唑修饰后交联树脂的制备方法及应用
CN108043365A (zh) * 2017-12-14 2018-05-18 暨南大学 一种基于仿生小肽配基的亲和富集整体材料及制备与应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009007993A2 (en) * 2007-04-23 2009-01-15 Arvind Mallinath Lali A process for purification of immunoglobulins using a pseudobioaffinity adsorbent
US9284347B2 (en) * 2010-01-22 2016-03-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Chromatographic method for purifying FC-containing proteins

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102256993A (zh) * 2008-12-16 2011-11-23 米利波尔公司 蛋白的纯化
CN105797689A (zh) * 2016-03-15 2016-07-27 厦门大学 一种基于两种交联剂多孔吸附剂的制备方法
CN105859962A (zh) * 2016-06-12 2016-08-17 中南大学 一种咪唑修饰后交联树脂的制备方法及应用
CN108043365A (zh) * 2017-12-14 2018-05-18 暨南大学 一种基于仿生小肽配基的亲和富集整体材料及制备与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"功能化聚合物基质整体色谱柱的研究进展";王启钦;《分析测试学报》;20181025;全文 *
"特异性小肽亲和整体柱对单抗药的富集纯化策略研究";王祥宇;《暨南大学硕士论文》;20180630;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111333776A (zh) 2020-06-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Babac et al. Binding of antibodies to concanavalin A-modified monolithic cryogel
Ertürk et al. Cryogels-versatile tools in bioseparation
Mallik et al. Affinity monolith chromatography
Kikuchi et al. Intelligent thermoresponsive polymeric stationary phases for aqueous chromatography of biological compounds
Josić et al. Application of monoliths as supports for affinity chromatography and fast enzymatic conversion
Josić et al. Application of membranes and compact, porous units for the separation of biopolymers
US7355020B2 (en) Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method
US9643174B2 (en) Temperature responsive adsorbent having a strong cation exchange group and method for producing the same
Vergara-Barberan et al. Current trends in affinity-based monoliths in microextraction approaches: A review
Yuan et al. Preparation of high efficiency and low carry-over immobilized enzymatic reactor with methacrylic acid–silica hybrid monolith as matrix for on-line protein digestion
US20140046023A1 (en) Specific sorbent for binding proteins and peptides, and separation method using the same
Wang et al. Biomimetic small peptide functionalized affinity monoliths for monoclonal antibody purification
EP3048109A1 (en) Novel antibody purification method and antibody obtained therefrom, and novel antibody purification method using cation exchanger and antibody obtained therefrom
Yarmush et al. Immunoaffinity purification: basic principles and operational considerations
AU2001294253A1 (en) Stimulus responsive affinity chromatographic material and separation/purification method
CN111333776B (zh) 一种氮杂环类有机聚合物整体材料及制备与应用
CN115318256A (zh) 阴离子交换-疏水混合模式色谱树脂
CN108456280B (zh) 一种磷脂类有机聚合物整体材料及其制备方法和应用
EP2822687A2 (en) Anionic exchange-hydrophobic mixed mode
Fan et al. Purification of a monoclonal antibody using a novel high-capacity multimodal cation exchange nonwoven membrane
US20240001338A1 (en) Mixed mode cation exchange chromatography ligands based on 1,3-dioxoisoindolin-2-yl structures
CN109307771A (zh) 亲和层析定量检测重组人α干扰素工艺中间体含量的方法
CN102179237A (zh) 一种用于分离、提纯单克隆抗体和抗体球蛋白的亲和色谱填料及其制备方法
CN108191956B (zh) 组合型配基、组合型仿生层析介质及其制备方法和应用
CN108043365B (zh) 一种基于仿生小肽配基的亲和富集整体材料及制备与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant