JPH03296657A - 電気泳動用支持体およびそれを用いた電気泳動法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １棗上Ω■亙±！ 本発明は、ＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物か
らなる電気泳動用支持体に関する。さらに詳しくは温度
を変化させることによって親水的性質、疎水的性質を変
化させることが可能な電気泳動用支持体に関する。

良未立弦韮 電気泳動は電荷を有する物質の分析、分取を目的として
開発されたものであり、今日上としてタンパク質の最も
有力な分析手段である。アミノ酸には酸性、塩基性、中
性があり、アミノ酸から構成されるタンパク質は酸性、
塩基性、中性タンパク質に分類される。タンパク質は溶
液中では正又は負に荷電されていてこの溶液のｐＨを変
化させていくと、正電荷と負電荷が全く等しくなるｐＨ
があり、このｐＨをタンパク質の等電点と称して、等電
点がｐＨ７以下のものを酸性、ｐＨ７以上のものを塩基
性またＰＨ７近傍のものを中性タンパク質とそれぞれ呼
んでいる。したがってタンパク質の荷電は用いられる溶
液のｐＨと等電点との差によって生じ電気泳動で分離さ
れることになる。

従来の電気泳動は泳動の場の違いによって自由電気泳動
法と支持体電気泳動法に分類される。自由電気泳動法に
は自由界面電気泳動法、電気泳動対流法、毛細管中での
等速電気泳動法などがありいずれも試料を自由溶液中で
泳動させる方法であるがこの方法は、操作が煩雑で、分
析試料の保存が不可能であり、熱対流によってパターン
が乱れるなどの多くの欠点を有していて現在ではほとん
ど使用されていない。

一方、上記の欠点を有する自由電気泳動法にかわって今
日、支持体電気泳動法が盛んに用いられている。支持体
電気泳動に用いられている支持体としては寒天ゲル、ア
ガロースゲル、デンプンゲル、ポリアクリルアミドゲル
などのゲル状物質とろ紙、セルロースアセテート膜など
の多孔性膜が用いられている。これらの支持体を用いる
ことによって上記の自由電気泳動法の問題点が解決され
た。

一方、支持体電気泳動法の一つであるゲル電気泳動法の
特徴はゲル状物質の分子篩作用を利用して分子量によっ
てタンパク質を分離することが可能であるということで
ある。即ちドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）でタンパ
ク質を処理すると、タンパク質の電気泳動の易動度を左
右する２つの因子である電荷と分子量のうち電荷を一様
化することが可能であり易動度はタンパク質の分子量の
みに依存し分子量による分離が可能となる。またこのゲ
ルにｐＨ勾配を作りタンパク質をその等電点に集束させ
ることで分離する等電点電荷泳動法も可能である。

一方、多孔膜電気泳動法の特徴は電荷の差異に対する分
離能が高く、試料が極く微量で良く、泳動時間が極めて
短く、試料の保存が容易であるなどの実際的な使い易さ
にある。このため多孔性電気泳動法は血清、尿、髄液な
どの種々の体液中のタンパク分析に適している。したが
ってゲル電気泳動法は主として医学、生物学分野の基礎
的研究を行うのに対して適しており多孔膜電気泳動法主
として臨床検査領域における重要な診断方法として発展
してきた。

すでにのべたようにタンパク質分子の荷電と分子量は溶
液中のタンパク質の構造を決定する重要な因子であるが
さらに重要な因子と考えられているのが疎水結合である
。即ち水を媒体として作用する疎水結合がタンパク質の
安定化に大きく寄与していてタンパク質の疎水性が高く
なる程、疎水結合のタンパク質構造への寄与が大きいも
のと考えられている。

タンパク質を構成するアミノ酸にはすでにのべた酸性、
塩基性、中性といった荷電による分類以外に親水性、疎
水性といった性質による分類がある。即ち電気的には中
性であるが側鎖に疎水性基を有するアラニン、バリン、
ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェ
ニールアラニン、トリプトファンなどは典型的な疎水性
アミノ酸であるのに対して側鎖に親水性基を有するグリ
シン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン、
グルタミンなどは典型的な親水性アミノ酸である。した
がって−量的には親、疎水性アミノ酸の組成と比例して
タンパク質の親、疎水性度が決まると考えられている。

すでにのべたように従来の電気泳動法ではタンパク質の
荷電密度と分子量の違いのみがタンパク質の分離に利用
されていた。そして、もう１つの重要な因子であるタン
パク質の親、疎水性度の違いを利用した分離は全く行わ
れていなかった。即ち、分子量と荷電密度は同程度であ
るが親、疎水的性質が異なるタンパク質は従来分離する
ことができなかった。したがって従来の電気泳動法では
、特に疎水性の強いリポタンパク質や、膜内在住タンパ
ク質などの疎水性部分の相違による分離、また親水性の
強い糖タンパク質の親水性部分の相違による分離はほと
んど不可能であるという大きな問題点を有していた。

が　　しようと　る 本発明の目的は、従来の電気泳動法では不可能であった
疎水性度あるいは親水性度のちがいを利用したタンパク
質の分離を可能にする電気泳動用支持体を提供すること
にある。また、本発明は、かかる電気泳動用支持体を用
いた新しい電気泳動法を提供することも目的とする。

を　　　るための 上記の目的は新規な電気泳動用支持体を提供する本発明
によって達成された。

本発明の電気泳動用支持体はＬＣＳＴを有する温度感応
性高分子化合物からなることを特徴とする。ここでＬ　
ＣＳ　Ｔ　（Ｌｏｗｅｒ　Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｓｏｌｕ
ｔｉｏｎＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　）とは温度感応性高
分子化合物の水和と脱水和の転移温度をいう。

本発明の電気泳動用支持体はＬＣＳＴを有する温度感応
性高分子化合物のみからなるものであってもよいし、該
高分子化合物が担体にコーティングあるいはグラフトさ
れているものであってもよい、また該高分子化合物は架
橋構造を有していてもよい、ＬＣＳＴを有する温度感応
性高分子化合物は水の共存下に於いて、ＬＣＳＴ以上の
温度では疎水的性質を示し、温度をＬＣ９Ｔ以下に下げ
ると親木的性質を示すように変化する。この疎水性と親
水性の間の変化は可逆的である。

温度感応性高分子化合物の状態変化は、水和と脱水和に
よるものとされている。これについては、［ａｓｋｉｎ
ｓ、　　Ｎ、、　　ｅｔ　　ａｌ、、　　Ｊ、　　Ｍａ
ｃｒｏｍｏｌ、　　Ｓｅｉ、−Ｃｈｅｗ。

＾２（８）、　１４４１．１９６８に、該高分子化合物
のひとつであるポリ−Ｎ−イン１０ピルアクリルアミド
（ＰＮＩＰ＾＾ｍ）を例に挙げて説明がなされている６
ＰＮＩＰ＾＾耐よ水に対する溶解度温度係数が負の高分
子化合物である。そして、低温においては、ＰＮＩＰ＾
＾躊分子と水分子との水素結合に依存する水和物（オキ
ソニウムヒドロキシド）が生成している。

しかし、これはＬＣＳＴ以上に温度を上げることによっ
て分解し、脱水和するため、結果としてＰＨＩＰＡ＾−
分子同士が凝集して沈澱するとされている。

電気泳動用支持体として該温度感応性高分子化合物から
なる担体を用いると担体の疎水的性質あるいは親水的性
質を温度によって可逆的に変えて電気泳動を実施するこ
とが可能になる。即ちＬＣＳＴ以上の温度で電気泳動を
行うと、支持体が疎水的であるために疎水性の強いタン
パク質が支持体と疎水結合を形成する。このため１．疎
水性の強いタンパク質は、支持体との親和性が高いため
に泳動が阻止される。一方、ＬＣＳＴ以下に温度を下げ
ると、支持体は親木的になり疎水性タンパク質との親和
性が低下して泳動の阻害が解除される。

それと同時に親水性の強いタンパク質と支持体との親和
力が高まるため、親水性のタンパク質の泳動は阻止され
る。上記のようにＬＣＳＴの上下の温度で電気泳動する
ことによってたとえ、分子量およぶ荷電量がほぼ同程度
であり、従来の電気泳動法では分離することが不可能で
あったチタンバク質の場合でも、親・疎水性の違いを利
用する本発明の電気泳動法によって分離が可能になる。

一方、本発明の温度感応性高分子からなる支持体を用い
て、陽極−陰極間にＬＣＳＴ以下の温度からＬＣＳＴ以
上の温度にわたる温度勾配を作り電気泳動を行うことも
可能である。即ち、陽極側をＬＣＳＴ以下の温度に陰極
側をＬＣＳＴ以上の温度に設定すると支持体の性質は陽
極側では親水的であり陰極側に向かうにしたがって疎水
的となり支持体に疎水性あるいは親水性の勾配を作製す
ことが可能となる。また同様に全く逆の勾配を作ること
も可能である０本明細書において「陽極−陰極間にＬＣ
ＳＴ以下の温度からＬＣＳＴ以上の温度にわたる温度勾
配をつくる」という表現は、これら正逆両方の温度勾配
を含むものである。上記のように疎水性あるいは親水性
の勾配を有した本発明の支持体を用いて電気泳動を行う
と、たとえ分子量および荷電量がほぼ同程度で従来の電
気泳動法では分離が不可能であったタンパク質であって
も、疎水性あるいは親水性の相違を利用して分離するこ
とが可能となる。

また、本発明の電気泳動用支持体に試料をチャージした
後、ＬＣＳＴの上下で温度を変化させることによって試
料をより確実かつ明確に分離することもできる０例えば
、ＬＣＳＴ以下の温度で試料をチャージし、ＬＣＳＴ以
上の温度で電気泳動を行ったり、逆にＬＣＳＴ以上の温
度で試料をチャージしＬＣＳＴ以下の温度で電気泳動を
行うことが可能である０本発明の電気泳動法は、これら
の例に代表される操作からなる電気泳動法を含むもので
ある。

本発明の支持体に使用することのできる温度感応性高分
子化合物としては、ポリＮ置換アクリルアミド誘導体、
ポリＮ置換メタアクリルアミド誘導体およびこれらの共
重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリエチレンオキ
サイド、エーテル化メチルセルロース、ポリビニルアル
コール部分酸化物などが挙げられる。特に好ましいのは
、ポリＮ置換アクリルアミド誘導体またはポリＮ置換メ
タアクリルアミド誘導体またはこれらの共重合体、ポリ
ビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化
物である。

好ましい高分子化合物を以下にＬＣＳＴが低い順に列挙
する ポリ−Ｎ−アクリロイルピペリジン； ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ
−イソプロピルアクリルアミド；ポリーＮ、Ｎ−ジエチ
ルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルメタアクリ
ルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド：
ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン； ポリーＮ、Ｎ−エチルメチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ
−シクロプロピルメタアクリルアミドポリ−Ｎ−エチル
アクリルアミド 上記の高分子は単独でも、他の単量体と共重合してもよ
い、共重合する単量体としては、親水性単量体、疎水性
単量体のいずれも用いることができる。−量的には親水
性単量体と共重合するとＬＣＳＴは上昇し、疎水性単量
体と共重合するとＬＣＳＴは下降する。従って、これら
を選択することによっても所望のＬＣＳＴを有する高分
子化合物を得ることができる。

親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリドン、ビニル
ピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ−
メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレ
ート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチ
ルメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、
酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれ
らの塩、とニルスルホン酸、スチルスルホン酸など、並
びに塩基性基を有するＮ、Ｎ−ジメチルアミノエチルメ
タクリレート、Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリ
レート、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミ
ドおよびそれらの塩などが挙げられるがこれらに限定さ
れるものではない。

一方、疎水性単量体としては、エチルアクリレート、メ
チルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等のア
クリレート誘導体およびメタクリレート誘導体、Ｎ−ｎ
−ブチルメタアクリルアミドなとのＮ置換アルキルメタ
アクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル
、スチレン、酢酸ビニルなどが挙げられるが、これらに
限定されるものではない。

上記の温度感応性高分子化合物自身から電気泳動用支持
体を作製する方法は特に制限されない。

最も好ましい方法は湿式製膜法である。湿式製膜の条件
（溶媒種、高分子濃度、温度、凝固剤種など）を適宜選
択することによって膜の孔径および空孔率を調節するこ
とが可能である。孔径は０．１〜１００−一、好ましく
は０．５〜５１ｍ　；空孔率は１０％〜９５％、好まし
くは５０％〜９０％とすることができる。

一方、上記温度感応性高分子化合物を多孔性の担体にコ
ーティングあるいはグラフトすることによっても電気泳
動用支持体を作製することが可能である。多孔性の担体
としては多孔性アセチルセルロース膜、多孔性ポリプロ
ピレン膜、多孔性ポリエチレン膜、多孔性ポリテトラフ
ロロエチレン膜などを用いることができるがこれらに限
定されるものではない、コーティングした支持体を製造
する場合にはあらかじめ所望の孔径、空孔率、および形
状の担体を用意して通常の方法でその支持体表面に高分
子化合物をコーティングすることができる。

支持体表面に高分子化合物をグラフト重合する場合には
、それ自体所望のＬＣＳＴをもつ高分子化合物を選択す
る他、前記のように、各種の単量体と共重合グラフト法
を用いることによって所望のＬＣＳＴに調節することが
できる。共重合グラフト法を行う場合には、親水性単量
体、疎水性単量体のいずれも用いることができる。−量
的には親水性単量体と共重合するとグラフト共重合体の
ＬＣＳＴは上昇し、疎水性単量体と共重合するとＬＣＳ
Ｔは下降する。使用しうる親水性単量体、疎水性単量体
は上記の通りである。

支持体への温度感応性単量体のグラフト重合法は材質、
その形状などによって最適な方法を選ぶことができる。

低温プラズマ重合法は、支持体が板状、フィルム状、平
膜状の場合に好適に用いることができる。該方法は支持
体の表面のみにグラフト重合が可能であり、支持体のバ
ルクの性質を損なうことが少なく、比較的ラジカルが発
生しにくいポリマー、例えばポリプロピレン、ポリエチ
レン、ポリテトラフロロエチレン、ポリジメチルシロキ
サン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリメチルメ
タクリレートなどのポリマーに容易にグラフト重合でき
るからである。

その他にもオゾン酸化法、セリウムイオン法など通常の
グラフト重合法も適用が可能である。

架橋構造を形成する方法としては、単量体を重合する時
に架橋構造を導入する方法と、重合終了後に架橋構造を
導入する方法とがあるが、本発明前者の方法は具体的に
は、二１器性単量体を共重合することによって行う０例
えば、Ｎ、Ｎ−メチレンビスアクリルアミド、ヒドロキ
シエチルジメチタクリレート、ジビニールベンゼンなど
を用いて行うことができる。

後者の方法では、光今、電子線、γ線照射により分子間
に架橋を形成するのが一般的である。

以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明の範囲は特許請求の範囲の項の記載により定
まるものであり、以下の実施例により制限を受けるもの
ではない。

夾施旧 市販品セルロースアセテート膜（富士フィルム社製セパ
ラックスＳ、孔径：約２１１ＩＩ、空孔率：約８０％、
サイズ：２Ｘ２２ｅｅｉ）をチューブ中に入れＮ−イソ
プロピｌレアクリフレアミド（ＮＩＰ＾＾−）モノマー
１０ｇ、水３０ｄを注入し、硝酸第二セリウムアンモニ
ウム２７ｍを水１〇−溶解した０、ＩＮ硝酸水溶液を滴
下し３０℃で１時間、窒素気流中でグラフト反応を行っ
た０反応後、水洗し 秘真空乾燥を行った。得られたポリ−Ｎ−イソプロピル
アクリルアミドがグラフト重合された多孔膜（ＰＮＩＰ
＾＾ｅｅ−ｇ−Ｃ＾）のグラフト重合率を反応前の乾燥
状態の重量と反応後の乾燥状態の重量の測定することに
よって計算した結果、約２４，５％であった。

得られたＰＮＩＰ＾＾ｍ−ｇ−ＣＡ膜を用いて通常のセ
ルロースアセテート膜電気泳動装置により牛血清アルブ
ミンとオボアルブミンの混合物の分析を行った。

牛血清アルブミンと等量のオボアルブミンを混合しタン
パク質濃度が約１０ｇ／ｄｉのＰＢＳ溶液を作製した。

コントロール実験としてグラフト重合反応前の市販品セ
ルロースアセテート膜上に混合タンパク質溶液約０．５
μ！を塗布し、温度３７℃で０．８ｍＡの定電流を約４
５分間印加した後にデカリンを用いて透明化しデンシト
メトリーによってタンパク質の分析を行った結果、ピー
クは１本であり牛血清アルブミンとオボアルブミンの分
離されなかった。

一方、約２０℃で約１５分間放置することにより本発明
で得られたＰＨ！ＰＡＡｓ−ｇ−ＣＡ膜を充分に親水的
に処理し、試料を塗布した後、３７℃で上記と同様の条
件下に電気泳動を行った。その結果、牛血清アルブミン
とオボアルブミンの２つのピークが観察された。即ち、
牛血清アルブミンの移動度がオボアルブミンの移動度よ
りも大きかった。

丈な、該ＰＮＩＰ＾＾ｍ−ｇ−Ｃ＾膜を用いて陽極側を
約３７℃に保温し、陰極側を約２０℃に冷却して上記と
同様にして電気泳動を行ったところ牛血清アルブミンと
オボアルブミンの２つのピークがより明確に区別して観
察された。

以上の結果は、本発明のＰＮＩＰ＾＾ｍ−ｇ−Ｃ＾膜を
用いることによって従来の電気泳動法では分離不可能で
あった疎水性度の異なる牛血清アルブミンとオボアルプ
ミンを分離することが可能になったことを示している。

先吸Ω匁１ 本発明の電気泳動用支持体を用いて電気泳動を行うこと
によって、疎水性・親水性の違いを利用して試料を分離
することが可能になった。これによって、従来の電気泳
動法では分離することができなかった荷電量と分子量が
ともに同じ成分同士を、その疎水性・親水性の違いを利
用して分離することが可能になった。

また、温度条件の設定・変化に特徴を有する本発明の電
気泳動法を適用することにより、従来の電気泳動法より
も容易かつ明瞭に試料を分離することも可能になった。

（外４名） 手続補正書 平成　２年６月２２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＬＣＳＴを有する温度感応性高分子化合物からなる
   電気泳動用支持体。 ２、前記温度感応性高分子化合物が、ポリＮ置換アクリ
   ルアミド誘導体、ポリＮ置換メタアクリルアミド誘導体
   、これらの共重合体、ポリビニルメチルエーテルおよび
   ポリビニルアルコール部分酢化物からなる群より選ばれ
   ることを特徴とする請求項１の電気泳動用支持体。 ３、前記温度感応性高分子化合物が多孔性高分子担体に
   コーティングまたはグラフトされていることを特徴とす
   る請求項１の電気泳動用支持体。 ４、前記多孔性高分子担体が、多孔性アセチルセルロー
   ス膜、多孔性ポリプロピレン膜、多孔性ポリエチレン膜
   および多孔性ポリテロラクロロエチレン膜からなる群よ
   り選ばれることを特徴とする請求項１の電気泳動用支持
   体。 ５、前記温度感応性高分子化合物が架橋構造を有するこ
   とを特徴とする請求項１の電気泳動用支持体。 ６、請求項１の電気泳動用支持体の陽極−陰極間に、Ｌ
   ＣＳＴ以下の温度からＬＣＳＴ以上の温度にわたる温度
   勾配をつくり電気泳動を行うことを特徴とする電気泳動
   法。 ７、請求項１の電気泳動用支持体に試料をチャージした
   後、ＬＣＳＴの上下で温度を変化させることを特徴とす
   る電気泳動法。 ８、請求項１の電気泳動用支持体にＬＣＳＴ以下の温度
   で試料をチャージし、ＬＣＳＴ以上の温度で電気泳動を
   行うことを特徴とする電気泳動法。