DE69729726T2

DE69729726T2 - Verfahren zur trennung von wirkstoffgemischen mit kapillaraffinity-gelelektrophorese

Info

Publication number: DE69729726T2
Application number: DE69729726T
Authority: DE
Inventors: Angelika Muscate-Magnussen; Aran Paulus; François NATT
Original assignee: Zeptosens AG
Current assignee: Zeptosens AG
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-23
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2017-05-24
Also published as: EP0901623A1; JP2000511633A; WO1997045721A1; EP0901623B1; AU3028797A; US6379515B1; DE69729726D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Stufenverfahren zur selektiven Trennung und/oder Bestimmung von geladenen organischen Verbindungen, bei dem man Stoffgemische mit diesen organischen Verbindungen unter Bedingungen einer hohen Bindungsaffinität einer Kapillaraffinitätsgelelektrophorese unterwirft, wobei die Kapillare mit einem Gel auf der Basis von Polymeren als Trennmittel gefüllt ist, an die spezifische Erkennungselemente (Rezeptoren) für eine oder mehrere organische Verbindungen kovalent gebunden sind, durch Anlegen eines elektrischen Feldes die unerwünschten Anteile im Stoffgemisch gegebenenfalls unter Auftrennung abtrennt, und dann die Affinitätsbedingungen ändert, so dass die gebundenen Verbindungen gegebenenfalls unter Auftrennung eluiert und detektiert werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind in Kapillaren einfüllbare Trennmittel für die Kapillaraffinitätsgelelektrophorese und deren Verwendung für die Trennung geladener organischer Verbindungen.
Chromatographische Kolonnenverfahren haben zur präparativen Trennung und Reinigung von insbesondere biologisch aktiven Verbindungen eine hohe Bedeutung erlangt und eine breite Anwendung gefunden. Unter den flüssigkeitschromatographischen Verfahren ist die Gelchromatographie mit polymeren Gelen als Trennmittel beziehungsweise stationäre Phase besonders verbreitet. Da diese Methode in vielen Fällen den Anforderungen nicht genügt, sind immer wieder Verbesserungen vorgeschlagen worden. So wurde schon vor längerer Zeit vorgeschlagen, an den polymeren Gelen spezifische Rezeptoren wie zum Beispiel Oligonukleotide oder Proteine kovalent zu binden, die auf Grund ihrer Wechselwirkung und Affinität zu biologischen Molekülen Bindungen eingehen, die Moleküle unter bestimmten Elutionsbedingungen zurückhalten und so eine Abtrennung unerwünschter Nebenbestandteile erlauben. Mit der Veränderung der Elutionsbedingungen kann dann die Affinität so beeinflusst werden, dass eine Elution der gewünschten und gereinigten Verbindung möglich ist. Diese Affinitätschromatographie ist zum Beispiel von H. W. Jarrett im Journal of Chromatography, Biomedical Applications, 618 (1993), Seiten 315 bis 31, oder von S. Ostrove in Methods of Enzymologie, Band 182 (1990), Seiten 357 bis 379 beschrieben worden.
Eine andere bekannte Methode für präparative Trennungen sind gelelektrophoretische Verfahren zur Trennung geladener Verbindungen, die besonders im biochemischen Bereich zur Trennung von Peptiden, Antigenen, Antikörpern und Oligo- bis Polynukleotiden angewendet wird. In der Regel werden hierfür Platten oder Stäbe des Gels mit den kovalent gebundenen Rezeptoren verwendet, wie dies zum Beispiel in der DE-A-27 12 344, von V. Horejsi in Analytical Biochemistry 125, Seiten 358 bis 369 (1982) und im Journal of Chromatography, 376 (1986) Seiten 49 bis 67, von G. L. Igloi in Biochemistry 27 (1988), Seiten 3842 bis 3849, und von H. Goubran-Botros et al. im Journal of Chromatography, 597 (1992), Seiten 357 bis 364 beschrieben wird. Diese Methode kann auch als Kolonnenverfahren ausgebildet sein, siehe zum Beispiel FR-A-2 402 716, in deren Beschreibung die kontinuierliche Elution und Anreicherung eines Testeron-Antikörpers mit Hilfe eines polymergebundenen Antigens bei einem pH von knapp unter dem isoelektrischen Punkt des Antikörpers offenbart ist.
Für analytische Trenn- und Bestimmungsverfahren von geladenen organischen Verbindungen ist die Kapillargelelektrophorese besser geeignet, da man zum einen mit kleineren Probenmengen auskommt, diese Methode erheblich empfindlicher ist und hohe Auflösungen erzielt werden können. Diese Methode ist auch schneller durchzuführen und kann sogar automatisch betrieben werden. Als Beispiel sei die analytische Trennung von Oligonukleotiden genannt, wie sie von A. Paulus et al. im Journal of Chromatography, 507 (1990), Seiten 113 bis 123 beschrieben ist.
Es sind auch schon Vorschläge offenbart worden, die Kapillargelelektrophorese mit der Affinitätschromatographie zu verbinden. In der WO 95/10344 werden Polymerkugeln mit kovalent gebundenen Rezeptoren an die Innenwand einer Kapillare chemisch gebunden. Hiermit sollen in einem kontinuierlichen Elutionsverfahren die Trennleistungen verbessert werden. Die Anzahl kovalent gebundener Rezeptoren ist jedoch sehr gering und begrenzt, bedingt durch die spezifische Ausführung, so dass die Empfindlichkeit oft nicht ausreichend ist. Ferner ist die chemische Bindung des Trennmaterials an die Kapillarinnenwand sehr aufwendig und begrenzt die Anwendbarkeit.
Y. Baba et al. beschreiben im Journal of Chromatography 632 (1993), Seiten 137 bis 142 ein kontinuierliches Verfahren zur Trennung von Oligodesoxynukleotiden mittels Kapillaraffinitätsgelelektrophorese. Mit der Verwendung von Polyvinyladenin als stationäre Phase soll die Selektivität verbessert werden. Dieses Ziel kann aber nicht vollständig erreicht werden, da zwar gewisse Interaktionen von Analyt und Rezeptor stattfinden, aber keine festen Bindungen wie bei Verwendung komplementärer Rezeptoren auftreten können. Die Selektivität ist daher für viele Zwecke, besonders bei der Trennung von Oligonukleotidgemischen, völlig unzureichend, wozu auch die kontinuierliche Elution erheblich beiträgt.
Von S. Birnbaum et al. wird in Anal. Chem. 64 (1992), Seiten 2872 bis 2874 die Trennung der optischen Isomeren des Tryptophans durch kontinuierliche Elution mittels Kapillaraffinitätsgelelektrophorese beschrieben, wobei als chiraler Selektor ein BSA-Gel (BSA gleich Bovin Serum Albumin) Verwendung findet, das mit Glutaraldehyd vernetzt ist. Die Trennung und Detektion von Analytgemischen mit solchen Gelen als Trennmittel ist jedoch nicht möglich, da keine gezielten spezifischen Bindungen an Rezeptoren möglich sind.
In der EP-A-0 671 626 werden Kapillaren für die Kapillaraffinitätselektrophorese beschrieben, bei der an die Innenwand eines ersten Teils der Kapillare Rezeptoren gebunden sind und der Rest der Kapillare mit einem Puffer befüllt ist. Bei dem Trennverfahren kann zum Beispiel eine Mischung von markierten und unmarkierten Analytmolekülen an die Rezeptoren gebunden und die ungebundenen Anteile eluiert werden. Danach verändert man die Elutionsbedingungen (pH-Änderung, Zusatz organisches Lösungsmittel, anderer Puffer) und löst dadurch die markierten und unmarkierten Analytmoleküle, die im nachfolgenden Gel getrennt werden. Auch bei dieser Ausführung ist durch die spezifische Anordnung die Anzahl kovalent gebundener Rezeptoren zu gering, um Trennungen mit hoher Empfindlichkeit erzielen zu können. Die Herstellung der Kapillaren ist darüber hinaus aufwendig, und die chemischen Möglichkeiten zur Bindung von Rezeptoren sind durch das Material der Kapillaren und der vorhandenen funktionellen Gruppen sehr eingeschränkt.
P. Sun et al. beschreiben im Journal of Chromatography A 652 (1993), Seiten 247 bis 252 die kovalente Bindung von BSA an ein hochmolekulares Dextran (M_r 2,000,000). Das immobilisierte Polymer wird als ersetzbares chirales Trennmittel für die Enantiomeren des Leucovorins in der Kapillaraffinitätsgelelektrophorese verwendet, wobei ebenfalls eine kontinuierliche Verfahrensweise angewendet wird. Die Selektivität und die Empfindlichkeit lassen auch bei diesem Verfahren Wünsche offen; insbesondere ist die selektive Trennung und Detektion von Zielanalyten neben anderen Analytbestandteilen mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit mit dem beschriebenen Verfahren nicht möglich.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass Zielmoleküle auch bei der Kapillaraffinitätsgelelektrophorese durch die Wahl bestimmter Bedingungen vollständig zurückgehalten und durch Veränderung der Bedingungen vollständig eluiert werden können, wenn man als Trennmittel Polymergele mit kovalent gebundenen und zu Zielanalyten komplementäre Rezeptoren verwendet. Es wurde ferner überraschend gefunden, dass man dann Analyte und Analytgemische (1) mit sehr hoher Selektivität und Empfindlichkeit, sowie (2) schnell und gezielt trennen und detektieren und (3) gleichzeitig andere Bestandteile des Analyten trennen und bestimmen kann, und (4) ferner Trennungen dieser Art in vollautomatisierten Online Apparaten ausführen kann, wenn man in der Kapillaraffinitätsgelelelektrophorese (a) ein Polymergel als Trennmittel verwendet, das zu einem oderen mehreren zu trennenden Zielmolekülen komplementäre Rezeptoren am Polymerrückgrat direkt oder über eine Brückengruppe kovalent gebunden enthält, und (b) die Elution zweistufig oder mehrstufig unter Änderung der Elutionsbedingungen vorgenommem wird.
Die Einleitung von Anspruch 1 ist aus dem Dokument WO 96/08716 bekannt.
Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur selektiven Trennung von elektrisch geladenen Zielmolekülen in einem Analytgemisch mittels Kapillaraffinitätsgelelektrophorese unter Verwendung einer wenigstens teilweise mit einem Polymergel gefüllten Kapillare, wobei an das Polymer Rezeptoren für Zielmoleküle kovalent gebunden sind, und ein elektrisches Feld von mindestens 50 Volt/cm angelegt ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymergel fest ist, oder eine Lösung des Polymers in einem Lösungsmittel ist und eine Viskosität von wenigstens 20 mPa·s aufweist, und dass man (a) die Kapillare mit dem Analytgemisch beläd, (b) in einem ersten Trennschritt die Zielmoleküle im Analytgemisch an die Rezeptoren bindet und die übrigen Bestandteile eluiert, und (c) in einem zweiten Verfahrensschritt die Elutionsbedingungen gegeenenfalls schrittweise so ändert, dass die Affinität der Zielmoleküle zum Rezeptor aufgehoben und die Zielmoleküle eluiert und detektiert werden.
Rezeptor bedeutet im Rahmen der Erfindung ein organisches Molekül, das zu einem Zielmolekül komplementär ist, so dass es unter gegebenen Bedingungen durch seine räumliche Anordnung und/oder Nebenvalenzbindungen (zum Beispiel Wasserstoffbrücken), elektrostatische Kräfte oder hydrophobe Effekte, und/oder Van der Waals Kräfte gebunden wird.
Gemäss der Erfindung ist das Polymergel ein festes Gel oder eine Lösung des Polymers in einem Lösungsmittel, das eine Viskosität von mindestens 20 mPa·s aufweist. Die Viskosität wird im wesentlichen durch die Eigenschaften (Molekulargewicht) und die Konzentration des Polymers in der Lösung bestimmt.
An das Polymer können gleiche oder verschiedene Rezeptoren gebunden sein. Wenn verschiedene Rezeptoren gebunden sind, kann es sich um bis zu 10, bevorzugt bis zu 5 und besonders bevorzugt bis 3 verschiedene Rezeptoren handeln.
Polymergele mit kovalent gebundenen Rezeptoren (nachfolgend auch als immobilisierte Polymere bezeichnet), und deren Herstellung sind aus der Affinitätsgelchromatograhie in grosser Zahl bekannt oder sie sind nach analogen Verfahren herstellbar. In der Kapillargelelektrophorese werden zweckmässig Polymere eingesetzt, die mittlere Molekulargewichte von 5000 bis 5 000 000, bevorzugter 10000 bis 2 000 000, noch bevorzugter 10000 bis 1 000 000 und besonders bevorzugt 20000 bis 500 000 Dalton. Die Molekulargewichte werden durch Gelpermeationschromatographie mit Hilfe von Polymeren bekannten Molekulargewichts als Standards ermittelt.
Die Polymeren müssen funktionelle Gruppen enthalten, an die die funktionalisierten Rezeptoren gebunden werden können.
Gelbildende Polymere sind in Wasser, Lösungsmitteln oder Mischungen aus Wasser (Puffer) und Lösungsmitteln löslich oder quellbar, vor allem wenn es sich um vernetzte Polymere handelt. Hierbei ist es sehr zweckmässig, die Viskositäten der Lösungen so einzustellen, dass ein Befüllen der Kapillare und Ersetzen in der Kapillare möglich ist. Geeignete wasserlösliche Polymere sind in grosser Vielzahl bekannt. Die Wahl des Polymers und dessen Molekulargewichts sowie dessen Konzentration in der Zusammensetzung bestimmen die Viskosität. Das erforderliche Molekulargewicht kann entweder durch eine gezielte Synthese, durch Dialyse oder durch einen zum Beispiel hydrolytischen Abbau höhermolekularer Polymere erzielt werden. Die Polymere müssen unter den gewählten Trennbedingungen stabil sein. Es können sowohl synthetische als auch natürliche Polymere verwendet werden. Beispiele sind gegebenenfalls teilweise veretherte oder veresterte Polyvinylalkohole, Polyvinylpyrrolidon, gegebenenfalls N-monoalkylierte Polyacrylamide oder -methacrylamide, Polyhydroxyalkylacrylate und -methacrylate, Polyethylenglykole oder Copolymere von Ethylenglykol und 1,2-Diolen wie zum Beispiel 1,2-Propylenglykol, Polysaccharide oder Derivate von Polysacchariden wie zum Beispiel Cellulose und Celluloseether, Stärke, Dextrane und Carragenan. Als Polymere sind auch Dendrimere geeignet. Es können auch leicht vernetzte Polymere verwendet werden, oder die Polymeren können nach dem Befüllen der Kapillaren vernetzt werden. Ferner ist es möglich, Lösungen der Monomere in die Kapillaren zu füllen und dann die Polymerisation durchzuführen. An das Polymerrückgrat sind die Rezeptoren direkt oder über eine Brückengruppe gebunden. Ferner können solche Rezeptoren auch an die funktionellen Endgruppen eines Polymers gebunden sein, zum Beispiel an die Hydroxylgruppen eines Polyethylenglykols. Bei den immobilisierten Polymeren kann es sich um Homopolymere handeln, oder es kann sich um Copolymere handeln, die die Strukturelemente mit kovalent gebundenen Rezeptoren in einer Menge von 0,01 bis 99,9, bevorzugt 0,1 bis 90, bevorzugter 0,1 bis 60, noch bevorzugter 0,1 bis 40 und besonders bevorzugt 0,1 bis 30 Gew.-% enthalten, bezogen auf die Monomeren. Besonders bevorzugt werden Copolymere verwendet, insbesondere solche, die 0,1 bis 10 und ganz besonders bevorzugt 0,1 bis 5 Gew.-% Strukturelemente mit kovalent gebundenen Rezeptoren enthalten.
Bevorzugte wasserlösliche Polymere sind Polyethylenglykole, Polyacryl- beziehungsweise Methacrylamide, Polyhydroxyalkylacrylate und -methacrylate, und Polyvinylalkohole. Ganz besonders bevorzugt sind Polyacryl- beziehungsweise Methacrylamide.
Der Rezeptor kann direkt oder über eine Brückengruppe an das Polymerrückgrat gebunden sein, wobei die Bindung über eine Brückengruppe bevorzugt ist.
Die Brückengruppe kann 1 bis 60 Atome, bevorzugt 5 bis 60 Atome, bevorzugter 5 bis 50 Atome und besonders bevorzugt 10 bis 40 Atome ausgewählt aus der Gruppe C, O, S, P und N enthalten. Bei der Brückengruppe handelt es sich bevorzugt um Kohlenwasserstoffreste, die mit einem oder mehreren Heteroatomen aus der Gruppe O, S und N und/oder der Gruppe -C(=O)- unterbrochen sein können
Der an das Polymerrückgrat gebundene Rest eines Rezeptors kann zum Beispiel der Formel I entsprechen, -X₀₀₁-(R₀₀₁)_r-(X₀₀₂)_s-R₀₀₃-Rez (I),worin
X₀₀₁ eine direkte Bindung, oder X₀₀₂ und X₀₀₁ unabhängig voneinander -O-, -S-, -NR₀₀₂-, -C(O)-O-, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, --SO₂-O-, -O-SO₂-, -O-SO₂-O-, -NR₀₀₂-C(O)-, -C(O)-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-C(O)-O-, O-C(O)-NR₀₀₂-, NR₀₀₂-C(O)-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-SO₂-, -SO₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂SO₂-O-, -O-SO₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-SO₂-NR₀₀₂-, -O-P(O)OR₁₂(O)-, -NR₀₀₂-P(O)OR₁₂(O)-, -O-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -P(O)OR₁₂-(O)- oder -P(O)OR₁₂-NR₀₀₂- bedeuten,
R₀₀₁ eine bivalente Brückengruppe darstellt,
Rez für einen monovalenten Rest eines Rezeptors steht,
R₀₀₂ H, C₁-C₁₂-Alkyl, C₅- oder C₆-Cycloalkyl, C₅- oder C₆-Cycloalkylmethyl oder -ethyl, Phenyl, Benzyl oder 1-Phenyleth-2-yl steht,
R₀₀₃ eine direkte Bindung, C₁-C₁₈-Alkylen, C₅- oder C₆-Cycloalkylen, C₆-C₁₀-Arylen oder C₇-C₁₂-Aralkylen bedeutet,
R₁₂ für H, C₁-C₁₂-Alkyl, Ammonium, ein Alkalimetallion wie zum Beispiel Li⁺, Na⁺ und K⁺, oder ein Äquivalent eines Erdalkalimetallion wie zum Beispiel Mg²⁺ und Ca²⁺ stehen;
r die Zahlen 0 oder 1 und s die Zahlen 0 oder 1 bedeuten, und s für 0 steht, wenn r 0 darstellt.
Bei dem Ammonium kann es sich um NH₄ ⁺ handeln oder das Ammonium kann sich von primären, sekundären, tertiären Aminen oder quaternärem Ammonium ableiten, die bevorzugt 1 bis 20 C-Atomen enthalten.
R₀₀₂ in der Bedeutung von Alkyl enthält bevorzugt 1 bis 6 und besonders bevorzugt 1 bis 4 C-Atome. Einige Beispiele sind Methyl, Ethyl, n- oder i-Propyl, Butyl, Hexyl und Octyl. R₀₀₂ in der Bedeutung von Cycloalkyl ist bevorzugt Cyclohexyl, und in der Bedeutung von Cycloalkylmethyl Cyclohexylmethyl. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt R₀₀₂ H oder C₁-C₄-Alkyl dar.
Die bivalente Brückengruppe stellt bevorzugt einen Kohlenwasserstoffrest dar, der bevorzugt 1 bis 30, bevorzugter 1 bis 20, besonders bevorzugt 1 bis 16 und insbesondere bevorzugt 1 bis 12 C-Atome enthält, der unsubstituiert oder mit C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Alkoxy oder =O ein- oder mehrfach substituiert ist. Der Kohlenwasserstoffrest kann auch ein- oder mehrfach mit Heteroatomen ausgewählt aus der Gruppe -O-, -S- und -NR₀₀₂- unterbrochen sein, wobei R₀₀₂ bevorzugt H oder C₁-C₄-Alkyl darstellt.
Bei der bivalenten Brückengruppe kann es sich zum Beispiel um C₁-C₂₀-, bevorzugt C₂-C₁₂-Alkylen handeln, das linear oder verzweigt sein kann. Einige Beispiele sind Methylen, Ethylen, 1,2- oder 1,3-Propylen, 1,2-, 1,3- oder 1,4-Butylen, Pentylen, Hexylen, Octylen, Dodecylen, Tetradecylen, Hexadecylen und Octadecylen.
Bei der bivalenten Brückengruppe kann es sich zum Beispiel um Polyoxaalkylen mit 2 bis 12, bevorzugt 2 bis 6 und besonders bevorzugt 2 bis 4 Oxaalkyleneinheiten und und 2 bis 4, bevorzugt 2 oder 3 C-Atomen im Alkylen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Polyoxaethylen und Polyoxapropylen mit 2 bis 6 Oxaalkyleneinheiten.
Bei der bivalenten Brückengruppe kann es sich zum Beispiel um C₅-C₁₂-, bevorzugt C₅-C₈- und besonders bevorzugt um C₅- oder C₆-Cycloalkyl wie zum Beispiel Cyclopentylen, Cyclohexylen, Cyclooctylen oder Cyclododecylen handeln.
Bei der bivalenten Brückengruppe kann es sich zum Beispiel um C₅-C₁₂-, bevorzugt C₅-C₈- und besonders bevorzugt um C₅- oder C₆-Cycloalkyl-C₁-C₁₂- und bevorzugt -C₁-C₄-alkyl handeln. Einige Beispiele sind Cyclopentyl-C_nH_2n- und Cyclohexyl-C_nH_2n-, worin n für eine Zahl von 1 bis 4 steht. Besonders bevorzugt ist -Cyclohexyl-CH₂-.
Bei der bivalenten Brückengruppe kann es sich zum Beispiel um C₅-C₁₂-, bevorzugt C₅-C₈- und besonders bevorzugt um C₅- oder C₆-Cycloalkyl-(C₁-C₁₂-Alkyl)₂- und bevorzugt (-C₁-C₄-alkyl)₂ handeln. Einige Beispiele sind Cyclopentyl-(C_nH_2n-)₂ und Cyclohexyl-(C_nH_2n-)₂, worin n für eine Zahl von 1 bis 4 steht. Besonders bevorzugt ist -CH₂-Cyclohexyl-CH₂-.
Bei der bivalenten Brückengruppe kann es sich zum Beispiel um C₆-C₁₄-Arylen und bevorzugt C₈-C₁₀-Arylen handeln, zum Beispiel um Naphtylen oder bevorzugter um Phenylen.
Bei der bivalenten Brückengruppe kann es sich zum Beispiel um C₇-C₂₀-Aralkylen und bevorzugt um C₇-C₁₂-Aralkylen handeln. Bevorzugter ist Arylen-C_nH_2n, worin Arylen für Naphthylen und besonders Phenylen und n für eine Zahl von 1 bis 4 steht. Beispiele sind Benzylen und Phenylethylen.
Bei der bivalenten Brückengruppe kann es sich zum Beispiel um Arylen-(C_nH_2n-)₂- handeln, worin Arylen bevorzugt Naphtylen und besonders Phenylen ist und n für eine Zahl von 1 bis 4 steht. Beispiele sind Xylylen und Phenylen(CH₂CH₂)₂-.
R₀₀₃ enthält als Alkylen bevorzugt 1 bis 12 und besonders bevorzugt 1 bis 6 C-Atome. Besonders bevorzugte Beispiele sind Methylen, Etylen, 1,2- oder 1,3-Propylen und 1,2-, 1,3- und 1,4-Butylen. R₃ ist als Arylen bevorzugt Phenylen und als Aralkylen bevorzugt Benzylen.
R₁₂ enthält als Alkyl bevorzugt 1 bis 8 und besonders bevorzugt 1 bis 4 C-Atome. Beispiele für Alkyl sind Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl und Octyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform entspricht der Rest der Formel I der Formeln Ia, -X₀₀₃-R₀₀₅-Y-X₀₀₄-Rez (Ia),worin
X₀₀₃ eine direkte Bindung oder -O-, -S-, -NR₀₀₂-, -C(O)-O-, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, --SO₂-O-, -O-SO₂-, -O-SO₂-O-, -NR₀₀₂-C(O)-, -C(O)-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-C(O)-O-, O-C(O)-NR₀₀₂-, NR₀₀₂-C(O)-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-SO₂-, -SO₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂SO₂-O-, -O-SO₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-SO₂-NR₀₀₂-, -O-P(O)OR₁₂(O^–)-, -NR₀₀₂-P(O)OR₁₂-(O)-, -O-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -P(O)OR₁₂(O)- oder -P(O)OR₁₂-NR₀₀₂- bedeutet;
X₀₀₄ eine direkte Bindung oder -O-, -S- oder -NR₀₀₂ mit R₀₀₂ gleich H oder C₁-C₄-Alkyl bedeutet,
R₀₀₅ C₁-C₂₀-Alkylen, oder mit -O-, -S-, -O-C(O)-, -C(O)-O-, -NR₀₀₂-C(O)-, -C(O)-NR₀₀₂-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-C(O)-O-, -NR₀₀₂-C(O)-, -O-P(O)OR₁₂(O^–)-, -NR₀₀₂-P(O)OR₁₂-(O)-, -O-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂- ein oder mehrfach unterbrochenes C₂-C₁₈-Alkylen steht;
Y eine direkte Bindung oder -O-C(O)-, -NR₀₀₂-C(O)-, -O-P(O)(OR₁₂)O- oder -NR₀₀₂-P(O)-O- darstellt,
R₀₀₂ für H oder C₁-C₄-Alkyl steht,
R₁₂ für H, C₁-C₁₂-Alkyl, Ammonium, ein Alkalimetallion wie zum Beispiel Li⁺, Na⁺ und K⁺, oder ein Äquivalent eines Erdalkalimetallion wie zum Beispiel Mg²⁺ und Ca²⁺ stehen; und
Rez den Rest eines Rezeptors bedeutet.
Reste von Rezeptoren, besonders biospezifischen Rezeptoren, die zu Zielanalyten komplementär sind, sind in grosser Vielzahl bekannt. Die Reste können sich zum Beispiel von Antigenen oder Bruchstücken davon, Antikörpern oder Bruchstücken davon, Hormonen, Proteinen (zum Beispiel Enzyme) oder Bruchstücken davon, RNA- und DNA-Molekülen oder Bruchstücken davon, natürlichen oder synthetischen Oligonukleotiden, Kohlenhydrate oder Bruchstücken davon, Peptide oder Bruchstücken davon und natürlichen oder synthetischen biologischen Wirkstoffen ableiten.
Bei einer bevorzugten Untergruppe an erfindungsgemäss zu verwendenden Polymere kann es sich zum Beispiel um solche handeln, die gleiche oder verschiedene wiederkehrende Strukturelemente der Formel II, oder gleiche oder verschiedene Strukturelemente der Formeln II und III enthalten,
worin
X₀₀₁, R₀₀₁, X₀₀₂, R₀₀₃ und Rez die zuvor für Formel I angegebenen Bedeutungen haben;
R für H oder C₁-C₄-Alkyl steht;
R₃ H, C₁-C₁₀-Alkyl, Phenyl oder C₁-C₄-Alkylphenyl bedeutet;
R₂ H, -C(O)-OR₄ oder -C(O)-NR₅R₆ darstellt;
R₁ H, Cl, -CN, -OH, -OC₁-C₆-Alkyl, -O-(O)C-R₈, -OC₁-C₆-Hydroxyalkyl, Phenyl, C₁-C₄-Alkylphenyl, -C(O)-OR₄ oder -C(O)-NR₅R₆ darstellt, oder R₁ und R₂ zusammen -O-C₁-C₁₂-Alkyliden-O- bedeuten;
R₄ H, Ammonium, ein Alkalimetallion, ein Äquivalent Erdalkalimetallion, C₁-C₁₂-Alkyl, Phenyl oder C₁-C₄-Alkylphenyl bedeutet;
R₅ und R₆ unabhängig voneinander für H, C₁-C₁₂-Alkyl, C₁-C₆-Hydroxyalkyl, Cyclohexyl, Benzyl oder Phenyl, oder R₅ und R₆ zusammen für Tetra- oder Pentamethylen, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂- oder -(CH₂)₂-NR₇-(CH₂)₂- stehen, wobei R₇ H oder C₁-C₄-Alkyl ist,
x und y je für 0 oder 1 stehen und x + y 1 oder 2 ist; und
R₈ C₁-C₁₂-Alkyl, C₁-C₄-Halogenalkyl, C₅- oder C₆-Cycloalkyl, Benzyl oder Phenyl bedeutet.
Für X₀₀₁, R₀₀₁, X₀₀₂, R₀₀₃, R₁₂ und Rez gelten die zuvor angegebenen Bevorzugungen und Ausführungsformen.
R bedeutet bevorzugt H oder Methyl.
R₃ steht als Alkyl bevorzugt für C₁-C₄-Alkyl steht. R₃ steht bevorzugt für H oder Methyl.
Beispiele für R, R₁, R₄, R₅, R₆, R₇ und R₈ als Alkyl sind Methyl, Ethyl und die Isomeren von Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl, Octyl, Nonyl, Decyl, Undecyl und Dodecyl.
R₂ steht bevorzugt für H.
R₁ steht bevorzugt für H, -CN, -OH, -OC₁-C₆-Alkyl, -O-(O)C-R₈, -OC₁-C₆-Hydroxyalkyl, -C(O)-OR₄ oder -C(O)-NR₅R₆, oder R₁ und R₂ stehen bevorzugt zusammen für -O-C₁-C₆-Alkyliden-O-.
R₁ und R₂ zusammen bedeuten bevorzugt -O-C₁-C₈- und besonders bevorzugt -O-C₁-C₄-Alkyliden-O-. Einige Beispiele für Alkyliden sind Methylen, Ethyliden, Propyliden, Butyliden, Phenylmethyliden, (CH₃)₂C= und (CH₃)C₆H₅)C=.
R₄ bedeutet bevorzugt Li⁺, Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺ oder C₁-C₆-Alkyl. Für Ammonium gelten die zuvor angebenen Bevorzugungen.
R₅ und R₆ bedeuten bevorzugt unabhängig voneinander H, C₁-C₄-Alkyl oder C₁-C₆-Hydroxyalkyl, R₇ steht bevorzugt für H oder Methyl.
R₈ stellt bevorzugt C₁-C₆-Alkyl, C₁- oder C₂-Halogenalkyl, Cyclohexyl, Benzyl oder Phenyl dar.
Eine bevorzugte Ausführungsform für die erfindungsgemäss zu verwendenden Polymere mit kovalent gebundenen Rezeptoren sind solche auf der Basis von Polyacryl- oder Polymethacrylamiden. Unter diesen sind solche mit gleichen oder verschiedenen wieder kehrenden Strukturelementen der Formel IV oder mit gleichen oder verschiedenen wiederkehrenden Strukturelementen der Formeln IV und V,
worin
X₀₀₂ -O-, -S-, -NR₀₀₂-, -C(O)-O-, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, --SO₂-O-, -O-SO₂-, -O-SO₂-O-, -NR₀₀₂-C(O)-, -C(O)-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-C(O)-O-, O-C(O)-NR₀₀₂-, NR₀₀₂-C(O)-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-SO₂-, -SO₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂SO₂-O-, -O-SO₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-SO₂-NR₀₀₂-, -O-P(O)OR₁₂(O)-, -NR₀₀₂-P(O)OR₁₂(O)-, -O-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -P(O)OR₁₂(O)- oder -P(O)OR₁₂-NR₀₀₂- bedeuten,
R₀₀₁ eine bivalente Brückengruppe darstellt;
Rez für einen monovalenten Rest eines Rezeptors steht,
R₀₀₂ H, C₁-C₁₂-Alkyl, C₅- oder C₆-Cycloalkyl, C₅- oder C₆-Cycloalkylmethyl oder -ethyl, Phenyl, Benzyl oder 1-Phenyleth-2-yl steht;
R₀₀₃ eine direkte Bindung, C₁-C₁₈-Alkylen, C₅- oder C₆-Cycloalkylen, C₆-C₁₀-Arylen oder C₇-C₁₂-Aralkylen bedeutet;
R H oder Methyl bedeutet;
R₉ H oder C₁-C₄-Alkyl darstellt;
R₁₂ für H, C₁-C₁₂-Alkyl, Ammonium, ein Alkalimetallion wie zum Beispiel Li⁺, Na⁺ und K⁺, oder ein Äquivalent eines Erdalkalimetallion wie zum Beispiel Mg²⁺ und Ca²⁺ stehen; und
R₁₀ und R₁₁ unabhängig voneinander H, C₁-C₆-Alkyl oder C₁-C₆-Hydroxyalkyl sind, oder R₁₀ und R₁₁ zusammen Tetramethylen, Pentamethylen, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂- oder -(CH₂)₂-NR₇-(CH₂)₂- stehen, wobei R₇ H oder C₁-C₄-Alkyl ist.
Für R₀₀₁, X₀₀₂, R₀₀₃, R₁₂ x, y und Rez gelten die zuvor angegebenen Bevorzugungen und Ausführungsformen.
R₀₀₃ steht bevorzugt für eine direkte Bindung.
R₉ beutet bevorzugt H. R₁₀ und R₁₁ stehen bevorzugt für H, C₁-C₄-Alkyl oder C₁-C₆-Hydroxyalkyl. Besonders bevorzugt sind R₁₀ und R₁₁ je H.
Bei den Polyacryl- oder Polymethacrylamiden handelt es sich besonders bevorzugt um solche mit wiederkehrenden Strukturelementen der Formel IVa, oder wiederkehrenden Strukturelementen der Formel IVa und der Formel Va,
worin
R H oder Methyl und bevorzugt H bedeutet;
R₉ H oder C₁-C₄-Alkyl und bevorzugt H darstellt;
R₀₀₁ für C₁-C₁₈-Alkylen, oder für mit -O-, -S-, -O-C(O)-, -C(O)-O-, -NR₀₀₂-C(O)-, -C(O)-NR₀₀₂-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-C(O)-O-, -NR₀₀₂-C(O)-, -O-P(O)OR₁₂(O)-, -NR₀₀₂-P(O)-OR₁₂(O)-, -O-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂- ein oder mehrfach unterbrochenes C₂-C₁₈-Alkylen steht;
R₁₂ für H, C₁-C₁₂-Alkyl, ein Alkalimetallion wie zum Beispiel Li⁺, Na⁺ und K⁺, oder ein Äquivalent eines Erdalkalimetallion wie zum Beispiel Mg²⁺ und Ca²⁺ stehen;
R₁₀ und R₁₁ unabhängig voneinander H oder C₁-C₄-Alkyl, bevorzugt R₁₀ H und R₁₁ H oder C₁-C₄-Alkyl, und besonders bevorzugt R₁₀ und R₁₁ je für H stehen; und
und Oli der monovalente Rest eines Rezeptors ausgewählt aus der Gruppe komplementärer Oligonukleotide darstellt.
Bei den Oligonukleotiden kann es sich um solche aus natürlichen oder synthetischen Nukleotiden, oder aus beiden Nukleotiden handeln. Sie können aus 3 bis 200, bevorzugt 5 bis 100, bevorzugter 5 bis 50 und besonders bevorzugt 8 bis 30 Nukleotideinheiten bestehen.
Die erfindungsgemäss zu verwendenden Polymere sind teilweise bekannt oder können nach analogen oder bekannten Verfahren hergestellt werden. Grundsätzlich können zwei Methoden angewendet werden: (1) Die Polymerisation von Monomeren aus einem Rezeptor, an den eine polymerbildende Gruppe direkt oder über eine Brückengruppe kovalent gebunden ist, alleine oder zusammen mit Comonomeren, oder (2) die Umsetzung von funktionelle Gruppen enthaltenden löslichen Polymeren mit Rezeptoren, die geeignete funktionelle Gruppen enthalten. Zur Herstellung der monomeren Rezeptoren mit kovalent gebundenen Rezeptorgruppen können vorhandene funktionelle Gruppen, die nicht umgesetzt werden sollen, zunächst mit Schutzgruppen geschützt werden. Danach kann eine Kettenverlängerung an einer funktionellen Gruppe vorgenommen werden. Bekannte Methoden für eine Kettenverlängerung sind zum Beispiel Veretherung, Veresterung, Amid-, Harnstoff- und Urethanbildung.
Die Verknüpfung über funktionelle Gruppen kann nach allgemein bekannten Verfahren durchgeführt werden. Dabei ist es grundsätzlich auch möglich, vorhandene funktionelle Gruppen in andere funktionelle Gruppen umzuwandeln, zum Beispiel -CH₂OH-Gruppen durch Oxidation in Carbonsäuren, Carbonsäuren in Amide oder Halogenide, Amingruppen in Isocyanatgruppen, Alkohole oder Amine in Carbonate oder Urethane. Ferner ist es möglich, Alkohole oder Amine zuerst mit Halogencarbonsäuren (zum Beispiel Chloressigsäure) umzusetzen. Man kann auch Kettenverlängerungsmittel wie zum Beispiel Epoxide, Azirin, Diole, Diamine, Dicarbonsäuren oder -ester und Diisocyanate ein- oder mehrfach hintereinander einsetzen, und so die Länge der Brückengruppe definiert bestimmen. Diese Methoden und Verfahren zur Verknüpfung sind bekannt und in der Fachliteratur beschrieben. Die Comonomeren und die Ausgangsverbindungen zur Herstellung der polymerbildenden Rezeptoren sind bekannt, teilweise kommerziell erhältlich oder nach analogen Verfahren herstellbar.
Die zu detektierenden organischen geladenen Substanzen im Analytgemisch können Molekulargewichte von zum Beispiel 300 bis zu 1 000 000 oder sogar mehr, bevorzugt 300 bis 500 000, noch bevorzugter 300 bis 200 000, besonders bevorzugt 300 bis 100 000, insbesondere bevorzugt 300 bis 50 000 aufweisen.
Es wurde ferner gefunden, dass man für Gemische elektrisch geladener organischer Verbindungen mit Molekulargewichten bevorzugt im Bereich von etwa wenigstens 300 bis etwa 1 000 000 Da vorteilhaft füll- und entfernbare Polymerlösungen einer bestimmten Viskosität als Trennphase verwenden kann, wobei das Polymer kovalent gebundene Rezeptoren enthält. Als Lösungsmittel kommt Wasser beziehungsweise wässrige Puffer alleine oder in Abmischung mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln in Frage. Die Reproduzierbarkeit (Laufzeit der organischen Verbindungen) ist hierbei überraschend hoch, so dass sich diese stationären Trennphasen zum einen für eine Automatisierung und zum anderen für eine Standardisierung zur qualitativen Bestimmung unbekannter Verbindungsgemische eignen. Die Auflösung ist in vielen Fällen sogar überraschend so hoch, dass selbst Gemische oligomerer Verbindungen getrennt und bestimmt werden können, die sich nur in einem Baustein oder einem anderem Strukturelement unterscheiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens verwendet man als ersetzbares Trennmittel eine Zusammensetzung aus (a) 0,1 bis 30 Gew.-% eines im wesentlichen unvernetzten wasserlöslichen Polymers, an das ein Rezeptor kovalent gebunden ist, und das ein mittleres Molekulargewicht von weniger als 5 000 000 Dalton aufweist, und (b) 99,9 bis 70 Gew.-% einer wässrigen Pufferlösung alleine oder zusammen mit einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wobei die Zusammensetzung eine Viskosität von 20 bis 600 mPa·s aufweist.
Das Molekulargewicht der Polymeren in dieser Zusammesetzung beträgt bevorzugt 5000 bis 5 000 000, bevorzugter 10000 bis 2 000 000, besonders bevorzugt 10000 bis 1000 000, und ganz besonders bevorzugt 20000 bis 500000. Je höher das Molekulargewicht ist, desto verdünntere Lösungen werden zweckmässig verwendet.
Wenn das mittlere Molekulargewicht des Polymers in dieser Zusammensetzungen 10 000 bis 500 000 und bevorzugt 20 000 bis 200 000 Dalton beträgt, sind die Zusammensetzungen neu und ein weiterer Gegenstand der Erfindung.
Die Gewichtsprozente ergänzen sich stets auf hundert Prozent. Das Molekulargewicht wird mittels Gelpermeationschromatographie unter Verwendung bekannter Standards von zum Beispiel Polyacrylamid bekannten Molekulargewichts bestimmt. Die Viskosität wird mit einem Rotationsviskosimeter (Low Shear 30//MS 1/1) bei 30°C bestimmt.
Für die Polymeren der Zusammensetzung gelten die zuvor angegeben Bevorzugungen und Ausführungsformen. Geeignete wasserlösliche Polymere sind in grosser Vielzahl bekannt. Die Wahl des Polymers und dessen Molekulargewichts sowie dessen Konzentration in der Zusammensetzung bestimmen im wesentlichen die Viskosität. Das erforderliche Molekulargewicht kann entweder durch eine gezielte Synthese oder durch einen zum Beispiel hydrolytischen Abbau höhermolekularer Polymere erzielt werden. Mit Hilfe einer Dialyse können ebenfalls bestimmte Molekulargewichte eingestellt werden.
Mit der Menge des organischen Lösungsmittel kann ebenfalls die Viskosität der Zusammensetzung eingestellt, aber auch die Trennleistung beeinflusst werden. Die Zusammensetzung enthält bevorzugt 1 bis 80 Gew.-%, bevorzugter 5 bis 50 Gew.-%, noch bevorzugter 5 bis 40 Gew.-%, und besonders bevorzugt 5 bis 30 Gew.-% Lösungsmittel, bezogen auf die Pufferlösung und das Lösungsmittel. Bei den Lösungsmitteln kann es sich zum Beispiel um polare und erotische oder bevorzugter aprotische Lösungsmittel handeln. Einige Beispiele sind gegebenenfalls mit Methoxy oder Etoxy substituierte Alkanole und Polyole wie Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol, Methoxyethanol und Ethoxyethanol; Diole wie Ethylenglykol, Propandiol, Butandiol, Cyclohexandiol; Triole wie Glycerin oder Trimethylolpropan; und Tetrole wie Pentaerythrit; Carbonsäureamide und Lactame, deren N-Atome zwei beziehungsweise einen Methyl- oder Ethylsubstituenten enthalten können wie Formamid, Acetamid, Caprolactam, Dimethylformamid, Diethylacetamid und N-Methylpyrrolidon, Ketone und Aldehyde wie Acetaldehyd oder Aceton, Sulfone wie Dimethylsulfon, Diethylsulfon und Tetramethylensulfon; Sulfoxide wie Diethylsulfoxid, Diethylsulfoxid und Tetramethylensulfoxid; und Nitrile wie Acetonitril, Propionitril, Butyronitril und Benzonitril.
Die Zusammensetzung enthält 70 bis 99,9 Gew.-%, bevorzugter 75 bis 99 Gew.-%, noch bevorzugter 80 bis 99 Gew.-%, und besonders bevorzugt 90 bis 99 Gew.-% wässrige Pufferlösung. Die wässrige Pufferlösung kann einen pH-Wert im Bereich von 2 bis 12, bevorzugt 4 bis 9 aufweisen.
Art, Menge und Konzentration des Puffermittels werden so ausgewählt, dass die Leistung des kapillarelektrophoretischen Systems bis zu etwa 10, bevorzugt bis zu 3 und besonders bevorzugt 1 Watt beträgt. Geeignete Puffermittel sind zum Beispiel solche auf der Basis von Phospaten und Boraten, zum Beispiel 10 bis 500 mMol TRIS (Tris-(hydroxymethyl)-ami nomethan) und 10 bis 500 mMol Borsäure. Man kann auch BIS (Bis-(2-hydroxyethyl)aminotrishydroxymethyl-methan) ver- oder mitverwenden.
Die Viskosität der Zusammensetzung beträgt bevorzugt 20 bis 500, bevorzugter 50 bis 500, und besonders bevorzugt 50 bis 400 mPa·s.
Die erfindungsgemässe Zusammensetzung ist eine klare und viskose Lösung und eignet sich hervorragend zum Befüllen von Kapillaren elektrophoretischer Vorrichtungen, die nach der Trennung wieder entfernt (ausgespült) werden, um die Kapillaren für weitere Messungen erneut zu befüllen. Die Vorrichtungen sind damit wiederverwendbar, was ein erheblicher wirtschaftlicher Vorteil ist. Dies eröffnet die Möglichkeit, ganze Systeme aus Kapillaren und Trenmittel (sogenannte "kits") in den Handel zu bringen. Ein weiterer ganz erheblicher Vorteil ist, dass man erfindungsgemässe Trennungen nach Ladung, Grösse und Affinität mit Trennungen nur nach Ladung und Grösse unter Verwendung von Polymergelen oder -lösungen ohne kovalent gebundene Rezeptoren in einer Kapillare kombinieren und Trennsysteme optimieren kann, wobei bei Verwendung ersetzbarer Trennphasen auch dies sogar vollautomatisch erfolgen kann. Die Kombination kann zum Beispiel durch Vermischen der Trennsysteme (Polymergele oder -lösungen) vorgenommen werden. Zweckmässiger ist jedoch eine räumlich getrennte Anordnung in der Kapillare unter Verwendung ersetzbarer Trennphasen.
Als ersetzbare Trennphasen ohne kovalent gebundene Rezeptoren sind zum Beispiel Zusammensetzung aus (a) 0,1 bis 30 Gew.-% eines im wesentlichen unvernetzten wasserlöslichen Polymers, das ein mittleres Molekulargewicht von weniger als 5 000 000 aufweist, und (b) 99,9 bis 70 Gew.-% einer wässrigen Pufferlösung alleine oder in Abmischung mit mindestens einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wobei die Zusammensetzung eine Viskosität von 20 bis 600 mPa·s aufweist.
Für diese Zusammensetzung gelten unabhängig die zuvor für die Zusammensetzungen als ersetzbares Trennmittel mit kovalent gebundenen Rezeptoren angegebenen Ausführungsformen und Bevorzugungen. Das Molekulargewicht beträgt bevorzugt 5000 bis 5 000 000, bevorzugter 10000 bis 2 000 000, besonders bevorzugt 10000 bis 1 000 000. Je höher das Molekulargewicht ist, desto verdünntere Lösungen werden zweckmässig verwendet. Das mittlere Molekulargewicht des Polymers in dieser Zusammensetzungen beträgt besonders bevorzugt 10 000 bis 500 000 und ganz besonders bevorzugt 20 000 bis 200 000 Dalton.
Das Molekulargewicht wird mittels Gelpermeationschromatographie unter Verwendung bekannter Standards von zum Beispiel Polyacrylamid bekannten Molekulargewichts bestimmt. Die Viskosität wird mit einem Rotationsviskosimeter (Low Shear 30//MS 1/1) bei 30°C bestimmt.
Geeignete wasserlösliche Polymere sind in grosser Vielzahl bekannt. Die Wahl des Polymers und dessen Molekulargewichts sowie dessen Konzentration in der Zusammensetzung bestimmen die Viskosität. Das erforderliche Molekulargewicht kann entweder durch eine gezielte Synthese oder durch einen zum Beispiel hydrolytischen Abbau höhermolekularer Polymere erzielt werden. Die Polymeren müssen unter den gewählten Trennbedingungen stabil sein. Es können sowohl synthetische als auch natürliche Polymere verwendet werden. Beispiele sind gegebenenfalls teilweise veretherte oder veresterte Polyvinylalkohole, Polyvinylpyrrolidon, gegebenenfalls N-monoalkylierte oder N-dialkylierte Polyacrylate oder -methacrylate, Polyethylenglykole oder Copolymere von Ethylenglykol und 1,2-Diolen wie zum Beispiel 1,2-Propylenglykol, Polysaccharide oder Derivate von Polysacchariden wie zum Beispiel Cellulose und Celluloseether, Stärke, Dextrane und Carragenan. Als Polymere sind auch Dendrimere geeignet.
Bevorzugte wasserlösliche Polymere sind Polyethylenglykole, Polyacrylamide und Polyvinylalkohol.
Die Kapillaren können zum Beispiel auf folgende Weise befüllt sein:

1. Nur mit einem Polymergel, wobei an das Polymer gleiche oder verschiedene Rezeptoren gebunden sind, vorzugsweise nicht mehr als drei verschiedene Rezeptoren.
2. (a) Mit einem Polymergel, wobei an das Polymer gleiche Rezeptoren gebunden sind, (b) und darauffolgend mit einem Polymergel, wobei an das Polymer von (a) verschiedene oder gleiche Rezeptoren gebunden sind. Bei dieser Ausführungsform können auch mehr als zwei, zum Beispiel bis zu zehn, bevorzugter bis zu fünf und besonders bevorzugt bis zu drei Polymergele in der Kapillare aufeinanderfolgend zugegen sein, wobei an die verschiedenen Polymere jeweils verschiedene Rezeptoren gebunden sind.
3. (a) Mit einem Polymergel, wobei an das Polymer gleiche oder verschiedene Rezeptoren gebunden sind, und (b) darauffolgend mit einem Polymergel ohne gebundene Rezeptoren, wie zum Beispiel eine der zuvor beschriebenen Polymerlösungen.
4. (a) Mit einem Polymergel, wobei an das Polymer gleiche oder verschiedene Rezeptoren gebunden sind, (b) darauffolgend mit einem Polymergel ohne gebundene Rezeptoren, wie zum Beispiel eine der zuvor beschriebenen Polymerlösungen, und (c) darauffolgend mit einem Polymergel, wobei an das Polymer zu (a) gleiche oder verschiedene Rezeptoren gebunden sind.
5. (a) Mit einem Polymergel ohne gebundene Rezeptoren, wie zum Beispiel eine der zuvor beschriebenen Polymerlösungen, (b) darauffolgend mit einem Polymergel, wobei an das Polymer gleiche oder verschiedene Rezeptoren gebunden sind, und (c) darauffolgend mit einem zu (a) gleichen oder verschiedenen Polymergel ohne gebundene Rezeptoren, wie zum Beispiel eine der zuvor beschriebenen Polymerlösungen.

Diese Ausführungsformen zeigen bereits auf, dass noch eine grosse Anzahl von nicht mehr erwähnten Varianten möglich ist, um das System an spezifische Trennprobleme anzupassen.
Die Länge der einzelnen Trennphasen in der Kapillare hängt im wesentlichen von der Länge der Kapillare, der Menge gebundener Rezeptoren und der gewünschten Trennleistung für Bestandteile im Analytgemisch ab.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Kapillare für eine elektrophoretische Trennvorrichtung, die wenigstens mit einem festen Polymergel oder einer Polymerlösung, das eine Viskosität von mindestens 20 mPa·s aufweist, mit an das Polymer kovalent gebundenen Rezeptoren, alleine oder in Kombination mit Polymergelen oder -lösungen ohne kovalent gebundene Rezeptoren gefüllt sind, wobei das mittlere Molekulargewicht des Polymers mit kovalent gebundenen Rezeptoren weniger als 2 000 000 und bevorzugt weniger als 1 500 000 Dalton beträgt; zum Beispiel wenigstens mit einer erfindungsgemässen Zusammensetzung und gegebenenfalls mit wenigstens einer der zuvor beschriebenen Polymerlösungen ohne kovalent gebundenen Rezeptor gefüllt ist.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist eine Zusammenstellung für eine elektrophoretische Trennvorrichtung aus (1) wenigstens einem Behälter, in dem sich ein festes Polymer gel oder einer Polymerlösung, die eine Viskosität von mindestens 20 mPa·s aufweist, mit kovalent gebundenen Rezeptoren befindet, wobei des Polymer ein mittleres Molekulargewicht von bis zu 5 000 000 Dalton aufweist, und (2) wenigstens einem Behälter, in dem sich eine Polymerlösung oder ein Polymergel ohne an das Polymer kovalent gebundene Rezeptoren befindet, sowie (3) gegebenenfalls eine oder mehrere Kapillaren für die Kapillargelelektrophorese, wobei die Kapillaren mit den Gelen und Lösungen befüllbar sind; bevorzugt aus wenigstens (1) einem Behälter, in dem sich eine erfindungsgemässe Zusammensetzung befindet, und (2) wenigstens einem Behälter, in dem sich eine wie zuvor beschriebene Zusammensetzung ohne an ein Polymer kovalent gebundene Rezeptoren befindet, sowie (3) gegebenenfalls eine oder mehrere Kapillaren für die Kapillargelelektrophorese.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zusammenstellung für eine elektrophoretische Trennvorrichtung aus (1) wenigstens einem Behälter, in dem sich ein festes Polymergel oder einer Polymerlösung, die eine Viskosität von mindestens 20 mPa·s aufweist, mit kovalent gebundenen Rezeptoren befindet, wobei das mittlere Molekulargewicht des Polymers weniger als 2 000 000 und bevorzugt weniger als 1 500 000 Dalton beträgt, und die Kapillaren mit den Gelen und Lösungen befüllbar sind; und (2) eine oder mehrere Kapillaren für die Kapillargelelektrophorese.
Kapillarelektrophoretische Vorrichtungen mit Detektionseinrichtungen (zum Beispiel UV-Absorptionsmessung) sind bekannt, in der Fachliteratur beschrieben und von unterschiedlichen Herstellern kommerziell angeboten, beispielsweise das Gerät P/ACE 5000 von der Firma Beckmann, Fullerton, CA, USA, oder ^3DCE der Firma Hewlett Packard, Waldbronn, Deutschland. Die Kapillarwände werden zur Vermeidung eines elektroosmotischen Flusses beim pH-Wert der stationären Phase beschichtet, zum Beispiel mit einer dünnen Schicht eines Polyvinylalkohols. Die Schicht kann über einen Linker kovalent gebunden sein.
Der innere Durchmesser der Kapillaren kann zum Beispiel 5 bis 200 und bevorzugt 50 bis 150 μm betragen. Die Länge der Kapillare kann zum Beispiel 0,1 bis 200 cm, bevorzugt 1 bis 30 cm betragen. Die Befüllung der Kapillaren mit den erfindungsgemäss zu verwendenden Zusammensetzung wird zweckmässig unter Druck vorgenommen, zum Beispiel im Bereich von etwa 10³ bis 10⁷ Pa.
Die Kapillaren können aus einem Material bestehen, das ein elektrischer Nichtleiter ist, zum Beispiel aus Glas, Quartz, oder Kunststoffen wie Teflon. Einzelkapillaren werden häufig zum Schutz vor Beschädigungen mit einer Schutzschicht zum Beispiel aus Polyimid versehen. Es können auch Kapillaren oder Kapillarsysteme verwendet werden, die durch Aetztechniken, Prägen oder Mikrofräsen auf Planaren Trägern erhältlich sind.
Die erfindungsgemässe Kapillare für eine elektrophoretische Trennvorrichtung eignet sich hervorragend zur Trennung elektrisch geladener organischer Verbindungen vor allem bioorganischer Verbindungen mit Molekulargewichten im Bereich von etwa wenigstens 300 bis etwa 1 000 000 Da, vorzugsweise 300 bis 800 000 Da, bevorzugter 300 bis 500 000, und besonders bevorzugt 300 bis 200 000, ganz besonders bevorzugt 300 bis 100 000, und insbesondere bevorzugt 300 bis 50 000. Die Vorrichtung kann hierbei durch Ersetzen der erfindungsgemässen Zusammensetzung in der Kapillare nach einer Messung erneut verwendet werden. Die Zusammensetzung kann hierbei in einfacher Weise unter Druck ausgespült werden, wobei man Wasser, organische Lösungsmittel oder Gemische aus Wasser und organischen Lösungsmitteln verwenden kann.
Bei den organischen Verbindungen kann es sich bevorzugt um natürliche oder synthetische Verbindungsgemische handeln, zum Beispiel um Oligonukleotide mit etwa bis zu etwa 5000 Nukleotideinheiten, um oligomere RNA- oder DNA-Sequenzen mit etwa bis zu etwa 5000 Nukleotideinheiten, oligomere Kohlehydrate mit etwa bis zu 100 Zuckereinheiten, sowie oligomere Peptide und Proteine mit etwa bis zu 3000 Aminosäureeinheiten.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann im einzelnen wie folgt ausgeführt werden, wobei Modifikationen zur Optimierung der Trennleistung im Rahmen der Erfindung liegen.
Das elektrische Feld kann zum Beispiel von 50 bis 2000, bevorzugt 100 bis 1500, besonders bevorzugt 200 bis 1200 und insbesondere bevorzugt 200 bis 600 Volt/cm betragen.
Die Detektion der organischen Verbindungen wird zweckmässig mit optischen Methoden vorgenommen, zum Beispiel einer Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge meist im UV-Bereich, oder einer Fluoreszenzdetektion wie einer laserinduzierten Fluoreszenz; oder auch massenspektrometrischen oder NMR-spektroskopischen Methoden.
Die Konzentration der organischen Verbindungen in der Messprobe (Lösung) kann vom milimolaren über den mikromolaren, picomolaren bis zum femtomolaren Bereich liegen.
Die organischen Verbindungen können in Wasser, wässrigen Pufferlösungen oder Gemischen von Wasser beziehungsweise Pufferlösungen mit wassermischbaren organischen Lösungsmitteln gelöst sein. Zur Beladung der Kapillare kann man ein Ende in die Messprobe tauchen und für kurze Zeit (zum Beispiel 1 bis 10 Sekunden) eine Spannung anlegen, wobei die organischen Verbindungen durch Elektrophorese aufgenommen werden. Die Beladung kann auch auf hydrodynamische Weise erfolgen, indem man eine Druckdifferenz zwischen den Kapillarenden erzeugt. Die aufgenommene Menge kann zum Beispiel von wenigen Molekülen über den Attomol- bis zum Picomolbereich betragen.
Es ist ein ganz besonderer Vorteil bei der elektrokinetischen Beladung, dass Aufkonzentrationen und Vorreinigungen aus sehr verdünnten Lösungen wie zum Beispiel Naturstoffextrakten ermöglicht werden, weil komplementäre Zielanalyte an die Rezeptoren des Polymergels gebunden und nicht eluiert werden. In diesem Fall ist der elektrokinetische Beladungsvorgang als vorgeschaltete Verfahrensstufe für das erfindungsgemässe Trennverfahren zu verstehen. Bei dieser Verfahrensführung eignet sich das erfindungsgemässe Verfahren sogar als präparative Methode, mit der ausreichende Mengen für weitere Untersuchungen zur Verfügung gestellt werden, und wobei andere Konzentrationsverfahren wie zum Beispiel die PCR-Methode vermieden werden können. Die elektrokinetische Beladung wird für diese Verfahrensführung bei Bedingungen vorgenommen, bei denen die komplementären Zielanalyte an die Rezeptoren binden, zum Beispiel bei relativ niedrigen Temperaturen.
Die Trennung wird bei der ersten Verfahrensstufe im allgemeinen bei konstanter Temperatur, zum Beispiel –20 bis 90°C, bevorzugt 10 bis 50°C vorgenommen. In dieser ersten Verfahrensstufe werden komplementäre Analytmoleküle an die Rezeptoren gebunden und daher nicht eluiert. Die nicht gebundenen Analytmoleküle werden eluiert und können dabei nach Ladung und Grösse aufgetrennt und detektiert werden.
Die Aufhebung der Affinität der gebundenen komplementären Analytmoleküle durch Veränderung der Elutionsbedingungen kann auf verschiedene Weise vorgenommen werden, zum Beispiel mit einer Veränderung des elektrischen Feldes, einer Temperaturveränderung (kontinuierliche, stufenweise oder einmalige Erhöhung um bis zu etwa 50°C), Veränderung des pH-Wertes (Erhöhung oder Erniedrigung), Zugabe von Denaturierungsmitteln wie Basen (zum Beispiel Amine oder Harnstoff), Zugabe von kompementären organischen Verbindungen mit höherer Affinität zum Rezeptor, oder Zugabe von chaotropischen Reagenzien. Diese Methoden können auch kombiniert werden.
Die Elution und Detektion der Verbindungen wird bei der zweiten Verfahrensstufe im allgemeinen wie schon bei der ersten Verfahrensstufe beschrieben vorgenommen. Wenn zwei oder mehrere Analytverbindungen gebunden sind, kann bei der Elution auch hier eine Auftrennung nach Grösse und Ladung vorgenommen werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann auf verschiedensten Gebieten angewendet werden, bei denen ein Ligand/Substrat-System von Bedeutung ist, besonders bei der Analyse, Detektion und Reinigung von Gemischen organischer Verbindungen, die biologisch wirksame Verbindungen enthaften. Als Beispiele seien genannt:
Isolierung von spezifischen Proteinen und DNA-Molekülen; Reinigung von Antikörpern, Antigenen, Oligonukleotiden, DNA-Molekülen und anderen Wirksubstanzen; Analyse von Oligonukleotiden (Antisensverbindungen) in komplexen Gemischen, zum Beispiel Synthesegemischen; Trennung und Bestimmung von Antigenen und Analyse der Reaktivität mit Antikörpern; Prüfverfahren (Screening) zum Auffinden von zum Beispiel Enzyminhibitoren in Verbindungsbibliotheken und biologischen Extrakten; Prüfverfahren (Screening) zum Auffinden von komplementären DNA-Molekülen in DNA-Bibliotheken; Analyseverfahren (screening tool) zur Kartierung von Organismen wie zum Beispiel Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen; Diagnostikverfahren zur Bestimmung von Krankheiten über körpereigene Peptide, oder mittels Genproben; Verfahren in Form von Immuno- und Enzymassays; Verfahren zur selektiven Isolierung von DNA-Molekülen; Verfahren zur selektiven Isolierung von allelischen Genen aus Gemischen von c-DNA oder genomischen Bibliotheken im Hinblick auf Klonierungen.
Das erfindungsgemässe Verfahren bietet viele, teils überraschende Vorteile. Man erzielt eine höhere Auflösung und Selektivität, besonders bei komplexen biologischen Analytgemischen, die in geringer Konzentrationen und grossen Volumen vorliegen können. Es können ferner Systeme mit Verbraucher bezogenen Rezeptoren angeboten werden. Das Verfahren kann in einfacher Weise unter Verwendung von Standardgeräten voll automatisiert betrieben werden. Das Verfahren weist auch eine hohe Empfindlichkeit auf, selbst bei kleinen Probenmengen. Es handelt sich um ein besonders einfaches Analyseverfahren, bei dem Ergebnisse in kurzen Zeiträumen erhältlich sind. Es können gleichzeitig Polymere mit mehr als einem kovalent gebundenen Rezeptor oder Mischungen von Polymergelen mit verschiedenen kovalent gebundenen Rezeptoren verwendet werden. Das Analyseverfahren bietet durch verschiedenste Ausführungsformen eine hohe Flexibilität und Möglichkeiten zur Optimierung bestimmter Problemstellungen. Ferner wird eine Paralleltrennung und Detektion von gleichen oder verschiedenen Analyten ermöglicht. Besonders vorteilhaft ist es, dass das System zur Lösung unterschiedlichster Aufgabenstellungen bei der Trennung und Detektion von biologisch aktiven Substanzen bis sogar im diagnostischen Bereich verwendet werden kann. Die benötigten Reagenzien sind gut zugänglich und die Polymergele können gezielt nach einfachen Standardmethoden synthetisiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Isolierung von spezifischen Proteinen und DNA-Molekülen; zur Reinigung von Antikörpern, Antigenen, Oligonukleotiden, DNA-Molekülen und anderen Wirksubstanzen; zur Analyse von Oligonukleotiden in komplexen Gemischen; zur Trennung und Bestimmung von Antigenen und Analyse der Reaktivität mit Antikörpern; als Prüfverfahren zum Auffinden von Enzyminhibitoren in Verbindungsbibliotheken und biologischen Extrakten; als Prüfverfahren zum Auffinden von komplementären DNA-Molekülen in DNA-Bibliotheken; als Analyseverfahren zur Kartierung von Organismen aus der Gruppe Pflanzen, Tiere und Mikroorganismen; als Diagnostikverfahren zur Bestimmung von Krankheiten über körpereigene Peptide oder mittels Genproben; als Immuno- und Enzym Assays; als Verfahren zur selektiven Isolierung von DNA-Molekülen; als Verfahren zur selektiven Isolierung von allelischen Genen aus Gemischen von c-DNA oder genomischen Bibliotheken.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Zusammensetzungen (A) aus (a) 0,1 bis 30 Gew.-% eines im wesentlichen unvernetzten wasserlöslichen Polymer, an das ein Rezeptor kovalent gebunden ist, und das ein mittleres Molekulargewicht von weniger als 5 000 000 aufweist, und (b) 99,9 bis 70 Gew.-% einer wässrigen Pufferlösung alleine oder zusammen mit einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wobei die Zusammensetzung eine Viskosität von 20 bis 600 mPa·s aufweist, alleine oder zusammen mit einer in einer Kapillare vor oder nach der Zusammensetzung (A) angeordneten Zusammensetzung (B) aus (a) 0,1 bis 30 Gew.-% eines im wesentlichen unvernetzten wasserlöslichen Polymers, das ein mittleres Molekulargewicht von weniger als 5000000 aufweist, und (b) 99,9 bis 70 Gew.-% einer wässrigen Pufferlösung alleine oder in Abmischung mit mindestens einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wobei die Zusammensetzung eine Viskosität von 20 bis 600 mPa·s aufweist, als Trennmittel in einer wenigstens zweistufigen Kapillaraffinitätsgelelektrophorese.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. A) Herstellung von Ausgangsverbindungen Beispiel A1: Herstellung von
worin
bedeutet.

a) Das Oligonukleotid wird gemäss Standardprotokoll nach der β-Cyanoethylphosphoramiditmethode in einem automatisierten DNA-Synthesizer ABI 394 B hergestellt. In der letzten Stufe wird nach der gleichen Methode Monomethoxytrityl-NH-(CH₂)₆-OP[β-cyanoethyl][N(i-propyl)₂] an die endständige CH₂OH-Gruppe des Oligonukleotids gebunden.
b) Die Synthesekolonne mit dem Trägermaterial, an das das Aminohexamethyloligonukleotid (50 mg, etwa 1 mmol) gebundenen ist, wird dem Synthesizer entnommen, das Trägermaterial durch Absaugen im Vakuum getrocknet und dann mit Dichlormethan gewaschen. Danach gibt man in die Kolonne eine Lösung von 0,25 mmol Methacrylsäureanhydrid und 0,25 mmol N-Methylmorpholin in 1 ml Dichlormethan und lässt 30 Minuten bei Raumtemperatur reagieren. Danach wird die Kolonne mit Dichlormethan und Acetonitril gewaschen und durch Absaugen im Vakuum getrocknet. Das Trägermaterial wird in einen Kolben gegeben, 1 ml konzentiertes wässriges Ammoniumhydroxid zugefügt und über Nacht bei 55°C stehen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit wird zur Entfernung des überschüssigen Ammoniaks schnell verdampft und die erhaltene Lösung chromatographiert, um kleine Moleküle zu entfernen. Die erhaltene salzfreie Lösung wird ohne Erwärmen lyophylisiert und dann direkt für die Polymerisation verwendet. Beispiel A2: Herstellung von
a) Das Oligonukleotid mit der Brückengruppe H[(OCH₂CH₂)₃OP(O)-ONa]₂- (über DimethoxytritylO-[(CH₂CH₂O)₃]₂OP[β-cyanoethyl][N(i-propyl)₂]) wird gemäss Standardprotokoll nach der β-Cyanoethylphosphoramiditmethode in einem automatisierten DNA-Synthesizer ABI 394 B hergestellt. In der letzten Stufe wird nach der gleichen Methode Monomethoxytrityl-NH-(CH₂)₆-OP[β-cyanoethyl][N(i-propyl)₂] an die endständige CH₂OH-Gruppe der Brükkengruppe gebunden.
b) Es wird wie in Beispiel A1, Teil b) verfahren, aber Acrylsäureanhydrid verwendet.

B) Herstellung von Polymeren
Beispiel B1
2477 μl einer dreiprozentigen Lösung von Acrylamid in wässrigem Puffer (100 mmol TRIS, 100 mmol Boräure) werden in einem Kolben mit Helium entgast. Dann gibt man 7,5 μl (0,1 mg Monomer pro μl) Monomer gemäss Beispiel A1, 8 μl einer zehnprozentigen (Gewicht/Volumen) Lösung von Ammoniumpersulfat und 8 μl einer zehnprozentigen (Volumen/Volumen) Lösung von Tetramethylethylendiamin je in Wasser zu. Der Kolben wird verschlossen, geschüttelt und 5 Minuten einem Ultraschallbad ausgesetzt. Dann lässt man 30 Minuten bei Raumtemperatur reagieren und gibt die Reaktionsmischung in ein Dialysegerät zur Entfernung von Oligomeren mit einem Molekulargewicht kleiner als 10 000 Dalton. Die Lösung wird 48 h gegen 1 l Wasser dialysiert, wobei das Wasser dreimal ausgetauscht wird. Danach wird die Polymerlösung in einen Falcon-Kolben gegeben, mit Trockeneis/Aceton gekühlt und lyophylisiert. Die Ausbeute beträgt etwa 75%. Das Gewichtsverhältnis von Acrylamid zu Monomer gemäss Beispiel A1 beträgt 100 : 1.
Beispiel B2
Es wird wie in Beispiel B1 verfahren, aber mit dem Monomeren gemäss Beispiel A2. Die Ausbeute beträgt etwa 75%. Das Gewichtsverhältnis von Acrylamid zu Monomer gemäss Beispiel A2 beträgt 100 : 1.
C) Herstellung von Polymergelen als Trennmittel
Beispiel C1
Das Polymer gemäss Beispiel B1 wird in in einem wässrigen Puffer bestehend aus 100 mmol TRIS [(Trihydroxymethyl)aminomethan] und 100 mmol Borsäure (pH 8,3) zu einer 1,5 prozentigen Lösung gelöst und zur Entfernung von ungelösten Anteilen zentrifugiert. Die gebrauchsfertige Lösung kann bis vor deren Verwendung gelagert werden. Die Viskosität beträgt etwa 40 mPa·s.
Beispiel C2
Es wird wie in Beispiel C1 verfahren, aber mit dem Polymer von Beispiel B2, wobei der Puffer aus 58 mmol TRIS, 58 mmol Borsäure, 24 Volumen-% Dimethylformamid, 20 Volumen-% Dimethylsulfoxid und der Rest Wasser besteht. Die Viskosität beträgt etwa 100 mPa·s.
D) Anwendungsbeispiele
Beispiel D1
496 μl einer dreiprozentigen Lösung von Acrylamid in wässrigem Puffer (100 mmol TRIS, 100 mmol Boräure) werden in einem Kolben mit Helium entgast. Dann gibt man 1,5 μl (0,1 mg Monomer pro μl) Monomer gemäss Beispiel A1, 1,3 μl einer zehnprozentigen (Gewicht/Volumen) Lösung von Ammoniumpersulfat und 1,3 μl einer zehnprozentigen (Volumen/Volumen) Lösung von Tetramethylethylendiamin je in Wasser zu. Die Polymerlösung wird mit einer Spritze in eine mit Methacrylsäure-3-trimethoxysilyl-propylester silylierte Kapillare aus "fused silca" gefüllt. Dann lässt man 24 h polymerisieren und äquilibriert danch mit dem wässrigen Puffer. Die Kapillare hat eine Länge von 24 cm und einen Innendurchmesser von 77 μm und ist bei 17 cm mit einem UV-durchlässigen Fenster versehen. Eine wässrige Lösung enthaltend 100 mmol TRIS [(Trihydroxymethyl)-aminomethan] und 100 mmol Borsäure (pH 8,3) werden als Elektrophorese-Puffer verwendet. Die Kapillare wird bei –5 kV für 10 Minuten äquilibriert. Danach beobachtet man eine stabile UV-Basisabsorption und einen stabilen Strom.
Danach wird die gefüllte Kapillare mit einer Probe d_12-18 (0,0005 OD/μl) und einer Probe dA₁₅ (0,0005 OD/μl) elektrokinetisch bei –6 kV während 5 Sekunden und bei 16°C beladen. Danach wird eine Spannung von –5 kV angelegt, und bei 16°C eluiert. Nach etwa 7,1 Minuten wird dC_12-18 unter Auftrennung eluiert. Nach 10 Minuten wird immer noch kein dA₁₅ beobachtet. Die Temperatur wird auf 40°C erhöht und die Elution fortgesetzt. Nach etwa 3,8 Minuten ab der Temperaturerhöhung wird eine scharfe Absorption beobachtet, die dem eluierten dA₁₅ entspricht.
Beispiel D2
Mit diesem Beispiel wird die Leistungsfähigkeit der Methode mit der Trennung von dA₁₅ unter gleichzeitiger Auftrennung von Mismatchstrukturen demonstriert.
Die Polymerlösung gemäss Beispiel C1 wird bei einem Druck von 3,5·10⁵ Pa während 10 Minuten in eine Kapillare (CElect N, Hersteller Supelco) gefüllt. Die Kapillare hat eine Länge von 24 cm und einen Innendurchmesser von 75 μm und ist bei 17 cm mit einem UV-durchlässigen Fenster versehen. Eine wässrige Lösung aus 100 mmol TRIS und 100 mmol Borsäure (pH 8,3) wird als Elektrophorese-Puffer verwendet. Die Kapillare wird bei –5 kV für 10 Minuten äquilibriert, wobei sich im Ein- und Auslassbehälter zusätzlich 0,5 mmol MgCl₂ befinden. Danach beobachtet man eine stabile UV-Basisabsorption und einen stabilen Strom.
Danach wird die gefüllte Kapillare mit einer Probe dA₁₅ (0,0005 OD/μl) elektrokinetisch bei –6 kV während 6 Sekunden und bei 23°C beladen. Darauf wird eine Mischung aus d(TA₆TA₆T), d(A₇TA₆T) und d(A₇TA₇) bei –8 kV für 9 Sekunden elektrokinetisch injiziert. Danach wird eine Spannung von –5 kV angelegt, und bei einer Temperatur von 23°C eluiert. Nach 6,5 Minuten wird die Temperatur auf 29°C erhöht. Nach etwa 7,7 Minuten werden d(TA₆TA₆T), nach etwa 9,7 Minuten d(A₇TA₆T), nach 10,5 Minuten d(A₇TA₇) eluiert. Nach 13 Minuten wird die Temperatur auf 50°C erhöht. Nach insgesamt 17,7 Minuten wird erst dA₁₅ eluiert.
Beispiel D3
Die Polymerlösung gemäss Beispiel C2 wird bei einem Druck von 3,5105 Pa während 10 Minuten in eine Kapillare (CElect N, Hersteller Supelco) gefüllt. Die Kapillare hat eine Länge von 24 cm und einen Innendurchmesser von 75 μm und ist bei 17 cm mit einem UV-durchlässigen Fenster versehen. 70 mmol TRIS und 70 mmol Borsäure (pH 8,3) in 70 Prozent Wasser (Volumen/Volumen) und 30 Prozent Dimethylformamid (Volumen/Volumen) werden als Elektrophorese Puffer verwendet. Die Kapillare wird bei –25 KV für 12 min äquilibriert. Danach beobachtet man eine stabile UV-Basisabsorption und einen stabilen Strom.
Danach wird die gefüllte Kapillare mit einer Mischung aus dT₁₀ (0.0005 OD/μL), dT₁₅ (0.0005 OD/μL) und dT₂₀ (0.0005 OD/μL) elektrokinetisch bei –4 KV und 10 Sekunden bei 13°C beladen. Darauf wird 5'-TCC CGC CTG TGA CAT GCA TT-3' (0.001 OD/μL) bei –10 KV für 20 Sekunden elektrokinetisch beladen. Danach wird eine Spannung von –15 KV and gelegt und bei einer Temperatur von 13°C eluiert. Nach etwa 9,1 Minuten werden dT₁₀, nach etwa 9,6 Minuten dT₁₅ und nach 10,4 Minuten dT₂₀ eluiert: Nach etwa 13 Minuten wird die Temperatur auf 50°C erhöht. Nach insgesamt 17.2 Minuten wird das Heteromer eluiert.

Claims

Verfahren zur selektiven Trennung von elektrisch geladenen Zielmolekülen in einem Analytgemisch mittels Kapillaraffinitätsgelelektrophorese unter Verwendung einer wenigstens teilweise mit einem Polymergel gefüllten Kapillare, wobei an das Polymer Rezeptoren für Zielmoleküle kovalent gebunden sind, und ein elektrisches Feld von mindestens 50 Volt/cm angelegt ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymergel fest ist, oder eine Lösung des Polymers in einem Lösungsmittel ist und eine Viskosität von wenigstens 20 mPa·s aufweist, und dass man (a) die Kapillare mit dem Analytgemisch beläd, (b) in einem ersten Trennschritt die Zielmoleküle im Analytgemisch an die Rezeptoren bindet und die übrigen Bestandteile eluiert, und (c) in einem zweiten Verfahrensschritt die Elutionsbedingungen gegebenenfalls schrittweise so ändert, dass die Affinität der Zielmoleküle zum Rezeptor aufgehoben und die Zielmoleküle eluiert und detektiert werden.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass an an das Polymer gleiche oder verschiedene Rezeptoren gebunden sind.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe gegebenenfalls teilweise veretherte oder veresterte Polyvinylalkohole, Polyvinylpyrrolidon, gegebenenfalls N-monoalkylierte Polyacrylamide oder -methacrylamide, Polyhydroxyalkylacrylate und -methacrylate, Polyethylenglykole oder Copolymere von Ethylenglykol und 1,2-Diolen, Polysaccharide oder Derivate von Polysacchariden, Stärke, Dextrane und Carragenan.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein verwendetes Copolymer die Strukturelemente mit kovalent gebundenen Rezeptoren in einer Menge von 0,01 bis 99,9 Gew.-% enthält.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Rezeptoren direkt oder über eine Brückengruppe an das Polymerrückgrat des Polymers gebunden sind.
Verfahren gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der an das Polymerrückgrat gebundene Rest eines Rezeptors der Formel I entspricht, -X₀₀₁-(R₀₀₁)_r-(X₀₀₂)_s-R₀₀₃-Rez (I),worin X₀₀₁ eine direkte Bindung, oder X₀₀₂ und X₀₀₁ unabhängig voneinander -O-, -S-, -NR₀₀₂-, -C(O)-O-, -O-C(O)-, -O-C(O)-O-, --SO₂-O-, -O-SO₂-, -O-SO₂-O-, -NR₀₀₂-C(O)-, -C(O)-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-C(O)-O-, O-C(O)-NR₀₀₂-, NR₀₀₂-C(O)-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-SO₂-, -SO₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂SO₂-O-, -O-SO₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-SO₂-NR₀₀₂-, -O-P(O)OR₁₂(O)-, -NR₀₀₂-P(O)OR₁₂(O)-, -O-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-P(O)O R₁₂-NR₀₀₂-, -P(O)OR₁₂-(O)- oder -P(O)OR₁₂-NR₀₀₂- bedeuten, R₀₀₁ eine bivalente Brückengruppe darstellt, Rez für einen monovalenten Rest eines Rezeptors steht, R₀₀₂ H, C₁-C₁₂-Alkyl, C₅- oder C₆-Cycloalkyl, C₅- oder C₆-Cycloalkylmethyl oder -ethyl, Phenyl, Benzyl oder 1-Phenyleth-2-yl steht, R₀₀₃ eine direkte Bindung, C₁-C₁₈-Alkylen, C₅- oder C₆-Cycloalkylen, C₆-C₁₀-Arylen oder C₇-C₁₂-Aralkylen bedeutet, R₁₂ für H, C₁-C₁₂-Alkyl, Ammonium, ein Alkalimetallion, oder ein Äquivalent eines stehen; r die Zahlen 0 oder 1 und s die Zahlen 0 oder 1 bedeuten, und s für 0 steht, wenn r 0 darstellt.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Rezeptoren von Antigenen oder Bruchstücken davon, Antikörpern oder Bruchstücken davon, Hormonen, Proteinen oder Bruchstücken davon, RNA- und DNA-Molekülen oder Bruchstücken davon, natürlichen oder synthetischen Oligonukleotiden, Kohlenhydrate oder Bruchstücken davon, Peptide oder Bruchstücken davon, und natürlichen oder synthetischen biologischen Wirkstoffen ableiten.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymere gleiche oder verschiedene wiederkehrende Strukturelemente der Formel I, oder gleiche oder verschiedene Strukturelemente der Formeln II und III enthalten,

worin X₀₀₁, R₀₀₁, X₀₀₂, R₀₀₃ und Rez die zuvor für Formel I in Anspruch 19 angegebenen Bedeutungen haben; R für H oder C₁-C₄-Alkyl steht; R₃ H, C₁-C₁₀-Alkyl, Phenyl oder C₁-C₄-Alkylphenyl bedeutet; R₂ H, -C(O)-OR₄ oder -C(O)-NR₅R₆ darstellt; R₁ H, Cl, -CN, -OH, -OC₁-C₆-Alkyl, -O-(O)C-R₈, -OC₁-C₆-Hydroxyalkyl, Phenyl, C₁-C₄-Alkylphenyl, -C(O)-OR₄ oder -C(O)-NR₅R₆ darstellt, oder R₁ und R₂ zusammen -O-C₁-C₁₂-Alkyliden-O- bedeuten; R₄ H, Ammonium, ein Alkalimetallion, ein Äquivalent Erdalkalimetallion, C₁-C₁₂-Alkyl, Phenyl oder C₁-C₄-Alkylphenyl bedeutet; R₅ und R₆ unabhängig voneinander für H, C₁-C₁₂-Alkyl, C₁-C₈-Hydroxyalkyl, Cyclohexyl, Benzyl oder Phenyl, oder R₅ und R₆ zusammen für Tetra- oder Pentamethylen, -(CH₂)₂-O-(CH₂)₂- oder -(CH₂)₂-NR₇-(CH₂)₂- stehen, wobei R₇ H oder C₁-C₄-Alkyl ist, x und y je für 0 oder 1 stehen und x + y 1 oder 2 ist; und R₈ C₁-C₁₂-Alkyl, C₁-C₄-Halogenalkyl, C₅- oder C₆-Cycloalkyl, Benzyl oder Phenyl bedeutet.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Polymere Polyacryl- oder Polymethacrylamide mit wiederkehrenden Strukturelementen der Formel IVa, oder wiederkehrenden Strukturelementen der Formel IVa und der Formel Va sind,
worin R H oder Methyl und bevorzugt H bedeutet; R₉ H oder C₁-C₄-Alkyl und bevorzugt H darstellt; R₀₀₁, für C₁-C₁₈-Alkylen, oder für mit -O-, -S-, -O-C(O)-, -C(O)-O-, -NR₀₀₂-C(O)-, -C(O)-NR₀₀₂-, -O-C(O)-O-, -O-C(O)-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-C(O)-O-, -NR₀₀₂-C(O)-, -, -O-P(O)OR₁₂(O)-, -NR₀₀₂-P(O)OR₁₂(O)-, -O-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂-P(O)OR₁₂-NR₀₀₂-, -NR₀₀₂- ein oder mehrfach unterbrochenes C₂-C₁₈-Alkylen steht; R₁₂ für H, Ammonium, C₁-C₁₂-Alkyl, ein Alkalimetallion, oder ein Äquivalent eines Erdalkalimetallions stehen; R₁₀ und R₁₁ unabhängig voneinander H oder C₁-C₄-Alkyl; und und Oli der monovalente Rest eines Rezeptors ausgewählt aus der Gruppe komplementärer Oligonukleotide darstellt.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht der geladenen Zielmoleküle von 300 bis 1 000 000 Dalton beträgt.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapillare mit einer Zusammensetzung aus (a) 0,1 bis 30 Gew.-% eines im wesentlichen unvernetzten wasserlöslichen Polymer, an das ein Rezeptor kovalent gebunden ist, und das ein mittleres Molekulargewicht von weniger als 5 000 000 aufweist, und (b) 99,9 bis 70 Gew.-% einer wässrigen Pufferlösung alleine oder zusammen mit einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wobei die Zusammensetzung eine Viskosität von 20 bis 600 mPa·s aufweist, gefüllt ist.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Trennungen nach Ladung, Grösse und Affinität unter Verwendung von Polymergelen oder -lösungen mit kovalent gebundenen Rezeptoren mit Trennungen nur nach Ladung und Grösse unter Verwendung von Polymergelen oder -lösungen ohne kovalent gebundene Rezeptoren in einer Kapillare kombiniert.
Verfahren gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Kombination eine Zusammensetzung gemäss Anspruch 11 und eine Zusammensetzung aus (a) 0,1 bis 30 Gew.-% eines im wesentlichen unvernetzten wasserlöslichen Polymers ohne kovalent gebundene Rezeptoren, das ein mittleres Molekulargewicht von weniger als 5 000 000 auf weist, und (b) 99,9 bis 70 Gew.-% einer wässrigen Pufferlösung alleine oder in Abmischung mit mindestens einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, wobei die Zusammensetzung eine Viskosität von 20 bis 600 mPa·s aufweist, verwendet.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Aufkonzentrationen und Vorreinigungen aus verdünnten Lösungen durch Bindung komplementärer Zielanalyte an die Rezeptoren des Polymergels mittels elektrokinetischer Beladung bei Bedingungen vornimmt, bei denen die komplementären Zielanalyte an die Rezeptoren binden, und dann die endgültige Trennung durchführt.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur in der ersten Verfahrensstufe –20 bis 90°C beträgt.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung Analytmolekül/Rezeptor aufgehoben wird durch eine Veränderung des elektrischen Feldes, einer Temperaturveränderung, einer Veränderung des pH-Wertes, einer Zugabe von Denaturierungsmitteln, einer Zugabe von kompementären organischen Verbindungen mit höherer Affinität zum Rezeptor, oder einer Zugabe von chaotropischen Reagenzien, oder Kombinationen dieser Methoden.
Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymergel ersetzbar ist und eine Zusammensetzung aus (a) 0,1 bis 30 Gew.-% eines im wesentlichen unvernetzten wasserlöslichen Polymers, an das ein Rezeptor kovalent gebunden ist, und das ein mittleres Molekulargewicht von weniger als 5 000 000 Dalton aufweist, und (b) 99,9 bis 70 Gew.-% einer wässrigen Pufferlösung alleine oder zusammen mit einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels verwendet wird, wobei die Zusammensetzung eine Viskosität von 20 bis 600 mPa·s aufweist.
Zusammensetzung aus (a) 0,1 bis 30 Gew.-% eines im wesentlichen unvernetzten wasserlöslichen Polymers, an das ein Rezeptor kovalent gebunden ist, und das ein mittleres Molekulargewicht von 10 000 bis 500 000 Dalton aufweist, und (b) 99,9 bis 70 Gew.-% einer wässrigen Pufferlösung alleine oder zusammen mit einem organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmittels verwendet wird, wobei die Zusammensetzung eine Viskosität von 20 bis 600 mPa·s aufweist.
Kapillare für eine elektrophoretische Trennvorrichtung, die wenigstens mit einem festen Polymergel oder einer Polymerlösung mit einer Viskosität von wenigstens 20 mPa·s und mit an das Polymer kovalent gebundenen Rezeptoren alleine oder in Kombination mit Polymergelen oder -lösungen ohne kovalent gebundene Rezeptoren gefüllt sind, wobei das mittlere Molekulargewicht des Polymers mit kovalent gebundenen Rezeptoren weniger als 2 000 000 Dalton beträgt.
Ein Kit für eine elektrophoretische Trennvorrichtung aus (1) wenigstens einem Behälter, in dem sich ein festes Polymergel oder eine Polymerlösung mit einer Viskosität von wenigstens 20 mPa·s und mit kovalent gebundenen Rezeptoren befindet, wobei das mittlere Molekulargewicht des Polymers weniger als 5 000 000 Dalton beträgt; und (2) eine oder mehrere Kapillaren für die Kapillargelelektrophorese.
Ein Kit für eine elektrophoretische Trennvorrichtung aus (1) einem Behälter, in dem sich ein festes Polymergel oder einer Polymerlösung mit einer Viskosität von wenigstens 20 mPa·s und mit kovalent gebundenen Rezeptoren befindet, und (2) einem Behälter, in dem sich eine Polymerlösung oder ein Polymergel ohne an das Polymer kovalent gebundene Rezeptoren befindet, sowie (3) gegebenenfalls eine oder mehrere Kapillaren für die Kapillargelelektrophorese.