DE4403779A1 - Synthese von Farbstoff-Biomolekül-Konjugaten - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren, mit dem man in der Lage ist, auch solche Ankergruppen tragende Farbstoffe an Biomoleküle kovalent zu koppeln, die in ihrer oxidierten Form nur in unzureichendem Maße oder überhaupt nicht dazu befähigt sind.

Eine Vielzahl von Farbstoffen hat Einzug in biochemische, molekularbiologische und medizinische Laboratorien gehalten, die in Verbindung mit Biomolekülen (vorzugsweise Proteine, Nukleinsäuren und Kohlenhydrate) eine breite Anwendung erfahren. Die Palette der Anwendungen reicht von der DNA-Sequenzierung, wo insbesondere Fluorophore zum Einsatz kommen (Smith et al., Nature 321 (1986), 674; Prober et al., Science 238 (1987), 336) über verschiedene Hybridisierungs- und Diagnosetechniken (Landegren et al., Science 242 (1988), 229; Schmitz et al., Anal. Biochem. 192 (1991), 222) bis hin zu Untersuchungen von Kinetik und Mechanismen in biologischen Systemen (Loke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 3474; Allen et al, Biochem. 28 (1989), 4601). Nicht nur in analytischer bzw. diagnostischer Hinsicht sind Farbstoff-Biomolekül-Konjugate interessant, auch für therapeutische Zwecke werden diese Konjugate zunehmend herangezogen. In diesem Zusammenhang sei nur an das weite Feld der Photodynamischen Therapie von Tumoren erinnert, wo solche Farbstoffe eine entscheidende Rolle spielen, die Singulett-Sauerstoff generieren (Dougherty, Photochem. Photobiol. 45 (1987), 879; Oseroff et al., Photochem. Photobiol. 46 (1987), 83).

Für die Anbindung von Farbstoffen an Biomoleküle sind kovalente und nicht­ kovalente Varianten zu unterscheiden. Die nicht-kovalente Markierung verläuft prinzipiell über die Bildung von Interkalationskomplexen. Als Beispiele seien Ethidiumbromid bei Nukleinsäuren (Al-Hakeem und Sommer, Anal. Biochem. 163 (1987), 433) und Coomassieblau bzw. Amidoschwarz für Proteine (Fazekas de St. Groth et al., Biochim. Biophys. Acta 71 (1963), 377) genannt.

Bei den zahlreichen Anwendungen von Farbstoff-Biomolekül-Konjugaten erweist sich eine kovalente Kopplung des Chromophors als vorteilhaft. Infolgedessen sind bis heute eine Reihe von Kopplungsstrategien entwickelt worden, die entweder auf primär vorhandene reaktive Gruppen (sogenannte Ankergruppen), wie Amino-, Hydroxyl- und Carboxyl-Gruppen oder auf nachträglich in die Biomoleküle eingefügte, als Ankergruppen dienende, Modifizierungen zurückgreifen. Bei den Proteinen sind primär Amino- (Lysin), Hydroxyl- (Serin) und Carboxyl-Gruppen (Glutamin- und Asparaginsäure) vorhanden. Um zusätzliche Möglichkeiten der Kopplung an Proteine zu schaffen, unterzieht man selbige einer Reduktion (Freisetzung von Thiolgruppen) oder einer Oxidation (Generierung von Aldehydfunktionen in Glykoproteinen). Im Falle der Nukleinsäuren müssen in der Regel Komponenten der Nukleinsäurebausteine an der erforderlichen Position mit der entsprechenden Gruppe modifiziert werden (Haralambidis et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 4857; Sproat et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 6181).

Häufig werden bei der kovalenten Verknüpfung von Biomolekülen mit Farbstoffen, die zunächst ungeeignet erscheinende Ankergruppen tragen, bifunktionelle Kopplungsreagenzien verwendet, wo eine reaktive Funktionalität des Reagenz mit der primär vorhandenen Ankergruppe der biologischen Substanz und die andere Seite mit der Ankergruppe des Farbstoffes reagiert. Des weiteren finden zur Erhöhung der Wirksamkeit der Farbstoffe (z. B. Fluoreszenzamplifikation) am Biomolekül gekoppelte Polyalkohole oder Polyamine Anwendung, die die Anbindung einer großen Anzahl von Chromophoren gewährleistet (Yamane et al., EP 0 251 283; Jiang et al., J. Immunol. Methods 134 (1990), 139).

Als Farbstoffe verwendete man bisher nur in Gegenwart von Luftsauerstoff stabile und unter diesen Bedingungen ausreichend reaktive Substanzen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, weitere geeignete Farbstoffe mit für die beschriebenen Anwendungen notwendigen Eigenschaften zu erschließen. Vor allem aminofunktionalisierte Chromophore, die in ihrer oxidierten Form durch die Anwesenheit mesomer bzw. induktiv wirkender positiver Ladungen keine ausreichende Nukleophilie der Aminogruppe für eine Kopplungsreaktion mit Carboxyl-Gruppen oder anderen elektrophilen Reaktionspartnern (Aldehyde, Halogenalkyl-Funktionen u. a.) aufbringen können, sind darin eingeschlossen.

Neben Amino-Gruppen können prinzipiell auch Thiol- und Hydroxyl-Gruppen auf diese Weise in einen nukleophileren Zustand für entsprechende Kopplungsreaktionen überführt werden.

Carboxyl-Gruppen, die primär vorhanden sind (Proteine) bzw. leicht in Kohlenhydrate (Inman et al., J. Immunol. 114 (1975), 704) und Nukleinsäuren (Kremsky et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 2891) eingeführt werden können, eignen sich bevorzugt für die Kopplung mit den genannten Farbstoffen. Um eine große Anzahl von Farbstoffmolekülen an die Biopolymere zu koppeln, wird eine vorherige Verknüpfung mit p-L-Glutaminsäure vorgeschlagen. Die Kopplung der Farbstoffe ist in drei seperat bzw. nebeneinanderherlaufender Teilreaktionen gegliedert. In einer ersten Reaktion wird die oxidierte Form des Farbstoffes mittels eines geeigneten Reduktionssystems in dessen Leukoform überführt. Die Bildung der Leukoform verläuft entweder vor der eigentlichen Kopplung mit dem Biomolekül in einem eigenen Reaktionsgefäß oder unmittelbar ("in situ") im Kopplungsansatz (vorzugsweise kurz vor Kopplung in einem separaten Reaktionsgefäß) und ist zumeist verbunden mit einer Änderung der elektronischen Struktur der Farbstoffe, was wiederum eine Erhöhung der Reaktivität der nukleophilen Substituenten nach sich zieht. Aminogruppen zum Beispiel reagieren dann unter den üblichen Kopplungsbedingungen mit den Carboxyl-Gruppen der Biopolymere. Ein abschließender Oxidationsschritt überführt die Leukoform des Farbstoffes zurück in dessen oxidierte Ausgangsform, wobei der Chromophor kovalent gebunden bleibt.

Ein Vorteil der Erfindung ist es, die Anwendung von bekannten und neuen Farbstoffen durch die Verknüpfung mit verschiedenen Biomolekülen in biochemischen, molekularbiologischen und medizinischen Bereichen zu ermöglichen oder auszudehnen. Folgende Farbstoffklassen werden davon besonders positiv betroffen:

• - Di- und Triarylmethanfarbstoffe (z. B. Malachitgrün-Derivate)
• - Acridinfarbstoffe
• - Phenoxazin-, Phenothiazin- und Phenazinfarbstoffe (z. B. Methylenblau-Derivate)
• - Xanthenfarbstoffe (z. B. Fluoresceine und Rhodamine)
• - Anthrachinonfarbstoffe

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die einfache Anbindung von p- L-Glutaminsäure als Träger einer großen Zahl von Ankergruppen (Carboxyl- Gruppen) die Option einer Amplifikation der Chromophor-Wirkung durch multiple Farbstoffkopplung eröffnet.

Die einfache Handhabung der Erfindung wird an Hand der aufgeführten Beispiele deutlich. Der genaue Syntheseablauf der Erfindung ist am Beispiel der Kopplung von 8-Aminomethylenblau mit einem monocarboxy- und einem p-L-Glutaminsäure­ funktionalisierten Oligonukleotid beschrieben.

Beispiel 1 Carboxymodifizierte Oligonukleotide Va-c

Synthese von Va: Aus den Verbindungen I und II, die im Handel erhältlich sind, kann das Phosphoramidit III, wie in Schema 1 gezeigt, synthetisiert werden. Die Darstellung der Verbindung III erfolgt analog der in McBride und Caruthers, Tetrahedron Letters 24 (1983), 245 sowie Kremsky et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 2891 offengelegten Strategie.

Die Anbindung des Phosphoramiditbausteins III an das 5′-Ende von Oligonukleotiden ist unter den üblichen Bedingungen der automatischen Oligonukleotidsynthese durchführbar, wobei das carboxymodifizierte DNA- Fragment Va nach anschließender Aufarbeitung mit 0.1 N NaOH und Reinigung mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) an reverser Phase (C₁₈, VDS-Optilab o. ä.) erhalten wird. Der Nachweis der Carboxyl-Gruppe am 5′-Ende der Oligonukleotide gelingt mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), wie bei Kremsky et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987), 2891 beschrieben.

Synthese von Vb und Vc: Die Synthese der 5′-aminofunktionalisierten Oligonukleotide VI und VII erfolgt mit den käuflichen Aminoalkyl- Phosphoramiditbausteinen in der bekannten Weise.

Für die Carboxy-Funktionalisierung von aminomodifizierten Oligonukleotiden besteht die Möglichkeit, sowohl unter wäßrigen als auch in organischen Lösungsmitteln zu arbeiten. Beide Verfahren sollen im folgenden kurz beschrieben werden.

100 nmol Oligonukleotid VII werden in 50 µl Wasser gelöst und mit 50 µl einer Bernsteinsäureanhydridlösung in Wasser (50 mg/ml) versetzt. Nach dem Schütteln des Reaktionsansatzes über den Zeitraum einer Stunde werden weitere 50 µl der Bernsteinsäureanhydridlösung zugesetzt. Nach einer weiteren Stunde wird der Ansatz auf 1 ml mit Wasser verdünnt und das Oligonukleotid über die handelsüblichen Sephadex G-25-Säulen (Pharmacia LKB o. ä.) gereinigt. Das so erhaltene Oligonukleotid wird im Vakuum zur Trockne eingeengt, danach mit 500 µl konzentrierter Ammoniaklösung versetzt und eine halbe Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Eine abschließende Reinigung an Sephadex G-25 und mittels HPLC führt zu den Verbindungen Vb und Vc.

Die am polymeren Träger gebundenen und 5′-carboxymodifizierten Oligonukleotide VIII werden durch Umsetzung von Verbindung VI mit Bernsteinsäureanhydrid in Pyridin dargestellt (Schema 2). Dazu suspendiert man VI (0.2 µmol) in einer Lösung von 1 mg (8 µmol) Dimethylaminopyridin in 500 µl trockenem Pyridin. Zu dieser Suspension werden innerhalb von 30 min zweimal 250 µl einer Bernsteinsäureanhydridlösung in trockenem Pyridin (2 mg/ml, 10 µmol) gegeben. Den Reaktionsansatz läßt man 24 h unter Feuchtigkeitsausschluß schütteln. Der polymere Träger wird anschließend mit Ethanol und Wasser gewaschen. Die Abspaltung der Oligonukleotide vom Träger und deren gleichzeitige Deblockierung mit konzentriertem Ammoniak ergibt Vb und Vc. Die Reinigung der Rohprodukte und der Nachweis der Carboxyl-Gruppe erfolgte wie oben beschrieben.

Beispiel 2 Darstellung von Oligonukleotid-Konjugaten mit einer größeren Anzahl von Carboxylgruppen durch Kopplung von Oligonukleotiden mit Poly-L-Glutaminsäure (Schema 3)

Poly-L-Glutaminsäure-Oligonukleotid-Konjugat Xa-c: 10 nmol eines monocarboxymodifizierten Oligonukleotids, wie z. B. Verbindung Va-c, werden in 2 µl Wasser gelöst und mit 20 µl aminfreiem Dimethylformamid verdünnt. Dazu gibt man 9 µl (30 nmol) einer O-(N-Succinimidyl)-1,1,3,3-tetramethyluronium­ tetrafluoroborat-Lösung in Dimethylformamid (10 µg/10 µl) und 10 µl (30 nmol) einer Diisopropyl-ethylamin-Lösung in Dimethylformamid (5 · 10^-3 µl/10 µl). Zur Aktivierung der Carboxyl-Gruppe läßt man den Reaktionsansatz eine Stunde schütteln. Ohne weitere Aufarbeitung werden 50 µl (100 nmol) einer Poly-L- Glutaminsäure-Lösung in Wasser (19.4 mg/1 ml) und 8.6 µl (100 µmol) einer Diisopropyl-ethylamin-Lösung in Dimethylformamid (20 · 10^-3 µl/10 µl) zugegeben. Nach 24 Stunden Schütteln engt man das Rohprodukt im Vakuum bis zur Trockne ein. Die Isolierung der entsprechenden Konjugate erfolgt durch präparative Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE).

In Abb. 1 ist der Nachweis der Konjugat-Bildung an Hand eines 20%iges Polyacrylamid-Geles nachvollziehbar.

Beispiel 3

Die Darstellung der Leukoform soll am Beispiel von 8-Amino-methylenblau (XI) und von 5′-Amino-fluorescein (XIII) aufgezeigt werden (Schema 4).

Das Verfahren verläuft nach der von Gnehm und Schröter, J. prakt. Chem. 73 (1906), 401 für 8-Amino-methylenblau beschriebenen Methodik.

In einem Reaktionsgefäß werden 46 µmol der oxidierten Form des Farbstoffes (XI oder XIII) und 400 mg (6 mmol) Zinkpulver eingewogen. Das Gefäß wird mit Argon gespült und verschlossen. Anschließend werden unter ständigem Rühren 2 ml einer 1 N HCl-Lösung mittels einer Spritze injiziert. Infolge der reduzierenden Eigenschaften des entstehenden Wasserstoffs bildet sich die entsprechende farblose Leukoform des Farbstoffs. Den Ansatz läßt man insgesamt 30 min rühren, was eine fast vollständige Neutralisation der Salzsäure durch den dreifachen Überschuß an Zink gewährleistet. Eine Aufarbeitung des Reaktionsansatzes erfolgt nicht, da die erhaltene Lösung direkt in den folgenden Kopplungsreaktionen mit den Carboxyl- Gruppen eingesetzt werden kann.

Beispiel 4 Konjugation von Farbstoff und Oligonukleotid (Schema 5)

Das lyophilisierte 5′-carboxymodifizierte Oligonukleotid Va-c (24 nmol) wird in einem geeigneten Reaktionsgefäß in 86 µl 0.1 M MES-Puffer pH 6 (2- Morpholinoethansulfonsäure/Natriumhydroxid-Puffer) und 50 µl aminfreiem Dimethylformamid gelöst. Zu der Oligonukleotidlösung gibt man jeweils 10 µl einer Lösung von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimid-hydrochlorid in 0.1 M MES-Puffer pH 6 (28 mg/ml, 1.5 µmol) und Imidazol in 0.1 M MES-Puffer pH 6 (136 mg/ml, 20 µmol). Aus dem Reaktionsgefäß mit der Leukoform des Farbstoffes (XII), die in der Art synthetisiert wird, wie in Beispiel 3 beschrieben, entnimmt man die entsprechende Menge der wäßrigen Lösung. Die farblose Lösung der Leukoform gibt man dann in das Reaktionsgefäß mit dem in der Zwischenzeit aktivierten Oligonukleotid und schüttelt 3 Stunden unter Argon bei Raumtemperatur. Im Anschluß wird im Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Die Oxidation des Farbstoffs erfolgt an der Luft. Zur Trennung des überschüssigen Farbstoffs vom entstandenen Konjugat (XVa-c) nutzt man Sephadex G-25-Säulen (NAP-10, Pharmacia LKB o. ä.). Die Reinigung der Konjugate gelingt abschließend mittels HPLC an reverser Phase (C18, VDS Optilab o. ä.) mit einem Acetonitril-Gradienten, wobei die Konjugate eine wesentlich längere Retentionszeit zeigen als die Oligonukleotide ohne Farbstoff. An Hand der integrierten Peakflächen kann abgeschätzt werden, wieviel der eingesetzten DNA-Fragmente den Farbstoff kovalent binden konnten (in der Regel 50-70%). Die UV-Vis-Spektren der gereinigten Konjugate XVa-c weisen sowohl die Oligonukleotidbande bei 260 nm als auch das entsprechende Absorptionsmaximum des Farbstoffes (XI, λ_max = 668 nm) auf.

Beispiel 5 Konjugation von Farbstoff und Polypeptid (Schema 6)

In einem Reaktionsgefäß werden 14.7 mg (46 µmol) 8-Amino-methylenblau (XI), wie in Beispiel 3 gezeigt, zur Leukoform umgesetzt. In der Zwischenzeit werden in ein zweites Reaktionsgefäß 62.6 mg (920 µmol) Imidazol eingewogen und 1 ml 0.1 M MES-Puffer sowie 1 ml aminfreies Dimethylformamid pipettiert. Nach Auflösen des Imidazols setzt man 100 µl einer Polypeptidlösung (2.3 µmol bezogen auf vorhandene Carboxyl-Gruppen) hinzu. Kurz vor der eigentlichen Kopplung gibt man in das zweite Reaktionsgefäß zur Aktivierung der Carboxyl-Gruppen 500 µl eine Lösung von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimid-hydrochlorid in 0.1 M MES-Puffer pH 6 (26.4 mg/ml, 69 µmol). Unter Rühren werden nun die 2 ml des Reduktionsansatzes aus dem ersten Gefäß in die Polypeptidlösung gegeben. Das Kopplungsgemisch läßt man 18 Stunden bei Raumtemperatur in der Dunkelheit und unter Argon rühren. Zur Oxidation des Farbstoffes spült man das Reaktionsgefäß 10 min mit Sauerstoff. Die nun dunkelblaue Lösung engt man im Vakuum auf 3 ml ein und chromatographiert je ein Drittel an einer Sephadex G-25-Säule (NAP-10, Pharmacia LKB o. ä.). Die blaugefärbten Fraktionen von 2-8 ml enthalten das gewünschte Produkt. Das überschüssige 8-Aminomethylenblau verbleibt auf der Sephadex-Säule.

Schema 3

Schema 4

Schema 5

Schema 6

Claims (9)

1. Verfahren zur Synthese von Farbstoffen-Biomolekül-Konjugaten, dadurch gekennzeichnet, daß Leukofarbstoffe verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Biomo­ leküle Carboxyl-Gruppen tragen.

3. Verfahren nach Anspruch 1-2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bio­ moleküle vorzugsweise Nukleinsäuren, Proteine bzw. Polysaccharide und Kombinationen zwischen diesen darstellen.

4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bio­ moleküle in erster Linie Nukleinsäure-Fragmente oder Oligonukleotide mit einem carboxymodifizierten 3′- oder 5′-Ende sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß der An­ teil der Carboxyl-Gruppen in den Biomolekülen durch Einführung von p-L- Aminosäuren, vorzugsweise p-L-Glutaminsäure, erhöht werden kann.

6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Farb­ stoffe solche sind, die nukleophile Gruppen tragen und in ihrer oxidierten Form keine ausreichende Nukleophilie für die Anbindung an Carboxyl-Gruppen be­ sitzen.

7. Verfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß die Farb­ stoffe vor oder während (vorzugsweise kurz vor) der Kopplung an die Carb­ oxyl-Gruppen in ihre reduzierte Form (Leukoform) überführt werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die An­ bindung der Farbstoffe in ihrer Leukoform über die Aktivierung der Carboxyl- Gruppen verläuft.

9. Verfähren nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die Akti­ vierung der Carboxyl-Gruppen vorzugsweise mit Carbodiimiden, insbesondere N′-(3-Dimethyl-aminopropyl)-N-ethylcarbodiimid Hydrochlorid, oder über aktivierte Ester, insbesondere N-Hydroxysuccinimidester, erfolgt.