DE3000879C2

DE3000879C2 -

Info

Publication number: DE3000879C2
Application number: DE3000879A
Authority: DE
Inventors: Kikuo Kotani; Nobuaki Nakagawa; Kunio Ohyama; Susume Watanabe; Tadashioro Shizuoka Jp Fujii
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1979-01-12
Filing date: 1980-01-11
Publication date: 1989-08-31
Also published as: DE3000879A1; CA1134830A; GB2040935A; SE8000146L; NL8000188A; FR2446287B1; US4287345A; FR2446287A1; GB2040935B; SE446184B

Description

Die Erfindung betrifft polyfunktionelle Disulfidverbindungen, die als Vernetzungsmittel wirksam sind, da sie funktionelle Gruppen mit zwei unterschiedlichen Reaktivitäten enthalten.

In der Literatur werden noch keine multifunktionellen Reagentien beschrieben, die unterschiedliche Reaktivitäten an den funktionellen Gruppen aufweisen. In der Literatur werden beispielsweise folgende bekannte Reagentien beschrieben:

OHC-X-CHO,
HOOC-X-COOH,
HOOC-X-NH2 und
H₂N-X-NH₂.

Diese Reagentien enthalten im Molekül die gleiche funktionelle Gruppe, und man beobachtet keine unterschiedliche Reaktivität der funktionellen Gruppe.

In den Literaturstellen "J. Amer. Chem. Soc. 80 (1958) 2132 bis 2141"; "J. Med. Chem. 13 (1970) 273 bis 276" und "Chem. Abstr. 71 (1969) 91 245p" werden Verbindungen der Formel R′-S-S-R′ beschrieben. Diese Verbindungen zeigen keine unterschiedliche Vernetzungsaktivität. In den Literaturstellen "Torchinsky, Y. M.: Sulfur in Proteins, Pergamon Press Ltd., 1981 (Russische Erstausgabe 1977), Seite 121 bis 125" und "Bohak, Sharon: Biotechnological Applications of Proteins and Enzymes, Acad. Press, N.Y., 1977, Seite 93 bis 94, 100 bis 102" wird eine einfache Reaktivität der S-S-Austauschreaktion beschrieben.

Die vorliegende Erfindung betrifft polyfunktionelle Disulfidverbindungen der Formel

worin R 2-Benzothiazolyl oder 2-Pyridyl-N-oxid bedeutet und X eine geradkettige - oder verzweigte Alkylengruppe auf 2 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, deren Enden unmittelbar an die S-S-Gruppen gebunden sind, wobei X gegebenenfalls durch eine Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppe substituiert und/oder gegebenenfalls durch eine Ether- oder Amidbindung unterbrochen ist.

Die erfindungsgemäße polyfunktionelle Disulfidverbindung der Formel (I), die im folgenden als "polyfunktionelle Verbindung (I)" bezeichnet wird, ist als Vernetzungsreagens nützlich, da sie funktionelle Gruppen für die S-S-Austauschreaktivität mit zwei unterschiedlichen Arten von Reaktivitäten enthält

Die polyfunktionelle Verbindung (I) weist eine S-S- Austauschreaktion bei einer äquimolaren Reaktion mit einer Verbindung mit einer Thiolgruppe, z. B. einem Enzym, einer Verbindung, die bei einer Immunreaktion auftritt, wie ein Hapten, ein Antigen oder Rezeptor, einem Träger, wie einem Proteinträger oder einem immobilisierten Träger, oder einem thiolmodifizierten Derivat auf. Bei der Reaktion der ersten Stufe zeigt die S-S-Gruppe, die an die 2-Benzothiazolyl gruppe gebunden ist, eine S-S-Austauschreaktion mit einer Thiolgruppe in einer Verbindung mit einer Thiolgruppe. Wird nach der ersten Stufe der Reaktion zusätzlich eine Verbindung mit einer Thiolgruppe zugegeben und umgesetzt, so zeigt die S-S-Gruppe, die an die 2-Pyridylgruppe gebunden ist, eine S-S-Austauschreaktivität zweiter Ordnung und die an die 2-Pyridylgruppe gebundene S-S-Gruppe reagiert mit der Thiolgruppe.

Der Grund, daß die Gruppe R schneller reagiert als

ist der, daß die Gruppe R-S-S-, worin R

bedeutet, reaktiver ist als -S-S-.

Beispielsweise beträgt die S-S-Austauschreaktivität unter Verwendung von Dithiothrytol:

Die erfindungsgemäße polyfunktionelle Verbindung (I) kann wegen der Aktivität ihrer funktionellen Gruppen bei geeigneter Auswahl und Kombination mit einer Verbindung mit einer Thiolgruppe, wie Verbindungen, die bei Immunreaktionen auftreten, Trägern oder ihren thiolmodifizierten Derivaten, für die Herstellung markierter Substanzen für den Immunoassay, verwendet werden. Sie kann auch zusammen mit einem Gemisch aus Enzymen und Substanzen, die bei Immunreaktionen auftreten, zusammen mit einem immobilisierten Enzym, einem Gemisch aus Enzym und unlöslichem Träger, als feste Phase für den Immunoassay, zusammen mit einem Gemisch aus Substanzen, die bei Immunreaktionen auftreten und einem unlöslichen Träger, als Träger für die Affinitätschromatographie oder zusammen mit einem haptenischen Gemisch für die Antikörperbildung das Hapten und einen Proteinträger enthält, verwendet werden.

Die Anmelderin hat überraschenderweise gefunden, daß die polyfunktionelle Verbindung (I), die bei der Umsetzung von Carbonsäurederivaten der Formel (II)

R-S-S-CH₂-CH₂-COOH (II)

worin R die zuvor gegebene Bedeutung besitzt, mit einem Aminderivat der Formel (III)

erhalten wird, eine stufenweise S-S-Austauschreaktivität aufweist, wobei die S-S-Gruppe, die an die 2-Benzothiazolyl- oder 2-Pyridyl-N-oxid-Gruppe gebunden ist, eine S-S- Austauschreaktion für eine Verbindung mit einer Thiolgruppe erster Ordnung zeigt und die andere S-S-Gruppe, die an die 2-Pyridylgruppe gebunden ist, eine S-S-Austauschreaktion zweiter Ordnung aufweist.

Zwei Arten von Verbindungen mit Thiolgruppen werden stufenweise mit der Verbindung (I) umgesetzt, und die Verbindung (I) ist somit eine nützliche Verbindung für verschiedene Reagentien, in denen Verbindungen mit einer Thiolgruppe quantitativ an beide Enden der Verbindung (I) gebunden sind.

Ein anderes Verfahren zur Herstellung der polyfunktionellen Verbindung (I) besteht darin, daß 2,2′-Dithio-bis-(benzothiazol) und 2,2′-Dithio-bis-(pyridin) mit einer Dithiolverbindung der Formel (IV)

HS-X-SH (IV)

worin X die zuvor gegebene Bedeutung besitzt (die im folgenden als "Dithiolverbindung (IV)" bezeichnet wird), in einem inerten Medium umgesetzt werden.

Die erfindungsgemäße polyfunktionelle Verbindung (I) kann z. B. durch Umsetzung eines funktionellen Derivats eines Carbonsäurederivats der Formel (II) mit einem Aminderivat der Formel (III) in einem inerten Medium, je in äquimolarem Verhältnis, bei -20° bis 30°C während 10 Minuten bis 5 Stunden hergestellt werden. Beispiele inerter Medien sind Dimethylformamid, Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Methylenchlorid, Tetrahydrofuran und deren Gemische. Das gewünschte Produkt, nämlich das polyfunktionelle Derivat (I), kann nach üblichen Trenn-, Isolierungs- oder Reinigungs verfahren hergestellt werden.

Das obige Carbonsäurederivat der Formel (II) kann beispielsweise entsprechend dem in der DE-OS 29 28 384 beschriebenen Verfahren erhalten werden. Beispielsweise wird 2,2′-Dithio- bis-(benzothiazol) oder 2,2′-Dithio-bis-(pyridin-N-oxid) mit 3-Mercaptopropionsäure in einem äquimolaren Verhältnis oder in einem etwas überschüssigen Verhältnis von 3-Mercapto propionsäure in Benzol, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Aceton, Methanol oder Äthanol bei 10 bis 70°C während 10 Minuten bis 5 Stunden umgesetzt. Danach kann das Carbonsäurederivat der Formel (II) nach an sich bekannten Isolierverfahren, wie Kühlen, Konzentrieren oder Vakuumtrocknung, erhalten werden. Das Carbonsäurederivat wird in seinen aktivierten Ester durch Behandlung des Säurederivats mit N-Hydroxysuccinimid oder p-Nitrophenol und Dicyclo hexylcarbodiimid in einem Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Äthylacetat, Tetrahydrofuran oder Dioxan, überführt, oder es wird in sein Säurechlorid durch Umsetzung mit Thionylchlorid als reaktivem Derivat eines Carbonsäurederivats der Formel (II) umgewandelt. Das reaktive Derivat wird der Kondensationsreaktion mit einem Aminderivat der Formel (III) unterworfen, oder es wird direkt mit dem Aminderivat mittels eines Kondensationsmittels, wie Dicyclo hexylcarbodiimid, umgesetzt. Ein weiteres Beispiel eines Aminderivats der Formel (III) wird in The Journal of Organic Chemistry, 29, 1635 (1964), beschrieben; hier wird 2-Mercaptoäthylamin mit Wasserstoffperoxid unter Bildung von 2-Aminoäthyl-2′-aminoäthanthiolsulfonat oxidiert, und diese Verbindung wird mit 2-Mercaptopyridin unter Bildung des Aminderivats umgesetzt. Sie kann ebenfalls durch Umsetzung von 2,2′-Dithio-bis-(pyridin) und 2-Mercaptoäthylamin erhalten werden.

Ein anderes Verfahren zur Herstellung der polyfunktionellen Verbindung (I) ist die Umsetzung von 2,2′-Dithio-bis- (benzothiazol) oder 2,2′-Dithio-bis-(pyridin) mit der Dithiol verbindung (IV) in einem inerten Medium, wie zuvor erläutert. Beispiele von inerten Medien sind Lösungsmittel, die 2,2′-Dithio-bis-(benzothiazol), 2,2′-Dithio-bis- (pyridin) und die Dithiolverbindung (IV) auflösen können, z. B. Alkohole, wie Methanol oder Äthanol, Tetrahydrofuran, Dioxan, Äthyläther, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Aceton, Benzol oder deren Gemische. Es können auch Gemische der obigen organischen Lösungsmittel und Wasser oder Puffer lösungen erwähnt werden.

Beispiele sind Dithiolverbindungen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, wie 1,2-Dimercaptoäthan, 1,4- Dimercaptoäthan, 1,6-Dimercaptohexan, 1,8-Dimercaptooctan, 1,9-Dimercaptononan, 1,10-Dimercaptodecan, 2,3-Dimercapto- 1-propanol, Di-(2-mercaptoäthyl)-äther, Dithioerythrit oder Dithiothreit.

Das Auflösen der 2,2′-Dithio-bis-(benzothiazol)-, der 2,2′- Dithio-bis-(pyridin)- und der Dithiolverbindung (IV) kann vorab oder gleichzeitig erfolgen. Das Verhältnis von jedem Reagens beträgt mehr als 1 Mol oder bevorzugt 1 bis 1,5 Mol an 2,2′-Dithio-bis-(benzothiazol) und mehr als 1 Mol oder bevorzugt 5 bis 30 Mol an 2,2′-Dithio-bis-(pyridin) pro Mol der Dithiolverbindung (IV). Die Reaktionstemperatur beträgt 0 bis 40°C. Die Reaktionszeit kann entsprechend der Reaktionstemperatur oder des verwendeten Lösungsmittels variieren und beträgt gewöhnlich 2 bis 240 Minuten. Die Isolierung der polyfunktionellen Verbindung (I) kann nach an sich bekannten Trenn-, Isolierungs- oder Reinigungs verfahren, wie durch Lösungsmittelextraktion oder Säulen chromatographie, erfolgen.

Die polyfunktionelle Verbindung (I) hat S-S-Gruppen an beiden Seiten ihrer Abstandsgruppe, und eine 2-Benzothiazolylgruppe, eine 2-Pyridyl-N-oxid-Gruppe oder eine 2-Pyridylgruppe ist an jede S-S-Gruppe gebunden. Die Abstandsgruppe ist identisch mit der Gruppe X in der Dithiolverbindung (IV) und bedeutet eine geradkettige - oder verzweigte Alkylengruppe aus 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, deren Enden unmittelbar an die S-S-Gruppen gebunden sind, wobei X gegebenenfalls durch eine Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppe substituiert und/oder gegebenenfalls durch eine Ether- oder Amidbindung unterbrochen ist.

Die S-S-Austauschreaktivitäten der erfindungsgemäßen poly funktionellen Verbindung sind in Tabelle 1 aufgeführt.

In der Tabelle werden die Verbindungen der Formel (Ia) und (Ib), wie im folgenden angegeben, als erfindungsgemäße poly funktionelle Derivate (I) verwendet.

Als Verbindung mit einer Thiolgruppe wird Glutathion in einem Molverhältnis von dem 0,5- bis 2,0fachen Überschuß, bezogen auf die polyfunktionellen Verbindungen, verwendet, wobei die S-S-Austauschreaktivität der Verbindungen (Ia) und (Ib) gemessen werden soll. Die Konzentration ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Reaktion erfolgt in einem 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,2, als Reaktionsmedium bei 25°C während 30 Minuten, wobei der Puffer 1 ml EDTA enthält.

Die maximalen Absorptionen bei 310 nm, 333 nm und 343 nm des so gebildeten 2-Mercaptobenzothiazols, 2-Mercaptopyridin- N-oxids oder 2-Mercaptopyridins werden bei der Konzentration einer 50fachen Verdünnung der jeweiligen Reaktionsgemische bestimmt.

Bei den Versuchen, bei denen ein höherer als äquimolarer Überschuß an Glutathion verwendet wurde, wird die Reaktion durchgeführt, indem man zuerst das äquimolare Verhältnis von Glutathion zugibt und nach dem Nachweis des Reaktions produktes die restliche überschüssige Menge an Glutathion zufügt.

Δ A gibt in der Tabelle den Unterschied der Absorption bei der jeweiligen maximalen Absorptionswellenlänge zwischen, nach und vor der Reaktion an.

Die molaren Absorptionskoeffizienten bei einer maximalen Absorptions wellenlänge sind wie folgt:

2-Mercaptopyridin-N-oxid: 3830 (333 nm), 3190 (343 nm);
2-Mercaptobenzothiazol: 19 300 (310 nm), 160 (343 nm);
2-Mercaptopyridin: 3170 (310 nm), 7270 (333 nm), 8130 (343 nm).

Tabelle 1

Wie aus Tabelle 1 folgt, ist die erfindungsgemäße poly funktionelle Verbindung (I) eine neue Verbindung mit einer S-S-Austauschreaktivität, die in zwei stufenweise Reaktivitäten für eine Verbindung mit einer Thiolgruppe zerfällt. Die S-S-Austauschreaktivität ist für die Reaktionsrichtung konstant und quantitativ.

Eine andere S-S-Austauschreaktivität kann beispielsweise festgestellt werden, wenn die polyfunktionelle Verbindung (I) in einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5), der 10% Dimethylformamid enthält, gelöst und 2-Mercaptoäthanol zugegeben wird. Die Mengen an gebildetem 2-Mercaptobenzothiazol und 2-Mercaptopyridin werden analysiert, wodurch die S-S- Austauschreaktivität der Verbindung bestätigt wird.

Die erfindungsgemäße polyfunktionelle Verbindung (I) besitzt verschiedene Verwendungsmöglichkeiten, z. B. als Vernetzungs mittel für einen gebundenen Komplex aus Enzym und Hapten, Antigen, Antikörper oder Rezeptor bei einem Enzym- Immunassay und einem Enzym-Rezeptorassay; als Vernetzungs mittel für einen gebundenen Komplex aus Hapten und einem Enzym bei der Antigenbildung; als Immobilisierungsmittel für die Immobilisierung eines festen Trägers und Hapten, Antigen, Antikörper oder Rezeptor bei einem Immunoassay; als Immobilisierungsreagens für einen gebundenen Komplex aus Enzym und Träger bei einem immobilisierten Enzym; oder als Immobilisierungsreagens für Hapten, Antigen, Antikörper oder Rezeptor und Träger bei der Affinitätschromatographie. Weiterhin können reaktive Derivate der obigen physiologisch aktiven Substanzen oder Träger mit S-S-Austauschreaktivität erhalten werden, indem man diese Substanzen oder den Träger und die polyfunktionelle Verbindung umsetzt.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann erhalten werden, indem man in einem inerten Lösungsmittel, wie Wasser, Phosphatpuffer, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder ihren Lösungs mittelmischungen, bei Umgebungstemperatur während 10 Minuten bis 24 Stunden umsetzt.

Die oben erwähnten, physiologisch aktiven Substanzen oder Träger sind nicht auf eine Verbindung mit einer Thiolgruppe, bzw. Enzyme wie β-Galactosidase und Urease, oder im Handel erhältliche Träger mit Thiolgruppen, wie Acryl amidpolythiol oder eine Glasverbindung mit Thiolgruppe beschränkt. Physiologisch aktive Substanzen oder Träger, wie ein Protein oder ein Peptid mit einer S-S-Gruppe im Molekül, können nach der Reduktion der S-S-Gruppe verwendet werden. Die Thiolgruppe kann in eine funktionelle Gruppe, wie eine Aminogruppe, eingeführt werden, z. B. unter Verwendung von S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid [Arch. Biochem. Biophys., 96, 605-612 (1962)]. Das funktionelle Derivat des Disulfidderivats mit einer 2-Benzothiazolyl- oder 2-Pyridyl-N-oxidgruppe wird mit der Aminogruppe in der physiologisch aktiven Substanz oder dem Träger umgesetzt (JA-OS 53-85 900), und die S-S-Gruppe wird durch Behandlung mit Dithiothreit oder Alkali, wie einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert über 9,5, zur Einführung der Thiolgruppe behandelt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

(1) Zu 40 g 2,2′-Dithio-bis-(benzothiazol) gibt man 1,5 l Benzol und 8,0 g 3-Mercaptopropionat und setzt 3 h bei 70°C unter Rühren um. Danach wird das Reaktionsgemisch auf Zimmertemperatur abgekühlt, im Vakuum konzentriert und über Nacht bei 5°C stehengelassen. Dabei fallen rohe Kristalle aus, die aus Benzol umkristallisiert werden; man erhält 16,25 g 3-(2′-Benzothiazolyldithio)-propionatkristalle.

Zu 8,13 g 3-(2′-Benzothiazolyldithio)-propionat in 80 ml Dimethylformamid gibt man 34,5 g N-Hydroxysuccinimid und 6,8 g Dicyclohexylcarbodiimid, rührt 1 h unter Eiskühlung und 2 h bei Umgebungstemperatur. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat wird in 10 Vol. Wasser gegeben. Der sich bildende Niederschlag wird filtriert, getrocknet und wiederholt aus Benzol umkristallisiert; man erhält 7,18 g 3-(2′-Benzothiazolyl-dithio)- propionat-N-succinimid-ester-Kristalle.

λ _max = 270 nm [Dimethylformamid : Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,5) = 1 : 5];
R_f = 0,53 (Silikagel TLC, Benzol : Äthylacetat = 3 : 1).

(2) Zu 10,0 g 2-Mercaptoäthylamin-hydrochlorid, gelöst in 40 ml Wasser, gibt man tropfenweise unter Rühren und Kühlen im Verlauf von 30 min 4,5 ml 30%iges wäßriges Wasserstoffperoxid. Man fügt 9,0 ml 30%iges wäßriges Wasserstoffperoxid zu und läßt 24 h bei Zimmertemperatur stehen. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum unter Bildung eines Sirups konzentriert. Wasserfreies Äthanol wird zugesetzt zur Bildung von 10,7 g roher Kristalle, die aus Essigsäure um kristallisiert werden; man erhält 9,77 g 2-Aminoäthyl-2′- aminoäthan-thiolsulfonat-2-hydrochlorid in Form weißer, nadelförmiger Kristalle.

H₂N-CH₂CH₂SO₂-S-CH₂-CH₂-NH₂ · 2 HCl; Fp. 165 bis 166°C.

7,7 g 2-Aminoäthyl-2′-aminoäthan-thiosulfonat · 2 HCl, gelöst in 12 ml einer 3 ml konz. Chlorwasserstoffsäure enthaltenden, wäßrigen Lösung, werden tropfenweise unter Rühren bei Zimmertemperatur mit 12 ml Äthanollösung aus 3,33 g 2-Mercaptopyridin versetzt. Nach 20stündigem Rühren wird Äthanol aus dem Reaktionsgemisch abdestilliert (unter vermindertem Druck) und Chloroform zur Extraktion der nichtumgesetzten Verbindung zugegeben. Eine kalte, wäßrige Lösung, die 8,4 g Kaliumhydroxid enthält, wird zugegeben, und dann wird mit Chloroform extrahiert. Anschließend wird noch zweimal mit Chloroform extrahiert. Diese Extrakte werden sofort mit konz. HCl geschüttelt. Die konz. HCl-Schichten werden vereinigt und konzentriert. Man erhält eine sirupartige Substanz. Wasserfreies Äthanol wird zur Ausfällung der rohen Kristalle (4,91 g) zugegeben, die aus wasserfreiem Äthanol umkristallisiert werden; man erhält 3,68 g 2-Pyridyl-2′- aminoäthyldisulfid · 2 HCl.

(3) 2,0 g 2-Pyridyl-2′-aminoäthyldisulfid · 2 HCl werden in 20 g Wasser gelöst. Nach Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf 10 durch Zugabe von 1 N wäßrigem Kaliumhydroxid wird mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Zu der Äthylacetatschicht gibt man tropfenweise unter Kühlen und Rühren eine Äthylacetatlösung von 2,27 g 3-(2′-Benzothiazolyldithio)-propionat-N-succinimid-ester, setzt 90 min um, filtriert den gebildeten Niederschlag und trocknet. Dieser wird weiterhin in Chloroform gelöst, unter Eiskühlen mit 5%igem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat gewaschen, dann mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und als Chloroformschicht konzentriert. Hexan wird zu dem Konzentrat zugegeben; man erhält 2,07 g N-[2-(2′-Pyridyldithio)-äthyl]- 3-(2′-benzothiazolyldithio)-propionamid.

λ _max = 282 nm;
E = 235 [Dimethylformamid : 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) = 1 : 9];
R_f = 0,41 (Chloroform : Äthylacetat = 1 : 1, Silikagel TLC);
R_f = 0,12 (Benzol : Äthylacetat = 3 : 1, Silikagel TLC).

Die Reaktivität sowie die Nützlichkeit dieser Verbindung gehen klar aus den folgenden Ausführungen hervor.

Zu 0,15 M (0,85%igem) NaCl, enthaltend Antiinsulin-Antikörper-Fab′ (2,0 mg) und Phosphatpuffer, enthaltend 1 mM EDTA (im folgenden als "PBS" bezeichnet), 0,01 M, pH 7,2, (2,0 ml) gibt man 10%ige Dimethylformamidlösung von PBS (0,01 M, pH 7,2), enthaltend 50 µg/ml Lösung von N-[2-(2′-Pyridyldithio)-äthyl]- 3-(2′-benzothiazolyldithio)-propionamid (365 µl), und setzt 30 min bei 25°C um. Die Absorptionen bei 310 und 343 nm des Reaktionsgemisches werden gemessen. Man stellt in dem Reaktionsgemisch 96% 2-Mercaptobenzothiazol und 3% 2-Mercaptopyridin in N-[2-(2′-pyridyldithio)-äthyl]-3-(2′-benzothiazolyldithio)- propionamid fest.

Zu einer Probe dieses Reaktionsgemisches gibt man 2-Mercaptoäthanol. Man beobachtet keine Absorption des 2-Mercaptobenzothiazols, jedoch wird eine Absorption von 2-Mercaptopyridin beobachtet, wovon 93% gebildet wurden.

Als Ergebnis stellt man fest, daß etwa 96% Antiinsulin- Antikörper-Fab′ bei der S-S-Austauschreaktion mit der S-S- Gruppe, die an die 2-Benzothiazolylgruppe gebunden ist, reagiert haben.

Nach Einstellung des pH-Wertes des Reaktionsgemisches (0,5 ml) mit 0,1 N wäßrigem NaOH auf 8,5 wird eine Lösung von β-Galactosidase (4,37 mg), gelöst in PBS (0,01 M, pH 8,5), 1 h bei 25°C inkubiert. Eine Gelfiltration (Entwickler: PBS (0,01 M, pH 7,2) unter Verwendung von Sephadex G-50®-Säule (1,5 × 84 cm) wird durchgeführt und die Fraktionen Nr. 11 bis 13 mit je 5,0 ml Fraktion werden gesammelt. Diese Fraktionen enthalten 4,6% nichtumgesetzte β-Galactosidase, und nichtumgesetzter Antiinsulin-Antikörper-Fab′ wird nicht nachgewiesen.

Aus diesen Ergebnissen stellt man bei dieser Untersuchung fest, daß Antiinsulin-Antikörper-Fab′ in einem Verhältnis von 1 : 1 für β-Galactosidase gebunden ist. Die SH-Gruppe des Antiinsulin-Antikörper-Fab′ hat bei der S-S-Austauschreaktion mit der an die 2-Benzothiazolylgruppe gebundene S-S- Gruppe reagiert, und die SH-Gruppe von β-Galactosidase hat bei der -S-Austauschreaktion mit der an die 2-Pyridylgruppe gebundene S-S-Gruppe reagiert.

Der obige Antiinsulin-Antikörper-Fab′ wird wie folgt hergestellt.

Zu IgG enthaltendem Antiinsulin-Antikörper (50 mg), gelöst in 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,5, 2 ml), gibt man 1 mg Pepsin, inkubiert 16 h bei 37°C. Die Lösung wird einer Gelfiltration unter Verwendung von einer Sephadex G-150®-Säule [1,5 × 50 cm, Entwickler: 0,1 M Boratpuffer (pH 8,0)] unterworfen, wobei man eine aktive Fraktion erhält, die F(ab′)₂ enthält. Die Fraktion wird mit einer Collodion-Packung konzentriert und gegenüber 0,1 M Acetatpufferlösung (pH 5,0) bei 4°C über Nacht dialysiert. Zu der inneren Lösung gibt man Mercaptoäthanolamin in einer Konzentration von 10 mM inkubiert 90 min bei 37°C. Das Reaktionsgemisch wird für die Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex G-25®-Säule [1,5 × 50 cm, Entwickler: 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,0)] genommen; man erhält die Fab′-Fraktion (15 mg). Die SH-Gruppe pro 1 Mol des so erhaltenen Antiinsulin-Antikörper-Fab′ beträgt etwa 0,95 Mol [J. Immunol., 116 (6), 1554 (1976)].

Beispiel 2

5,05 g 2,2′-Dithio-bis-(pyridin-N-oxid) werden in 200 ml Chloroform aufgelöst und tropfenweise mit 2,55 g 3-Mercaptopropionat versetzt. Das Gemisch wird 1 h bei 40°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wird abgekühlt, und die rohen, ausfallenden Kristalle werden abfiltriert und aus Chloroform umkristallisiert; man erhält Kristalle von 3-(2′-Pyridyl-N- oxid-dithio)-propionat (3,72 g) [R_f = 0,63 (TLC, Silikagel, n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 4 : 1 : 1)].

20 g 2-Pyridyl-2′-aminoäthyldisulfid · 2 HCl, erhalten gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, werden in 20 ml Wasser gelöst. Man stellt den pH-Wert auf 10 unter Eiskühlen und Zugabe von wäßrigem NaOH ein und extrahiert mit Chloroform. Die Chloroformschicht wird gesammelt, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.

Zu dem obigen 3-(2′-Pyridyl-N-oxid-dithio)-propionat (1,19 g), gelöst in 50 ml Tetrahydrofuran, gibt man tropfenweise unter Kühlen und Rühren 2 ml einer Tetrahydrofuranlösung aus 1,06 g Dicyclohexylcarbodiimid. Nach 20 min wird diese Lösung mit der obigen konzentrierten Lösung unter Rühren und Eiskühlen 1 h und bei Zimmertemperatur während 3 h vermischt.

Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, zu dem Filtrat gibt man Wasser und extrahiert mit Chloroform.

Die Chloroformschicht wird mit 5%iger HCl, 5%igem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Chloroform wird abdestilliert; man erhält N-[2-(2′-Pyridyldithio)-äthyl]-3- (2′-pyridyl-N-oxid-dithio)-propionamid.

R_f = 0,55 (obere Schicht aus n-Butanol : Pyridin : Essigsäure : Wasser = 10 : 3 : 0,1 : 11; Silikagel TLC).

Beispiel 3

Zu 20 mg 2,2′-Dithio-bis-(benzothiazol), gelöst in 3 l 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,4, enthaltend 1 mM EDTA), der 40% Äthanol enthält, gibt man tropfenweise 397 mg 2,2′-Dithio- bis-(pyridin), gelöst in 1 l 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,4, enthaltend 1 mM EDTA), der 40% Äthanol enthält, und 5,7 mg 1,2-Dimercaptoäthan, gelöst in 1 l des gleichen Pufferlösungs gemisches, unter Rühren im Verlauf von 60 min zu. Nach der Reaktion wird Äthanol abdestilliert und dreimal mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wird gesammelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Das Konzentrat wird auf eine Silikagel-Säule (1,0 × 40 cm) gegeben und mit Benzol : Äthylacetat (20 : 1) eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und im Vakuum eingedampft; man erhält 13,2 mg 1-(2′-Benzothiazolyl dithio)-2-(2′-pyridyldithio)-äthan mit den folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:

λ _max = 179 nm [Dimethylformamid : 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) = 1 : 9;
R_f = +0,51 (Silikagel TLC, Benzol : Äthylacetat = 10 : 1).

Zu 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5), enthaltend 0,030 mMol dieser Verbindung, gelöst in 10% Dimethylformamid, gibt man 2-Mercaptoäthanol bei 0,1%. 2-Mercaptobenzothiazol (0,029 mMol) und 2-Mercaptopyridin (0,028 mMol) werden freigesetzt.

Beispiel 4

Zu einer Lösungsmischung aus 20 mg 2,2′-Dithio-bis-(benzothiazol), gelöst in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,4, enthaltend 1 mM EDTA) (3 l), enthaltend 40% Äthanol, und 132 mg 2,2′- Dithio-bis-(pyridin), gelöst in 1 l der gleichen Pufferlösung, gibt man tropfenweise 12,4 mg 1,10-Dimercaptodecan, gelöst in 1 l der gleichen Pufferlösung, bei Zimmertemperatur unter Rühren zu und setzt 90 min um.

Nach der Reaktion wird Äthanol im Vakuum abdestilliert und dreimal mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschichten werden gesammelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Das Konzentrat wird auf eine Silikagelsäule (1,0 × 20 cm) gegeben und mit Benzol : Äthylacetat (20 : 1) eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und im Vakuum eingedampft; man erhält 19,5 mg 1-(2′-Benzothiazolyl- dithio)-10-(2′-pyridyldithio)-decan mit den folgenden physiko-chemischen Eigenschaften.

λ _max = 279 nm [Dimethylformamid : 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5) = 1 : 9];
R_f = 0,51 (Benzol : Äthylacetat = 10 : 1, Silikagel TLC);
R_f = 0,75 (Benzol : Äthylacetat = 3 : 1, Silikagel TLC).

Zu einer Lösung dieser Verbindung (0,030 mM) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5), enthaltend 10% Dimethylformamid, gibt man 2-Mercaptoäthanol bei einer Konzentration von 0,1%. 2-Mercaptobenzothiazol (0,029 mM) und 2-Mercaptopyridin (0,029 mM) werden freigesetzt.

Beispiele 5 bis 12

Man verwendet 2,2′-Dithio-bis-(benzothiazol), 2,2′-Dithio- bis-(pyridin) sowie die folgende Dithiolverbindung (IV) und arbeitet gemäß dem Verfahren von Beispiel 3, wobei man jeweils die entsprechende polyfunktionelle Verbindung (I) erhält.

Die verwendeten Dithiolverbindungen (IV) sind: 1,4-Dimercaptobutan, 1,6-Dimercaptohexan, 1,8-Dimercaptooctan, 1,9- Dimercaptononan, Di-(2-mercaptoäthyl)-äther, Dithioerythrit und Dithiothreit.

Die in der folgenden Tabelle 2 gewählten Abkürzungen haben die folgende Bedeutung:
2,2′-DBB = 2,2′-Dithio-bis-(benzothiazol),
2,2′-DBP = 2,2′-Dithio-bis-(pyridin).

Die obige polyfunktionelle Verbindung (I) in 0,1 M Phosphatpufferlösung (pH 7,5), die 10% Dimethylformamid enthält, setzt 2-Mercaptobenzothiazol und 2-Mercaptopyridin entsprechend einer 97 bis 93% molaren Menge der polyfunktionellen Verbindung (I) bei der Zugabe von 2-Mercaptoäthanol frei.

Claims

Polyfunktionelle Disulfidverbindungen der Formel worin R 2-Benzothiazolyl oder 2-Pyridyl-N-oxid bedeutet und X eine geradkettige - oder verzweigte Alkylengruppe aus 2 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet, deren Enden unmittelbar an die S-S-Gruppen gebunden sind, wobei X gegebenenfalls durch eine Hydroxy-, Amino- oder Carboxylgruppe substituiert und/oder gegebenenfalls durch eine Ether- oder Amidbindung unterbrochen ist.