DE2808476C2

DE2808476C2 - Reagens zur Verwendung in immunochemischen Untersuchungsmethoden

Info

Publication number: DE2808476C2
Application number: DE2808476A
Authority: DE
Inventors: Rolf Erik Axel Verner Bälinge Axen; Jan Per Erik Uppsala Carlsson; Haakan Nils Yngve Brunna Drevin
Original assignee: Pharmacia Diagnostics AB
Current assignee: Phadia AB
Priority date: 1977-03-04
Filing date: 1978-02-28
Publication date: 1986-11-06
Also published as: US4232119A; JPS53130423A; NL7802451A; SE427505B; JPS6145775B2; GB1597754A; NL188544C; DE2808476A1; SE7702464L; NL188544B; FR2382695B1; FR2382695A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Reagens zur Verwendung in immunochemischen Untersuchungsmethoden, die in Gegenwart einer wäßrigen Flüssigkeit durchgeführt werden.

Es sind bereits verschiedene immunochemische Untersuchungsmethoden bekannt, bei denen als Reagens ein wasserlösliches Reagens, das mit mindestens einer analytisch nachweisbaren Gruppe markiertes Immunglobulin enthält, verwendet wird (vgL zürn Beispiel Radioimmunoassay Methods, K. E. Kirkham und W.M. Hunter, Churchü Livingstone, London 1971, Seiten 405 bis 412, des Artikels »Solid Phase Antigen Antibody Systems« von L. Wide).

Bei diesen bekannten Methoden ist das Immunglobulin häufig ein gegen ein Antigen oder Hapten gerichteter Antikörper. Das Immunglobulin kann jedoch in solchen Untersuchungsmethoden auch als reaktive Komponente

3u eines Antigens oder von Protein A wirken. Es ist weiterhin bekannt, daß das Immunglobulin zu verschiedenen Immunglobulin-Klassen (z. B. IgG, IgM oder IgE) gehören kann. Der Ausdruck »Immunglobulin« umfaßt hier auch modifiziertes Immunglobulin (z. B. aggregiertes Immunglobulin) sowie Fragmente desselben (z. B. Fab-■oder Fc-Fragmente), weiche zu einem anderen Reaktionsteilnehmer der Untersuchungsmethode eine Affinität aufweisen. Vorzugsweise ist jedoch das Immunglobulin ein Antikörper.

Bekanntlich kann in immunochemischen Untersuchungsmethoden die analytisch nachweisbare Gruppe z. B.

eine radioaktive, eine fluoreszierende, eine iumineszierende, eine chromophore oder eine enzymatisch aktive Gruppe sein. Die enzymatisch aktive Gruppe kann z. B. ein Enzym, wie Hydrolasen, Oxidasen oder Reduktasen sein, jedoch können auch andere Arten von Enzymen verwendet werden.

Zum Zweck der Markierung des Immunglobulins mit einer analytisch nachweisbaren Gruppe ist es möglich, das Immunglobulin direkt mit der markierenden Gruppe zu koppeln oder zwischen beiden eine Brücke einzuführen. Diese chemische Reaktion kann z. B. durch Verwendung von Aminogruppen in einem der Reaktionsteilnehmer und Carboxylgruppen in dem anderen oder von Aminogruppen in beiden Reaktionsteilnehmern erzielt werden. Zum Koppeln (Konjugieren) mittels einer Brücke wurden bisher z. B. Reaktionsteilnehmer wie Glutardialdehyd, Bromcyan und Carbodiimide verwendet. Die bisher zum Koppeln der Komponenten aneinander bekannten Methoden sind jedoch mit verschiedenen Nachteilen verbunden.

So kann die Aktivität und Spezifität des Immunglobulin-Molekiils als Ergebnis der Konjugation verändert werden (wie auch die Aktivität und Spezifität eines Enzyms, wenn es zum Markieren verwendet wird, verändert werden kann). Nebenreaktionen, die zu Aggregaten von ausschließlich einer Art von Molekül führen, können stattfinden. Besonders nachteilig sind Nebenreaktionen, die zu einem Komplex führen, der lediglich Immunglobulin enthält Weiterhin können Nebenreaktionen häufig zu einer großen Menge an unerwünschten Aggregaten mit hohem Molekulargewicht führen. Schließlich führen die bekannten Methoden zu einer wesentlichen Menge an nicht umgesetztem Material. Wenn Glutardialdehyd als Kopplungsmittel verwendet wird, werden auch Polymere von Glutardialdehyd selbst von etwa der gleichen Größe wie das Konjugat gebildet. Diese Polymeren können reaktive Strukturen enthalten, die in der Lage sind, lange nach der Entfernung des überschüssigen Glutaraldehyds aus dem Reaktionsgemisch mit dem Konjugat zu reagieren und dessen immunochemische und (bei enzymatischer Markierung) enzymatische Aktivität zu beeinträchtigen. Daher führen die bekannten Methoden zu einem in hohem Maße heterogenen Produktgemisch, dessen Aufarbeitung in bezug auf das gewünschte Konjugat umständlich und relativ zeitraubend ist. Weiterhin sind die Ausbeuten häufig sehr gering.
Aus Clin. Chem. 22/8 (1976), S. 1243 bis 1255, sind Reagentien zur Verwendung in immunochemischen Untersuchungsmethoden, die in Gegenwart einer wäßrigen Flüssigkeit durchgeführt werden, bekannt, die aus einem in der wäßrigen Flüssigkeit löslichen Konjugat von einem oder mehreren Molekülen Immunglobulin und einer oder mehreren Einheiten einer analytisch nachweisbaren Gruppe bestehen. Die Herstellung dieser Konjugate erfolgte mittels Glutaraldehyd oder auch über Sulfidbrücken. Eine Konjugation über Disulfidbrücken wurde jedoch nicht vorgeschlagen. Die Konjugate bzw. die Verfahren zu ihrer Herstellung wiesen die vorstehend beschriebenen Nachteile auf.

Aus der US-PS 36 52 761 ist eine Kopplung von Immunglobulinen an unlösliche anorganische Träger über ein Kopplungsmittel vom Silan-Typ bekannt, wobei die Kopplung u. a. auch über eine Disulfidgruppe erfolgen soll. Dieses bekannte Kopplungsverfahren dient der Stabilisierung oder Isolierung von Antikörpern oder Antigcnen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Reagens zur Verwendung in immunochemischen Untersuchungsmethoden, die in Gegenwart einer wäßrigen Flüssigkeit durchgeführt werden, welches Reagens ein in der wäßrigen Flüssigkeit lösliches Konjugat von einem oder mehreren Molekülen Immunglobulin und einer oder mehreren Einheiten einer analytisch nachweisbaren Gruppe umfaßt, bereitzustellen, welches unter Verringerung unerwünschter Nebenreaktionen hergestellt werden kann und homogener als die bisher bekannten Re- agentien ist.

Diese Aufgabe wird für das erfindungsgemäße Reagens dadurch gelöst, daß die Immunglobulin-Moleküle und die Einheiten der analytisch nachweisbaren Gruppe über die —S—S—Gruppe enthaltende Brücken aneinrnder gebunden sind.

Die zur Herstellung des erfindungsgemäßen Reagens angewendete Konjugierungstechnik basiert auf einem Thiol-Disulfid-Austausch. Gemäß einer Ausführungsform dieser Technik wird bzw. werden in eine der beiden Molekülarten, die das Konjugat bilden, d. h. entweder in das Immunglobulin oder in die markierende Substanz, z. B. ein Enzym, eine oder mehrere Thiolgruppen (soweit sie nicht bereits vorliegen) eingeführt und in der anderen Molekülart eine oder mehrere Disulfidstrukturen für den Thiol-Disulfid-Austausch aktiviert, d. h, wenn eine Thiolgruppe in die markierende Substanz eingeführt wird, wird das Immunglobulin mit Disulfldstruktur versehen und umgekehrt Die beiden modifizierten Molekülarten werden dann miteinander in Kontakt gebracht worauf sie über die Thiol-Disulfid-Austauschreaktion durch eine —S—S—Bindung aneinandergebunden werden.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform dieser Technik wird eine inerte Trägersubstanz (z. B. ein wasserlösliches Polyme??s als Träger) verwendet, welche in der Flüssigkeit in deren Gegenwart die immunochemische Reaktion durchgeführt wird, löslich ist wobei eine Disulfidstruktur, die für den Thiol-Disulfid-Austausch aktiviert wird, in den löslichen Träger und eine oder mehrere Thiolgruppen in die markierende Substanz und das immunglobulin eingeführt wird, woraufhin die markierende Substanz und das Immunglobulin unter Bildung von —S—S—Bindungen durch die Thiol-Disulfid-Austauschreaktion an den Träger (z. B. ein Polymeres) gebunden werden.

Die analytisch nachweisbare Gruppe in dem erfindungsgemäßen Reagens is; vorzugsweise eine enzymatisch aktive, radioaktive, chromophore, fluoreszierende oder lumineszierende Gruppe.

Vorzugsweise ist die —S—S—Brücke an beiden Seiten mit einem Kohlenstoffatom einer aliphatischen oder aromatischen Gruppe verbunden. Diese Kohlenstoffatome sind wiederum vorzugsweise jeweils an mindestens ein Kohlenstoffatom gebunden. Die restlichen Bindungen der ersteren Kohlenstoffatome sind vorzugsweise mit 3c Wasserstoffato.nen abgesättigt Jedes der zuerst genannten Kohlenstoffatome kann z. B. in Form einer —CH2—Gruppe und/oder als

C—

in einem aromatischen Ring, z. B. einem Benzolring, vorliegen. Daher befindet sich die Disulfidhrücke vorzugsweise in einer Gruppe der Formel

—c—s—s—c—

I I

worin eine der verbleibenden Bindungen jedes Kohlenstoffatoms an ein weiteres Kohlenstoffatom und die restlichen Bindungen jedes Kohlenstoffatoms an Wasserstoff und/oder Kohlenstoff gebunden sind.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Reagens befindet sich die Disulfidbrücke in einer Gruppe der Formel

-\c-dJ„-s-s-\d'-cJ„-

-CH-CH₂-CH₂- oder —(CH₂)_m— NH

I
c=o

worin die beiden Reste X gleich sind und O oder NH bedeuten, D und D' gleich oder verschieden sind und die Gruppen

■SJ bedeuten, worin m eine ganze Zahl von 1 bis 2 darstellt, und n\ und /J₂ gleich oder verschieden sind und jeweils 0

t'; oder 1 bedeuten. Zum Beispiel können die Gruppen

X XO

Il Il Il

— C — D— und/oder —D'—C— die Gruppe —C — CH₂—CH₂—

bedeuten, wobei dann die Disulfidbrücke an die -CH₂ —Gruppe gebunden ist

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist ein bevorzugtes Reagens dadurch gekennzeichnet, daß die Immunglobulin-Moleküle und die Einheiten der analytisch nachweisbaren Gruppe jeweils an einen wasserlöslichen Träger gebunden sind, wobei mindestens das Immunglobulin oder die Gruppe über die —S—S—Gruppe enthaltende Brücken an den Träger gebunden ist

Im Vergleich zu bisher bekannten Techniken ergibt die erfindungsgemäß angewandte Konjugationstechnik auch den besonders wertvollen Vorteil, daß das gebildete Konjugat in einer reduzierenden Umgebung reversibel spaltbar ist, was zur Erhöbung der Empfindlichkeit der Untersuchungsmethoden ausgenutzt werden kann, wenn das Konjugat angewendet wird. Zum Beispiel weisen Enzyme, die als analytisch nachweisbare Gruppen an ein anderes Molekül konjugiert sind, häufig eine geringere Aktivität als die entsprechenden nativen Enzyme auf.

Diese Verminderung der Aktivität ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß das Enzym als Ergebnis der Konjugation sterisch an ei&er Wirkung auf sein Substrat gehindert ist Ein weiterer Grund kann die Diffusionskontrolle sein, welche häufig in der dem Emiyrnkonjugat nächstliegenden Wasserschicht auftritt Wenn ein Koiijugat das mittels einer oder mehrerer die —S—S—Gruppe enthaltender Brücken gemäß der Erfindung zusammengehalten wird, verwendet wird, kann die Enzymmarkierung durch Methoden aufgespalten werden, die im Zusammenhang mit dem Aufbrechen von —S—S—Brücken bekannt sind. z. B. durch Reduktion oder Thiol-Disulfid-Austausch, wonach die Enzymaktivität in einer flüssigen Phase gemessen weiden kann, wodurch optimale Enzymaktivität erhalten wird, pies gestattet auch die Verwendung von wasserunlöslichen Substraten für Enzymuntersuchungen. (Dies setzt natürlich voraus, daß ausgewählte Bedingungen vorliegen, so daß beim Spalten die verwendete Enzymraarkierung nicht inaktiviert wird oder daß das verwendete Meßsystern nicht ungünstig durch die zum Spalten der Brücke verwendete Umgebung beeinflußt wird) Selbst in Fällen, in denen die analytisch nachweisbare Gruppe z. B. ein fluoreszierendes oder radioaktives Molekül enthält, ist es in hohem Maße vorteilhalt, daß diese Moleküle von dem Immunglobulin abgespalten werden können, da sie dann leicht ohne Strahlungsabsorbierende Effekte, die durch andere Konjugatbestandteile und die feste Phase bewirkt werden, gemessen werden können.

Zur Einführung einer Thiolgruppe in eine der beiden in das Konjugat einzuschließenden Moleküiarten können bekannte Thiolierungsmittel, z. B. ein Thioliminoether der Formel

NH

HS-(CH₂J_n-C

worin R einen Methylrest oder einen Ethylrest und η eine Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise von 2 bis 4, bedeuten oder N Acetylhomocysteinthiolacton, verwendet werden.

Die Reaktion wird in einer wäßrigen Lösung in einer leicht alkalischen Umgebung (pH 7 bis 9) und bei einer Temperatur von 15 bis 30° C mit einem großen Überschuß an Thiolierungsmittel durchgeführt

Zur Einführung einer Disulfidstruktur, die für den Thiol-Disulfid-Austausch aktiviert ist, können ebenfalls bekannte Disulfide verwendet werden, deren entsprechende reduzierte Form, abhängig von der Resonanzstabi- !isation oder von der Thiol-Thioui-Tautomerie_c geringe S-Nucleophilität besitzt Beispiele für solche Disulfide sind 2,2'-Dipyridyl-disulfid, 4,4*· Dipyridyldisulfid und entsprechende Verbindungen, die in der Pyridylgruppe substituiert sind, wobei die Substituenten in diesen Verbindungen derart sind und in solcher Stellung vorliegen, daß die Thiol-Thion-Tautomerie nicht gestört wird, z. B. 5-Nitro-2-pyridyl-disulfid und 5-Carboxy-2-pyridyl-disulfid.

Die Reaktion wirti in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 2 bis 9 und einer Temperatur von 15 bis 30⁰C mit einem großen Disulfidüberschuß durchgeführt.
Vos zugsweise wird jedoch für beide Zwecke ein heterobifunktionelles Mittel der Formel

R'-S-S-A-Z (I)

verwendet, worin R¹ den 2-Pyridyl-, 5-Nitro-2-pyridyl- oder 4-Pyridylrest darstellt, A einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, bedeutet und Z einen Rest der Formeln

O
O C^ O NH

Il /^ Il Il

— C —O —N (CH₂),, —C —S—R¹ oder —C —O—R²

Il ο

oder die Säurcaclditionssalze des letztgenannten Restes darstellt, worin η 2 oder 3 ist, Ri die vorstehend für Ri angegebene Bedeutung besitzt und diesem gleich ist und R₂ einen Methylrest oder einen Ethylrest darstellt.

Die Verbindungen der Formel 1 können auf verschiedenen Wegen hergestellt werden (z. B. nach der gleichzeitig eingereichten DE-OS 28 08 523). Die für die Herstellung besonders bevorzugten Verfahren sind die folgenden.

Die Verbindungen der Formel I, worin Z einen Rest der Formel

Il
ο c^

— C —Ο —Ν (CH₂),

C-^

Il
ο

bedeutet, werden durch Umsetzen des Disulfide der Formel

R'-S-S-A-COOH (II)

worin R¹ und A die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, mit N-Hydroxysuccinimid, wenn π = 2 ist (oder die analoge Verbindung mit π=3, wenn Verbindungen mit π=3 gewünscht werden), in Gegenwart eines Kondensationsmittels hergestellt.

Die Reaktion wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 10 bis 30°C durchgeführt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist z. B. Methylenchlorid, Ethylacetat und Dioxan. Die Reaktionszeit variiert mit der Wahl der Reaktionskomponenten und der Reaktionstemperatur.

Das Kondensationsmittel, das verwendet wird, kann eines sein, das üblicherweise in Veresterungsreaktionen verwendet wird, wie z. B. Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid. Die Ausgangsverbindung der Formel II kann durch Umsetzen einer Mercaptoalkylcarbonssure der Formel

HS-A-COOH (III)

mit einem Dipyridyl-disulfid der Formel

R¹-S-S-R¹ (IV)

worin A und R¹ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, hergestellt werden.

Diese Reaktion wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 10 bis 30⁰C durchgeführt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist für diesen Zweck z. B. Ethanol, Ethylacetat und Dioxan. Die Reaktionszeit variiert mit der Wahl der Reaktionskomponenten und der Reaktionstemperatur.

Die Verbindungen der Formel I, worin Z den Rest der Formel _x

O

— C—S—R¹

bedeutet, werden dadurch hergestellt, daß man ein Disulfid der Formel II in Gegenwart eines Kondensationsmittels in einem organischen Lösungsmittel bei anfänglich niedriger Temperatur, z. B. —20° C, etwa 1 bis 2 Stunde.; und anschließend bei Umgebungstemperatur (z. B. + 20° C) mit einem entsprechenden Thiopyridon umsetzt Das Lösungsmittel kann geeigneterweise z. B. Methylenchlorid, Ethylacetat und Dioxan sein. Das verwendete Kondensationsmittel ist vorzugsweise N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid.

Das verwendete Ausgangsmaterial ist vorzugsweise ein Gemisch, das durch Umsetzen einer Verbindung der Formel HI mit einer Verbindung der Formel FV erhalten wird. Die Verbindungen der Formel I, worin Z einen Rest der Formel

NH

— C — O — R²

bedeutet, werden dadurch hergestellt, daß man ein Thiolimidat der Formel

NH

ii

HS—A —C —O —R²
worin R² und A die vorstehend angegebene Bedeutung besitzen, in einem organischen Lösungsmittel mit einem

Pyridyldisulfid der Formel R¹-S-S-R¹, worin R¹ die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt, umsetzt. Das verwendete Lösungsmittel kann beispielsweise Methanol sein, das etwa 10% Eisessig enthält.

Die Verwendung dieser Mittel kann durch die folgenden Reaktionen dargestellt werden, in welchen das bifunktionelle Mittel beispielsweise N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat ist:

O °

A. Π)—NHi+<" ^S-S-(CH₂J₂-C-O-N

O O

—► (T)-NH-C-

» ^B■ ®-

—S—(CH₂)j—C — O —

NH-C-(CHj)₂-S-S

C. (e)— NH- C— (CH₂J₂- S — S—<

Il

Reduktionsmittel (ζ. B. DTT) /λ _WH Jl „„ „_{u cu}
> {cj—Nn — C— Cn₂—Cn₂ — an

O O

^E)- NH- C-(CHj)₂- SH + (T)-NH-C-(CHj)J-S-S

N
O O

Il Il _

-NH- C— (CH₂)J- S—S—(CHj)₂- C — NH- Q

In den vorstehend angegebenen Formeln bedeutet®—NH2 ein Immunoglobulinmolekül und ©—NH2 stellt ein Beispiel einer nachweisbaren Gruppe dar, z. B. ein Enzym oder eine Gruppe, die ein oder mehrere radioaktive Atome enthält In der durch Stufe C veranschaulichten Reduktion kann z. B. DTT (Dithiotreitol) verwendet werden. Mit diesem Reduktionsmittel ist es z. B. möglich, proteingebundene Pyridyldisulfid-Strukturen zu reduzieren, ohne daß zur gleichen Zeit die nativen DisulfidbrCcken im Protein reduziert werden. Dies wird dadurch erreicht, daß man die Reduktion bei pH 3 bis 5 mit überschüssigem DTT oder bei einem höheren pH-Wert mit einem geringeren Überschuß an DTT oder einer äquimolaren Menge desselben durchführt

Der Substitutionsgrad von Thiol und Disulfid kann in dieser Konjugationsmethode leicht durch Variieren des . 55 molaren Überschusses des Reaktionsteilnehmers oder durch Variieren des pH-Wertes im Bereich von 5 bis 8 beeinflußt werden. Zum Beispiel können bimolekulare Konjugate, die z. B. ein Enzymmolekül (als nachweisbare Gruppe) und ein Immunoglobulin-Molekül (z. B. ein Antikörper) enthalten, durch Einführen einer Thiolgruppe und einer Disulfidstruktur in entsprechende Moleküle und Reaktion der modifizierten Moleküle mittels Thiol-Disulfid-Austausch hergestellt werden. Da die Thiol-Disulfid-Austauschreaktion ein reaktives Thiol und eine Disulfidstruktur erfordert und nur eine dieser Gruppen in jeder Art von Molekül vorliegt, kann ein Konjugat das nur eine Art von Molekül umfaßt vermieden werden. Trimolekulare oder polymolekulare Konjugate können in ähnlicher Art und Weise erhalten werden. In gleicher Weise können natürlich andere nachweisbare Gruppen an das Immunoglobulin über abspaltbare —S—S—Brücken zwischen der nachweisbaren Gruppe und dem Immunoglobulin gebunden werden.

Die vorstehend genannten Thioi-Disulfid-Austauschreaktionen können in einer wäßrigen Umgebung bei pH 2 bis 8 und einer Temperatur von 15 bis 30° C durchgeführt werden.

In bestimmten Fällen kann es wünschenswert sein, eine direkte Konjugation der analytisch nachweisbaren Gruppe an die Immunoglobulinkomponente zu vermeiden. Zum Beispiel können die beiden Arten von Molekü-

: lcn ζ. B. durch hydrophobe Einwirkung und/oder Ladungseffekte die Aktivität des anderen ungünstig beeinflus-

> sen. In solchen Fällen kann es geeignet sein, einen inerten löslichen Träger für sowohl die analytisch nachweisba-

^f, re Gruppe als auch die Immunoglobulinkomponente zu verwenden, die dann jeweils an den löslichen Träger mit

% Brücken der vorstehend genannten Art, umfassend oder bestehend aus der Gruppe —S—S—, an den löslichen

^ Träger gekuppelt werden, wodurch sie voneinander getrennt sind. Die Empfindlichkeit eines Testes, der auf

'ii solchen Konjugaten basiert, kann erhöht werden, indem eine große Anzahl von analytisch nachweisbaren

}k Gruppen an einen löslichen Träger geknüpft wird, an welchen gleichzeitig nur ein oder wenige Immunoglobulin-

Ij moleküle gekuppelt werden.

£■ Der vorstehend genannte wasserlösliche Träger kann z. B. Dextran, ein Dextranderivat, Biopolymere und

If andere Polymere, die in dem System inert sind und in der Flüssigkeit, in deren Gegenwart die immunochemische

W Reaktion durchgeführt wird, löslich sind, sein.

P Die Kupplung wird z. B. durch Einführung von Disulfidstrukturen in den Träger und von SH-Gruppen in die

ι] Markierung und die Immunoglobulinkomponente, welche dann an das Polymere durch Thiol-Disulfid-

li.i Austauschreaktion gekuppelt werden, durchgeführt. Für den Zweck der Kupplung entweder der Immunoglobul-

f| inkomponente oder der Markierung an den löslichen Träger können andere Methoden verwendet werden,

h welche für die Kupplung solcher Substanzen an einen Träger bekannt sind, da es nicht notwendig ist, beide

$! Substanzen von dem Träger zu spalten.

I Wenn eine besonders hohe Empfindlichkeit in der Analyse gewünscht wird, besteht das Mittel gemäß einer

j| besonders wertvollen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in markiertem Immunoglobulin, bestehend

I,* aus einem Multikonjugat einer Vielzahl von analytisch nachweisbaren Gruppen, die durch spaltbare —S—S—

I Brücken zwischen denselben verbunden sind, wobei das Multikonjugat von nachweisbaren Gruppen wiederum

p ebenfalls an das Immunglobulin durch eine abspaltbare —S—S—Brücke gebunden ist.
§ Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung.

1 Beispiel 1

'|j Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-ar-Amylase-Konjugat

a) Thiolierte tx- Amylase

6 mg «-Amylase (bakterieller Typ HA', 4 χ kristallisiert) wurden in 2 ml 0,1M NaHCCh gelöst. Die Lösung wurde mit sauerstoff-freiem Stickstoffgas perkuliert und unter eine Stickstoffgasatmosphäre gebracht. 3 mg Methyl-4-mercaptobutyrimidat-hydrochlorid wurden zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde kräftig geschüttelt. Die Reaktion wurde 30 Minuten in der Stickstoffatmosphäre fortgesetzt, wonach überschüssiges Imidat und andere Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht aus der thiolierten «-Amylase durch Gelfiltration an Sephadex® G-25 (Perlen von Dextran, vernetzt mit Epichlorhydrin) entfernt wurden (das verwendete Medium war O₁IM NaHaPCM). Es wurde gefunden, daß die thioiierten ar-Amyiasen 1,4 Mol SH/Mol Protein enthielten.

b) Pyridyl-Disulfid-Gruppen enthaltende ar-Amylase

Die gemäß a) hergestellte thiolierte Λ-Amylase (in etwa 3 ml 0,1 M NaH₂PO₄) wurde mit 1 ml 8 mM Bis-5-(carboxy-2-pyridyl)-disulfid (wäßrige Lösung pH etwa 6,5) gemischt Nach etwa 2stündiger Reaktion bei +23° C wurde das Reaktionsgemisch gegen 0,1 M NaH₂PO₄ (3 χ 200 ml, 3 Stunden in jedem Bad) dialysiert, woraufhin überschüssiger Reaktionsteilnehmer zusammen mit anderen Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht von der modifizierten Λ-Amylase entfernt wurde. Die thiolierte und disulfid-behandelte Λ-Amylase enthielt 1,0 Mol Carboxy-pyridyldisulfidgruppen/Mol Protein.

c) Thiolierte Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper

In einer Weise, die der vorstehend unter a) beschriebenen entspricht, wurden 10 mg Schaf-Antikaninchen-Antikörper (hergestellt aus Schafserum durch Ausfällung mit Natriumsulfat) mit 0,25 mg Methyl-4-mercaptobutyrimidat-hydrochlorid thioliert Die thiolierten Antikörper enthielten 1,2 Mol SH/MoI Protein.

d) Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-ar-Amylase-Konjugat

Das Carboxypyridyl-disulfid-Ä-amylase-derivat das gemäß b) hergestellt wurde, in etwa 3 ml 0,1 M NaH₂PO₄ wurde mit den gemäß c) hergestellten thiolierten Antikörpern in etwa 3 ml gemischt Nach kräftigem Schütteln des Gemisches fand die Reaktion bei +23"C statt Die Reaktion konnte spektrophotometrisch bei 343 nm verfolgt werden, da Carboxy-2-thiopyridin, welches während der Thiol-Disulfid Austauschreaktion freigesetzt wird, ein Extinktionsmaximum bei dieser Wellenlänge aufweist Die Reaktion wurde nach f 0 Stunden unterbrochen.

Das Reaktionsgemisch wurde an Sepharose^B (Perlen von Agarose) gelfiltriert, und die verschiedenen Fraktionen wurden analysiert, woraufhin gefunden wurde, daß 40% der Λ-Amylase-Aktivität, die in das Reaktionsgemisch gebracht wurde, an Antikörper konjugiert war. Das gebildete Konjugat, weiches nach der Gelfiltration beurteilt wurde, war bimolekular (kleine Mengen an tri- und termolekularem Material wurden ebenfalls gefunden), und war ebenfalls immunologisch aktiv. Das gelfiltrierte Konjugat wurde in 0,3M NaCl bei +4"C

B-J is pi el 2

Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-ai-Amylase-Konjugat
a) Thiolierte α-Aitiylase

5 mg Λ-Amyluse wurden in 0,5 ml 0,1M Natlriumphosphatpuffer (pH 7,5) gelöst und 75 μΐ N-SucciniiTiidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (34 mM in 99,5% Ethanol) wurden zugesetzt. Nach kräftigem Schütteln des Gemisches wurde die Reaktion 40 Minuten bei +23"C fortgesetzt Das Reaktionsgemisch wurde an Sephadex®G-2J (Perlen von Dextran, vernetzt mit Epichlorhyclrin) gelfiltriert, wobei das verwendete Medium 03M Natriumphosphatpuffer, pH 7.5, war. Das so erhaltene Λ-Amylase-pyridyldisulfid-derivat wurde anschließend durch Zusatz von 50 μΙ 50 mM Dithiothreitol zu dem aus der Gelfiltration erhaltenen Material (1,5 ml) reduziert Die Reduktion wurde 20 Minuten bei +23⁰C fortgesetzt. Überschüssiges Dithiotreitol und andere Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex® G-25, wobei das verwendete Medium 03M NaCl war, entfernt. Die so erhaltene thiiolierte u-Amylase enthielt 0,75 Mol SH/Mol Protein.

b) Schaf-Antikaninchen-IgG-Amtikörper, die 2-Pyridiyl-disulfidgruppen enthalten

1,2 n'ig Scnäf-ÄriiikäfiiriGucn-igG-Anukurpci (hergestellt äü5 SchäinypcnmmunoscrüiTi durch !rnrnunosorbens-Reinigung) wurden in 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5 gelöst 15 μΙ N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldiiiiio)-propionat (5,9 mM in Ethanol) wurden zugesetzt. Nach kräftigem Schütteln des Reaktionsgemisches wurde die Reaktion 40 Minuten bei +23⁰C durchgeführt. Überschüssiges Reagens und andere unerwünschte Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex G-25 entfernt, wobei das verwendete Medium 0,3M Natriumchlorid war.

Die so modifizierten Schaf-Antikaninchen-IftO-Antikörper enthielten 2 Mol 2-Pyridyl-disulfid-gruppen/Mol Protein.

N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propional: kann in der folgenden Art und Weise hergestellt werden:
1,9 g (8,6 mMol) 2,2'-Dipyridyl-disulfid wurden in 10 ml Ethylacetat gelöst. Eine Lösung von 0,9 g (8,6 mMol) 3-Mercaptopropionsäure In 10 ml Ethylacetat wurde unter Rühren innerhalb von 15 Minuten tropfenweise

JO zugesetzt, zur gleichen Zeit a!s 0,5 mg (2 Tropfen) Bortrifluorid-etherat dem Reaktionsgemisch zugesetzt wurden. Nach 20 Stunden bei Raumtemperatur und unter Rühren wurde das Reaktionsgemisch eingedampft, (< 40° C) und der feste gelbe Rückstand wurde in 10 ml kaltem (-1- 4° C) Ethylacetat aufgeschlämmt und filtriert Anschließend wurde das Filtrat mit 0,68 g (5 mMol) N-Hydroxysuccinimid versetzt, woraufhin 1,03 g (5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 10 ml trockenem Ethylacetat unter Rühren bei Raumtemperatur innerhalb von 15 Minuten zugetropft wurden. Die Reaktion wurde unter Rühren 5 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt, woraufhin das Reaktionsgemisch auf +4° C gekühlt wurde und das ausgefallene Dicyclohexylcarbamid abfütriert wurde. Die !eicht gelbe Lösung wurde eingedampft und das öl in Ethanol gelöst und bei —20° C kristallisiert Ausbeute 45%, Schmelzpunkt 78,5 bis 80,5⁰C.

c) Schaf-Antikaninchen-lgG-Antikörper-Ä-Amylase-Konjugat

1,2 mg Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-2-Pyridyldisulfid (8 nMol Protein, enthaltend 17 nMol 2-Pyridyldisulfidgruppen), wie vorstehend unter b) hergestellt in 1 ml 0,3M Natriumchlorid wurden mit 5 mg isolierter «-Amylase (100 nMol, enthaltend 75 nMol SH-Gruppen), wie vorstehend unter a) hergestellt, in 2 ml 03M Natriumchlorid gemischt 0,1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 wurde zugesetzt, und die Reaktion wurde 18 Stunden bei +4° C durchgeführt

Die Gelfiltration des Reaktionsgemisches an Sephadex® G-200 (Perlen aus Dextran, vernetzt mit Epichlorhydrin) und die Analyse der Fraktionen zeigte, daß 80% der zugesetzten Antikörper konjugiert hatten. Das gebildete Konjugat war hauptsächlich bimolekular (kleine Mengen von tri- und termolekularem Material

so konnten ebenfalls beobachtet werden). Es wurde gefunden, daß das Konjugat sowohl enzymatisch als auch immunologisch aktiv, war und zur quantitativen Bestimmung von Kaninchen-IgG in der üblichen Sandwich-Technik verwendet werden konnte. Konjugat enthaltende Fraktionen wurden vereinigt und auf 290 μg (konjugierte Antikörper)/ml konzentriert und in 0,3M Natriumchlorid bei +4⁰C gelagert

Beispiel 3

Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-ialkaüschePhosphataseJ-Konjugat

a) Alkalische Phosphatase, die 2-Pyridyl-disulfid-gruppen enthält
eo

4 mg alkalische Phosphatase (aus Kalbdarm) wurden in 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer von pH 7,5 gelöst. 150 μΐ N-Succimimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (1,7 mM in 993% Ethanol) wurden zugesetzt Nach kräftigem Schütteln des Reaktionsgemisches wurde die Reaktion 40 Minuten bei +23⁰C fortgesetzt Das Reaktionsgemisch wurde anschließend an Sephadex® G-25 gelfiltriert, wobei das verwendete Medium der gleiche vorstehend genannte Phosphatpuffer war.

Die so modifizierte alkalische Phosphatase enthielt 1 Mol Pyridyldisulfidgruppen pro Mol Protein.

b) Thiolierte Schaf-Antikaninchen-IgG- Antikörper

23 mg Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper (hergestellt aus Schafserum durch Natriumsulfatausfällung) wurden in 03 mli'.l M Natriumphosphatpuffer, pH 73, gelöst 40 ul N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (1,7 mM in 993% Ethanol) wurden zugesetzt Nach kräftigem Schütteln des Gemisches wurde die Reaktion 40 Minuten bei 23°C fortgesetzt Überschüssiger Reaktionsteilnehmer und andere unerwünschte Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex® G-25 entfernt wobei das verwendete Medium 0,1 M Natriumacetatpuffer von pH 5 war. Das so erhaltene Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-Pyridyldisulfid-Derivat wurde anschließend durch Zusatz von 50 ul 50 mM Dithiothreitol zu dem aus der Gelfiltration erhaltenen Material (etwa 13 ml) reduziert Die Reduktion wurde 30 Minuten bei +23⁰C fortgesetzt Überschüssiges Dithiothreitol und andere Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex® G-25 entfernt (das verwendete Medium war 03M Natriumchlorid). Die so thiolierten Schaf-Antikaniuchen-IgG-Antikörper enthielten 2MoI SH/Mol Protein.

c) Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-ialkalische Phosphatase)-Konjugat

Die thiolierten Schaf-Antikaninchen-lgG-Antikörper (etwa 23 mg) gemäß b) in 1 ml 03M Natriumchlorid wurden mit dem vorstehend unter a) hergestellten alkalischen Phosphatase-2-pyridyldisulfid-Derivat in 33 ml OJ M Natriumphosphatpuffer. pH-Wert 73? gemischt Das Reaktionsgemisch wurde geschüttelt und die Reaktion wurde 24 Stunden bei +23° C durchgeführt Die Gelfiltration des Reaktionsgemisches an Sephadex® G-200 (das ver vendete Medium war 03M Natriumchlorid) und die Analyse der Fraktionen zeigte, daß ein Konjugat mit niedrigem Molekulargewicht (bi- und trimolekular) gebildet worden war. Die Fraktionen, die das Konjugat enthielten, wurden vereinigt und auf etwa 100 μg (im bezug auf Antikörper)/ml konzentriert Das Konjugat war enzymatisch und immunochemisch aktiv und konnte für quantitative Bestimmung von Kaninchen-IgG verwendet werden.

Beispiel 4 Schaf-Antikaninchen-lgG-Antikörper-ialkalischePhosphataseJ-Konjugat

a) Alkalische Phosphatase, die 2-Pyridyl-disulfid-gruppen enthält

4 mg alkalische Phosphatase (wie gemäß Beispiel 3) wurden in 23 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 73. gelöst ΙΟΟμΙ N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (5,9 mM in 993% Ethanol) wurden zugesetzt Nach Schütteln des Reaktionsgemisches wurde das Reaktionsgemisch 45 Minuten bei + 23° C abgestellt Überschüssiger Reaktionsteilnehmer und andere unerwünschte Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex® G-25 entfernt (das verwendete Medium war 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 75). Das erhaltene alkalische Phosphatase-Derivat enthielt 1,1 Mol 2-Pyridyl-disulfidgruppen/Mol Protein.

b) Thiolierte Schaf-Antikaninchen-lgG-Antikörper ,

Immunosorbent-gereinigte Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper wurden in der in Beispiel 3 beschriebenen Art und Weise thioliert

45 c)Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-(alkalischePhosphatase)-Konjugat

Die thiolierten Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper (etwa 1,2 mg) gemäß b) in 1 ml 03M Natriumchlorid wurden mit dem alkalischen Phosphatase-2-pyridyl-disulfid-Derivat aus Stufe a) (etwa 4 mg) in 33 ml O₁IM Natriumphosphatpuffer, pH 73, gemischt Das Reaktionsgemisch wurde geschüttelt und die Reaktion wurde 24 Stunden bei +!23"C fortgesetzt

Die Gelfiltration des Reaktionsgemisches an Sephadex® G-200 (das verwendete Medium war 03M Natriumchlorid) zeigte, daß ein bimolekulares Konjugat und zu gewissem Grade ein trimolekulares Konjugat gebildet worden war. Das Konjugat war sowohl enzymatisch als auch immunologisch aktiv und konnte zur quantitativen Bestimmung von Kaninchen-IgG verwendet werden. Das Konjugat wurde in 03M Natriumchlorid bei +4⁰C gelagert.

Beispiel 5 Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-Catalase-Konjugat

a) 2-Pyridyl-disulfid-gruppen enthaltende Catalase

5 mg Catalase (aus Rinderleber) wurden in 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, gelöst. 50 μ! N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (1,7 mM in 993% Ethanol) wurden zugesetzt. Nach Schütteln des Reaktions- gemisches wurde die Reaktion 45 Minuten bei +23⁰C fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend

an Sephadex® G-25 gelfiltriert (das verwendete Medium war 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5). Die modifizierte Catalase enthielt 0,7 Mol 2-Pyridyl-disulfid-gruppen/Mol Enzym.

' b) Thiolierte Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper

1,1 mg Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper (die gleiche Art wie gemäß Beispiel 1 verwendet) wurden in 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, gelöst 20 μΐ N-Surcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (1,7 mM in 99,5% Ethanol) wurden zugesetzt

Nach Schottern des Reaktionsgemisches wurde die Reaktion 45 Minuten bei +23° C fortgesetzt Überschüssiger Reaktionsteilnehmer und andere unerwünschte Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex* G-25 entfernt (das verwendete Medium war 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5).

0,1 ml 50 mM Dithiothreitol wurden dem erhaltenen Material (1,55 ml) zugesetzt Die Reduktion wurde 30 Minuten bei +23⁰C fortgesetzt Überschüssiges Dithiothreitol wurde anschließend durch Gelfiltration an Sephadex® G-25 entfernt (das verwendete Medium war 0,3M Natriumchlorid).

Die Analyse der Fraktionen zeigte, daß ein Catalase-Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-Konjugat gebildet worden war.

Das gebildete Konjugat welches nach der Gelfiltration beurteilt wurde, hatte ein Molekulargewicht von 400 000 bis 700 000, war sowohl enzymatisch als auch immunochemisch aktiv und konnte zur quantitativen Bestimmung von Kaninchen-IgG mit Hilfe der üblichen Sandwich-Technik verwendet werden. Das gelfiltrierte Konjugat wurde in 03M Natriumchlorid bei + 4° C gelagert

Beispiel 6

Schaf-Antikaninchen-lgG-Antikörper-DcÄtran-ii-Aniyiääe-Korijügai a) 2-Pyridyl-disulfid-Derivat von Dextran

Ig Bromhydroxypropyldextran wurde in 12^ ml destilliertem Wasser gelöst und 3,8 g Na₂S₂Os x 7H₂O wurden zugesetzt Die Reaktion wurde 3 Stunden bei 100⁰C durchgeführt Anschließend wurde das Gemisch gegen H₂O (2 χ 2 1 für 24 Stunden und 1 χ 101 für 6 Stunden) dialysiert

Der Inhalt des Dialysebeutels wurde gefriergetrocknet und nachfolgend als »Bunte Salz-dextran« bezeichnet Die Analyse zeigte, daß das Dextranderivat 1,2 mMol S/g Trockenderivat enthielt 1 g des Bunte Salzdextrans wurde in 10 ml 50% Ethanol 50% 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 83, gelöst 0,7 g 2,2'-Dipyridyl-disulfid wurden zugesetzt und das Gemisch wurde auf 60° C erhitzt und 24 Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch gegen 3x3150%iges Ethanol (jede Dialyse dauerte 6 Stunden) und g3gen 3x31 destilliertes Wasser (jede Dialyse dauerte 2 Stunden) dialysiert Die Analyse zeigte, daß das 2-Pyridyl-disulfid-dextran 430 μΜοΙ 2-Pyridyl-disuIfid-gruppen/g Derivat enthielt

M ThioHerte Schsf-Antiksninchen-!^<TG-Aniikör^T*er

2,6 mg Schaf-Antikaninchen-lgG-Antikörper (der gleichen Art wie in Beispiel 1 verwendet) wurden in 1 ml 0,1M Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) gelöst 120 μΐ N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (1,6 mM in 99,5% Ethanol) wurden zugesetzt, und die Reaktion wurde 30 Minuten bei +23⁰C (nach Schütteln des Gemisches) fortgesetzt Das Reaktionsgemisch wurde anschließend an Sephadex® G-25 gelfiltriert wobei das verwendete Medium 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,0, war. Das erhaltene Material (2,5 ml) (2-Pyridyl-disulfid-Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-Derivat) wurde mit 64 μΐ 50 mM Dithiothreitol reduziert. Nach 15 Minuten bei +23° C wurde überschüssiges Dithiothreitol durch Gelfiltration an Sephadex® G-25 entfernt wobei das verwen-

•♦5 dete Medium 0,3M Natriumchlorid war. Ein Elutions· Volumen von 3,5 ml wurde erhalten.

c) Thiolierte λ- Amylase Die thiolierte «-Amylase wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel la) beschrieben hergestellt

d) Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-Oextran-«-Ainylase-Konjugat

2,4 mg der thiolierten Λ-Amylase gemäß c) (in 13 ml) und 2,6 mg der thiolierten Schaf-Antikaninchen-lgG-Antikörper gemäß b) in 3,5 ml wurden mit 1,6 mg 2-Pyridyl-disulfid-dextran in 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7A gemischt. Nach Schütteln des Gemisches wurde das Gemisch 10 Minuten abgestellt und anschließend an Sepharose® 6B (Perlen aus Agarose) mit 0,3M Natriumchlorid als Medium gelfiltriert.

Die Analyse der verschiedenen Fraktionen zeigte, daß 80% der «-Amylase-Aktivität konjugiert hatte. Eine konjugierte immunologische Aktivität konnte ebenfalls beobachtet werden. Die Fraktionen, die das Konjugat enthielten, wurden vereinigt und bei +4⁰C gelagert. Wenn das Konjugat in der üblichen Sanwich-Technik zur Bestimmung von Kaninchen-IgG verwendet wurde, wurde aufgrund der Vielzahl von Enzymmarkierungsgruppen im Konjugat ein Verstärkungseffekt beobachtet.

Beispiel 7

Kaninchen-Antihuman-Fc^'-Antikörper-Peroxidase-Konjugat

a) 2-Pyridyl-disulfid-gruppen enthaltende Peroxidase

10 mg Peroxidase (aus Meerrettich, Reinheitsgrad 1) in 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurden mit 035 ml 14 mM N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat versetzt. Nach 40minütiger Reaktionszeit w^jde überschüssiger Reaktionsteilnehmer mittels Gelfiltration an Sephadex® G-25 entfernt, wobei das verwendete Medium 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, war. Das so erhaltene Peroxidase-2-pyridyl-disulfid-Derivat hatte ein Volumen von 2,75 ml.

b) Thiolierte Kaninchen-Antihuman-Fc^-Antikörper

4 mg Kaninchen-Antihuman-Fcy-Antikörper (hergestellt aus Kaninchenserum durch Ausfällung und Immunosorbens-Reinigung) wurden in 1,5 ml O₁IM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, gelöst 60 μΐ 13 mM N-SuccinimidyI-3-(2-pyridyIdithio)-propionat in Ethanol (99,5%) wurden zugesetzt Das Reaktionsgemisch wurde geschüttelt und anschließend 40 Minuten bei +23⁰C abgestellt Überschüssige Reaktionsteilnehmer wurden durch Gelfiltration an Sej^adex® G-25 entfernt wobei das verwendete Medium 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,8, war. Die erhaltenen Fraktionen, die die modifizierten Antikörper enthielten, wurden zu einem Gesamtvolumen von 2J5 ml vereinigt Die Reduktion des Antikörper-Derivates mit Dithiothreitol (siehe unten) und die Bestimmung der Menge an freigesetztem 2-Thiopyridon zeigte, daß das Derivat etwa 2 Mol 2-Pyridyl-disulfid-Gruppen/Mol Protein enthielt

Das Antikörper-2-pyridyI-disulfid-Derivat (23 ml des vorstehend beschriebenen Materials) wurde mit 0,1 ml 5OmM Dithiothreitol 30 Minuten bei +23⁰C reduziert Überschüssiges Dithiothreitol wurde anschließend mittels Gelfiltration an Sephadex* G-25 entfernt (das verwendete Medium war 03M NaCl). Die thiolierten Antikörper wurden in einem Volumen von etwa 3,5 ml erhalten (Eluat).

c) Kaninchen-Antihuman-Fc/-Antikörper-Peroxidase-Konjugat

Peroxidase-2-pyridyl-disulfid-Derivat gemäß a) in 2,75 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde mit den thiolierten Antikörpern gemäß x>) in 3,5 ml 0,1M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, gemischt Nach Schütteln wurde das Gemisch 24 Stundin bei +4⁰C abgestellt 2,0 ml des Reaktionsgemisches wurden anschließend an Sephadex® G-25 (das verwendete Medium war 03M Natriumchlorid) und der Rest (6,25—2 = 4,25 ml) an Sephadex® G-200 (das verwendete Medium war 03M Natriumchlorid) gelfiltriert Das Konjugat, welches nach der Gelfiltration an Sephadex® G-25 als Material erhalten wurde, wurde als Konjugatlösung 1 bezeichnet und die vereinigten, Konjugat enthaltenden Fraktionen, die nach Filtrieren an Sephadex® G-200 erhalten wurden, wurden als Konjugat-lösung H bezeichnet.

Die Konjugat-lösung I enthielt etwa 250 μg konjugierte Antikörper/ml.

Die Konjugat-lösung II enthielt etwa 50 μg konjugierte Antikörper/ml.

Die Lösungen wurden bei +4⁰C gelagert. Die Konjugate waren enzymatisch aktiv und die Antikörper in den Konjugaten waren weiterhin immunchemisch aktiv und konnten mit dem entsprechenden Antigen kombinieren.

Beispiele

Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Ä-Amylase-Multikomkplex-Konjugat

30 mg Λ-Amylase (der gleichen Art und Vorbehandlung wie in Beispiel 1) wurden in 4,5 ml 0,1 M Natriumphosphat — 03M Natriumchlorid, pH 74, gelöst 100 μΐ 50 mM N-Succinimidyl-3-(2-pyridyIditliio)-propionat in absolutem Ethanol wurden in Portionen von 25 μΐ in Intervallen von 5 Minuten zugesetzt. Nach 40 Minuten bei + 25°C wurde das Reaktionsgemisch an Sephadex® G-25 (da^c- verwendete Medium war 0,1 M Natriumphosphat — 03M Natriumchlorid, pH 7,5) gelfiltriert Der überschüssige Reaktionsteilnehmer und die Reaktionsprodukte mit niedrigem Molekulargewicht wurden entfernt Das eluierte Material, das die modifizierte Λ-Amylase (2-PyridyI-disulfid-«-amyIase) enthielt, wurde zu 8 ml vereinigt. Der Substitutionsgrad in bezug auf den Gehalt an 2-PyridyldisuIfid betrug 3,7 μΜοΙ 2-Pyridyl-disulfid-gruppen pro 50 mg Λ-Amylase.

Ein anderes 2-Pyridyl-disulfid-«-amyIase-Derivat wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt, mit dem Unterschied, daß 400 μΐ 50 mM N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in absolutem Ethanol in Intervallen von 5 Minuten in Portionen von 100 μΐ zugesetzt wurden. Der Substitutionsgrad dieses Derivates betrug 7,5 μΜοΙ 2-Pyridyl-disulfid-gruppen pro 50 mg Λ-Amylase.

2,5 mg 2-Pyridyl-disulfid-A-amylase, die 3,7 μΜοΙ 2-Pyridyldisulfidgruppen pro 50 mg enthielt, in 0,75 ml 0.1 M Natriumphosphat — 03M Natriumchlorid, pH 73, wurden mit 50 μΐ 50 mM Dithiothreitol gemischt und lOMinuten bei +25⁰C reduziert. Überschüssiges Dithiothreitol und Reaktionsprodukte mit niedrigem Molekulargewicht wurden durch Gelfiltration an Sephadex® G-25 (das verwendete Medium war 03M Natriumchlorid) gelfiltriert.

Das eluierte Material, 2,5 ml, das 2,3 mg Thiol-*-amylase enthielt, wurde mit 1,5 mg 2-Pyridyl-disuIfid-«-amylase, die 7,5 μΜοΙ 2-Pyridyl-disulfid-gruppen pro 50 mg enthielt, in 0,75 ml 0,1 M Natriumphosphat — 0,3M Natriumchlorid gemischt. Nach 60minütiger Reaktion bei 25⁰C wurde die Reaktion durch Zusatz von 50 μΐ

20 mM 2,2'-DipyridyI-disuIfid in absolutem Ethanol abgebrochen. Ein Tropfen Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat (Sorbimacrogollaurat) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde an einer Sepharose®-6B-Säule (80 ml Gesamtvolumen) Chromatographie«, wobei das verwendete Medium 03M Natriumchlorid — 03% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat war. Das eluierte Material (etwa 15 ml), das etwa 0,19 mg Λ-Amylase-Aggregat/mI, enthaltend 2,4 μΜοΙ 2-Pyridyl-disulfidgnippen, enthielt, wurde vereinigt und bei +4⁰C gelagert

6 mg Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper (Immunosorbens — gereinigt mit ^-Globulin-Agarose-sorbens, das durch Kupplung von elektrophoretisch gereinigtem Human-Gammaglobulin an CNBr-aktivierte Sepharose® 4B hergestellt wurde) in 2,4 ml 0,1M Natriumphosphat — 0,3M Natriumchlorid, pH 6,0, wurden mit 20 μΐ 50 mM N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in absolutem Ethanol gemischt Nach 20 Minuten bei + 25° C wur-

ίο de überschüssiger Reaktionsteilnehmer durch Gelfiltration des Reaktionsgemisches an Sephadex® G-25 entfernt, wobei das verwendete Medium 0,1 M Natriumacetat — 03M Natriumchlorid, pH 5,0, war. Das eiuierte Material, etwa 3,0 ml, das etwa 5,5 mg 2-Pyridyl-disulfid-Antikörper enthielt, wurde vereinigt und mit 0,2 ml 5OmM Dithiothreitol in destilliertem Wasser umgesetzt Nach 25minütiger Reaktion wurde überschüssiges Dithiotreitol durch Gelfiltration des Reaktionsgemisches an Sephadex* G-25 entfernt, wobei das verwendete Medium 03M Natriumchlorid war. Das eluierte Material, 5,0 ml, das etwa 5 mg modifizierte Antikörper mit einem Substitutionsgrad von etwa 2 μΜοΙ SH-Gruppen pro 160 mg Protein enthielt, wurde vereinigt

Etwa 0,2 mg der so thiolierten Antikörper in 0,2 ml 03M Natriumchlorid wurden mit 0,4 mg des «-Amylase-Aggregats (siehe oben) in 2,0 ml 0,1 M Natriumphosphat — 0,3M Natriumchlorid — 0,5% Poiyoxyethylenderivat von Sorbitanmonooleat gemischt Das Reaktionsgemisch, das Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-«-A mylase-

Multikomkplex-Konjugat enthielt, wurde bei + 4° C gelagert

· Beispiel 9

Schaf-Antihuman-igG-AntikδφeΓ-GlutathionfluoΓescein-Konjugat

a) Glutathion-fluor^scein

100 mg Fluorescein-isothiocyanat wurden mit 35 mg oxidiertem Glutathion in 4 ml destilliertem Wasser umgesetzt Die Reaktion wurde 90 Minuten bei einem konstanten pH-Wert von 9 durchgeführt Das Reaktions gemisch wurde an einer 100-ml-Säule von Sephadex® G-25 gelfiltriert, wobei das verwendete Medium 0,3M Natriumchlorid war. Die Fraktionen, die dem Gesamtvolumen entsprechen, wurden aufgefangen (103 ml mit A 493=41,2). Der pH-Wert wurde mit Natriumborat-Puffer auf pH 9 eingestellt Die Lösung wurde durch eine Säule, die 2,2 ml Mercaptohydroxypropylagarose (hergestellt aus Agarose (Sepharosef®) 6B) gemäß Axen et al„ Acta Chem. Scand. B 29 (1975), 471—474; 660 μΜοΙ SH/g getrocknetes Gel enthaltendes Gel wurde verwendet) enthielt die mit 0,1 M Natriumborat-puffer, pH 9, ins Gleichgewicht gebracht wurde-, gepumpt

Die Durchflußmenge betrug 10 ml/Std. Das Eluat wurde in 1 M Natriumacetat, pH 4, aufgefangen und der Fiuoresceingehait und der Tnioigehait desselben wurde bestimmt Eine Fraktion (3 mi) mit einer Thioikonzentration von 1,19 mM und einer Fluoresceinkonzentration von 0,60 mM wurde in dem nachfolgenden Experiment verwendet

b) Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper, die '-Pyridyl-disulfid-gruppen enthalten

5 mg Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper (Immunosorbens, gereinigt mit Sepharose <®)-Human->«-globulin)

wurden in 03 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, gelöst 20 μΐ 1OmM N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldit hio)-propionat (in 993% Ethanol) wurden zugesetzt Nach Schütteln des Reaktionsgemisches wurde das Reak-

tionsgsmisch 40 Minuten bei + ?3° C abgestellt Überschüssiges Reagens wurde anschließend durch Gelfiltration an Sephadex G-25 entfernt, wobei das verwendete Medium 0,1 M Natriumphosphat-puffer, pH 73, war.

c) Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Glutathion-Fluorescein-Konjugat so

13 ml des eluierten Materials gemäß b) (43 mg Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper, die 2-Pyridyl-disulfidgruppen enthielten) v/urden mit 3 ml Glutathion-fluorescein, das gemäß a) hergestellt wurde, gemischt Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur abgestellt und anschließend an Sephadexi®) G-25 mit 0,9%igem Natriumchlorid als Medium gelfiltriert. Die Anaiyse zeigte, daß das eluierte Material (void, 6 ml) 3,2 mg Schaf-Äntihuman-IgG-Antikörper mit etwa 3,5 Mol Fluorescein/Mol Antikörper enthielt. Das Konjugat wurde,gelöst in 0,9 Gew.-% Natriumchlorid, bei +4⁰C gelagert

Human-IgG konnte in einem Sandwich-Verfahren unter Verwendung dieses !Conjugates mit der Fluoreszens-Technik nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang wurde der Strahlendämpfungseffekt des Trägerpolymeren durch reduktives Freisetzen des Glutathionfluoresceins aus dem Po'ymeren eliminiert

Beispiel 10

Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-GIutathion-Dextran-Fluorescein-Konjugat a) Glutathion-fluorescein

Etwa 3 ml des Denvatsmit einer Thiol-Konzentration von etwa 1.2 mM und einer Fluorescein-Konzentration von etwa 0,60 mM wurden gemäß dem in Beispiel 9a) beschriebenen Verfahren hergestellt.

bJSchaf-Antihuman-lgG- Antikörper- Dextran-Glutathion-Fluorescein-Konjugat

5 g Dextran wurden in 20 ml 2O°/oiger Natronlauge, die 1 % NaBH4 enthielt, gelöst. 5 g 2-Chloreth>laminhydrochlorid wurden zugesetzt und das Gemisch wurde 18 Stunden bei +9O⁰C gerührt. Nach Kühlen auf +25"C und Neutralisieren mit 6 M HCI wurde die kleine Menge an gebildetem Niederschlag durch Zentrifugation entfernt. Die überstehende Lösung wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet. 5 g Aminoethyldextran als Trockenprodukt wurde erhalten. Der Stickstoffgehalt betrug 1,5%.

1 g des Aminoethyl-dextrans wurde in 30 ml 0,05 M Natriumboratpuffer, pH 9, gelöst, und N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (300 mg in 30 ml absolutem Ethanol) wurde unter Rühren innerhalb von 10 Minuten zugetropit. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 20 Minuten abgestellt, woraufhin 3 ml konzentrierte Essigsäure zugesetzt wurden. Das so erhaltene Gemisch wurde 48 Stunden gegen 5O°/oiges Ethanol (3 χ 2CiOO ml) dialysiert und anschließend zu 15 ml eingedampft und gefriergetrocknet.

1 g des Trockenproduktes (2-Pyridyl-disulfid-dextran) wurde erhalten.

0.54 mg thiolierte Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper, die etwa 2 μΜοΙ Thiolgruppen/160 mg Protein enthielten (hergestellt gemäß Beispiel 8) in 03 M Natriumchlorid wurden mit 0,15 mg 2-Pyridyldisulfid-dextran (siehe oben), gelöst in 0,1 ml Natriumphosphat 03 M Natriumchlorid, pH 7,5, gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde 48 Stunden bei +4"C sorgfältig gerührt. Der pH-Wert wurde anschließend durch Zusatz von 2 M HCl auf 5,0 eingestellt. 30 μΐ GIutathion-fluorescein-Lösung (siehe oben) wurden anschließend zugesetzt. Nach 3 Stunden bei +25"C wurde das Reaktionsgemisch auf eine Sephadex>^sHj-25-Säuie gebracht (das verwendete Medium war 03 M Natriumchlorid) und die Fraktionen, entsprechend dem Elutionsvolumen (void volume) wurden aufgefangen (etwa 2 ml).

Die Konzentration an Dextran betrug etwa 0,07 mg/ml, die Fluorescein-Konzentration betrug etwa 5,5 μΜ und die Konzentration an Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper betrug etwa 0,24 mg/ml.

Das so erhaltenen Konjugat wies immunochemische Aktivität auf und konnte für die quantitative Bestimmung von Humangammaglobulin in einem Sandwich-Verfahren verwendet werden, wodurch das Glutaihion-fluorescein nach Binden des Antikörper-Dextran-Glutathion-fluorescein-Konjugates an das unlösliche Trägerpolymere durch Reduktion freigesetzt wurde und so in der äußeren Lösung ohne irgendeinen störenden Einfluß vom festen Trägermaterial und den Konjugatnachbarn fluorometrisch gemessen werden konnte.

Anwendungsbeispiel

Quantitative Bestimmung von Human-gammaglobulin unter Anwendung von
Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Ä-Amylase-Multikomplex-Konjugat

Etwa 50 μg (getrocknetes Derivat) Agarose-Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Derivat (hergestellt durch Kupplung von Immunosorbens-gereinigte Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper an CNBr-aktivierte Sepharosd*S4 B), das etwa 400 ng Antikörper enthielt und in 300 μ! 0,3 M Natriumchlorid und 0,5% Polyoxyeihylen sor> bitanmonooleat suspendiert war, wurden in jedes Rohr einer Reihe von Polystyrol-Rohren (3 ml), die variierende Mengen (1 bis 5OD ng) Human-gammaglobulin, gelöst in 100 μ! 0.1 M Natriumphosphat — 0,3 M Natriumchlorid — 0,5% Polyoxyethyleriderivat von Sorbitanmonooleat, pH 7.4, enthielten, gebracht. Eine Anzahl von Rohren, die lediglich Puffer enthielten, und eine Anzahl von Rohren, die Aminoethyl-agarose (hergestellt durch Kupplung von Ethanolamin an CNBR-aktivierte Sepharose<^e>4 B) wurden als Kontrollproben verwendet.

Die Rohre wurden etwa 18 Stunden bei +25⁰C unter sorgfältigem Schütteln inkubiert. Das Agarosegel in jedem Rohr wurde anschließend durch wiederholtes Zentrifugierungs-Dekantierungs-Verfahren mit 6 χ 2 ml 03 M Natriumchlorid — 0,5% Polyoxyethylenderivat von Sorbitanmonooleat gewaschen.

Nach dem letztten Waschen wurde die überstehende Lösung zu 03 ml abgesaugt und 100 μΐ des Reaktionsgemisches von Beispiel 8, das Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-ar-Amylase-MuItikomplex-Konjugat (etwa 400 ng in bezug auf Antikörper) enthielt, wurde jedem Rohr zugesetzt, welches anschließend unter sorgfältigem Schütteln 4 Stunden bei + 25°C inkubiert wurde. Das feste Material jedes Rohres wurde wieder, wie vorstehend beschrieben, mit 6 χ 2 ml 03 M Natriumchlorid und 0,5% Polyoxyethylenderivat von Sorbitanmonooleat gev-jsehen.

1,0 ml 1OmM Dithiothreitol in 0,1 M Natriumphosphat — 03 M Natriumchlorid, pH 8, wurde den Rohren (03 ml Suspension) zugesetzt Nach (üOminütiger Reduktion (während welcher der Λ-Amylase-Multikomplex aus dem immobilisierten Immunokomplex freigesetzt wurde und in kleinere Einheiten gespalten wurde) wurde 1,0 ml einer Suspension von Phadebas<^e>-Amylase-Test (1 Tablette/4 ml) zugesetzt und die Rohre wurden wieder 60 Minuten bei +25"C inkubiert, woraufhin die Reaktion durch Zusatz von 0,5 ml 0,5 M Natronlauge abgebrochen wurde. Nach Entfernung von ungelöstem Stärkepolymeren mittels Filtration wurde die Extinktion des blaugefärbten Filtrates bei 620 nm bestimmt Die Extinktionswerte beziehen sich auf die freigesetzte Λ-Amylase-Aktivität, weiche zu der Menge an gebundenem Konjugat in Beziehung steht welche wiederum zu der Menge an gebundenem Gammaglobulin in Beziehung steht und daher ein Maß der Gammaglobulin-Konzentration der Testlösungen ist Human-gammaglobulin konnte auf diese Weise bis hinab zu einer Konzentration von < 1 ng/ml nachgewiesen werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Reagens zur Verwendung in immunochemischen Untersuchungsmethoden, die in Gegenwart einer wäßrigen Flüssigkeit durchgeführt werden, welches Reagens ein in der wäßrigen Flüssigkeit lösliches Konjugat von einem oder mehreren Molekülen Immunglobulin und einer oder mehreren Einheiten einer analytischen nachweisbaren Gruppe umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunglobulin-Moleküle und die Einheiten der analytisch nachweisbaren Gruppe über die —S—S—Gruppe enthaltende Brücken aneinandergebunden sind.

Z Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die analytisch nachweisbare Gruppe eine ίο enzymatisch aktive, radioaktive oder fluoreszierende Gruppe ist

3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Immunglobulin ein Antikörper ist, der gegen ein Antigen oder Hapten gerichtet ist

4. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunglobulin-Moleküle und die Einheiten der analytisch nachweisbaren Gruppe jeweils an einen wasserlöslichen Träger gebunden sind, wobei mindestens das Immunglobulin oder die Gruppe über die —S—S—Gruppe enthaltende Brücken an den Träger gebunden ist