CH641570A5 - Process for the determination of an immunologically active material and reagent for carrying out this process - Google Patents
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung immunologisch aktiver Materialien sowie auf ein Reagens zur Durchführung dieses Verfahrens. The invention relates to a method for determining immunologically active materials and to a reagent for performing this method.
40 In den letzten Jahren sind zahlreiche analytische Systeme auf der Grundlage konkurrierender Proteinbindungsanalyse (auch als Sättigungsanalyse bezeichnet) entwickelt worden. 40 In recent years, numerous analytical systems based on competing protein binding analysis (also known as saturation analysis) have been developed.
Die Begriffe «Sättigungsanalyse» und «konkurrierende Proteinbildungsanalyse», die gleichbedeutend sind, beziehen 45 sich auf analytische Systeme, die zur Bestimmung immunologisch aktiver Materialien (Liganden) verwendet werden. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen in biologischen Flüssigkeiten werden in der medizinischen und veterinärmedizinischen Diagnose angewandt. Die Diagnose hängt davon ab, ob der so Gehalt der bestimmten Substanz normal oder pathologisch ist. Das analytische Prinzip beruht z.B. auf der Konkurrenz zwischen einem Liganden und einem markierten Liganden für ein übliches spezifisches bindendes Mittel (Rezeptor), wie durch die folgende Gleichung veranschaulicht: The terms “saturation analysis” and “competing protein formation analysis”, which are synonymous, refer to analytical systems that are used to determine immunologically active materials (ligands). The results of these determinations in biological fluids are used in medical and veterinary diagnosis. The diagnosis depends on whether the content of the particular substance is normal or pathological. The analytical principle is based e.g. on competition between a ligand and a labeled ligand for a common specific binding agent (receptor), as illustrated by the following equation:
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Markierung Ligand + Ligand + Rezeptor—»• Labeling ligand + ligand + receptor— »•
6o Markierung Markierung 6o marking marking
Ligand + Ligand + Ligand + Ligand Ligand + ligand + ligand + ligand
I I I I
Rezeptor Rezeptor 05 (1) (2) (3) (4) Receptor Receptor 05 (1) (2) (3) (4)
Gleichung 1 Equation 1
Die Primärreaktion ist eine Kombination eines Liganden-moleküls mit einem Rezeptormolekül unter Bildung eines The primary reaction is a combination of a ligand molecule with a receptor molecule to form one
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bimolekularen Ligand-Rezeptor-Komplexes (1). Eine Sekundärreaktion wird durch Addition eines markierten Liganden verursacht, der ähnlich mit Rezeptor unter Bildung eines markierten Liganden-Rezeptor-Komplexes (2) kombiniert. Bei der Sättigungsanalyse sind die Konzentrationen des Rezeptors und des markierten Liganden konstant. Die Rezeptorkonzentration ist so begrenzt, dass der markierte Ligand relativ zum Rezeptor im Überschuss vorliegt. Unter diesen Bedingungen löst die Addition des Liganden eine Konkurrenz zwischen Ligand und markiertem Ligand bei der Bindung an den Rezeptor aus. Folglich setzt eine Erhöhung der Ligandenkon-zentration die Menge an markiertem Ligand-Rezeptor-Komplex herab. Das Testprinzip beruht auf der Bestimmung des Prozentsatzes des gesamten markierten, an den Rezeptor gebundenen Liganden. Dieser Prozentsatz ist umgekehrt proportional der Menge an dem Reaktionsgemisch von der zu messenden Probe oder von dem beim Test verwendeten Standard zugesetzten Liganden. Die Abnahme der Konzentration des markierten Ligand-Rezeptor-Komplexes oder die Zunahme der Konzentration des markierten Liganden im Reaktionsgemisch kann zur Bestimmung der Ligandenkon-zentration verwendet werden. bimolecular ligand-receptor complex (1). A secondary reaction is caused by the addition of a labeled ligand, which similarly combines with the receptor to form a labeled ligand-receptor complex (2). Concentrations of the receptor and the labeled ligand are constant in the saturation analysis. The receptor concentration is limited so that the labeled ligand is in excess relative to the receptor. Under these conditions, the addition of the ligand triggers competition between the ligand and the labeled ligand when binding to the receptor. Consequently, increasing the ligand concentration decreases the amount of labeled ligand-receptor complex. The test principle is based on the determination of the percentage of the total labeled ligand bound to the receptor. This percentage is inversely proportional to the amount of reaction mixture from the sample to be measured or from the ligand used in the standard used in the test. The decrease in the concentration of the labeled ligand-receptor complex or the increase in the concentration of the labeled ligand in the reaction mixture can be used to determine the ligand concentration.
Die Empfindlichkeit der Sättigungsanalyse hängt von der Verwendung eines Rezeptors ab, der eine sehr hohe Affinität zum Liganden und zum markierten Liganden aufweist. Zum anderen hängt die Empfindlichkeit auch von der Verwendung einer Markierung ab, die bei sehr geringer Konzentration nachweisbar ist. The sensitivity of the saturation analysis depends on the use of a receptor that has a very high affinity for the ligand and for the labeled ligand. On the other hand, the sensitivity also depends on the use of a label that can be detected at a very low concentration.
Die Spezifität der Sättigungsanalyse hängt von dem Vermögen des Rezeptors ab, ausschliesslich den Liganden und den markierten Liganden in einem komplexen Gemisch verschiedener Moleküle zu binden. The specificity of the saturation analysis depends on the ability of the receptor to bind only the ligand and the labeled ligand in a complex mixture of different molecules.
Die Sättigungsanalyse ist unter Anwendung zahlreicher unterschiedlicher Techniken eingesetzt worden, wobei die Unterschiede in erster Linie mit der Art der verwendeten Markierung zusammenhängen. Im allgemeinen werden diese Techniken durch die breiten Bezeichnungen «Radioaktivtest» oder «Nicht-Radioaktivtest» eingeteilt, in Abhängigkeit davon, ob ein radioaktiver Tracer als Markierung verwendet wird oder nicht. Saturation analysis has been used using a variety of different techniques, the differences being primarily related to the type of label used. In general, these techniques are categorized by the broad terms "radioactive test" or "non-radioactive test" depending on whether or not a radioactive tracer is used as a label.
Der Radioaktivtest ist in grösserem Umfang angewandt worden als Nicht-Radioaktivtests. Der Radioaktivtest kann weiter als Radioimmuntest oder Radiorezeptortest unterteilt werden, je nach der Art des bei dem Test verwendeten Rezeptors. Beim Radioimmuntest wird ein Antikörper verwendet, der den Liganden und den markierten Liganden spezifisch bindet. Andererseits bezieht sich die Radiorezeptoranalyse auf die Verwendung irgendeines anderen Typs eines biologischen Rezeptors, der den Liganden und den markierten Liganden ähnlich spezifisch bindet. The radioactive test has been used to a greater extent than non-radioactive tests. The radioactive test can be further classified as a radioimmunoassay or a radio receptor test, depending on the type of receptor used in the test. The radioimmunoassay uses an antibody that specifically binds the ligand and the labeled ligand. On the other hand, radioreceptor analysis refers to the use of any other type of biological receptor that similarly specifically binds the ligand and the labeled ligand.
Bei allen radioaktivenTesttechniken ist es wesentlich, die gebundene Fraktion (1 und 2 in Gleichung 1) von der ungebundenen Fraktion (3 und 4 der Gleichung 1) des Reaktionsgemisches physikalisch zu trennen. Ein Index der Liganden-konzentration kann dann durch Auszählen dieser Fraktionen in einem Radioaktivitätszähler und durch Vergleich der für unbekannte Proben erhaltenen Zählwerte mit solchen, wie sie für geeignete, dem gleichen Test unterworfene Standard-Ligandenproben erhalten wurden, erhalten werden. Zahlreiche verschiedene und auseinanderstrebende Methoden sind für die Trennung der gebundenen und freien Anteile des Radioaktivtest-Reaktionsgemischs beschrieben worden, In all radioactive test techniques, it is essential to physically separate the bound fraction (1 and 2 in Equation 1) from the unbound fraction (3 and 4 in Equation 1) of the reaction mixture. An index of ligand concentration can then be obtained by counting these fractions in a radioactivity counter and comparing the counts obtained for unknown samples with those obtained for suitable standard ligand samples subjected to the same test. Numerous different and divergent methods have been described for the separation of the bound and free portions of the radioactive test reaction mixture,
wobei Techniken wie z.B. Gelfiltration, Absorption und Ionenaustauschchromatographie, fraktionierte Fällung, Feststoffphase oder Elektrophorese, eingesetzt wurden. techniques such as Gel filtration, absorption and ion exchange chromatography, fractional precipitation, solid phase or electrophoresis, were used.
Nach der Entwicklung von Radioaktivtesttechniken bei der Sättigungsanalyse wurden Methoden entwickelt, die nichtradioaktive Markierungen anwenden. Verfahren unter After the development of radioactive test techniques in saturation analysis, methods were developed that use non-radioactive labels. Procedure under
Einsatz von Enzymen als Markierung sind aufgezeigt worden. Diese Verfahren können den Vorteil haben, dass physikalische Trennung der gebundenen (1 +2) und freien (3+4) Fraktionen oder Anteile des markierten Liganden beim Testablauf nicht notwendig ist. The use of enzymes as a label has been shown. These methods can have the advantage that physical separation of the bound (1 +2) and free (3 + 4) fractions or portions of the labeled ligand is not necessary during the test procedure.
Wenn ein Antikörper einem mit einem Enzym markierten Liganden bindet, wird die Aktivität des Enzyms verändert. Der Grad oder das Ausmass der Veränderung der Enzymaktivität ist ein Anzeichen für die Konzentration des markierten Liganden in der gebundenen Fraktion und liefert folglich einen Konzentrationsindex des Liganden im Reaktionsgemisch. When an antibody binds to a ligand labeled with an enzyme, the activity of the enzyme is changed. The degree or extent of the change in enzyme activity is an indication of the concentration of the labeled ligand in the bound fraction and consequently provides a concentration index of the ligand in the reaction mixture.
Die chemische Struktur des Ligand-Enzym-Komplexes ist extrem schwer zu ermitteln, und dies ist ein Hauptnachteil des Enzymimmuntests. Dies beruht zweifellos auf der grossen Vielfalt der Aminosäureseitenketten, die auf der Enzymoberfläche zur Komplexbildung mit dem Liganden zur Verfügung stehen. Dies führt zu grossen Schwierigkeiten beim Reproduzieren des Ligand-Enzyms bei verschiedenen Herstellungen des Komplexes. Das allgemeine Fehlen der Steuerung der Komplexierungsreaktion führt zur Bindung vieler Liganden-moleküle an ein einziges Enzymmolekül, obgleich es leicht sein kann, dass die Bindung nur einiger weniger dieser Ligan-denmoleküle durch Antikörper an der Hemmung der Enzymaktivität beteiligt ist. Daher führen nicht alle Antikörpermarkierte Antigen-Wechselwirkungen zu einer Veränderung der Enzymaktivität, wodurch die Empfindlichkeit dieser Technik gemindert wird. The chemical structure of the ligand-enzyme complex is extremely difficult to determine, and this is a major disadvantage of the enzyme immunoassay. This is undoubtedly due to the large variety of amino acid side chains that are available on the enzyme surface for complex formation with the ligand. This leads to great difficulties in reproducing the ligand enzyme in various preparations of the complex. The general lack of control over the complexation reaction results in the binding of many ligand molecules to a single enzyme molecule, although it may be easy for antibodies to inhibit enzyme activity by binding only a few of these ligand molecules. Therefore, not all antibody-labeled antigen interactions lead to a change in enzyme activity, which reduces the sensitivity of this technique.
Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen verschiedenen Antikörpermolekülen und Antikörper- und Enzymmolekülen ist eine weitere Folge der Vielfalt der Ligandenmoleküle an der Enzymoberfläche. Protein-Protein-Wechselwirkung nimmt ferner zu, wenn der Ligand ebenfalls ein Polypeptid ist. Somit induziert das Enzymmolekül eine örtlich begrenzte Mikroumgebung hoher Proteinkonzentration. In solchen Situationen wurde gezeigt, dass Proteinausfällung eintritt, wodurch der Verlust eines der Hauptvorteile des Enzymimmuntestes verursacht wird, indem nämlich die Trennung von antikörpergebundenen und freien Fraktionen notwendig wird. Protein-protein interaction between different antibody molecules and antibody and enzyme molecules is another consequence of the diversity of the ligand molecules on the enzyme surface. Protein-protein interaction also increases when the ligand is also a polypeptide. The enzyme molecule thus induces a localized microenvironment of high protein concentration. In such situations, it has been shown that protein precipitation occurs, causing the loss of one of the main advantages of the enzyme immunoassay by requiring the separation of antibody-bound and free fractions.
Es wurde eine Abwandlung des Enzymimmuntests beschrieben, die diese Probleme teilweise überwindet, indem nämlich der Ligand mit einem Detektormolekül niedrigen Molekulargewichts markiert wird. Bei diesem Test hindert die Antikörperbindung des markierten Liganden sterisch die Bindung eines Detektormoleküls durch einen anderen, für das Detektormolekül spezifischen Antikörper. Das Ausmass der Hinderung wird durch die Konkurrenz um die Bindung des freien Liganden-Detektor-Moleküls und des mit dem Detektormolekül markierten Enzyms mit Detektormolekül-Antikör-per bestimmt. Der Grad der Veränderung der Enzymaktivität, wie er beim normalen Enzymimmuntest bestimmt wird, gibt einen Hinweis auf die Konzentration an freiem Ligand-Detektor-Molekül, was wiederum auf die Konzentration des Liganden im Reaktionsgemisch hinweist. A modification of the enzyme immunoassay has been described which partially overcomes these problems by labeling the ligand with a low molecular weight detector molecule. In this test, the antibody binding of the labeled ligand sterically prevents the binding of one detector molecule by another antibody specific for the detector molecule. The extent of the hindrance is determined by the competition for the binding of the free ligand-detector molecule and the enzyme labeled with the detector molecule with the detector molecule antibody. The degree of change in enzyme activity, as determined in the normal enzyme immunoassay, gives an indication of the concentration of free ligand detector molecule, which in turn indicates the concentration of the ligand in the reaction mixture.
Der Vorteil dieser Technik liegt darin, dass ein kleines Molekül anstelle eines Enzyms an den Liganden gebunden ist, was es zulässt, die chemische Struktur des markierten Liganden zu bestimmen und damit viele der früher beschriebenen Nachteile des Enzymimmuntestes zu überwinden. Dieses System überwindet jedoch nur die Nachteile der primären Bindungsreaktion, an der der Ligand und der markierte Ligand beteiligt sind, und überträgt sie auf das Detektorsystem zur Bestimmung des Ausmasses der antikörpergebundenen und antikörperfreien Anteile des markierten Liganden. The advantage of this technique is that a small molecule is bound to the ligand instead of an enzyme, which allows the chemical structure of the labeled ligand to be determined, thereby overcoming many of the disadvantages of the enzyme immunoassay previously described. However, this system only overcomes the disadvantages of the primary binding reaction involving the ligand and the labeled ligand and transfers them to the detector system to determine the extent of the antibody-bound and antibody-free portions of the labeled ligand.
Die Nachteile der Verfahren nach dem Stand der Technik werden durch die Erfindung überwunden, wonach als Markierung eine Enzymmodifizierung verwendet wird. The disadvantages of the methods according to the prior art are overcome by the invention, according to which an enzyme modification is used as the label.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials in einer Probe, wobei die Probe mit einem Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, dem mit einer Substanz, das die Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag, markierten immunologisch aktiven Material, einem Enzym und einem Enzymsubstrat zusammengebracht wird, und wobei der Grad oder die Art der anfallenden Enzymaktivität gemessen und mit der mit einem Standard erhaltenen verglichen wird. The invention relates to a method for determining an immunologically active material in a sample, the sample being labeled with a receptor which is capable of specifically binding the immunologically active material, the immunologically active material which is labeled with a substance which is capable of modifying the activity of an enzyme , an enzyme and an enzyme substrate, and the degree or type of enzyme activity obtained is measured and compared with that obtained with a standard.
Eine Ausgestaltung des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass das immunologisch aktive Material in unlöslich gemachter Form mit einem Enzym und einem Enzymsubstrat zusammengebracht wird, wobei der Grad oder die Art der Enzymaktivität nach der Abtrennung der festen Phase gemessen und mit der mit einem Standard erhaltenen verglichen wird. One embodiment of the method according to the invention is that the immunologically active material is brought together in an insolubilized form with an enzyme and an enzyme substrate, the degree or type of enzyme activity being measured after the solid phase has been separated off and compared with that obtained with a standard .
Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Reagens zur Durchführung des Verfahrens, welches das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, markiert mit einer Substanz, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag. The invention further relates to a reagent for carrying out the method, which is able to bind the immunologically active material specifically, labeled with a substance which is able to modify the degree or the type of activity of an enzyme.
Die Begriffe «immunologisch aktives Material» oder «Ligand» in dieser Beschreibung beziehen sich auf irgendeine immunologisch aktive Substanz oder einen Teil von dieser, die bzw. der immunologsich bestimmbar ist, z.B. durch Anwendung der Techniken der Sättigungsanalyse. Wesentliches Erfordernis ist, dass ein Rezeptor vorliegt, der den Liganden spezifisch bindet. Ist der Rezeptor ein Antikörper, so ist der Ligand ein Hapten oder Antigen, so dass ein spezifischer Antikörper entstehen kann. Ein Ligand wird als Hapten bezeichnet, wenn er Antikörperbildung nur bei Bindung an eine Verbindung mit Antigeneigenschaften hervorruft. Andererseits wird ein Ligand als Antigen bezeichnet, wenn er Antikörperbildung ohne chemische Abwandlung zeigt. Der Ligand kann im Molekulargewicht stark variieren, von etwa 100 bis 1000000. Dieser Molekulargewichtsbereich setzt beim Test keine Grenzen, vorausgesetzt, es steht ein Rezeptor zur Verfügung, der den Liganden spezifisch bindet. The terms "immunologically active material" or "ligand" in this specification refer to any or part of an immunologically active substance that is immunologically determinable, e.g. using techniques of saturation analysis. An essential requirement is that there is a receptor that specifically binds the ligand. If the receptor is an antibody, the ligand is a hapten or antigen, so that a specific antibody can arise. A ligand is called a hapten if it only produces antibodies when bound to a compound with antigenic properties. On the other hand, a ligand is called an antigen if it shows antibody formation without chemical modification. The ligand can vary widely in molecular weight, from about 100 to 1,000,000. This molecular weight range does not set any limits in the test, provided that a receptor is available which specifically binds the ligand.
Der Ligand kann strukturell entweder polymer oder nicht-polymer sein. Ist er polymer, wird er gewöhnlich biologischen Ursprungs sein und als Nucleinsäurepolysaccharid und/oder -polypeptid zu klassifizieren sein. Ist der Ligand andererseits nicht-polymer, hat er im allgemeinen ein Molekulargewicht von weniger als 2000 und kann zahlreiche Strukturen, Funktionalitäten und physiologische Eigenschaften aufweisen. The ligand can be structurally either polymeric or non-polymeric. If polymeric, it will usually be of biological origin and classified as a nucleic acid polysaccharide and / or polypeptide. On the other hand, if the ligand is non-polymeric, it generally has a molecular weight of less than 2000 and can have numerous structures, functionalities and physiological properties.
Besonders wichtige Liganden sind Amine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine, Sterine, Steroide, Lipoide, Nucleinsäuren, Mono- und Polysaccharide, Alkaloide, Vitamine, Drogen, Narkotika, Antibiotika, Stoffwechselprodukte, Pesticide, Toxine, Industrieverunreinigungen, Geschmacks- und Aromamittel, Hormone, Enzyme, Coenzyme, zelluläre oder extrazelluläre Gewebekomponenten und aus Menschen oder Tieren isolierte Antikörper. Der Test ist jedoch nicht auf nur diese Liganden beschränkt. Particularly important ligands are amines, amino acids, peptides, proteins, lipoproteins, glycoproteins, sterols, steroids, lipoids, nucleic acids, mono- and polysaccharides, alkaloids, vitamins, drugs, narcotics, antibiotics, metabolites, pesticides, toxins, industrial contaminants, taste and Flavoring agents, hormones, enzymes, coenzymes, cellular or extracellular tissue components and antibodies isolated from humans or animals. However, the test is not limited to these ligands only.
Komponenten mit unmittelbarer Möglichkeit zur Analyse mit dem System sind Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen, Ferritin, Tumor-Antigene, wie CEA, a-Fetoprotein, Rheumatoid-Faktor, C-reaktive Proteine, Immunoglobulin-Klassen IgG, IgM oder IgA, Myoglobulin, Thyroidhormone einschliesslich T3 und T», Insulin, Steroidhormone, einschliesslich Testosteron oder Östradiol, missbrauchgefährdete Arzneimttel, wie narkotisierende Analgetika, wie Morphin, Barbiturate, Stimu-lantien, wie Amphetamin, Arzneimittel zur Behandlung von Epilepsie, einschliesslich Diphenylhydantoin und Phenobar-bitural, Herzglykozyten, wie Digoxin, Vitamine, wie Vitamin Bj2 und Folsäure. Weiter sind Antikörper, die der Analyse mit dem System unmittelbar zugänglich sind, solche, die mit einer Components with an immediate possibility for analysis with the system are hepatitis B surface antigen, ferritin, tumor antigens such as CEA, a-fetoprotein, rheumatoid factor, C-reactive proteins, immunoglobulin classes IgG, IgM or IgA, myoglobulin , Thyroid hormones including T3 and T », insulin, steroid hormones, including testosterone or estradiol, abuse-prone medicines, such as narcotic analgesics such as morphine, barbiturates, stimulants, such as amphetamine, medicines for the treatment of epilepsy, including diphenylhydrogenoin and phenobarco-glycerin, and cardiac glycosylamine like digoxin, vitamins like vitamin Bj2 and folic acid. Antibodies that are directly accessible for analysis with the system are also antibodies that are available with a
Infektion durch Syphillis, Gonorrhöe, Brucellose, Rubella und Rheumatismus verbunden sind. Infection associated with syphillis, gonorrhea, brucellosis, rubella and rheumatism.
Der Begriff «markiertes immunologisch aktives Material» oder «markierter Rezeptor» in der vorliegenden Beschreibung bezieht sich auf einen Liganden, ein Analogon eines Liganden oder dessen Teil oder einen Rezeptor, der mit einem Enzymabwandler markiert ist. Ein, mehr als ein und im allgemeinen weniger als 100 Markierungsmolekül(e) können an einem Liganden oder einem Rezeptormolekül befestigt sein. Ähnlich können ein, mehr als ein und gewöhnlich weniger als 5 Liganden- oder Rezeptor-Molekül(e) an einem Markierungsmolekül befestigt sein. Die Verknüpfung gesonderter Markierungsmoleküle mit einem Liganden- oder Rezeptor-Molekül erhöht im allgemeinen die Empfindlichkeit des Tests, vorausgesetzt, die Sondermarkierungen beeinträchtigen nicht die Bindung. The term “labeled immunologically active material” or “labeled receptor” in the present description refers to a ligand, an analogue of a ligand or its part or a receptor that is labeled with an enzyme modifier. One, more than one and generally less than 100 labeling molecule (s) can be attached to a ligand or a receptor molecule. Similarly, one, more than one and usually less than 5 ligand or receptor molecule (s) may be attached to a label molecule. Linking separate labeling molecules to a ligand or receptor molecule generally increases the sensitivity of the test, provided the special labels do not interfere with binding.
Die Verknüpfung eines modifizierenden Moleküls mit einem Liganden- oder Rezeptor-Molekül beinhaltet die Ausbildung intermolekularer Bindungen, die meist, aber nicht notwendigerweise, von kovalenter Natur sind. Die Verknüpfung kann zuweilen in Gegenwart eines Kupplungsmittels durch Einschub einer verbindenden Gruppe zwischen der Markierung und dem Liganden oder dem Rezeptor erfolgen. Linking a modifying molecule to a ligand or receptor molecule involves the formation of intermolecular bonds that are mostly, but not necessarily, covalent in nature. The linkage can sometimes take place in the presence of a coupling agent by inserting a connecting group between the label and the ligand or the receptor.
Das modifizierende Molekül kann direkt an den Liganden oder das Rezeptor-Molekül gebunden werden. Es kann jedoch wünschenswert sein, chemische Brücken unterschiedlicher Länge zwischen dem modifizierenden Molekül und den Liganden- oder Rezeptor-Molekülen einzubauen, in Abhängigkeit von dem jeweils speziell ins Auge gefassten Test. Manchmal kann es sogar vorteilhaft sein, das modifizierende Molekül und die Liganden- oder Rezeptor-Moleküle getrennt an dasselbe Trägermolekül zu binden, z.B. ein Makromolekül, wie ein Polypeptid oder ein Polysaccharid. The modifying molecule can be linked directly to the ligand or the receptor molecule. However, it may be desirable to incorporate chemical bridges of different lengths between the modifying molecule and the ligand or receptor molecules, depending on the particular test envisaged. Sometimes it may even be advantageous to bind the modifying molecule and the ligand or receptor molecules separately to the same carrier molecule, e.g. a macromolecule, such as a polypeptide or a polysaccharide.
Der hier gebrauchte Ausdruck «Rezeptor» bezieht sich auf jede Substanz, die einen Liganden oder einen markierten Liganden oder einen Teil hiervon spezifisch zu binden vermag. Im allgemeinen ist der beim Test verwendete Rezeptor ein spezifischer Antikörper zu dem im Blut von Vertebraten nach Injektion eines geeigneten Haptens oder Antigens gebildeten Liganden. Andererseits können bei dem Test auch natürlich vorkommende Rezeptoren eingesetzt werden. Diese letztere Gruppe umfasst, ohne hierauf zu beschränken, Proteine, Nucleinsäuren und Zellmembranen. Solche Rezeptoren wurden bei Radioaktivtest-Techniken für Thyroxin, Insulin, Angiotensin und verschiedene Steroidhormone verwendet. The term “receptor” used here refers to any substance that is capable of specifically binding a ligand or a labeled ligand or a part thereof. In general, the receptor used in the test is a specific antibody to the ligand formed in the blood of vertebrates after the injection of a suitable hapten or antigen. On the other hand, naturally occurring receptors can also be used in the test. This latter group includes, but is not limited to, proteins, nucleic acids, and cell membranes. Such receptors have been used in radioactive test techniques for thyroxine, insulin, angiotensin and various steroid hormones.
Für den Fall, dass der Ligand ein Antikörper ist, kann der Rezeptor das zum Induzieren des Antikörpers in einem Wirtstier verwendete Antigen sein. Bei einer anderen Ausführungsform kann der Rezeptor ein Antikörper gegen den zu bestimmenden Antikörper sein. In the event that the ligand is an antibody, the receptor may be the antigen used to induce the antibody in a host animal. In another embodiment, the receptor can be an antibody against the antibody to be determined.
Es ist unmöglich, mit Gewissheit die Art der Rezeptorwirkung zu bestimmen, die bei Bindung des markierten Liganden die Wechselwirkung zwischen Enzym und modifizierendem Molekül herabsetzt. Die plausibelste Erklärung ist die, dass die Affinität des Enzyms für das modifizierende Molekül als Folge einer Änderung in Grösse und Ladung des Komplexes Rezeptor-Liganden-Abwandler im Vergleich zum Liganden-anwandler alleine herabgesetzt ist. It is impossible to determine with certainty the type of receptor action which, when the labeled ligand binds, reduces the interaction between the enzyme and the modifying molecule. The most plausible explanation is that the affinity of the enzyme for the modifying molecule is reduced as a result of a change in the size and charge of the complex receptor-ligand-modifier compared to the ligand-modifier alone.
Der Begriff «modifizierende Substanz» oder «Abwand-ler» in der vorliegenden Beschreibung bezieht sich auf jede Substanz, die mit einem Enzym so in Wechselwirkung zu treten vermag, dass das Ausmass bzw. der Grad oder die Art der Enzymaktivität modifiziert oder abgewandelt wird. Diese Modifizierung kann zu einer Hemmung, Aktivierung oder einer Veränderung der Spezifität oder irgendeiner anderen Eigenschaft des Enzyms führen, das entweder direkt oder indirekt durch eine Änderung der Enzymaktivitäten oder in der Art der Aktivität nachweisbar ist, z.B. einer Änderung der The term “modifying substance” or “modifier” in the present description refers to any substance that is able to interact with an enzyme in such a way that the extent or the degree or the type of enzyme activity is modified or modified. This modification can lead to inhibition, activation or a change in the specificity or any other property of the enzyme which is detectable either directly or indirectly by a change in the enzyme activities or in the type of activity, e.g. a change in
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Reaktionsbedingungen wie Kofaktor-Anforderungen oder pH-Optimum, der kinetischen Eigenschaften oder der Aktivierungsenergie. Die modifizierende Substanz kann in der Grösse zwischen einem kleinen Molekül und einem Makromolekül liegen, und ihre Wechselwirkung mit einem Enzymmolekül kann entweder reversibel oder irreversibel sein, in Abhängigkeit davon, ob die intermolekulare Assoziation ionisch oder von kovalenter Natur ist. Reaction conditions such as cofactor requirements or pH optimum, the kinetic properties or the activation energy. The modifying substance can range in size from a small molecule to a macromolecule, and its interaction with an enzyme molecule can be either reversible or irreversible, depending on whether the intermolecular association is ionic or covalent in nature.
Die Empfindlichkeit des Tests hängt u.a. ab von der Affinität des Rezeptors für den Liganden und der Fähigkeit der modifizierenden Substanz, eine Änderung im Grad der Art der Enzymaktivität hervorzurufen. Vorzugsweise erfolgt eine Modifizierung des Ausmasses oder der Art der Enzymaktivität mit einer Minimalkonzentration an modifizierender Substanz. Je näher diese Konzentration bei der des Enzyms auf molekularer Basis liegt, um so grösser ist die Empfindlichkeit des Tests. The sensitivity of the test depends, among other things. depends on the affinity of the receptor for the ligand and the ability of the modifying substance to cause a change in the degree of the type of enzyme activity. The extent or type of enzyme activity is preferably modified with a minimum concentration of modifying substance. The closer this concentration is to that of the enzyme on a molecular basis, the greater the sensitivity of the test.
Vorzugsweise ist die modifizierende Substanz ein Enzymhemmstoff, der bei Wechselwirkung mit einem Enzym dessen Aktivität hemmt. Die Wirkungsweise des Hemmstoffs kann kompetitiv, nicht-kompetitiv, unkompetitiv und/oder allo-sterisch sein. Vorzugsweise sollte der Hemmstoff oder Inhibitor eine Hemmkonstante (Hemmstoffkonzentration, die für 50%ige Hemmung des Enzymsystems notwendig ist) unter 10~3 Mol/1, je nach dem durchgeführten Test, haben. Insbesondere bevorzugt liegt die Hemmkonstante zwischen 10~15 und 10"5. The modifying substance is preferably an enzyme inhibitor which, when interacting with an enzyme, inhibits its activity. The mode of action of the inhibitor can be competitive, non-competitive, non-competitive and / or all-steric. Preferably, the inhibitor or inhibitor should have an inhibition constant (inhibitor concentration necessary for 50% inhibition of the enzyme system) below 10 -3 mol / 1, depending on the test performed. The inhibition constant is particularly preferably between 10 ~ 15 and 10 "5.
Bei dem Test kann jedes Enzym verwendet werden, vorausgesetzt, es gibt ein modifizierendes Mittel, das die Enzymaktivität in der oben beschriebenen Weise spezifisch modifiziert. Enzyme der Wahl sind stabil, leicht mit geringen Kosten erhältlich und haben einen hohe Wechselzahl und ein einfach durchgeführtes Testsystem. Vorzugsweise liegt die Wechselzahl (pro Enzymmolekül in 1 min gebildete Produktmoleküle) über 100, je nach dem speziell durchgeführten Test. Insbesondere bevorzugt liegt die Wechselzahl so hoch wie möglich und wenigstens bei 200. Any enzyme can be used in the assay, provided there is a modifying agent that specifically modifies enzyme activity in the manner described above. Enzymes of choice are stable, easily available at low cost, have a high number of changes and a simple test system. The number of changes (product molecules formed in 1 min per enzyme molecule) is preferably over 100, depending on the test carried out specifically. The number of changes is particularly preferably as high as possible and at least 200.
Enzymmodifizierende Systeme, die erfindungsgemäss besonders brauchbar sind, sind Dihydrofolat-Reduktase/ Methotrexat, Dihydrofolat-Reduktase/4-Aminopterin, Dihy-drofolat-Reduktase/andere spezifische Inhibitoren dieses Enzyms, ß-Glucuronidase/4-Desoxy-5-amino-zuckersäure und deren Derivate, biotinhaltige Enzyme/Avidin, wie Carboxylase/Avidin, Chymotrypsin/TPCK Enzyme-modifying systems which are particularly useful according to the invention are dihydrofolate reductase / methotrexate, dihydrofolate reductase / 4-aminopterin, dihydrofolate reductase / other specific inhibitors of this enzyme, β-glucuronidase / 4-deoxy-5-amino-sugar acid and their derivatives, biotin-containing enzymes / avidin, such as carboxylase / avidin, chymotrypsin / TPCK
S0o-HH-C-C —CH«C1 S0o-HH-C-C -CH «C1
CE CE
y-Cystathionase/Propargylglycin, Alanin-Racemase/Tri-fluoralanin, Tryptophanase/Trifluoralanin, Tryptophan-Synthetase/Trifluoralanin, ß-Cystathionase/Trifluoralanin, Pyruvat-Glutamat-Transaminase/Trifluoralanin, Milchsäure-Oxidase/2-Hydroxy-3-butinsäure, Monoamin-Oxidase/ N,N-Dimethyl-propargyl-amin und Diamin-Oxidase/ H2N-CH-C = C-CH2-NH2. y-cystathionase / propargylglycine, alanine racemase / tri-fluoroalanine, tryptophanase / trifluoralanine, tryptophan synthetase / trifluoralanine, ß-cystathionase / trifluoralanine, pyruvate-glutamate-transaminase / trifluoroacid-oxidase, 3-lactic acid oxidase, 3-lactic acid oxidase, 2-lactic acid oxidase, 3-lactic acid oxidase, 2-lactic acid oxidase, 2-lactic acid oxidase, 2-lactic acid oxidase, 2-lactic acid oxidase, Monoamine oxidase / N, N-dimethyl-propargylamine and diamine oxidase / H2N-CH-C = C-CH2-NH2.
Die Bestimmung der Enzymaktivitäten kann durch direkte oder indirekte Aufzeichnung des Substratverbrauches oder der Produktbildung bei geeigneten pH und geeigneter Temperatur unter Anwendung von Nachweissystemen wie der Koloriemetrie, Spektrophotometrie, Fluoreszenz-Spektro-photometrie, Gaseometrie, Thermometrie (Wärmetönung), Szintillationszählung, erfolgen. The enzyme activities can be determined by direct or indirect recording of substrate consumption or product formation at a suitable pH and temperature using detection systems such as colorimetry, spectrophotometry, fluorescence spectrophotometry, gasometry, thermometry (toning), scintillation counting.
Um die Empfindlichkeit des Systems zu steigern, können Biolumineszenz- und Enzymzyklus-Techniken angewandt werden, z.B. die Techniken, wie sie beschrieben wurden von J. Lee et al. in Liquid Scintillation Counting: Recent Developments, Stanley P.E. und Scoggins, B.A., Academic Press, New York, S. 403 und Lowry O.H. et al. in J. Biol. Chem. 236. S. 2746-2755. To increase the sensitivity of the system, bioluminescence and enzyme cycle techniques can be used, e.g. the techniques as described by J. Lee et al. in Liquid Scintillation Counting: Recent Developments, Stanley P.E. and Scoggins, B.A., Academic Press, New York, p. 403 and Lowry O.H. et al. in J. Biol. Chem. 236. pp. 2746-2755.
Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens kann ein markierter Ligand zur Bestimmung der Anwesenheit eines Liganden in einer unbekannten Probe durch gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Zugabe des markierten Liganden und der unbekannten Probe zu einem wässrigen Medium bei geeignetem pH und mit einem Gehalt an für den Liganden und den markierten Liganden spezifischem Rezeptor verwendet werden. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird die Verteilung des an den Liganden und den markierten Liganden gebundenen Rezeptors durch Zusatz von Enzym und Substraten bestimmt. Der Rezeptor, der für den Liganden spezifisch ist, bindet auch den markierten Liganden und setzt damit die Wechselwirkung zwischen dem modifizierenden Mittel und dem Enzym herab und vermindert so die Abwandlung der Enzymaktivität. Der Zusatz des Liganden bei dem Test führt zur Konkurrenz mit dem markierten Liganden bei der Bindung an den Rezeptor und setzt dadurch die Konzentration an friem Liganden in der Probe herab. Die Wechselwirkung zwischen Ligand/modifi-zierendem Mittel und Enzym nimmt zu und die Enzymaktivität wird wiederum beeinträchtigt. Die Veränderung der Enzymaktivität ist daher eine Funktion der Ligandenkonzen-tration in der Probe und wird durch ungebundenen markierten Liganden verursacht. Folglich ist der Unterschied zwischen der erhaltenen Enzymaktivität und der in Abwesenheit des Liganden erhaltenen Aktivität ein Hinweis auf die Konzentration des Liganden in der unbekannten Probe. In one embodiment of the method according to the invention, a labeled ligand can be used to determine the presence of a ligand in an unknown sample by simultaneously or successively adding the labeled ligand and the unknown sample to an aqueous medium at a suitable pH and with a content of for the ligand and the labeled one Ligand specific receptor can be used. After a suitable incubation period, the distribution of the receptor bound to the ligand and the labeled ligand is determined by adding enzyme and substrates. The receptor, which is specific for the ligand, also binds the labeled ligand, thereby reducing the interaction between the modifying agent and the enzyme and thus reducing the variation in enzyme activity. The addition of the ligand in the test competes with the labeled ligand in binding to the receptor and thereby reduces the concentration of free ligand in the sample. The interaction between ligand / modifying agent and enzyme increases and the enzyme activity is in turn impaired. The change in enzyme activity is therefore a function of the ligand concentration in the sample and is caused by unbound labeled ligands. Thus, the difference between the enzyme activity obtained and the activity obtained in the absence of the ligand is an indication of the concentration of the ligand in the unknown sample.
Einer der Hauptvorteile dieses Verfahrens liegt darin, One of the main advantages of this process is
dass eine Trennung gebundener und freier Anteile bei der Arbeitsweise unnötig ist. Dies schliesst jedoch die Anwendung einer solchen Trennstufe bei dem Test nach der Inkubation von Ligand und markiertem Ligand mit dem Rezeptor und vor der Abschätzung der Enzymaktivität nicht aus. Eine Trennung der Anteile oder Fraktionen kann zuweilen wünschenswert sein, um Substanzen in der Probe zu entfernen, die den Enzymtest stören können. Die Trennung kann unter Anwendung irgendeiner der vielen für den Radioimmuntest beschriebenen Techniken, einschliesslich Gelfiltration, Adsorption und Ionenaustauschchromatographie, fraktionierter Fällung, fester Phase und Elektrophorese, durchgeführt werden. Dieser Test ist natürlich nicht auf die Bestimmung von Haptenen und Antigenen als Ligand beschränkt, sondern kann auch zur Identifizierung und Messung von Antikörpern als Ligand angepasst werden. that a separation of bound and free shares in the way of working is unnecessary. However, this does not exclude the use of such a separation step in the test after the incubation of ligand and labeled ligand with the receptor and before the estimation of the enzyme activity. Separation of the fractions or fractions may sometimes be desirable in order to remove substances in the sample which can interfere with the enzyme test. The separation can be performed using any of the many techniques described for the radioimmunoassay, including gel filtration, adsorption and ion exchange chromatography, fractional precipitation, solid phase, and electrophoresis. Of course, this test is not limited to the determination of haptens and antigens as ligands, but can also be adapted to identify and measure antibodies as ligands.
Dies kann z.B. durch Markieren des Antikörpers mit einem Enzym modifizierenden Mittel und Messen des Grades der Veränderung der Enzymaktivität nach Inkubation des markierten Antikörpers und des Antikörpers der Probe mit einer begrenzten Konzentration an Antigen oder Hapten geschehen. Die Abwandlung oder Veränderung der Enzymaktivität hängt mit der Konzentration des Antikörpers der Probe zusammen. Wenn nötig, können die gebundenen und freien Anteile vor Zugabe des Enzyms und des Substrats getrennt werden. This can e.g. by labeling the antibody with an enzyme modifier and measuring the degree of change in enzyme activity after incubation of the labeled antibody and the antibody of the sample with a limited concentration of antigen or hapten. The change or change in enzyme activity is related to the concentration of the antibody in the sample. If necessary, the bound and free portions can be separated before adding the enzyme and the substrate.
Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht zur Bestimmung eines Liganden auch die Verwendung eines markierten Rezeptors anstelle eines markierten Liganden. Ein Ligand in der unbekannten Probe reagiert mit überschüssigem Rezeptor, der mit einem enzymmodifizierenden Mittel markiert ist, und nach der Inkubation wird überschüssiger unlöslich gemachter Festphasenligand zugesetzt und reagiert mit dem übrigen freien markierten Rezeptor. Nach Abtrennung der festen Phase wird die Veränderung der Enzymaktivität, die The method according to the invention also makes it possible to use a labeled receptor instead of a labeled ligand to determine a ligand. A ligand in the unknown sample reacts with excess receptor labeled with an enzyme modifying agent and, after incubation, excess insolubilized solid phase ligand is added and reacts with the remaining free labeled receptor. After separation of the solid phase, the change in enzyme activity, the
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
c5 c5
641 570 641 570
6 6
mit dem löslichen Liganden verbunden ist, gemessen und auf die Ligandenkonzentration bezogen. is connected to the soluble ligand, measured and based on the ligand concentration.
Die erforderlichen Reagentien können auch in einer «Sandwich»-Technik verwendet werden, vorausgesetzt, der Ligand besitzt wenigstens zwei Verknüpfungsstellen. Der Ligand reagiert mit überschüssigem Festphasen-Rezeptor, und nach der Inkubation mit anschliessendem Waschen wird der Festphasen-Rezeptor/Ligand mit überschüssigem Rezeptor, der mit einem enzymmodifizierenden Mittel markiert ist, umgesetzt. Freier markierter Rezeptor wird durch Waschen entfernt, und das Ausmass der Enzymabwandlung in den abgetrennten Fraktionen wird bestimmt. Dies ergibt dann einen Index der Ligandenkonzentration. The required reagents can also be used in a "sandwich" technique, provided that the ligand has at least two attachment points. The ligand reacts with excess solid phase receptor, and after incubation with subsequent washing, the solid phase receptor / ligand is reacted with excess receptor that is labeled with an enzyme-modifying agent. Free labeled receptor is removed by washing and the extent of enzyme change in the separated fractions is determined. This then gives an index of the ligand concentration.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. The following examples illustrate the invention.
Beispiel 1 example 1
Herstellung von « Amino-digoxin» Production of «Amino digoxin»
Zu einer Suspension von 156 mg (0,2 mMol) Digoxin in 5 ml absolutem Äthanol wurden 10 ml 0,2 m Natriummetaper-jodat unter Rühren gegeben. Das Gemisch wurde nach 10 min homogen, und dann bildete sich langsam ein Niederschlag. Nach 2 h wurden 5 ml Wasser und 5 ml Äthanol zugesetzt. 122 jil (2,2 mMol) Äthylenglykol wurden nach weiteren 30 min zugesetzt, und ein dichter weisser Niederschlag begann sich sofort zu bilden. Nach 80 min Rühren wurden 133 ji.1 (2,0 mMol) Äthylendiamin zugesetzt, und der sich ergebende pH von 11,0 wurde auf 9,5 mit 0,1 m HCl eingestellt, und das Reaktionsgemisch konnte 18 h bei Raumtemperatur stehen. Der pH veränderte sich während dieser Zeit nicht. 10 ml of 0.2 M sodium metaperiodate were added to a suspension of 156 mg (0.2 mmol) of digoxin in 5 ml of absolute ethanol while stirring. The mixture became homogeneous after 10 minutes and then a precipitate slowly formed. After 2 hours, 5 ml of water and 5 ml of ethanol were added. 122 ml (2.2 mmol) of ethylene glycol was added after a further 30 min and a dense white precipitate began to form immediately. After stirring for 80 min, 133 ml of (2.0 mmol) ethylenediamine was added and the resulting pH of 11.0 was adjusted to 9.5 with 0.1 M HCl and the reaction mixture was allowed to stand at room temperature for 18 h. The pH did not change during this time.
151,4 mg (4,0 mMol) Natriumborhydrid wurden dann zugegeben, und das Gemisch wurde 3,5 h gerührt. Der pH wurde dann von 10,5 auf 6,5 mit 1 m Ameisensäure (etwa 3 ml) eingestellt, und ein Dünnschichtchromatogramm dieses Gemischs zeigte einen einzigen Hauptfleck mit einen Rf-Wert von 0,15 (Kieselgel auf Aluminium, entwickelt in Butanol/ Essigsäure/Wasser 4:1:1). Digoxin hatte einen Rf-Wert von 0,7 bei Entwicklung im gleichen System. 151.4 mg (4.0 mmol) of sodium borohydride was then added and the mixture was stirred for 3.5 h. The pH was then adjusted from 10.5 to 6.5 with 1 M formic acid (about 3 ml) and a thin layer chromatogram of this mixture showed a single main spot with an Rf value of 0.15 (silica gel on aluminum, developed in butanol / Acetic acid / water 4: 1: 1). Digoxin had an Rf of 0.7 when developed in the same system.
Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer mit einem Wasserbad bei 60° nahezu bis zur Trockne abgedampft. Die letzten wenigen ml Wasser wurden durch Zugabe von 95%igem Äthanol (3 x 20 ml) und Wiederholen des vorstehenden Abdampfens entfernt. The solvents were evaporated to dryness under vacuum in a rotary evaporator with a water bath at 60 °. The last few ml of water were removed by adding 95% ethanol (3 x 20 ml) and repeating the above evaporation.
Der anfallende blassgelbe Feststoff wurde dreimal mit absolutem Äthanol extrahiert, und diese vereinigten Extrakte wurden auf etwa 4 ml aufkonzentriert und zentrifugiert, um eine kleine Menge Salz abzutrennen, die verworfen wurde. Die blassgelbe überstehende Lösung wurde unter einem Strom trocknen Stickstoffs bis zur Trockne eingedampft, um ein gelbes Öl zu erhalten, das den gleichen Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie wie das oben beschriebene Reaktionsgemisch zeigte. Das Produkt erwies sich als eine freie Aminogruppe enthaltend, indem es mit Fluram (4-Phenylspiro[fluran-2(3H),l'-phthalan]-3,3'-dion) zu einer intensiv fluoreszierenden Verbindung umgesetzt wurde. Das Produkt zeigte ein Spektrum in konzentrierter Schwefelsäure, das dem von Digoxin ähnlich war, mit Absorptionspeaks bei 385 und 495 nm (m|i). Das Produkt zeigte auch eine starke Affinität zu Antiseren (Kaninchen), die für Digoxin spezifisch sind. The resulting pale yellow solid was extracted three times with absolute ethanol and these combined extracts were concentrated to about 4 ml and centrifuged to separate a small amount of salt which was discarded. The pale yellow supernatant solution was evaporated to dryness under a stream of dry nitrogen to give a yellow oil which showed the same Rf on thin layer chromatography as the reaction mixture described above. The product was found to contain a free amino group by reacting it with fluram (4-phenylspiro [fluran-2 (3H), l'-phthalan] -3,3'-dione) to form an intensely fluorescent compound. The product showed a spectrum in concentrated sulfuric acid similar to that of digoxin, with absorption peaks at 385 and 495 nm (m | i). The product also showed a strong affinity for antisera (rabbits) that are specific for digoxin.
Beispiel 2 Example 2
Herstellung Methotrexat-Aminodigoxin-Konjugat Preparation of methotrexate-aminodigoxin conjugate
11 mg Methotrexat wurden in 5 ml H2O gelöst und auf pH 6,5 eingestellt. 10 mg «Aminodigoxin» wurden in dieser Lösung gelöst, und das Volumen wurde mit H2O auf 20 ml eingestellt. Der pH wurde erneut auf 6,5 eingestellt und 484 mg N-Äthyl-N"-(3-dimethylamino)propyl-carbodiimid- 11 mg of methotrexate were dissolved in 5 ml of H2O and adjusted to pH 6.5. 10 mg "aminodigoxin" was dissolved in this solution and the volume was adjusted to 20 ml with H2O. The pH was again adjusted to 6.5 and 484 mg of N-ethyl-N "- (3-dimethylamino) propyl-carbodiimide-
Hydrochlorid, gelöst in 5 ml H2O, wurden zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Der pH wurde für 24 h bei Raumtemperatur bei 6,2 gehalten. Das Konjugal wurde an einer Kieselgelsäule unter Verwendung von 3%igem Ammoniumeitrat als Solvens gereinigt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zeigten das zweifache Vermögen, Antiseren (Kaninchen), die für Digoxin spezifisch sind, stark zu binden und auch das Enzym Dihydrofolat-Reduktase (Hühnerleber) stark zu hemmen. Hydrochloride dissolved in 5 ml of H2O was added to the reaction mixture. The pH was kept at 6.2 at room temperature for 24 h. The conjugal was purified on a silica gel column using 3% ammonium citrate as the solvent. The fractions containing the desired product were combined and showed the double ability to bind antisera (rabbits), which are specific for digoxin, strongly and also to strongly inhibit the enzyme dihydrofolate reductase (chicken liver).
Beispiel 3 Example 3
Enzym-Inhibitor-Immuntest für Digoxin Enzyme inhibitor immunoassay for digoxin
100 ul Serum wurden 15 min bei 30° C mit 100 ul Antidi-goxin-Antikörper-Lösung, 100 jil NADPH-Lösung, 100 ji.1 2-Mercapto-äthanol-Lösung und 550 (il Natriumphosphatpuffer pH 7,5 inkubiert. 100 j-il Methotrexat-Digoxin-Konjugat des Beispiels 2 (70 |i,g/ml) wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde 15-min inkubiert, worauf 100 jil Dihydrofo-lat-Reduktase-Lösung zugesetzt wurden. Das eingesetzte Dihydrofolat-Reduktase-Präparat wurde aus Hühnerleber nach der Methode von Kaufman, B.T., & Gardiner, R.C., Journal of Biological Chemistry, Bd. 211, S. 1319 (1966) isoliert. Das Gemisch wurde weitere 3 min inkubiert und die Enzymaktivität durch Zugabe von 100 jil Dihydrofolat-Lösung bestimmt und bei 340 nm mit einem Varian-Schrei-ber-Spektrophotometer aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben. 100 ul of serum were incubated for 15 min at 30 ° C. with 100 ul of anti-goxin antibody solution, 100 ml of NADPH solution, 100 ml of 2-mercapto-ethanol solution and 550 ml of sodium phosphate buffer pH 7.5 j-il methotrexate-digoxin conjugate of Example 2 (70 | i, g / ml) was added, and the mixture was incubated for 15 min, after which 100 ml of dihydrofo-lat reductase solution were added, the dihydrofolate reductase used Preparation was isolated from chicken liver according to the method of Kaufman, BT, & Gardiner, RC, Journal of Biological Chemistry, vol. 211, p. 1319 (1966) .The mixture was incubated for a further 3 min and the enzyme activity by adding 100 ml The dihydrofolate solution was determined and recorded at 340 nm with a Varian Schreberber spectrophotometer, and the results are shown in the following table.
Tabelle I Table I
Reaktionskomponenten Enzym-Aktivität Reaction components enzyme activity
Digoxin Digoxin
Anti- anti-
Metho- Metho-
Enzym- Enzyme-
OD/min OD / min
% %
(Proben digoxin- (Samples digoxin
trexat-Dig- trexat dig
test- test-
Hem konzen Hem conc
Antikör- Antibody
oxin- oxine
Kompo- Compo-
mung tration per mation tration per
Konjugat nenten Conjugates
ng/ml) ng / ml)
(ng in Testprobe) (ng in test sample)
0 0
fehlt is missing
0 0
vorhanden available
0,150 0.150
0 0
0 0
fehlt is missing
7 7
vorhanden available
0,100 0.100
33 33
0 0
vorhanden available
7 7
vorhanden available
0,145 0.145
3 3rd
5 5
vorhanden available
7 7
vorhanden available
0,125 0.125
16 16
10 10th
vorhanden available
7 7
vorhanden available
0,115 0.115
23 23
Die Reaktionskomponenten wurden in der oben beschriebenen Reihenfolge zugesetzt. The reaction components were added in the order described above.
OD = optische Dichte OD = optical density
Die obigen Ergebnisse lassen erkennen, dass einige wenige ng Digoxin in Serum, in dem beschriebenen System bestimmt werden können. The above results indicate that a few ng digoxin in serum can be determined in the described system.
Beispiel 4 Example 4
Herstellung eines Konjugates aus Methotrexat und menschlichem Serumalbumin Preparation of a conjugate from methotrexate and human serum albumin
45 mg Methotrexat wurden in 1,0 ml N,N-Dimethylform-amid gelöst, und 25 mg N-Hydroxysuccinimid wurden zugesetzt. 45 mg of methotrexate was dissolved in 1.0 ml of N, N-dimethylformamide and 25 mg of N-hydroxysuccinimide were added.
41 mg N,N-Dicyclohexylcarbodiimid wurden gelöst, und das Gemisch wurde 13 h bei Raumtemperatur gehalten. Das unlösliche Harnstoff-Nebenprodukt wurde abgefiltriert, und 100 (il des Filtrats wurden zu einer Lösung gegeben, die 5 mg menschliches Serumalbumin in 800 jil 0,1 m Natriumphosphatpuffer vom pH 7,5 und 100 u.1 Dioxan enthielt. Dieses 41 mg of N, N-dicyclohexylcarbodiimide were dissolved and the mixture was kept at room temperature for 13 hours. The insoluble urea by-product was filtered off and 100 ml of the filtrate was added to a solution containing 5 mg of human serum albumin in 800 ml of 0.1 M sodium phosphate buffer of pH 7.5 and 100 µl of dioxane
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
o5 o5
Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gehalten und dann auf eine Sephadex G-25-Säule gebracht, die mit 0,2 m Natriumphosphatpuffer vom pH 7,5 ins Gleichgewicht gebracht war. Die Säule wurde mit diesem Puffer entwickelt, und es wurden zwei Methotrexat enthaltende Elutionspeaks erhalten, von denen der erste das Konjugat aus Methotrexat und menschlichem Serumalbumin enthielt. The reaction mixture was kept at room temperature for 30 minutes and then placed on a Sephadex G-25 column which was equilibrated with 0.2 M sodium phosphate buffer of pH 7.5. The column was developed with this buffer and two elution peaks containing methotrexate were obtained, the first of which contained the conjugate of methotrexate and human serum albumin.
Beispiel 5 Example 5
Enzym-Inhibitor-Immuntest für menschliches Serumalbumin 100 |il verdünntes Serum wurden bei 30 °C 15 min mit 100 U.1 Antihuman-Serumalbumin-Antikörper (Kaninchen)-Lösung, 100 ni NADPH-Lösung, 100 u.12-Mercaptoäthanol-Lösung und 550 jil Natriumphosphatpuffer vom pH 7,5 inkubiert. 100 |il Methotrexat-Humanserumalbumin-Konjugat (8 |xg/ml) wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde 15 min inkubiert, worauf 100 jil Dihydrofolat-Reduktase-Lösung zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde weitere 3 min inkubiert und die Enzymaktivität durch Zugabe von 100 jxl Dihy-drofolat-Lösung bestimmt und bei 340 nm mit einem Varian-Schreiber-Spektrophotometer aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II wiedergegeben. Enzyme inhibitor immunoassay for human serum albumin 100 | il diluted serum were at 30 ° C for 15 min with 100 U.1 anti-human serum albumin antibody (rabbit) solution, 100 ni NADPH solution, 100 u.12 mercaptoethanol solution and 550 ml of pH 7.5 sodium phosphate buffer. 100 μl methotrexate-human serum albumin conjugate (8 μg / ml) was added and the mixture was incubated for 15 min, after which 100 μl dihydrofolate reductase solution was added. The mixture was incubated for a further 3 min and the enzyme activity was determined by adding 100 μl of dihydrofolate solution and recorded at 340 nm using a Varian-Schreiber spectrophotometer. The results are shown in Table II below.
Tabelle II Table II
Reaktionskomponenten Reaction components
Enzym-Aktivität Enzyme activity
Human Human
Anti- anti-
Metho- Metho-
Enzym- Enzyme-
OD/min OD / min
% %
serum human- serum human
trexat- trexate
test- test-
Hem albumin serum- Hem albumin serum
Humanser- Human ser
Kompo- Compo-
mung mung
(Proben albumin- (Samples of albumin
um- around-
nenten nenten
konz. conc.
Anti- anti-
albumin- albumin-
Hg/ml) Hg / ml)
körper body
Konjugat (Hg in Testprobe) Conjugate (Hg in test sample)
0 0
fehlt is missing
0 0
vorhanden available
0,123 0.123
0 0
0 0
fehlt is missing
0,8 0.8
vorhanden available
0,068 0.068
45 45
0 0
vorhanden available
0,8 0.8
vorhanden available
0,105 0.105
16 16
5 5
vorhanden available
0,8 0.8
vorhanden available
0,092 0.092
25 25th
10 10th
vorhanden available
0,8 0.8
vorhanden available
0,085 0.085
31 31
Die obigen Ergebnisse zeigen deutlich, dass einige wenige [ig menschliches Serumalbumin in dem beschriebenen System bestimmt werden können. The above results clearly show that a few human serum albumin can be determined in the system described.
Beispiel 6 Example 6
Synthese von Methotrexat-Aminoäthylmorphin-Konjugat a) Synthese von 03-Aminoäthylmorphin Synthesis of methotrexate-aminoethylmorphine conjugate a) Synthesis of 03-aminoethylmorphine
In 10 ml frisch von Lithiumaluminiumhydrid (LAH) destillierten Tetrahydrofurans (THF) wurden 400 mg LAH unter Stickstoff suspendiert. Eine Lösung von 400 mg Morphin und 400 mg Chloracetonitril in 4 ml frisch destilliertem THF wurde über 5 min zugesetzt, worauf 1 h rückflussge-kocht wurde. Das Gemisch konnte sich abkühlen, und 0,6 ml Wasser wurden zugesetzt, dann 0,6 ml 10 gewichtsprozentiges Natriumhydroxid und 2 ml Wasser. Nach dem Filtrieren des Gemischs wurden die Salze mit THF gewaschen, die THF-Anteile wurden vereinigt, mit Magnesiumsulfat unter Stickstoff getrocknet, filtriert und das Filtrat eingedampft, um 380 mg 03-Aminoäthylmorphin zu ergeben. 400 mg of LAH were suspended under nitrogen in 10 ml of tetrahydrofuran (THF) freshly distilled from lithium aluminum hydride (LAH). A solution of 400 mg of morphine and 400 mg of chloroacetonitrile in 4 ml of freshly distilled THF was added over 5 minutes, followed by refluxing for 1 hour. The mixture was allowed to cool and 0.6 ml of water was added, then 0.6 ml of 10 weight percent sodium hydroxide and 2 ml of water. After filtering the mixture, the salts were washed with THF, the THF portions were combined, dried with magnesium sulfate under nitrogen, filtered and the filtrate evaporated to give 380 mg of 03-aminoethylmorphine.
b) Synthese von N-t-Butoxycarbonyl-y-(03-aminoäthylmor-phin)-glutaminsäure-a-benzylester b) Synthesis of N-t-butoxycarbonyl-y- (03-aminoethylmorphine) -glutamic acid a-benzyl ester
641 570 641 570
Ein Gemisch von 03-Aminoäthylmorphin (50 mg, wie oben hergestellt), N-t-BOC-glutaminsäure-a-benzylester (34 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (25 mg) in Methylenchlorid (5 ml) wurde 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Äthylacetat verdünnt und mit verdünnter Natriumcarbonatlösung gewaschen. Die Äthylacetatlösung wurde dann zweimal mit 0,1 n Salzsäure extrahiert, und die vereinigten sauren Extrakte wurden mit genügend 10 gewichtsprozentiger Natriumhydroxidlösung behandelt, um den pH auf 8,0 einzustellen. Die Lösung wurde zweimal mit Äthylacetat extrahiert, und die vereinigten Äthylacetatex-trakte wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (wasserfreies Natriumsulfat) und abgedampft, um ein farbloses Öl (36 mg) zu ergeben. A mixture of 03-aminoethylmorphine (50 mg, prepared as above), N-t-BOC-glutamic acid a-benzyl ester (34 mg) and dicyclohexylcarbodiimide (25 mg) in methylene chloride (5 ml) was stirred for 4 hours at room temperature. The mixture was diluted with ethyl acetate and washed with dilute sodium carbonate solution. The ethyl acetate solution was then extracted twice with 0.1N hydrochloric acid and the combined acidic extracts were treated with enough 10% by weight sodium hydroxide solution to adjust the pH to 8.0. The solution was extracted twice with ethyl acetate and the combined ethyl acetate extracts were washed with brine, dried (anhydrous sodium sulfate) and evaporated to give a colorless oil (36 mg).
c) Synthese von Glutaminsäure-y-(03-amidoäthylmorphin)-a-benzylester-trifluoracetat c) Synthesis of glutamic acid-y- (03-amidoethylmorphine) -a-benzyl ester-trifluoroacetate
Eine Lösung von N-t-BOC-glutaminsäure-morphin-Derivat (36 mg, hergestellt wie oben beschrieben) in Methylenchlorid (3 ml) wurde bei Raumtemperatur gerührt, und Trifluoressigsäure (1 ml) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde 15 min gerührt und dann zur Trockne eingeengt. Der Rückstand war ein farbloses Glas (40 mg). A solution of N-t-BOC-glutamic acid morphine derivative (36 mg, prepared as described above) in methylene chloride (3 ml) was stirred at room temperature and trifluoroacetic acid (1 ml) was added. The mixture was stirred for 15 minutes and then concentrated to dryness. The residue was a colorless glass (40 mg).
d) Synthese von Methotrexat-y-(03-amidoäthylmorphin)-a-benzylester d) Synthesis of methotrexate-y- (03-amidoethylmorphine) -a-benzyl ester
Eine Lösung von 4-Amino-4-desoxy-N10-methylpteroin-säure (37 mg) in 3 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), bei Raumtemperatur gerührt, wurde mit Triäthylamin (28 jxl) und i-Butylchlorformiat (25 (il) behandelt, und das Gemisch wurde 30 min gerührt. Es wurde dann zu einem Gemisch des Morphinderivats (75 mg, hergestellt wie unter c) beschrieben) und Triäthylamin (28 jil) in DMSO (2 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 1 h bei 60° gerührt. Das gekühlte Gemisch wurde mit Wasser verdünnt und zweimal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte wurden mit Wasser gewaschen und dann zweimal mit 0,1 n Salzsäure extrahiert. Die vereinigten sauren Extrakte wurden mit genügend 10 gewichtsprozentigem Natriumhydroxid behandelt, um den pH auf 8,0 zu erhöhen. Das Gemisch wurde dreimal mit Äthylacetat extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen (über wasserfreiem Natriumsulfat) getrocknet und eingeengt, um ein gelbes Öl (15 mg) zu liefern. Dieses wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Entwicklung mit Chloroform/ Methanol, 4:1, gereinigt. Die gewünschte Verbindung wurde in Form eines gelben Feststoffs erhalten (4 mg). A solution of 4-amino-4-deoxy-N10-methylpteroic acid (37 mg) in 3 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO), stirred at room temperature, was treated with triethylamine (28 μl) and i-butyl chloroformate (25 (il), and the mixture was stirred for 30 minutes, then it was added to a mixture of the morphine derivative (75 mg, prepared as described under c) and triethylamine (28 ml) in DMSO (2 ml), and the mixture was stirred at 60 ° for 1 hour touched. The cooled mixture was diluted with water and extracted twice with ethyl acetate. The combined ethyl acetate extracts were washed with water and then extracted twice with 0.1N hydrochloric acid. The combined acidic extracts were treated with enough 10 weight percent sodium hydroxide to raise the pH to 8.0. The mixture was extracted three times with ethyl acetate and the combined extracts were washed with brine (over anhydrous sodium sulfate), dried and concentrated to give a yellow oil (15 mg). This was purified by preparative thin layer chromatography on silica gel with development with chloroform / methanol, 4: 1. The desired compound was obtained as a yellow solid (4 mg).
e) Synthese von Metrotrexat-y-(03-amidoäthylmorphin) e) Synthesis of metrotrexate-y- (03-amidoethylmorphine)
Das wie unter d) beschrieben hergestellte Produkt (4 mg) wurde mit 0,1 n Natriumhydroxidlösung (5 ml) gemischt, und das Gemisch wurde 8 h bei Raumtemperatur gerührt, was zu einer klaren gelben Lösung führte. The product (4 mg) prepared as described under d) was mixed with 0.1N sodium hydroxide solution (5 ml) and the mixture was stirred at room temperature for 8 hours, resulting in a clear yellow solution.
Sie wurde mit 0,1 n Salzsäure (5 ml) versetzt, und das Gemisch wurde mit Natriumorthophosphatpuffer (0,05 m, pH 7,4) auf 25 ml aufgefüllt, um eine Lösung der gewünschten Verbindung zu ergeben, die sich zur Verwendung beim Enzymtest eignet. 0.1 N hydrochloric acid (5 ml) was added and the mixture was made up to 25 ml with sodium orthophosphate buffer (0.05 m, pH 7.4) to give a solution of the desired compound which is suitable for use in Enzyme test is suitable.
Beispiel 7 Example 7
Enzym-Inhibitor-Immuntest für Morphin Enzyme inhibitor immunoassay for morphine
Ein Gemisch von 10 jil Morphinlösung geeigneter Konzentration, 50 (il Methotrexat-y-(03-amidoäthylmorphin)-Lösung (4 ng/25 ml), 50 jil Antimorphin-Antikörper-Lösung, 10 |j.l NAD PH-Lösung, 10 jal 2-Mercaptoäthanol-Lösung, 50 ji.1 Kaliumchloridlösung, 150 ul Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) mit ÄDTA und 10 ul Dihydrofolat-Reduktase (E. casei)-Lösung wurde 20 min bei 37° inkubiert. Die Enzymaktivität A mixture of 10 jil morphine solution of suitable concentration, 50 (il methotrexate-y- (03-amidoethylmorphine) solution (4 ng / 25 ml), 50 jil antimorphine antibody solution, 10 | jl NAD PH solution, 10 jal 2 -Mercaptoethanol solution, 50 μl 1 potassium chloride solution, 150 μl Tris-HCl buffer solution (pH 7.5) with ÄDTA and 10 μl dihydrofolate reductase (E. casei) solution was incubated for 20 min at 37 ° C. The enzyme activity
7 7
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
o5 o5
641 570 641 570
8 8th
in dem Gemisch wurde nach Zusatz von 10 ul Dihydrofolat-Lösung bestimmt, indem die Änderung der Extinktion der Lösung bei 340 nm unter Verwendung eines Centrifichem-Centrifugalanalysators aufgezeichnet wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III wiedergegeben: in the mixture was determined after adding 10 µl of dihydrofolate solution by recording the change in absorbance at 340 nm using a Centrifichem centrifugal analyzer. The results are shown in Table III below:
Tabelle III Table III
Reaktionskomponenten Enzym-Aktivität Reaction components enzyme activity
Morphin Antimor- Morphin- Enzym- OD/min %-Hem- Morphine Antimor- Morphin Enzyme- OD / min% -Hem-
tig/Probe phin- Metho- test- mung tig / sample phin metho test
Antikör- trexat- Kompo- Antibody trexate compo
per Konjugat nenten by conjugate
0 0
fehlt fehlt missing missing
vorhan existing
0,54 0.54
0 0
den the
0 0
fehlt is missing
3x 10"1 3x 10 "1
!m vorhan ! m existing
0,14 0.14
76 76
den the
0 0
vorhan existing
3x 10"1 3x 10 "1
!m vorhan ! m existing
0,41 0.41
29 29
den the
den the
0,04 0.04
vorhan existing
3x10-' 3x10- '
!m vorhan ! m existing
0,37 0.37
36 36
den the
den the
0,04 0.04
vorhan existing
3 x 10~! 3 x 10 ~!
!m vorhan ! m existing
0,35 0.35
40 40
den the
den the
4,0 4.0
vorhan existing
3x IO"1 3x IO "1
sm vorhan sm existing
0,31 0.31
46 46
den the
den the
20 20th
vorhan existing
3 x 10"' 3 x 10 "'
!m vorhan ! m existing
0,27 0.27
54 54
den the
den the
40 40
vorhan existing
3x10-' 3x10- '
!m vorhan ! m existing
0,23 0.23
60 60
den the
den the
10 10th
20 20th
25 25th
Die obige Tabelle zeigt, dass mit zunehmender Konzentration an Morphin die Aktivität der Dihydrofolat-Reduktase abnimmt. So konnten Morphinlösungen mit vier ug/ml bis 4 mg/ml Morphin getestet werden, wobei nur 10 |j.l Lösung zur Verfügung standen. Dies soll jedoch nicht bedeuten, dass dies der erforderliche Bereich ist, sondern nur die erfolgreiche Anwendung demonstriert. The table above shows that the activity of dihydrofolate reductase decreases with increasing concentration of morphine. For example, morphine solutions with four µg / ml to 4 mg / ml morphine could be tested, whereby only 10 μl solution was available. However, this is not intended to mean that this is the required area, but only demonstrates the successful application.
Beispiel 8 Example 8
Synthese von Ferritin-Methotrexat-Konjugat Synthesis of ferritin-methotrexate conjugate
Eine Lösung von Ferritin aus menschlicher Leber (1,3 mg) in Natriumphosphatpuffer (0,05 m, pH 8,0,5 ml) und 1 ml Dimethylformamid (DMF) wurde bei Raumtemperatur gerührt, und 100 jj.1 einer Lösung, erhalten durch Behandeln von Methotrexat (23 mg) in DMF (2 ml) mit Triäthylamin (21 jil) und i-Butylchlorformiat (15 p.1) bei Raumtemperatur für 30 min, wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann gegen 2x21 Natriumortho-phosphatpuffer (0,05 m, pH 7,4, 0,1 m an Natriumchlorid und mit 0,05 Gewichtsprozent Natriumazid) 24 h dialysiert. Die Lösung wurde dann durch eine Sephadex G-25-Säule geführt, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, und die Ferritin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mit dem Puffer auf 10 ml aufgefüllt. A solution of ferritin from human liver (1.3 mg) in sodium phosphate buffer (0.05 m, pH 8.0.5 ml) and 1 ml of dimethylformamide (DMF) was stirred at room temperature and 100 ml of a solution was obtained by treating methotrexate (23 mg) in DMF (2 ml) with triethylamine (21 ml) and i-butyl chloroformate (15 p.1) at room temperature for 30 min were added. The mixture was stirred at room temperature for 2 h and then dialyzed against 2 × 21 sodium orthophosphate buffer (0.05 m, pH 7.4, 0.1 m sodium chloride and with 0.05% by weight sodium azide) for 24 h. The solution was then passed through a Sephadex G-25 column which had been equilibrated with the same buffer and the fractions containing ferritin were pooled and made up to 10 ml with the buffer.
Die anfallende Lösung eignet sich zur Verwendung bei einem Enzym-Immuntest zur Bestimmung von Ferritin. The resulting solution is suitable for use in an enzyme immunoassay for the determination of ferritin.
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PL | Patent ceased |