SE447026B

SE447026B - PROCEDURE FOR IMMUNOLOGICAL DETERMINATION

Info

Publication number: SE447026B
Application number: SE7802923A
Authority: SE
Inventors: Douglas E Hawley; Peter G Tonkes
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1977-03-15
Filing date: 1978-03-14
Publication date: 1986-10-20
Also published as: NO154814B; ATA182178A; DK152313B; AU519326B2; IT7821256A0; IL54234A0; DE2811257A1; NO152955C; AT367203B; AU3396578A; FR2384262A1; NO152955B; NO780902L; BE864856A; NO844764L; CA1102789A; IT1158665B; DK114778A; DK152313C; NL7802845A

Description

447 026 2 .. , Den primära reaktionen utgör en kombination av en molekyl av liganden med en molekyl av receptorn under bildning av ett bimolekylärt ligand/receptor-komplex (1). En sekundär reaktion åstadkommas genom tillsats av märkt ligand, vilken likaledes kombineras med receptorn under bildning av ett märkt ligand/receptor-komplex (2). Vid mättnads- analys är koncentrationerna av receptorn och den märkta liganden konstan- ta. Koncentrationen av receptorn är begränsad på så sätt att den märkta liganden föreligger i överskott i förhållande till receptorn. Under dessa betingelser medför tillsatsen av ligand en konkurrens mellan ligand och märkt ligand med avseende på bindning med receptorn. Således medför en ökning av ligandkoncentrationen en sänkning armängden märkt ligand/ receptor-komplex. Analysprincipen baserar sig på bestämningen av den del av den totala märkta liganden som är bunden vid receptorn. Denna andel i procent är omvänt proportionell mot den mängd ligand som satts till reaktionsblandningen från det för bestämning avsedda provet eller från den standard som användes vid analysen. Sänkningen i koncentration av det märkta ligand/receptor-komplexet eller ökningen i koncentrationen av märkt ligand i reaktionsblandningen kanznvändas för bestämning av ligandkoncentrationen. _ Känsligheten av mättnadsanalysen är beroende på användningen av en receptor som uppvisar en mycket hög affinitet till liganden och den märkta liganden. Känsligheten är för det andra även beroende på använd- ningen av ett märkningsmedel, som kan påvisas vid mycket låg koncentra- tion. 447 026 2 .., The primary reaction is a combination of a molecule of the ligand with a molecule of the receptor to form a bimolecular ligand / receptor complex (1). A secondary reaction is effected by addition of labeled ligand, which is also combined with the receptor to form a labeled ligand / receptor complex (2). In case of saturation analysis, the concentrations of the receptor and the labeled ligand are constant take. The concentration of the receptor is limited in that it is labeled the ligand is present in excess relative to the receptor. Under these conditions, the addition of ligand causes competition between ligands and labeled ligand for binding to the receptor. Thus entails an increase in the ligand concentration a decrease in the amount of arm labeled ligand / receptor complex. The principle of analysis is based on its determination part of the total labeled ligand bound to the receptor. This percentage is inversely proportional to the amount of ligand set to the reaction mixture from the test sample or from the standard used in the analysis. The decrease in concentration of the labeled ligand / receptor complex or the increase in concentration of labeled ligand in the reaction mixture can be used to determine ligand concentration. The sensitivity of the saturation assay depends on the use of a receptor that exhibits a very high affinity for the ligand and it labeled ligand. Secondly, the sensitivity also depends on the the labeling agent, which can be detected at very low concentrations tion.

Specificiteten vid mättnadsanalysen är beroende på förmågan hos receptorn att exclusivt binda liganden och den märkta liganden i en kom- plexblandning av olika molekyler.The specificity of the saturation analysis depends on the ability of the receptor to exclusively bind the ligand and the labeled ligand in a plexus mixture of different molecules.

Mättnadsanalys har använts med användning av många olika metoder, varvid skillnaderna primärt hänför sig till den använda typen av märk- ningsmedel. Dessa metoder klassificeras vanligen med användning av de allmänt hållna benämningarna "radioanalys“ och "icke-radioanalys", be- roende på om man såsom märkningsmedel använder ett radioaktivt spår- ämne_eller icke.Saturation analysis has been used using many different methods, the differences being primarily related to the type of label used means. These methods are usually classified using the commonly referred to as "radioanalysis" and "non-radioanalysis", depending on whether a radioactive tracer is used as a label subject_or not.

I Radioanalys har tillämpats i högre grad än icke-radioanalys.Radioanalysis has been applied to a greater extent than non-radioanalysis.

Radioanalys kan vidare klassificeras såsom radioimmunoanalys eller radio-receptoranalys, beroende på typen av den vid analysen använda receptorn. Vid radioimmunoanalys användes en antikropp som specifikt binder liganden och den märkta liganden. Alternativt hänför sig radio- receptoranalys till användningen av varje annan typ av biologisk receptor som på liknande sätt specifikt binder liganden och den märkta liganden. 447 026 -' vid all radioanalysteknik är det väsentligt att fysikaliskt separera den bundna fraktionen (1 och 2 i ekvation l) från den obundna fraktionen (3 och 4 i ekvation l) i reaktionsblandningen. Ett index på ligandkoncentrationen kan därefter erhållas genom att man bestämmer radioaktiviteten hos dessa fraktioner och jämför de erhållna värdena för de okända proverna med dem som erhålles för lämpliga standardligand- prover underkastade samma analys. Många olika och divergerande metoder har beskrivits för separation av de bundna och fria fraktionerna av radioanalysreaktionsblandningen vid tillämpning av teknik inkluderande gelfiltrering, absorption och jonbyteskromatografering, fraktionerad utfällning, fastfas eller elektrofores.Radioassay can be further classified as radioimmunoassay or radio-receptor assay, depending on the type used in the assay the receptor. In radioimmunoassay, an antibody was used as specific binds the ligand and the labeled ligand. Alternatively, radio receptor analysis for the use of any other type of biological receptor which similarly specifically binds the ligand and the labeled ligand. 447 026 - ' In all radio analysis techniques, it is essential that physically separate the bound fraction (1 and 2 in Equation 1) from the unbound the fraction (3 and 4 in Equation 1) in the reaction mixture. An index of ligand concentration can then be obtained by determining the radioactivity of these fractions and compare the values obtained for the unknown samples with those obtained for appropriate standard ligand samples subjected to the same analysis. Many different and divergent methods has been described for the separation of the bound and free fractions of the radioassay reaction mixture when applying techniques including gel filtration, absorption and ion exchange chromatography, fractionated precipitation, solid phase or electrophoresis.

Efter utarbetandet av radioanalysteknik vid mättnadsanalys har man utvecklat metoder med användning av icke-radioaktiva märkningsmedel.After the development of radio analysis technology in saturation analysis has methods have been developed using non-radioactive labels.

Metoder med användning av enzymer såsom märkningsmedel har åskådlig- gjorts. Dessa metoder kan ha den fördelen att fysikalisk separation av de bundna (l + 2) och fria (3 + 4) fraktionerna av den mäkta liganden icke är nödvändig vid analysproceduren.Methods using enzymes such as labels have illustrated done. These methods can have the advantage of physical separation of the bound (1 + 2) and free (3 + 4) fractions of the ligand is not necessary in the analysis procedure.

När en antikropp binder en ligand märkt med ett enzym, modifieras aktiviteten av enzymet. Graden av modifikationen av enzymaktiviteten är indikativ på koncentrationen av den märkta liganden i den bundna fraktionen och ger således ett index på koncentrationen av liganden i reaktionsblandningen.When an antibody binds a ligand labeled with an enzyme, it is modified the activity of the enzyme. The degree of modification of the enzyme activity is indicative of the concentration of the labeled ligand in the bound fraction and thus gives an index of the concentration of the ligand in the reaction mixture.

Den kemiska strukturen av ligand-enzym-komplexet är extremt svår att fastställa och detta utgör en väsentlig olägenhet vid enzym- immunoanalys. Detta beror otvivelaktigt på den stora mängd aminosyra- sidokedjor som är tillgängliga på enzymytan för komplexbildning med liga: den. Detta förorsakar stora svårigheter vid reproduktion av ligand~enzyme i olika preparationer av komplexet. Den allmänna bristen på kontroll av komplexbildningsreaktionen resulterar i bindning av många ligandmolekyle: vid en och samma enzymmolekyl, ehuru det är sannolikt att bindringen av endast några få av dessa ligandmolekyler av en antikropp medverkar vid inhiberingen av enzymaktiviteten. Således resulterar icke alla anti- kropp/märkt antigen-reaktioner i modifikation av enzymaktiviteten, vilken reducerar metodens känslighet.The chemical structure of the ligand-enzyme complex is extreme difficult to determine and this is a significant disadvantage of enzyme immunoassay. This is undoubtedly due to the large amount of amino acids side chains available on the enzyme surface for complex formation with liga: the. This causes great difficulty in the reproduction of ligand enzyme in various preparations of the complex. The general lack of control of the complexing reaction results in the binding of many ligand molecules: at one and the same enzyme molecule, although it is likely that the binding of only a few of these ligand molecules of an antibody are involved in inhibition of enzyme activity. Thus, not all anti- body / labeled antigen reactions in modification of enzyme activity, which reduces the sensitivity of the method.

Protein-protein-reaktion mellan olika antikroppsmolekyler och antikropp och enzymmolekyler är en annan följd av mångfalden ligand- molekyler på enzymytan. Protein-protein-reaktionen ökas ytterligare om även liganden är en polypeptid. Således inducerar enzymmolekylen en lokal mikromiljö med hög proteinkoncentration. I sådana situationer har det visat sig att proteinutfällning sker, vilket medför en förlust ouzzrzïfr 447 '026 s av en av de väsentliga fördelarna med enzymimmunoanalys genom att let erfordras separation av antikroppsbundna och fria fraktioner.Protein-protein reaction between different antibody molecules and antibody and enzyme molecules are another consequence of the diversity of ligand molecules on the enzyme surface. The protein-protein reaction is further increased even if the ligand is a polypeptide. Thus, the enzyme molecule induces a local microenvironment with a high protein concentration. In such situations it has been shown that protein precipitation occurs, which results in a loss ouzzrzïfr 447 '026 s of one of the essential benefits of enzyme immunoassay by separation of antibody-bound and free fractions is required.

En modifikation av enzymimmunoanalys har beskrivits varvid man övervinner dessa problem genom att liganden märkes med en detektor- molekyl som uppvisar en låg molekylvikt. Vid denna analys hindrar anti- kroppsbindningen av märkt ligand steriskt bindningen av en detektormole- kyl vid en annan antikropp specifik för detektormolekylen. Graden av hinder bestämmes av konkurrensen beträffande bindning av den fria ligand-detektormolekylen och detektormolekylmärkt enzym med detektor- molekylantikroppen. Graden av modifikation av enzymaktivitet, bestämd medelst vanlig enzymimmunoanalys, är indikativ på koncentrationen av fri ligand-detektormolekyl, som likaledes är indikativ på koncentra- tionen av ligand i reaktionsblandningen. Fördelen med denna teknik är att en mindre molekyl snarare än ett enzym bindes vid liganden, varigenom det blir möjligt att bestämma den kemiska strukturen av den märkta liganden och därigenom övervinna många av de olägenheter vid den ovan beskrivna enzymimmunoanalysen. Detta system övervinner emeller- tid endast de olägenheter vid den primära bindningsreaktionen som om- fattar liganden och den märkta liganden och överför dem till detektor- systemet för bestämning av andelen antikroppsbundna och antikroppsfria fraktioner av den märkta liganden.A modification of enzyme immunoassay has been described in which one overcomes these problems by labeling the ligand with a detector molecule that has a low molecular weight. In this analysis, anti- the body binding of labeled ligand sterically the binding of a detector molecule cool with another antibody specific for the detector molecule. The grade of obstacles are determined by competition regarding the binding of the free ligand detector molecule and detector molecule labeled enzyme with detector molecular antibodies. The degree of modification of enzyme activity, determined by standard enzyme immunoassay, is indicative of the concentration of free ligand detector molecule, which is also indicative of concentration the addition of ligand in the reaction mixture. The advantage of this technology is that a smaller molecule rather than an enzyme binds to the ligand, thereby making it possible to determine the chemical structure of it labeled ligand and thereby overcome many of the inconveniences the enzyme immunoassay described above. However, this system overcomes only the disadvantages of the primary binding reaction which captures the ligand and the labeled ligand and transfers them to the detector the system for determining the proportion of antibody-bound and antibody-free fractions of the labeled ligand.

Olägenheterna vid de tidigare metoderna övervinnes enligt upp- finningen, varvid ett enzymmodifieringsmedel användes såsom märkninge- medel.The disadvantages of the previous methods are overcome according to the invention, using an enzyme modifier as a label. average.

Uppfinningen hänför sig närmare bestämt till ett reagens för bestämning av ett immunologiskt aktivt material, omfattande det immuno- logiskt aktiva materialet eller en receptor, som specifikt kan binda nämnda immunologiskt aktiva material, märkt med en substans med förmåga att modifiera storleken eller karaktären av ett enzyms aktivitet.More particularly, the invention relates to a reagent for determination of an immunologically active material, comprising the immuno- logically active material or a receptor, which can specifically bind said immunologically active material, labeled with a substance capable of to modify the size or character of an enzyme's activity.

Uppfinningen hänför sig vidare till en metod för bestämning av ett immunologiskt aktivt material i ett prov, varvid provet bringas i kontakt med en receptor, som specifikt kan binda det immunologiskt aktiva materialet, det immunologiskt aktiva materialet märkt med en substans med förmåga att modifiera aktiviteten av ett enzym, ett enaym och ett enzymsubstrat, och varvid storleken eller karaktären av den bildade enzymaktiviteten bestämmas och jämföras med den som erhålles med en standard. I _ Uppfinningen hänför sig även till en metod för bestämning av ett immunologiskt aktivt material i ett prov, varvid provet bringas i kon- takt med en receptor, som specifikt kan binda det immunologiskt aktiva 447 026 5 materialet och som är märkt med en substans med förmåga att modifiera aktiviteten av ett enzym, med det immunologiskt aktiva materialet i insolubiliserad form, och med ett enzym och ett enzymsubstrat, och var- vid storleken eller karaktären av enzymaktiviteten efter separation av den fasta fasen uppmätes och jämföres med den som erhålles med en standard.The invention further relates to a method for determining an immunologically active material in a sample, wherein the sample is introduced into contact with a receptor that can specifically bind it immunologically active material, the immunologically active material labeled with a substance capable of modifying the activity of an enzyme, an enzyme and an enzyme substrate, and wherein the size or character thereof formed enzyme activity is determined and compared with that obtained with a standard. I _ The invention also relates to a method for determining a immunologically active material in a sample, the sample being brought into rate with a receptor, which can specifically bind the immunologically active 447 026 5 the material and which is labeled with a substance capable of modifying the activity of an enzyme, with the immunologically active material in insolubilized form, and with an enzyme and an enzyme substrate, and each by the magnitude or character of the enzyme activity after separation of the solid phase is measured and compared with that obtained with one standard.

Uttrycken "immunologiskt aktivt material" eller "ligand“ avser täri varje immunologiskt aktiv substans eller del därav med förmåga att kunna immunologiskt bestämmas, exempelvis med användning av mättnads- analysteknik. Det väsentliga kravet är att det finns en receptor som specifikt binder liganden. När receptorn är en antikropp, kommer ligan- den att vara haptenisk eller antigenisk på så sätt att en specifik anti- kropp kan bildas. En ligand anses vara en hapten när den endast fram- kallar antikroppsbildning vid bindning vid en förening med antigena egenskaper. Alternativt anses en ligand vara ett antigen, när den fram- kallar antikroppsbildning utan kemisk modifikation. Liganden kan variera avsevärt i molekylvikt, såsom inom det ungefärliga intervallet 100 - 1.000.000. Detta molekylviktsintervall är icke begränsnade vid analysen, förutsatt att en receptor är tillgänglig som specifikt binder liganden.The terms "immunologically active material" or "ligand" refer to any immunologically active substance or part thereof capable of can be determined immunologically, for example using saturation analysis technique. The essential requirement is that there is a receptor that specifically binds the ligand. When the receptor is an antibody, the ligand will to be haptenic or antigenic in such a way that a specific anti- body can be formed. A ligand is considered a hapten when it is produced only calls antibody formation upon binding to a compound with antigens characteristics. Alternatively, a ligand is considered an antigen when it is produced calls antibody formation without chemical modification. The ligand may vary considerably in molecular weight, such as in the approximate range of 100 - 1,000,000. This molecular weight range is not limited in the assay, provided that a receptor is available that specifically binds the ligand.

Liganden kan vara antingen polymerisk eller icke-polymerisk i strukturen. När liganden är polymerisk är den vanligen av biologiskt ursprung och kan klassificeras såsom en nukleinsyrapolysackarid och/eller ﬂolypeptid. När liganden alternativt är icke-polymerisk, uppvisar den "anligen en molekylvikt lägre än 2000 och kan uppvisa helt varierande strukturer, funktionaliteter och fysiologiska egenskaper.The ligand may be either polymeric or non-polymeric in the structure. When the ligand is polymeric, it is usually biological origin and can be classified as a nucleic acid polysaccharide and / or ﬂ olypeptide. Alternatively, when the ligand is non-polymeric, it exhibits "probably a molecular weight lower than 2000 and can vary widely structures, functionalities and physiological properties.

Liqander av speciell betydelse som kan användas enligt upp- finningen utgöres av aminer, aminosyror, peptider, proteiner, lipopro- teiner, glykoproteiner, steroler, steroider, lipoider, nukleinsyror, mono- och polysackarider, alkaloider, vitaminer, läkemedel, narkotika, antibiotika, metaboliter, pesticider, toxiner, industriella föroreningar, arommedel, hormoner, enzymer, koenzymer, cellulära eller extracellulära komponenter i vävnader och isolerade antikroppar från människa eller djur. Analysen är emellertid icke begränsad till endast dessa ligander.Ligands of special importance that can be used according to The findings consist of amines, amino acids, peptides, proteins, lipoproteins. teins, glycoproteins, sterols, steroids, lipoids, nucleic acids, mono- and polysaccharides, alkaloids, vitamins, drugs, narcotics, antibiotics, metabolites, pesticides, toxins, industrial pollutants, flavorings, hormones, enzymes, coenzymes, cellular or extracellular components of human tissues and isolated antibodies or animal. However, the assay is not limited to only these ligands.

Omedelbart potentiella komponenter för analys med systemet är hepatit B-ytantigen; ferritin; tumörantiger såsom CEA; orfetoprotein; veumatoidfaktor; C-reaktiva proteiner; immunoglobulinklasserna IgG, 1gM eller IgA; myoglobin, tyroidhormoner inkl. T3 och T4, insulin; steroidhormoner inkl. testosteron och östradiol; missbrukade läkemedel inkl. narkotiska analgetika, såsom morfin; barbiturater; stimulantia såsom amfetamin; medel för behandling av epilepsi inkl. difenylhydantoin PÛÛR QmaLImf 447 026 6 ich fenobarbital; kardiakglykocyter såsom digoxin; vitaminer såsom vitamin B och folsyra. Vidare utgöres för analys med systemet omedel- bart poteåâiella antikroppar av sådana som föreligger i samband med infektioner såsom syfilis, gonorre, brucellos, rubella och reumatism.Immediate potential components for analysis with the system are hepatitis B ytantigen; ferritin; tumor antigens such as CEA; orphetoprotein; veumatoid factor; C-reactive proteins; immunoglobulin classes IgG, 1 μM or IgA; myoglobin, thyroid hormones incl. T3 and T4, insulin; steroid hormones incl. testosterone and estradiol; abused drugs incl. narcotic analgesics, such as morphine; barbiturates; stimulants such as amphetamine; agents for the treatment of epilepsy incl. diphenylhydantoin FOR QmaLImf 447 026 6 ich fenobarbital; cardiac glycocytes such as digoxin; vitamins such as vitamin B and folic acid. Furthermore, for analysis with the system, potent antibodies of those present in association with infections such as syphilis, gonorrhea, brucellosis, rubella and rheumatism.

Uttrycket "märkt immunologiskt aktivt material" eller "märkt receptor" avser häri en ligand analog till en ligand eller del därav eller en receptor som är märkt med ett enzymmodifieringsmedel. En, mer än en och vanligen mindre än lOO molekyler av märkningsmedlet kan bindas vid en ligand: dler receptormolekyl. Likaledes kan en, mer än en och 'anzijon mindre än 5 ligand- eller receptormolekyler bindas vid en märkt molekyl. Bindningen av ytterligare märkta molekyler vid en ligand- eller :eceptormolekyl ökar vanligen känsligheten vid analysen, förutsatt att de ytterligare märkningsmolekylerna icke påverkar bindningen.The term "labeled immunologically active material" or "labeled receptor "herein refers to a ligand analogous to a ligand or portion thereof or a receptor labeled with an enzyme modifier. One, more than one and usually less than 100 molecules of the label can be bound in a ligand: dler receptor molecule. Likewise, one, more than one and Anzion less than 5 ligand or receptor molecules bind to a label molecular. The binding of additional labeled molecules to a ligand or : eceptor molecule usually increases the sensitivity of the assay, provided that the additional label molecules do not affect binding.

Bindningen av en modifieringsmedelsmolekyl till en ligand- eller receptormolekyl omfattar bildning av intermolekylära bindningar, vilka i flertalet fall, men icke nödvändigtvis, är kovalenta till karaktären.The binding of a modifier molecule to a ligand or receptor molecule comprises the formation of intermolecular bonds, which in most cases, but not necessarily, are covalent in character.

Denna bindning kan åstadkommas i vissa fall i närvaro av ett kopplinge- iedel genom införing av en sammanlänkande grupp mellan märkningsmedlet :ch liganden eller receptorn.This binding can be achieved in some cases in the presence of a coupling by introducing a linking group between the label : ch the ligand or receptor.

Modifieringsmedelsmolekylen kan bindas direkt till ligand- eller feccptormolekylen. Det kan emellertid vara önskvärt att införa kemiska bryggor av olika längd mellan modiferingsmedelsmolekylen och ligand- :ller receptormolekylerna, beroende på den specifika analys som man avser utföra. I vissa fall kan det t.o.m. vara fördelaktigt att binda modiferingsmedelsmolekylen och ligand- eller receptormolekylerna separat vid samma bärarmolekyl, såsom en makromolekyl, exempelvis en polypeptid eller en polysackarid.The modifier molecule can bind directly to ligand or feccptormolecules. However, it may be desirable to introduce chemicals bridges of different lengths between the modifier molecule and the ligand : or the receptor molecules, depending on the specific assay performed intends to perform. In some cases, it may even be advantageous to tie the modifier molecule and the ligand or receptor molecules separately at the same carrier molecule, such as a macromolecule, for example a polypeptide or a polysaccharide.

Uttrycket "receptor" avser häri varje substans som specifikt kan binda en ligand och märkt ligand eller del därav. I allmänhet utgöres den använda receptorn av en specifik antikropp till liganden bildad i blod av ryggradsdjur efter injektion av en lämplig hapten resp. antigen.The term "receptor" as used herein refers to any substance which specifically can bind a ligand and labeled ligand or part thereof. In general the receptor used by a specific antibody to the ligand formed in blood of vertebrate animals after injection of a suitable hapten resp. antigen.

Man kan vid analysen alternativt använda i naturen förekommande recep- torer. Den sistnämnda gruppen omfattar, men är icke begränsad till, proteiner, nukleinsyror och cellmembraner. Sådana receptorer har använts vid radioanalysteknik för tyroxin, insulin, angiótensin och olika steroic hormoner.In the analysis, one can alternatively use naturally occurring recipes. torer. The latter group includes, but is not limited to, proteins, nucleic acids and cell membranes. Such receptors have been used in radioanalysis techniques for thyroxine, insulin, angiotensin and various steroids hormones.

När liganden är en antikrOpp, kan receptorn utgöras av det antigen som användes för införing av nämnda antikropp hos ett värddjur.When the ligand is an antibody, the receptor may be that antigen which was used to introduce said antibody into a host animal.

I en annan utföringsform kan receptorn utgöras av en antikronp mot den antikropp som skall bestämmas. 447 026 Det är icke möjligt att med säkerhet fastställa den mekanism med vilken receptorn vid bindning på den märkta liganden reducerar reaktionen mellan enzym och modifieringsmedel. Den mest sannolika för- klaringen är att affiniteten av enzymet till modifieringsmedlet reduceras såsom ett resultat av en ändring i storlek och nettoladdning av receptor/ ligand-modifieringsmedelskomplexet jämfört med ligand-modifieringsmedlet separat.In another embodiment, the receptor may be an antibody to it antibody to be determined. 447 026 It is not possible to determine that mechanism with certainty with which the receptor upon binding to the labeled ligand reduces the reaction between enzyme and modifier. The most likely the explanation is that the affinity of the enzyme for the modifier is reduced as a result of a change in the size and net charge of receptor / the ligand modifier complex compared to the ligand modifier separate.

Uttrycket "modifieringsmedel“ avser häri varje substans som har förmåga att reagera med ett enzym på så sätt att storleken eller typen av enzymaktivitet modifieras. Denna modifikation kan resultera i en inhibering, aktivering eller en ändring i specificitet eller någon annan eglnskap av enzymet, som är påvisbar antingen direkt eller indirekt genom en ändring i enzymaktivitet eller i verkningssättet, såsom en ändring av reaktionsbetingelserna, såsom krav på ko-faktor eller pH- optimum, i kinetiska egenskaper eller i aktiveringsenergi. Nodifierings- medlet kan variera i storlek från en liten molekyl till en makromolekyl och dess reaktion med en enzymmolekyl kan vara antingen reversibel eller irreversibel, allteftersom den intermolekylära associationen är jonisk eller kovalent till karaktären.The term "modifier" herein refers to any substance which has ability to react with an enzyme in such a way that the size or type of enzyme activity is modified. This modification may result in a inhibition, activation or a change in specificity or any other property of the enzyme, which is detectable either directly or indirectly by a change in enzyme activity or in the mode of action, such as a change in the reaction conditions, such as co-factor or pH requirements optimum, in kinetic properties or in activation energy. Nodification the agent may vary in size from a small molecule to a macromolecule and its reaction with an enzyme molecule can be either reversible or irreversible, as the intermolecular association is ionic or covalent to the character.

Analysens känslighet är bl.a. beroende på affiniteten av receptorn :iD.liganden och förmågan hos modifieringsmedlet att medföra en ändring av storleken av eller sättet för enzymaktivitet. Modifikationen av storleken av eller sättet för enzymaktivitet âstadkommes företrädesvis med minsta möjliga koncentration av modifieringsmedlet. Ju närmare denna koncentration ligger till den av enzymet på molekylär bas, ju större blir analysens känslighet.The sensitivity of the analysis is i.a. depending on the affinity of the receptor : iD.liganden and the ability of the modifier to effect a change of the size or mode of enzyme activity. The modification of the magnitude or mode of enzyme activity is preferably achieved with the lowest possible concentration of the modifier. The closer to this concentration is higher than that of the enzyme on a molecular basis, the greater becomes the sensitivity of the analysis.

Modifieringsmedlet utgöres företrädesvis av en enzyminhibitor, som vid reaktion med ett enzym inhiberar dettas aktivitet. Verknings- sätten för inhibitorn kan vara konkurrerande, icke-konkurrerande, allo- steroiska eller en kombination av tvâ eller fler av dessa verkningssätt.The modifier is preferably an enzyme inhibitor, which on reaction with an enzyme inhibits its activity. Effective the methods of the inhibitor may be competitive, non-competitive, allo- steroidal or a combination of two or more of these modes of action.

Inhibitorn bör företrädesvis ha en inhiberingskonstant (koncentrationen inhibitor nödvändig för 50 % inhibering av enzymsystemet) under lO_3 mol/ liter, alltefter den utförda analysen. Det är särskilt lämpligt att_ _15 och 10-5.The inhibitor should preferably have an inhibition constant (concentration) inhibitor necessary for 50% inhibition of the enzyme system) below 10_3 mol / liters, according to the analysis performed. It is particularly appropriate to_ _15 and 10-5.

Varje enzym kan användas vid analysen, förutsatt att det före- jnhibitionskonstanten ligger mellan 10 ligger ett modifieringsmedel som specifikt modifierar enzymaktiviteten på det ovan beskrivna sättet. Särskilt lämpliga enzymer är beständiga, kan erhållas med lätthet till låg kostnad och uppvisar ett högt över- íöringstal och kan användas i ett på enkelt sätt genomförbar analys- system. Överföringstalet (antal produktmolekyler bildade per enzymmole- PO Cia Q WSLÄIKY. 447 026 kyl under en minut) ligger företrädesvis över 100 med hänsyn tagen till det specifika test som utföres. Det är särskilt lämpligt att överföring:~ talet är så högt som möjligt och lägst 200.Each enzyme can be used in the assay, provided that the The inhibition constant is between 10 is a modifier that specifically modifies the enzyme activity in the manner described above. Particularly suitable enzymes are resistant, can be obtained with ease at low cost and exhibits a high and can be used in a simple feasible analysis. system. The transfer number (number of product molecules formed per enzyme molecule PO Cia Q WSLÄIKY. 447 026 refrigeration for one minute) is preferably above 100 taking into account the specific test performed. It is particularly suitable that transmission: ~ the number is as high as possible and at least 200.

Enzymmodifieringssystem som är särskilt lämpliga vid uppfinningen är dihydrofolatreduktas/metotrexat, dihydrofolatreduktas/4~aminoterin, dihydrofelatreduktas/andra specifika inhibitorer av detta enzym; ﬂ-glukn- ronidas/4-deoxi-5-aminoglukarsyra och dess derivat; biotinhaltiga enzymer avidin, såsom karboxylas/avidin; kymotrypsin/TPCK ?H2-Ph _ šI-Iíš SOz-NH-Cll- ﬁ-CllzCg H O Y-cystationas/propargylglycin; alaninracemas/trifluoralanin: trypto- fanas/trifluoralanin; tryptofansyntetas/trifluoralanin; ß-cystationas/ trifluoralanin; pyruvat-glutamattransaminas/trifluoralanin; mjölksyra- oxidas/2-hydroxi-3-butynsyra; monoaminoxidas/N,N-dimetylpropargylamin; och diaminoxidas/HZN-CH2-C CCH2-NH2; Bestämning av enzymaktivitet kan utföras genom att man direkt eller indirekt övervakar förbrukningen av substrateller produktion av produkt vid ett lämpligt pH resp. temperatur med användning av pâvisnings system, inkluderande kolorimetri, spektrofotometri, fluorspektrofoto- metri, gaseometri, termometri (värmealstring) och scintillationsbestäm~ ning.Enzyme modification systems which are particularly suitable for the invention is dihydrofolate reductase / methotrexate, dihydrofolate reductase / 4-aminoterin, dihydrophelate reductase / other specific inhibitors of this enzyme; ﬂ- glucan- ronidase / 4-deoxy-5-aminoglucaric acid and its derivatives; biotin-containing enzymes avidin, such as carboxylase / avidin; chymotrypsin / TPCK ? H2-Ph _ šI-Iíš SOz-NH-Cll- ﬁ- CllzCg H O Γ-cystationase / propargylglycine; alanine racemes / trifluoroalanine: trypto- fanas / trifluoroalanine; tryptophan synthetase / trifluoroalanine; ß-cystation / trifluoroalanine; pyruvate glutamate transaminase / trifluoroalanine; lactic acid- oxidase / 2-hydroxy-3-butynic acid; monoamine oxidase / N, N-dimethylpropargylamine; and diamine oxidase / HZN-CH 2 -C CCH 2 -NH 2; Determination of enzyme activity can be performed by directly or indirectly monitors the consumption of substrates or the production of product at a suitable pH resp. temperature using detection systems, including colorimetry, spectrophotometry, fluorospectrophotometry metrics, gasometry, thermometry (heat generation) and scintillation determination ~ ning.

För att höja känsligheten hos systemet är det möjligt att använde bioluminescens- och enzymatisk cirkulationsteknik, såsom den teknik som beskrives av J. Lee et al, Liquid Scintillation Counting: Recent Develop- nents, Stanley P.E. och Scoggins, B.A., Academic Press, New York, p. 403; och Lowry O.H. et al i J. Biol. Chem, gåâ, p. 2746-2755.To increase the sensitivity of the system, it is possible to use bioluminescence and enzymatic circulation techniques, such as the techniques used in described by J. Lee et al, Liquid Scintillation Counting: Recent Develop- nents, Stanley P.E. and Scoggins, B.A., Academic Press, New York, p. 403; and Lowry O.H. et al in J. Biol. Chem, goâ, pp. 2746-2755.

Enligt en utföringsform av uppfinningen kan en märkt ligand använd: för bestämning av närvaro av en ligand i ett okänt prov genom samtidig eller separat tillsats av den märkta liganden och det okända provet till ett vattenmedium med lämpligt pH, innehållande en receptor som. är specifik för liganden och den märkta liganden. Efter en lämplig inku- Lationsperiod bestämmas fördelningen av receptorbindning till ligand och märkt ligand genom tillsats av enzym och substrat. Den receptor som är specifik för liganden binder även den märkta liganden och reducerar nïriqcnom reaktionen mellan modifierinqsmodlet och vnzym, varvid modifíwv tionen av enzymaktiviteten således reduceras. Tillsats av en ligand vid _ t . . ,¶.- ~_, ' 'r-'f-ø '- x _. U -- i ' ü: f _. "V pQQI-R Q :Lïï a L :n _' 447 026 analysen medför en konkurrens med den märkta liganden med avseende på bindning med receptorn och ökar därigenom koncentrationen av den fria märkta liganden i analysen. Reaktionen mellan ligand/modifieringsmedel :ch enzym befrämjas och enzymaktiviteten pâverkas åter. Modifikationen av enzymaktiviteten är därför en funktion av ligandkoncentration i ana- lysen och åstadkommes av obunden märkt ligand. Skillnaden mellan den resulterande enzymaktiviteten och den som erhålles i frånvaro av ligand är därmed indikativ på koncentrationen av ligand i det okända provet.According to an embodiment of the invention, a labeled ligand may be used: for determining the presence of a ligand in an unknown sample by simultaneous or separate addition of the labeled ligand and the unknown sample to an aqueous medium of suitable pH, containing a receptor which. is specific for the ligand and the labeled ligand. After a suitable incu- Lation period determines the distribution of receptor binding to ligand and labeled ligand by the addition of enzyme and substrate. The receptor that is specific for the ligand also binds the labeled ligand and reduces nïriqcnom the reaction between the modifying model and enzyme, wherein modifying the enzyme activity is thus reduced. Addition of a ligand at _ t. . , ¶.- ~ _, '' r-'f-ø '- x _. U - i 'ü: f _. "V pQQI-R Q: Lïï a L : n _ ' 447 026 the assay involves competition with the labeled ligand with respect to binding to the receptor and thereby increasing the concentration of the free labeled ligand in the assay. The reaction between ligand / modifier The enzyme is promoted and the enzyme activity is affected again. The modification of the enzyme activity is therefore a function of ligand concentration in lysine and is provided by unbound labeled ligand. The difference between it resulting enzyme activity and that obtained in the absence of ligand is thus indicative of the concentration of ligand in the unknown sample.

En av de viktigare fördelarna med denna metod är att sandra- tion av bundna cch fria fraktioner vid proceduren är onödig. Detta ute- sluter emellertid icke användningen av ät sådan separationssteg i ana- lysen efter inkubering av ligand och märkt ligand med receptor och före bestämningen av enzymaktiviteten. Separation av fraktioner kan vara önskvärd i vissa fall för eliminering av substanser i provet, som kan störa enzymanalysen. Separation kan åstadkommas med användning av någon av de många metoder som beskrivas för radioimmunoanalys, inkluderan- de gelfiltrering, adsorption och jonbyteskromatografering, fraktionerad ntfällning, fastfas och elektrofores; Denna analys är givetvis icke begränsad till bestämningen av haptener och antigener såsom ligand, utan kan även tillämpas på identifieringen och mätningen av antikroppar såsom ligand.One of the major advantages of this method is that tion of bound and free fractions in the procedure is unnecessary. This outdoor does not, however, preclude the use of such separation steps in lysis after incubation of ligand and labeled ligand with receptor and before the determination of enzyme activity. Separation of fractions can be desirable in some cases for the elimination of substances in the sample, which can interfere with enzyme analysis. Separation can be achieved using any of the many methods described for radioimmunoassay, including the gel filtration, adsorption and ion exchange chromatography, fractionated precipitation, solid phase and electrophoresis; This analysis is of course not limited to the determination of haptens and antigens such as ligand, but can also be applied to the identification and measurement of antibodies such as ligand.

Detta kan exempelvis utföras genom märkning av antikropnen med ett enzymmodiferingsmedel och uppmätning av omfattningen av enzym- :ktivitetsmodifikation efter inkubering av märkt antikropp och antikropp i provet med en begränsad koncentration av antigen eller hapten. Modifika~ tionen av enzymaktivitet är beroende av antikroppskoncentrationen i provet. Om så erfordras kan de bundna och fria fraktionerna separeras före tillsats av enzymet och substratet.This can be done, for example, by labeling the antibody with an enzyme modifier and measuring the extent of the enzyme : activity modification after incubation of labeled antibody and antibody in the sample with a limited concentration of antigen or hapten. Modified ~ the enzyme activity is dependent on the antibody concentration in tried. If required, the bound and free fractions can be separated before adding the enzyme and the substrate.

I samband med bestämning av ligand möjliggör denna uppfinning även användning av en märkt receptor i stället för en märkt ligand. niganden i det okända-provet reagerar med ett överskott av receptor märkt med ett enzymmodifieringsmedel och efter inkubation tillsättes ett över- skott av fastfasinsolubiliserad ligand och omsättes med den kvarvarande Fria märkta receptorn. Efter separtion av den fasta fasen uppmätes modi- fikationen av enzymaktivitet associerad med den lösta liganden, vilken är beroende av ligandkoncentrationen.In connection with the determination of ligand, this invention enables also use of a labeled receptor instead of a labeled ligand. niganden in the unknown sample reacts with an excess of receptor labeled with an enzyme modifier and after incubation a supernatant is added shoots of solid phase solubilized ligand and reacted with the remainder Free labeled receptor. After separation of the solid phase, the modi- the activation of enzyme activity associated with the dissolved ligand, which is depending on the ligand concentration.

Reagenserna enligt uppfinningen kan även användas enligt en "sandwich"-teknik, förutsatt att liganden uppvisar minst två bindnings- ställen. Liganden reagerar med överskott av fastfasreceptor och efter i POOR QUALITY 447 026 10 inkubation följd av tvättning omsättes den fastfasreceptorbundna ligandtn mod ett överskott av receptor märkt ett enzymmodifieringsmedel. Fri märkt zuceptor avlägsnas genom tvättning och omfattningen av enzymmodifikationer i de separerade fraktionerna bestämmes. Detta ger sedan ett index på Éigandkoncentration.The reagents of the invention can also be used according to a "sandwich" technique, provided that the ligand exhibits at least two binding places. The ligand reacts with excess solid phase receptor and after and POOR QUALITY 447 026 10 incubation followed by washing, the solid phase receptor-bound ligand is reacted against an excess of receptor labeled an enzyme modifier. Free marked zuceptor is removed by washing and the extent of enzyme modifications in the separated fractions is determined. This then gives an index of Owner concentration.

Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande exempel, vari de angivna temperaturerna avser Celsius-grader. ÉEEE 01 1- gramställning av "amino-digoxin“ En suspension av 156 mg (0,2 mmol) digoxin i 5 ml absolut etanol försattes med l0 ml O,2M natriummetaperjodat under omröring.The invention is further illustrated by the following examples, wherein the indicated temperatures refer to degrees Celsius. ÉEEE 01 1- program of "amino-digoxin" A suspension of 156 mg (0.2 mmol) of digoxin in 5 ml absolute ethanol was added with 10 ml of 0.2M sodium metaperiodate with stirring.

Blandningen blev homogen efter 10 minuter och sedan bildades långsamt en fällning. Efter två timmar tillsattes 5 ml vatten plus 5 ml etanol.The mixture became homogeneous after 10 minutes and then formed slowly a precipitate. After two hours, 5 ml of water plus 5 ml of ethanol were added.

E¿2 23 (2,2 mmol) etylenglvkol tillsattes efter ytterligare 30 minuter :sh en tät vit fällning började omedelbart att bildas. Efter 80 minuters :uröring tillsattes 133 al (2,0 mmol) etylendiamin och pH inställdes på 11,0 till 9,5 med 0,1 M HCl och reaktionsblandningen förvarades 18 timmar v1d rumstemperatur. pH ändrade sig icke under denna tid. 151,4 mg (4,0 mmol) natriumborhydrid tillsattes därefter och blandningen omrördes 3,5 timmar. pH inställdes därefter från 10,5 till 6,5 med ln myrsyra (ungefär 3 ml) och TLC på denna blandning uppvisade en enda övervägande fläck med ett Rf av 0,15 (silika på aluminium fram- kallat i butanol:ättiksyrazvatten/4:1:l). Digoxin hade ett Rf av 0,7 vid framkallning i samma system.23 (2.2 mmol) of ethylene glycol was added after a further 30 minutes : sh a dense white precipitate immediately began to form. After 80 minutes After stirring, 133 [mu] l (2.0 mmol) of ethylenediamine were added and the pH was adjusted 11.0 to 9.5 with 0.1 M HCl and the reaction mixture was stored for 18 hours v1d room temperature. The pH did not change during this time. 151.4 mg (4.0 mmol) of sodium borohydride were then added and the mixture was stirred for 3.5 hours. The pH was then adjusted from 10.5 to 6.5 with 1n formic acid (about 3 ml) and TLC on this mixture showed a single predominant spot with an Rf of 0.15 (silica on aluminum front called in butanol: acetic acid water / 4: 1: 1). Digoxin had an Rf of 0.7 in development in the same system.

Lösningsmedlen avlägsnades till nära torrhet på en roterande indunstare under vakuum med användning av ett vattenbad vid 600. De sisïa få ml vatten avlägsnades genom tillsats av 3 x 20 ml 95%-ig etanol och upprepning av nämnda indunstning.The solvents were removed to near dryness on a rotary evaporator under vacuum using a water bath at 600. De sisïa a few ml of water were removed by adding 3 x 20 ml of 95% ethanol and repetition of said evaporation.

Den bildade blekgula fasta substansen extraherades tre gånger med absolut etanol och de kombinerade extrakten koncentrerades till unge- íär 4 ml och centrifugerades för separation av en ringa mängd salt, som bortkastades. Den blekgula överstående lösningen indunstades till torr- het under ett flöde av torrt väte för bildning av en gul olja, som upp- visade samma Rf på TLC som den ovan beskrivna reaktionsblandningen.The pale yellow solid formed was extracted three times with absolute ethanol and the combined extracts were concentrated to 4 ml and centrifuged to separate a small amount of salt, which was wasted. The pale yellow supernatant solution was evaporated to dryness. under a stream of dry hydrogen to give a yellow oil, which is showed the same Rf on TLC as the reaction mixture described above.

Produkten påvisades innehålla en fri aminogrupp genom omsättning därav med “Fluram" (4-feny1spiro[fluran-2(3H),l'-ftalan]-3,3'-dion) för bildning av en intensivt fluorescent förening. Produkten uppvisade ett spektrum i koncentrerad svavelsyra liknande det av digoxin med absorptionstoppar vid 385 och 495 m,. Produkten uppvisade även en kraftig affinitet för antisera (kanin) specifik för digoxin. Den mest sannolika strukturen för den isolerade produkten är: 9' '- *fil ¿ 447 D26 ll 0 wo (u. f.. The product was shown to contain a free amino group by reacting it with "Fluram" (4-phenylpiro [fluran-2 (3H), 1'-phthalane] -3,3'-dione) to form of an intensely fluorescent compound. The product showed a spectrum in concentrated sulfuric acid similar to that of digoxin with absorption peaks at 385 and 495 m ,. The product also showed a strong affinity for antisera (rabbit) specific for digoxin. The most likely structure for the isolated product are: 9 ' '- * fil ¿ 447 D26 ll 0 wo (u. f ..

IJ _ n: “x m: / b" x-f-s - s” f» A »Ica ' '\\° . \ ny- ngr-n; __ ,, [Å- G 'fasïwï-.fålm-Z-i ~ tramstñllning av mctotrcxat-aminodiqoxinknnjuqat ll mg metotrexat löstes i 5 ml H20 och inställdes på pH 6,5.IJ _ n: "x m: / b" x-f-s - s ”f» A »Ica '' \\ °. \ ny- ngr-n; __ ,, [Å- G 'fasïwï-.fålm-Z-i ~ tramstlllling of mctotrcxat-aminodiqoxinknnjuqate 11 mg of methotrexate was dissolved in 5 ml of H 2 O and adjusted to pH 6.5.

-J mg "aminodigoxin" löstes i denna lösning och volymen inställdes på 20 ml med H20. pH inställdes åter på 6,5 och 484 mg N-etyl-N“-(3- dimetylamino)-propyl-karbodiimid-hydroklorid löst i 5 ml H20, sattes till reaktionsblandningen. pH upprätthölls vid 6,2 under 24 timmar vid rumstemperatur. Konjugatet renades på en silikagelpelare med användning av 3%~i¶ ammoniumcitratlösning såsom lösningsmedel. Fraktioner inne- hillande den önskade produkten kombinerades och visade sig ha den dubbla iürmågan att aktiva binda antisera (kanin) specifika för digoxin och även kraftigt inhibera enzymet dihydrofolatreduktas (kycklinglever). Den mest sannolika strukturen för metotrexat-aminodigoxinkonkugatet är: _ cul e", oQ,¿ . §:~oh\\ É:::ï n FCK I N\,_cn_-r||: ,,,..,F*L_J\° _* O* 0“C[' m: L, ,~ l I* \ I /L u° m; ___: -m- I »ev-fw w, c" r , * , “i 0 WH I \\ N\\ n.- rv=;cﬂ;__,,,'_h_ f' 0 Püfïii Qumzivv 447 D26 12 ' Exemoel 3.-J mg of "aminodigoxine" was dissolved in this solution and the volume was adjusted to 20 ml with H 2 O. The pH was readjusted to 6.5 and 484 mg of N-ethyl-N dimethylamino) -propyl-carbodiimide hydrochloride dissolved in 5 ml of H 2 O, was added to the reaction mixture. The pH was maintained at 6.2 for 24 hours at room temperature. The conjugate was purified on a silica gel column using of 3% ammonium citrate solution as solvent. Fractions included healing the desired product was combined and found to have the double the ability to actively bind antisera (rabbit) specific for digoxin and also strongly inhibit the enzyme dihydrofolate reductase (chicken liver). The most The probable structure of the methotrexate aminodigoxine concugate is: _ cul e ", oQ, ¿. §: ~ oh \\ É ::: ï n FCK I N \, _ cn_-r ||: ,,, .., F * L_J \ ° _ * O * 0 "C [' m: L,, ~ l I * \ I / L u ° m; ___: -m- I »ev-fw w, c " r, *, “i 0 WH I \\ N \\ n.- rv =; c ﬂ; __ ,,, '_ h_ f' 0 Püfïii Qumzivv 447 D26 12 ' Example 3.

Enzvminhibitorimmunoanalys med avseende på digoxin 100 ßl serum inkuberades 15 minuter vid 300 med 100 Al anti~ digoxinantikroppslösning, 100 id NADPH-lösning, l0O,ul 2-merkaptoetanol- lösning och 550 pl natriumfosfatbuffert med pH 7,5. l0OÄßl metotrexat- digoxinkonjugat från exempel 2 (70 ﬂg/ml) tillsattes och blandningen inkuberades 15 minuter, varefter 100 gl dihydrofolatreduktaslösning tillsattes. Det använda dihydrofolatreduktaspreparatet isolerades ur kycklinglever enligt den metod som beskrives av Kaufman, B.T., & Gardiner, R.C., Journal of Biological Chemistry, vol. 211, p. l3l9 (1966). Bland- ningen inkuberades ytterligare 3 minuter och enzymaktiviteten bestämdes genom tillsats av lO0 lå dihydrofolatlösning och övervakades vid 340 nm med en registrerande spektrofotometer (Varian). Resultaten är samman- ställda i tabeil I.Enzyme inhibitor immunoassay for digoxin 100 μl of serum was incubated for 15 minutes at 300 with 100 μl of anti- digoxin antibody solution, 100 id NADPH solution, 10, ul 2-mercaptoethanol solution and 550 μl of sodium phosphate buffer at pH 7.5. l0OÄßl methotrexate- digoxin conjugate from Example 2 (70 ﬂ g / ml) was added and the mixture incubated for 15 minutes, after which 100 μl of dihydrofolate reductase solution was added. The dihydrofolate reductase preparation used was isolated chicken liver according to the method described by Kaufman, B.T., & Gardiner, R.C., Journal of Biological Chemistry, vol. 211, pp. 139 (1966). Among- The incubation was incubated for an additional 3 minutes and the enzyme activity was determined by the addition of 10 D 10, dihydrofolate solution was present and monitored at 340 nm with a recording spectrophotometer (Varian). The results are set out in Table I.

Tabell I _” Reaktanter- Enzvmaktívitet bigoxin Äntidigoxin- Metotrexat- Enzymana- OD/min. % inhibition 'provkonc.) antikropp digoxin-kon- lyskompo~ jugat (vid nenter analys) O frånvarande 0 närvarande 0,150 0 0 frånvarande 7 ng närvarande 0,100 33 0 närvarande 7 ng närvarande 0,145 3 5 ng/ml närvarande 7 ng närvarande 0,125 16 10 ng/ml närvarande 7 ng närvarande O,ll5 23 Reaktanterna tillsattes i den ovan angivna ordningsföljden.Table I _ ”Reactants- Enzyme Activity bigoxin Antidoxin- Methotrexate- Enzymana- OD / min. % inhibition 'test conc.) antibody digoxin-con- ly comp jugat (at nenter analysis) 0 absent 0 present 0.150 0 0 absent 7 ng present 0.100 33 0 present 7 ng present 0.145 3 5 ng / ml present 7 ng present 0.125 16 10 ng / ml present 7 ng present 0.115 23 The reactants were added in the above order.

OD = optisk densitet.OD = optical density.

Det framgår tydligt av nämnda resultat att några få ng digoxin i serum kan bestämmas i det beskrivna systemet.It is clear from the mentioned results that a few ng digoxin in serum can be determined in the described system.

Exemoel 4.Example 4.

Framställning av metotrexat-humanserumalbuminkonjugat 45 mg metotrexat löstes i 1,0 ml N,N-dimetylformamid och 25 mg ä-hydroxisuccinimid tillsattes. 41 mg N,N-dicyklohexylkarbodiimid löstes och blandningen upprätthölls 13 timmar vid rumstemperatur. Den olösliga karbamidbiprodukten avlägsnades genom filtrering och l0O.ul av filtratet _ sattes till en lösning innehållande 5 mg humanserumalbumin i 800 ßl 0,lM natriumfosfatbuffert med pH7,5 och 100 fd dioxan. Denna reaktionsbland- ning upprätthölls 30 minuter vid rumstemperatur och påfördes sedan en Sephadex >G-25-pelare jämviktsinställd med 0,lM natriumfosfatbuffert med pH 7,5. Pelaren framkallades med denna buffert och två elueringstoppar ..v¿j_ f 'V fn f“Éf::Lï?ï dE(} lá lf ' . 44-7 026 13 innehållande metotrexat erhölls, varav den första innehöll metotrexat- humanserumalbuminkonjugatet.Preparation of methotrexate-human serum albumin conjugate 45 mg of methotrexate were dissolved in 1.0 ml of N, N-dimethylformamide and 25 mg α-hydroxysuccinimide was added. 41 mg of N, N-dicyclohexylcarbodiimide were dissolved and the mixture was maintained for 13 hours at room temperature. The insoluble the urea by-product was removed by filtration and 10 .mu.l of the filtrate was added to a solution containing 5 mg of human serum albumin in 800 μl 0.1M sodium phosphate buffer with pH 7.5 and 100 fd dioxane. This reaction mixture was maintained for 30 minutes at room temperature and then applied Sephadex> G-25 Pillar Equilibrated with 0.1M Sodium Phosphate Buffer with pH 7.5. The column was developed with this buffer and two elution peaks ..v¿j_ f 'V fn f “Éf :: Lï? ï dE (} lá lf '. 44-7 026 13 containing methotrexate was obtained, the first of which contained methotrexate human serum albumin conjugate.

Exemgel 5.Example 5.

Enzyminhibitorimmunoanalys med avseende på humanserumalbumin 100 rd utspätt serum inkuberades 15 minuter vid 300 med l00 nl antihumanserumalbuminantikropp (kanin)-lösning, 100_u1 NADPH-lösning, l00 nl 2-merkaptoetanollösning och 550 pl natriumfosfatbuffert med pH 7,5. 100 nl metotrexathumanserumalbuminkonjugat (8 eg/ml) tillsattes och blandningen inkuberades 15 timmar, varefter l00_¿1 dihydrofolatreduk- taslösning tillsattes. Blandningen inkuberades ytterligare tre minuter och enzymaktiviteten bestämdes genom tillsats av 100,41 dihydrofolat- lösning och övervakades vid 340 nm med en reqistrerande spektrofotometer (Varian). Resultaten visas i tabell II.Enzyme inhibitor immunoassay for human serum albumin 100 rd diluted serum was incubated for 15 minutes at 300 with 100 nl antihuman serum albumin antibody (rabbit) solution, 100_u1 NADPH solution, 100 nl of 2-mercaptoethanol solution and 550 μl of sodium phosphate buffer with pH 7.5. 100 nl of methotrexate human serum albumin conjugate (8 μg / ml) was added and the mixture was incubated for 15 hours, after which the dihydrofolate reduction solution was added. The mixture was incubated for another three minutes and the enzyme activity was determined by adding 100.41 dihydrofolate solution and monitored at 340 nm with a recording spectrophotometer (Variation). The results are shown in Table II.

Tabell II Reaktanter Enzymaktivitet Humanserum- Antihuman- Metotrexat- Enzymana- OD/min. % inhibition albumin serumalbu- humanserum- lyskompo- Lprov- min-anti- albuminkonju-nenter konc.) kropp gat (vid ana- lys) 0 frånvarande 0 närvarande 0,123 0 0 frånvarande 0,8 ng närvarande 0,068 45 0 närvarande 0,8,ng närvarande 0,105 16 5,ug/ml närvarande 0,8 »Q närvarande 0,092 25 10 rg/ml närvarande 0,8 ng närvarande 0,085 31 Det framgår tydligt av nämnda resultat att några ng human- serumalbumin kan bestämmas i det beskrivna systemet.Table II Reactants Enzyme activity Human serum- Antihuman- Methotrexate- Enzymana- OD / min. % inhibition albumin serum albumin human serum light composition Lprov- my-anti-albumin conjugates conc.) body gat (at ana- light) 0 absent 0 present 0.123 0 0 absent 0.8 ng present 0.068 45 0 present 0.8, ng present 0.105 16 5 .mu.g / ml present 0.8 »Q present 0.092 25 10 rg / ml present 0.8 ng present 0.085 31 It is clear from the above results that some human serum albumin can be determined in the system described.

Exemgel 6.Example 6.

Svntes av metotrexat~aminoetylmorfinkonjugat a) Syntes av 03-aminoetylmorfin I 10 ml tetrahydrofuran (THF), nydestillerad ur litiumaluminiun hydrid (LAH), suspenderades 400 mg LAH under kväve. En lösning av 400 mg morfin och 400 mg kloracetonitril i 4 ml nydestillerad THF tillsattes under 5 minuter, varefter man återflödesupphettade en timme. Blandningen kyldes och 0,6 ml vatten tillsattes och därefter 0,6 ml 10%-ig (vikt) natriumhydroxidlösning och 2 ml vatten. Efter filtrering av blandningen tvättades salterna med THF, THF-fraktionerna kombinerades, torkades med magnesiumsulfat under kväve, filtrerades och filtratet indunstades för bildning av 380 mg O3~aminoety1morfin.Synthesis of methotrexate-aminoethylmorphine conjugate a) Synthesis of 03-aminoethylmorphine In 10 ml of tetrahydrofuran (THF), freshly distilled from the lithium aluminum hydride (LAH), 400 mg of LAH was suspended under nitrogen. A solution of 400 mg morphine and 400 mg chloroacetonitrile in 4 ml freshly distilled THF were added for 5 minutes, after which the reflux was heated for one hour. The mixture was cooled and 0.6 ml of water was added and then 0.6 ml of 10% (w / w) sodium hydroxide solution and 2 ml of water. After filtering the mixture the salts were washed with THF, the THF fractions were combined, dried with magnesium sulfate under nitrogen, filtered and the filtrate evaporated formation of 380 mg of O3-aminoethylmorphine.

POOR QUALITY 447 026 14. b) Syntes av N-t-butoxikarboxi~7"-(03-aminoetylmorfin)glutaminsyra-r- bensylester En blandning av 50 mg 03-aminoetylmorfin (framställd enligt ovan), 34 mg N-t-BOC-glutaminsyra-arbensylester och 25 mg dicyklohexyl~ karbodiimid i 5 ml diklormetan omrördes 4 timmar vid rumstemperatur.POOR QUALITY 447 026 14. b) Synthesis of N-t-butoxycarboxy-7 "- (03-aminoethylmorphine) glutamic acid-r- benzyl ester A mixture of 50 mg of 03-aminoethylmorphine (prepared according to above), 34 mg of N-t-BOC-glutamic acid arbenzyl ester and 25 mg of dicyclohexyl carbodiimide in 5 ml of dichloromethane was stirred for 4 hours at room temperature.

Blandningen utspäddes med etylacetat och tvättades med utspädd natrium- karbonatlösning. Etylacetatlösningen extraherades därefter två gånger med O,lN saltsyra och de kombinerade sura extrakten behandlades med en tillräcklig mängd 10%-ig (vikt) natriumhydroxidlösning för inställning av pH på 8,0. Lösningen extraherades två gånger med etylacetat och de kombinerade etylacetatextrakten tvättades med koncentrerad natriumklorid- lösning, torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades för bildning av en färglös olja (36 mg). c) Syntes av glutaminsyra-Y?(03-amidoetylmorfin)-arbensylester-trifluor- ättiksyrasalt En lösning av 36 mg N-t-BOC-glutaminsyra-morfinderivat (fram- ställt enligt ovan) i 3 ml diklormetan omrördes vid rumstemperatur och 1 ml trifluorättiksyra tillsattes. Blandningen omrördes 15 minuter och indunstades sedan till torrhet. Återstoden utgjordes av ett färglöst glas (40 mg). d) Syntes av metotrexat-Y;(03-amidoetylmorfin)-n-bensylester En lösning av 37 mg 4-amino-4-deoxi-N10-metylperoinsyra i 3 ml dimetylsulfoxid (DMSO) omrörd vid rumstemperatur behandlades med 28 #1 trietylamin och 25,ul i-butylklorformiat och blandningen omrördes 30 minuter. Den sattes sedan till en blandning av 75 mg morfinderivat (framställt enligt moment c) och 28 nd trietylamin i 2 ml DMSO och bland- ningen omrördes en timme vid 600. Den kylda blandningen utspäddes med vatten och extraherades två gånger med etylacetat. De kombinerade etyl- acetatextrakten tvättades med vatten och extraherades sedan två gånger med O,lN saltsyra. De kombinerade sura extrakten behandlades med en tillräcklig mängd 10%-ig (vikt) natriumhydroxidlösning för höjning av pH till 8,0. Blandningen extraherades tre gånger med etylacetat och de kombinerade extrakten tvättades med koncentrerad natriumkloridlösning, torkades över vattenfritt natriumsulfat och indunstades för bildning av en gul olja (15 mg). Denna renades genom preparativ tunnskiktskromato- grafering (TLC) på silikagel och framkallades med kloroform/metanol, 4:1.The mixture was diluted with ethyl acetate and washed with dilute sodium carbonate solution. The ethyl acetate solution was then extracted twice with 0.1N hydrochloric acid and the combined acidic extracts were treated with a sufficient 10% (w / w) sodium hydroxide solution for adjustment of pH of 8.0. The solution was extracted twice with ethyl acetate and de the combined ethyl acetate extracts were washed with concentrated sodium chloride solution, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated formation of a colorless oil (36 mg). c) Synthesis of glutamic acid-γ (03-amidoethylmorphine) -arbenzyl ester-trifluoro- acetic acid salt A solution of 36 mg of N-t-BOC-glutamic acid morphine derivative (prepared as above) in 3 ml of dichloromethane was stirred at room temperature and 1 ml of trifluoroacetic acid was added. The mixture was stirred for 15 minutes and then evaporated to dryness. The residue consisted of a colorless glass (40 mg). d) Synthesis of methotrexate-Y; (O 3 -amidoethylmorphine) -n-benzyl ester A solution of 37 mg of 4-amino-4-deoxy-N10-methylperoic acid in 3 ml of dimethyl sulfoxide (DMSO) stirred at room temperature was treated with 28 # 1 triethylamine and 25 .mu.l of i-butyl chloroformate and the mixture was stirred 30 minutes. It was then added to a mixture of 75 mg of morphine derivatives (prepared according to step c) and 28 nd triethylamine in 2 ml DMSO and mixed The mixture was stirred for one hour at 600 DEG C. The cooled mixture was diluted with water and extracted twice with ethyl acetate. The combined ethyl The acetate extracts were washed with water and then extracted twice with 0.1N hydrochloric acid. The combined acidic extracts were treated with a sufficient 10% (w / w) sodium hydroxide solution to increase pH to 8.0. The mixture was extracted three times with ethyl acetate and the combined extracts were washed with concentrated sodium chloride solution, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to give a yellow oil (15 mg). This was purified by preparative thin layer chromatography. engraving (TLC) on silica gel and developed with chloroform / methanol, 4: 1.

Den önskade föreningen erhölls i form av en gul fast substans (4 mg).The desired compound was obtained as a yellow solid (4 mg).

Pﬁfêf* ff'fﬂ';ïff,ï.zmif 447 026 15 G) Syntes av metotrexat-T-(03-amidoetylmorfin) 4 mg av den enligt moment d) erhållna produkten blandades mei 5 ml 0,lN natriumhydroxidlösning och blandningen omrördes 8 timmar vid rumstemperatur under bildning av en klargul lösning.P ﬁ fêf * ff'f ﬂ '; ïff, ï.zmif 447 026 15 G) Synthesis of methotrexate-T- (03-amidoethylmorphine) 4 mg of the product obtained according to step d) were mixed with 5 ml of 0.1N sodium hydroxide solution and the mixture was stirred for 8 hours at room temperature to give a clear yellow solution.

Denna försattes med 5 ml 0,lN saltsyra och blandningen in- ställdes på 25 ml med natriumortofosfatbuffert (0,05 M, pH 7,4) för bilå- ning av en lösning av den önskade föreningen lämplig för användning vid enzymanalysen.This was added with 5 ml of 0.1N hydrochloric acid and the mixture was was applied to 25 ml with sodium orthophosphate buffer (0.05 M, pH 7.4) for a solution of the desired compound suitable for use in enzyme analysis.

Exemgel 7.Example 7.

Enzyminhibitor-immunoanalvs med avseende nå morfin En blandning av 10 få morfinlösning av lämplig koncentration, F0 nl metotrexat-7f-(03-amidoetylmorfin)-lösning (4 ng/25 ml), 50_ßd antimorfinantikroppslösning, 10 id NADPH-lösning, lO Al 2~merkaptoetanol- lösning, 50 lå kaliumkloridlösning, 150 li tris-HCL-buffertlösning (pH 7,5) innehållande EDTA och 10 Al dihydrofolatreduktas (E. casei)-lösning inkuberades 20 minuter vid 370. Enzymaktiviteten i blandningen bestämdes efter tillsats av 10 id dihydrofolatlösning genom övervakning av ändringar i extinktion av lösningen vid 340 nm med användning av en centrifichem~ centrifugal-analysator. Resultaten visas i tabell III.Enzyme inhibitor immunoassay for reaching morphine A mixture of 10 g of morphine solution of suitable concentration, F0 nl methotrexate-7f- (03-amidoethylmorphine) solution (4 ng / 25 ml), 50_ßd antimorphin antibody solution, 10 id NADPH solution, 10 Al 2 solution, 50 l of potassium chloride solution, 150 l of tris-HCL buffer solution (pH 7.5) containing EDTA and 10 Al dihydrofolate reductase (E. casei) solution incubated for 20 minutes at 370. The enzyme activity in the mixture was determined after addition of 10 id dihydrofolate solution by monitoring changes in extinction of the solution at 340 nm using a centrifuge centrifugal analyzer. The results are shown in Table III.

Tabell III Peaktanter Enzymaktivitet Morfin Antimorfin- Morfin- Enzymanalys- OD/min. % inhibitio: .g/analys antikropp metotrexat- komponenter konjugat 0 frånvarande frånvarande närvarande 0,54 0 0 frånvarande 3xl0-8 M närvarande 0,14 76 närvarande 3xl0_8 M närvarande 0,41 29 -0,04 närvarande 3xlO_8 M närvarande 0,37 36 0,40 närvarande 3xl0_8 M närvarande 0,35 40 4,0 närvarande 3xl0_8 M närvarande 0,31 46' 20 närvarande 3xl0_8 M närvarande 0,27 54 40 närvarande 3xlO_8 M närvarande 0,23 60 Denna tabell visar att med ökande koncentration av morfin erhålles en reducerad aktivitet av dihydrofolatreduktas. På detta sätt kunde lösningar av morfin innehållande från 4 Ag per ml till 4 mg per ml morfin analyseras när endast 10 pd av lösningen var tillgänglig. Detta är icke avsett att bestämma några gränser, utan endast att man kan framgångs- rikt använda metoden inom detta intervall. i POOR QUALITY 447 026 16 QxemEel_§¿_ Svntes av ferritin-metotrexat-konjugat En lösning av 1,3 mg leverferritin från människa i 5 ml nat- riumfosfatubuffert (0,05M, pH 8,0) och l ml dimetylformamid (DMF) omrör- des vid rumstemperatur och 100 på av en lösning erhållen genom behandling av 23 mg metotrexat i 2 ml DMF med 21 ¿d trietylamin och l5 #1 i-butyl- kloroformiat vid rumstemperatur under 30 minuter, tillsattes. Bland- ningen omrördes två timmar vid rumstemperatur och dialyserades sedan mot 2 x 2 liter natriumortofosfatbuffert (0,05 M, pH 7,4, innehållande natriumklorid 0,1 M och natriumazid 0,05 vikt-%) under 24 timmar. Lös- ningen fördes sedan igenom en pelare av Sephadexd§(¥Q5 jämviktsinställn med samma buffert och de ferritinhaltiga fraktionerna kombinerades wch inställdes på l0 ml med buffertlösningen.Table III Peactants Enzyme activity Morphine Antimorphine- Morphine- Enzyme Assay- OD / min. % inhibition: .g / analysis antibody methotrexate components conjugate 0 absent absent present 0.54 0 0 absent 3x10-8 M present 0.14 76 present 3x10_8 M present 0.41 29 -0.04 present 3x10_8 M present 0.37 36 0.40 present 3x10_8 M present 0.35 40 4.0 present 3x10_8 M present 0.31 46 ' Present 3x10_8 M present 0.27 54 40 present 3x10_8 M present 0.23 60 This table shows that with increasing concentration of morphine a reduced activity of dihydrofolate reductase is obtained. In this way could solutions of morphine containing from 4 Ag per ml to 4 mg per ml morphine is analyzed when only 10 pd of the solution was available. This is not intended to set any limits, but only that one can successfully richly use the method within this range. and POOR QUALITY 447 026 16 QxemEel_§¿_ Treated by ferritin-methotrexate conjugate A solution of 1.3 mg human liver ferritin in 5 ml of natural sodium phosphate buffer (0.05M, pH 8.0) and 1 ml of dimethylformamide (DMF) stirred at room temperature and 100% of a solution obtained by treatment of 23 mg methotrexate in 2 ml DMF with 21 ¿d triethylamine and 15 # 1 i-butyl- chloroformate at room temperature for 30 minutes, was added. Among- The mixture was stirred for two hours at room temperature and then dialyzed against 2 x 2 liters of sodium orthophosphate buffer (0.05 M, pH 7.4, containing sodium chloride 0.1 M and sodium azide 0.05% by weight) for 24 hours. Loose- was then passed through a column of Sephadexd§ (¥ Q5 equilibrium setting with the same buffer and the ferritin-containing fractions were combined wch was adjusted to 10 ml with the buffer solution.

Den erhållna lösningen är lämplig för användning vid en enzymimmunoanalys för bestämning av ferritin. .- är" 5. V Penn, QïïAtiTﬁrg.The resulting solution is suitable for use in a enzyme immunoassay for the determination of ferritin. .- is "5. V Penn, QïïAtiT ﬁ rg.

Claims

447 026 PATENT CLAIMS

A method for determining an immunologically active material in a sample, characterized in that the sample is contacted with a receptor which can specifically bind the immunologically active material, with the immunologically active material labeled with an enzyme inhibitor and with an enzyme and an enzyme substrate, and wherein the size or character of the resulting enzyme activity is measured and compared with that obtained as a standard.

A method according to claim 1, characterized in that the receptor is an antibody.

3. A method according to claims 1 or 2, characterized in that the inhibitor is an inhibitor of the enzyme dihydrofolate reductase.

4. A method according to any one of claims 1-3, characterized in that the inhibitor is methotrexate and the enzyme is dihydrofolate reductase.

5. A method according to any one of claims 1-4, characterized in that the immunologically active material is a hapten.

Method according to claim 5, characterized in that the hapten is digoxin and that the receptor is an antibody to digoxin.

7. A method according to claim 5, characterized in that the hapten is morphine and the receptor is an antibody to morphine.

A method according to any one of claims 1-4, characterized in that the immunologically active material is a protein. P 901% QUALITY 447 026

9. A method according to claim 8, characterized in that the protein is human serum albumin and the receptor is an antibody to human serum albumin. POOR QUALITY