DE2808515C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen 1 bis 5 beschriebene Verfahren zur Durchführung von Bestimmungsmethoden mit biospezifischen Affinitätsreaktionen, vorzugsweise immunchemischen Reaktionen, sowie das in den Patentansprüchen 6 und 7 beschriebene Reagens zur Verwendung in diesem Verfahren.

Es sind eine große Anzahl von Bestimmungsmethoden mit biospezifischen Affinitätsreaktionen bekannt, in erster Linie solche, welche immunchemische Bestimmungsmethoden betreffen. Bei einer Gruppe derartiger Methoden wird ein wasserunlösliches Polymermaterial verwendet, an das ein Antikörper oder ein Antigen, beispielsweise ein polypeptidhaltiges Antigen, oder irgendeine andere Komponente, gebunden wird. So ist es z. B. aus den SE-PS 3 43 949 und 3 41 239, aus Biochim. Biophys. Acta, Bd. 130, Seite 257 (1966) sowie "Radioimmunoassay Methods" (herausg.: K. E. Kirkham und W. M. Hunter, Churchil Livingstone, London 1971), z. B. Seite 405 bis 412 des Artikels "Solid Phase Antigen Antibody Systems" von L. Wide, bekannt, ein wasserunlösliches Polymermaterial zu verwenden, an das ein Antikörper oder ein Antigen mit Bindungen kovalenter Art gebunden wird. Ferner ist aus der US-PS 36 45 346 eine immunchemische Bestimmungsmethode bekannt, bei der an die Innenfläche von Kunststoff-Teströhrchen adsorbierte Antikörper benutzt werden.

Ein weiteres Beispiel der Bildung eines unlöslichen immunchemischen Konjugats ist in diesem Zusammenhang die sogenannte "doppelte Antikörper-Methode".

Bei einer Art dieser immunchemischen Bestimmungsmethoden wird ein an das Polymermaterial gebundener Antikörper gegen ein Antigen gerichtet, welches bei der Bestimmungsmethode verwendet wird und immunchemisch an dem Antikörper auf dem Polymermaterial gebunden ist. Das an den Antikörpergebundene Antigen kann seinerseits mit einem Antikörper in Lösung reaktionsfähig sein. Gemäß einer anderen Art dieser Methoden wird ein an das Polymermaterial gebundenes Antigen mit einem gegen das Antigen gerichteten Antikörper zur Umsetzung gebracht, oder das Antigen wird mit einem derartigen Antikörper umgesetzt, der seinerseits mit beispielsweise einem Antigen in Lösung umgesetzt werden kann.

Bei der Durchführung der infragestehenden immunchemischen Bestimmungsmethoden ist es ferner bekannt, vorzugsweise eine der bei der Bestimmungsmethode verwendeten Komponenten, die nicht direkt an das Polymer gebunden ist, mit einem analytisch nachweisbaren Atom oder einer derartigen Gruppe zu markieren, beispielsweise mit einem radioaktiven Atom oder einer radioaktiven Gruppe, einer fluoreszierenden, lumineszierenden oder chromophoren Gruppe oder aber einer enzymatisch aktiven Gruppe. Immunchemische Bestimmungsmethoden, bei denen eine Komponente mit einer enzymatisch aktiven Gruppe markiert wird, sind aus Clin. Chem., Bd. 22, Nr. 8 (1976), S. 1243 bis 1255 bekannt.

Es sind viele Varianten derartiger Bestimmungsmethoden (einschließlich analoger Methoden unter Verwendung anderer Komponenten I und II mit gegenseitiger biospezifischer Affinität als lediglich immunchemische Komponenten) bekannt, bei denen eine markierte Komponente, z. B. ein markiertes Antigen, markiertes Hapten, markierter Antikörper oder markiertes Protein A verwendet werden. So können beispielsweise (a) polymergebundene Antikörper mit dem Antigen der Probe und mit markiertem Antigen umgesetzt werden, oder (b) polymergebundene Antikörper werden mit dem Antigen der Probe auf solche Weise umgesetzt, daß das Antigen an den polymergebundenen Antikörper gebunden wird, wonach markierte Antikörper zugegeben werden, welche sich an das gebundene Antigen binden, oder (c) das polymergebundene Antigen wird mit einem Antikörper der Probe auf solche Weise umgesetzt, daß sich der Antikörper an das Antigen bindet, wonach markiertes Antigen zugegeben wird, welches sich an den gebundenen Antikörper bindet, oder (d) das polymergebundene Antigen wird mit dem Antikörper der Probe auf solche Weise umgesetzt, daß sich der Antikörper an das richtige Antigen bindet, wonach gegen die zuerst genannten Antikörper gerichtete markierte Antikörper zugegeben werden und sich an diese binden. Die polymergebundenen Antikörper können auch über Antigen an das Polymere gebunden sein, und die polymergebundenen Antigene können auch über Antikörper an das Polymer gebunden sein. Die Antikörper können einer oder mehreren Immunglobulinklassen angehören. Was hinsichtlich der Bestimmungsmethoden mit Antigenen und Antikörpern gesagt wurde, trifft auch für analoge Bestimmungsmethoden mit anderen Komponenten I und II zu.

Es ist gut bekannt, daß derartige Bestimmungen vorzugsweise in Gegenwart einer wäßrigen Flüssigkeit, z. B. einer Pufferlösung mit einem geeigneten pH-Wert und einer geeigneten Ionenstärke, durchgeführt werden.

Zur Markierung der Komponente I, z. B. des Antigens oder Antikörpers, mit einer analytisch nachweisbaren Gruppe ist es möglich, das Antigen bzw. den Antikörper direkt mit der markierten Gruppe chemisch zu kuppeln oder eine Brücke zwischen diesen einzuführen. Um diese chemische Umsetzung herbeizuführen, können z. B. Aminogruppen in dem einen und Carboxylgruppen in dem anderen Reaktanden verwendet werden, oder es können in beiden Reaktanden Aminogruppen benutzt werden. Beim Kuppeln (Konjugieren) mit Hilfe einer Brücke ist es bekannt, z. B. solche Reagentien wie Glutardialdehyd, Bromcyan und Carbodiimide zu verwenden. Die auf diese Weise zwischen dem Antigen, den Antikörpern oder anderen Komponenten I und der analytisch nachweisbaren Gruppe gebildeten kovalenten Bindungen sind von dauernder Art, d. h. es ist nicht beabsichtigt, sie aufzuspalten.

Wenn unlösliche Träger verwendet werden, an die ein Antikörper, ein Antigen oder irgendeine andere Komponente mittels kovalenter Bindungen gebunden sind, so sind diese Bindungen ebenfalls von dauernder Art. In diesem Fall wird der Träger zuerst durch Einführung reaktionsfähiger Gruppen aktiviert, wonach der aktivierte Träger mit dem Antikörper, Antigen usw. zur Umsetzung gebracht wird. Es kann nicht erwartet werden, daß alle reaktionsfähigen Gruppen Bindungen mit dem Antikörper, dem Antigen usw. eingehen, und trotz einer nachfolgenden Behandlung zur Überführung restlicher reaktionsfähiger Gruppen in inertere Gruppen sind die restlichen reaktionsfähigen Gruppen ein vermutlicher Grund für das nichtspezifische Binden von Komponenten, wie z. B. Antigenen und Antikörpern, in einer Probe und ferner der markierten, auf den Träger gerichteten Komponente, das bei dieser Art der Bestimmungsmethode festgestellt wurde. Da eine markierte Komponente, zusätzlich zur Tatsache, daß sie selbst nichtspezifisch gebunden wird, fähig ist, bei biospezifischen Affinitätsreaktionen mit nicht-spezifisch gebundenen Komponenten zu reagieren, und infolgedessen die nicht-spezifisch gebundenen Komponenten nicht vom Träger abgewaschen werden können, können die Meßergebnisse beträchtlich verfälscht werden, insbesondere dann, wenn die zu bestimmende Komponente in sehr geringen Konzentrationen vorliegt.

Aus der US-PS 36 52 761 ist ein Verfahren zur Isolierung eines Antigens aus einer Lösung bekannt, bei dem die Lösung mit einem Konjugat in Berührung gebracht wird, welches einen anorganischen Träger enthält, an den kovalent über ein Silan ein mit dem Antigen komplexbildungsfähiger Antikörper gekoppelt ist, anschließend das Konjugat aus der Lösung gewonnen wird und das komplex gebundene Antigen aus dem Konjugat eluiert wird.

Aus der DE-OS 25 37 275 ist ein immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen bzw. Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten bekannt, bei dem man die Antigene durch Bindung an eine damit eine Reaktion eingehende Arbeitssubstanz markiert, die selbst oder mittels eines Bruchstückes davon leicht der Bestimmung zugänglich ist, das markierte Antigen mit der zu untersuchenden Substanz immunchemisch reagieren läßt und die freigesetzte Arbeitssubstanz oder deren der Bestimmung zugängliches Bruchstück direkt mißt. Bei diesem bekannten Verfahren kann zur Freisetzung des der Bestimmung zugänglichen Bruchstückes der Arbeitssubstanz, d. h. der analytisch nachweisbaren Gruppe, eine hydrolytische Spaltung einer kovalenten Bindung erfolgen. Da jedoch auch Proteine, wie die Antigene und Antikörper, gegenüber einer Hydrolyse empfindlich sind, ist dieses Verfahren nicht besonders brauchbar.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Reagens zur Durchführung von Bestimmungsmethoden mit biospezifischen Affinitätsreaktionen, vorzugsweise immunchemischen Reaktionen, bei denen eine mit zumindest einer analytisch nachweisbaren Gruppe markierte und in der Flüssigkeit, in deren Gegenwart die biospezifische Affinitätsreaktion durchgeführt wird, lösliche Komponente I, vorzugsweise eine immunchemische Komponente I, mit einer Komponente II, die gegenüber I biospezifische Affinität zeigt, vorzugsweise mit einer immunchemischen Komponente II, und wahlweise ferner einer oder mehreren zusätzlichen Komponenten, welche gegenüber I und/oder II biospezifische Affinität aufweisen, vorzugsweise immunchemischen Komponenten, unter Bildung eines unlöslichen Konjugats, in das die markierte Komponente I eingeschlossen ist, zur Umsetzung gebracht wird, wobei die analytisch nachweisbare Gruppe mit einer spaltbaren Bindung kovalenter Natur an die Komponente I gebunden und/oder eine der Komponenten mit einer spaltbaren Bindung kovalenter Natur an einen in der Flüssigkeit unlöslichen Träger gebunden ist, und wobei die spaltbaren Bindungen, die gleich oder verschieden sein können, unter Bedingungen spaltbar sind, welche praktisch keinen störenden Einfluß auf die angewandte Bestimmungsmethode ausüben, bereitzustellen, bei dem Störungen, die von unspezifisch gebundenen Komponenten mit biospezifischer Affinität ausgehen oder durch hydrolytische Spaltung von Proteinen bewirkt werden, verhindert oder jedenfalls vermindert werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß im Hinblick auf das Verfahren dadurch gelöst, daß als spaltbare Bindung eine Bindung -S-S- oder

verwendet wird, die durch Reduktion bzw. Oxidation spaltbar ist, und daß das unlösliche Konjugat von der Flüssigkeitsphase abgetrennt wird und an der spaltbaren Bindung oder den spaltbaren Bindungen in Gegenwart einer Flüssigkeit unter Bildung von Fragmenten gespalten wird, die in der Flüssigkeit löslich sind und die analytisch nachweisbare Gruppe enthalten, welch'letztere sodann in der Flüssigphase bestimmt wird.

Im Hinblick auf das Reagens wird die Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß dieses eine markierte immunchemische Komponente I enthält, welche ein Multikonjugat einer Vielzahl von analytisch nachweisbaren Gruppen darstellt, welche über Verbindungsglieder aneinander gebunden sind, die durch Reduktion oder Oxidation spaltbare kovalente Bindungen der Formel -S-S- bzw.

enthalten, und welche, vorzugsweise mit durch Reduktion oder Oxidation spaltbare Bindungen der Formel -S-S- bzw.

enthaltenden Verbindungsgliedern, an die immunchemische Komponente gebunden sind. Im vorliegenden werden unter dem Begriff "immunchemische Komponente" Immunglobuline (einschließlich modifizierter Immunglobuline, wie z. B. aggregierte Immunglobuline, sowie Fragmente, wie z. B. Fab- oder Fc-Fragmente), vorzugsweise Antikörper, und Antigene sowie Haptene verstanden.

Beispiele für Komponenten I und II, welche gegenseitige biospezifische Affinität zeigen, sind Antigene (oder Haptene) und gegen diese gerichtete spezifische Antikörper. Andere Beispiele umfassen (a) Protein A (von S. aureus) und dessen Fragmente, die den Fc-Teil von zur IgG-Klasse gehörenden Immunglobulinen binden können; (b) C1q, welches beispielsweise sich an in der Wärme aggregiertes IgG binden kann; (c) Lectine (wie z. B. Concanavalin A), die z. B. an spezifische Kohlenhydratstrukturen in beispielsweise Biopolymeren gebunden werden können; (d) Enzyminhibitoren, welche sich an ihre Enzyme binden können; (e) physiologisch oder pharmazeutisch aktive Substanzen, die fähig sind, sich an entsprechende Rezeptoren zu binden; (f) Viren, insbesondere Bakteriophagen, die sich an Zellwand-Substanzen binden können. Auf dem biochemischen Gebiet gibt es viele andere Beispiele derartiger Stoffpaare, welche eine gegenseitige biospezifische Affinität aufweisen.

Im vorliegenden umfaßt die Angabe, daß die markierte Komponente I in der Flüssigkeit, in deren Gegenwart die biospezifische Affinitätsreaktion durchgeführt wird (d. h. in der Regel in Wasser oder in einer wäßrigen Flüssigkeit), löslich ist, beispielsweise auch, daß sie in dieser Flüssigkeit kolloidal dispergierbar sein kann oder auf einem anderen Weg in Form von Teilchen vorliegen kann, welche ausreichend klein sind, um sich selbst in der Flüssigkeit suspendiert zu halten.

Im vorliegenden werden unter dem Begriff "Bedingungen, die praktisch keinen störenden Einfluß auf die angewandte Bestimmungsmethode ausüben" beispielsweise Bedingungen verstanden, die nicht zu einer beträchtlichen Verminderung der Aktivität der analytisch nachweisbaren Gruppe führen, sowie Bedingungen, welche das Reagens, mit dem die analytisch nachweisbare Gruppe während dem Bestimmungsverfahren umgesetzt wird, oder andere Teile des angewandten Meßsystems beeinträchtigen.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßeen Verfahrens liegt darin, daß Strahlungs-Absorptionseffekte, die bei einem festen Konjugat auftreten, vermieden werden können, was besonders vorteilhaft ist, wenn beispielsweise eine fluoreszierende oder lumineszierende Gruppe, eine chromophore oder radioaktive Gruppe, wie z. B. eine β-Strahlungsgruppe, als analytisch nachweisbare Gruppe verwendet wird. In dieser Hinsicht wird besonders bevorzugt die Bindung zwischen der analytisch nachweisbaren Gruppe und der Komponente I gespalten und weniger bevorzugt eine Spaltung zwischen dem Träger und der an ihn gebundenen Komponente durchgeführt, da im ersteren Fall Strahlungs-Absorptionseffekte durch andere Bestandteile des Konjugats vermieden werden können.

Entsprechendes gilt auch dann, wenn die analytisch nachweisbare Gruppe eine enzymatisch aktive Gruppe ist. So zeigen Enzyme, welche als analytisch nachweisbare Gruppen an irgendein anderes Makromolekül gekuppelt sind, oft eine geringere Aktivität als die entsprechenden nativen Enzyme. Diese Aktivitätsverminderung beruht auf der Tatsache, daß das Enzym, als Ergebnis der Kupplung, sterisch daran gehindert wird, auf sein Substrat einzuwirken. Ein weiterer Grund kann die Diffusionssteuerung sein, die oft in der dem Enzymkonjugat am nächsten liegenden Wasserschicht auftritt. Durch Freisetzung der Enzymmarkierung kann die Aktivität in der Flüssigphase gemessen werden, wodurch eine optimale Enzymaktivität erhalten wird. Dies ermöglicht auch die Verwendung von wasserunlöslichen Substraten für die Enzymbestimmung. Infolgedessen können erfindungsgemäß als Markierungssubstanz nicht nur Enzyme (wie z. B. Hydrolasen, Oxidasen und Reduktasen), welche bisher als Markierungssubstanzen bei immunochemischen Bestimmungsmethoden verwendet wurden, sondern auch auf Substrate hohen Molekulargewichtes, sogar unlösliche Substrate einwirkende Enzyme benutzt werden. Vorzugsweise ist die enzymatisch aktive Gruppe der einzige Teil im Konjugat, der über eine der erfindungsgemäß verwendeten spaltbaren Bindungen gebunden ist.

Das Verfahren bietet auch Vorteile unter dem Gesichtspunkt der Meßtechnik, da die markierte Substanz in flüssiger Phase zwischen Gefäßen transportiert werden kann, anstelle der weniger leicht zu handhabenden festen Form, was eine Automatisierung der Analyse erleichert. Vorzugsweise ist die beim Spalten verwendete flüssige Phase eine wäßrige Flüssigkeit, wie z. B. eine Pufferlösung, von geeignetem pH-Wert und geeigneter Ionenstärke.

Die in der Mehrzahl der Fälle am meisten bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist diejenige Variante, bei der lediglich die Bindung zwischen der Komponente I und der analytisch nachweisbaren Gruppe spaltbar ist, und bei der diese Bindung im Verlauf der Bestimmung gespalten wird. Die Ausführungsform mit einer spaltbaren Bindung zwischen einer Komponente II und einem unlöslichen Träger ist in solchen Fällen von besonderem Wert, wo eine Störung infolge unspezifischer Adsorption der markierten Komponente I an der Feststoffphase auftritt. Die spaltbare Bindung kann in diesem Fall die einzige spaltbare Bindung sein, jedoch ist es in vielen Fällen von besonderem Vorteil, daß auch die Bindung zwischen der Komponente I und der nachweisbaren Gruppe, bzw. den nachweisbaren Gruppen, spaltbar ist; in diesem Falle wird für diese Bindung die andere spaltbare Bindung verglichen mit derjenigen zwischen der Komponente II und dem unlöslichen Träger ausgewählt, wobei der besondere Vorteil erhalten wird, daß die beiden Spaltungen in zwei verschiedenen Stufen durchgeführt werden können.

Die spaltbaren Bindungen können durch Reduktion bzw. Oxidation gespalten werden. Die erfindungsgemäß bevorzugt verwendete Disulfidbindung -S-S- kann durch Reduktion gespalten werden. Die Bindung mit vizinalen Diol-Strukturen kann oxidativ mit Natriumperiodat gespalten werden.

Eine -S-S--Bindung kann erhalten werden, indem man eine oder mehrere Thiolgruppen, falls sie nicht bereits vorliegen, in eine der beiden miteinander zu kuppelnden Substanzen einführt, und in das andere Molekül eine oder mehrere Disulfidstrukturen, die für den Thiol-Disulfid-Austausch aktiviert sind; wenn beispielsweise eine Thiolgruppe in die Markierungssubstanz eingeführt wird, sollte die Substanz mit biospezifischer Aktivität, die mit der Markierungssubstanz gekuppelt wird, mit der Disulfidstruktur versehen werden, und umgekehrt. Die beiden Arten modifizierter Substanzen werden sodann miteinander in Berührung gebracht, wobei sie über eine Thiol-Disulfid-Austauschreaktion mit -S-S--Bindungen aneinander gebunden werden.

Vorzugsweise befindet sich auf beiden Seiten der -S-S--Brücke ein Kohlenstoffatom, welches einen Teil einer aliphatischen oder aromatischen Gruppe bilden kann. Diese Kohlenstoffatome sind ihrerseits vorzugsweise an zumindest 1 Kohlenstoffatom gebunden. Die restlichen Bindungen der zuerst genannten Kohlenstoffatome sind vorzugsweise mit Wasserstoffatomen abgesättigt. Jedes der zuerst genannten Kohlenstoffatome kann z. B. in die Gruppe -CH₂- und/oder

einbezogen sein, wo das Kohlenstoffatom in einem aromatischen Ring, wie z. B. einem Benzolring, liegt. Infolgedessen liegt die Disulfid-Brücke vorzugsweise in einer Gruppe der Formel

worin eine der restlichen Bindungen eines jeden dieser Kohlenstoffatome an ein weiteres Kohlenstoffatom gebunden ist und restliche Bindungen eines jeden Kohlenstoffatoms an Wasserstoff und/oder Kohlenstoff gebunden sind.

Zur Einführung der Thiolgruppen können bekannte Thiolierungsmittel verwendet werden, wie z. B. ein Thiolimidat der

worin R die Methyl- oder Ethylgruppe, und n eine ganze Zahl von 1 bis 10, vorzugsweise 2 bis 4, bedeuten, oder N-Acetylhomocystein-thiolacton.

Die Umsetzung wird in wäßriger Lösung in schwach alkalischer Umgebung (pH-Wert: 7 bis 9) und bei einer Temperatur von 15 bis 30°C mit einem hohen Überschuß an Thiolierungsmittel durchgeführt.

Zur Einführung einer für den Thiol-Disulfid-Austausch aktivierten Disulfid-Struktur können z. B. bekannte Disulfide verwendet werden, deren entsprechende reduzierte Form ein geringes S-nukleophiles Verhalten aufweist, in Abhängigkeit von der Resonanzstabilisierung oder der Thiol-Thion-Tautomerie, und die mit den Thiolgruppen aufweisenden Substanzen umzusetzen sind. Beispiele für derartige Disulfide sind 2,2′-Dipyridyl-disulfid, 4,4′-Dipyridyl-disulfid und entsprechende Verbindungen, die in der Pyridylgruppe substituiert sind, bei denen die Substituenten von solcher Art und in einer solchen Stellung sind, daß die Thiol-Thion-Tautomerie nicht gestört wird, beispielsweise solche mit einer Nitro- oder Carboxylgruppe in der 5-Stellung.

Die Umsetzung der thiolhaltigen Substanz mit dem Disulfid der zuvor genannten Art wird in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 2 bis 9 und einer Temperatur von 15 bis 30°C mit einem hohen Überschuß an Disulfid durchgeführt.

Vorzugsweise wird jedoch sowohl für die Thiolierung als auch die Einführung einer aktivierten Disulfidstruktur ein heterobifunktionelles Reagens der Formel

R¹-S-S-A-Z (I)

verwendet, in der R¹ einen 2-Pyridyl-, 5-Nitro-2-pyridyl- oder 4-Pyridylrest, A einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 10, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Z eine der Gruppen

oder ein Säureanlagerungssalz der zuletzt genannten Gruppen bedeuten, worin n 2 oder 3, R¹ die gleiche Bedeutung wie R¹ weiter oben besitzt und diesem gleich ist, und R² die Methyl- oder Ethylgruppe darstellt.

Die Verbindungen der Formel I können auf eine Anzahl verschiedener Wege hergestellt werden. Die derzeit bevorzugten Verfahren sind folgende:

Verbindungen der Formel I, bei denen Z die Gruppe

bedeutet, werden hergestellt, indem man ein Disulfid der allgemeinen Formel

R¹-S-S-A-COOH (II)

worin R¹ und A die zuvor genannten Bedeutungen besitzen, falls n = 2 sein soll, mit N-Hydroxysuccinimid (oder, falls n = 3 sein soll, mit der analogen Verbindung, bei der n = 3 ist) in Gegenwart eines Kondensationsmittels umsetzt.

Die Reaktion wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 10 bis 30°C durchgeführt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist z. B. Methylenchlorid, Ethylenacetat und Dioxan. Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von der Auswahl der Reaktionskomponenten und -temperatur.

Das Kondensationsmittel kann ein solches sein, das üblicherweise bei Veresterungen benutzt wird, wie z. B. N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid.

Die Ausgangsverbindung der Formel II kann hergestellt werden, indem man eine Mercaptoalkylcarbonsäure der Formel III

HS-A-COOH (III)

mit einem Dipyridylsulfid der Formel

R¹-S-S-R¹ (IV)

umsetzt, wobei A und R¹ die zuvor genannten Bedeutungen besitzen.

Diese Umsetzung wird in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur von 10 bis 30°C durchgeführt. Ein geeignetes Lösungsmittel ist z. B. Ethanol, Ethylacetat und Dioxan.

Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von den ausgewählten Reaktionskomponenten und der Reaktionstemperatur.

Verbindungen der allgemeinen Formel I, bei denen Z die Gruppe

bedeutet, werden hergestellt durch Umsetzung eines Disulfids der Formel II mit einem entsprechenden Thiopyridon in Gegenwart eines Kondensationsmittels in einem organischen Lösungsmittel bei einer anfänglich niederen Temperatur, beispielsweise -20°C, während annähernd 1 bis 2 Stunden, und danach bei Umgebungstemperatur (z. B. 20°C). Ein in dieser Hinsicht geeignetes Lösungsmittel ist z. B. Methylenchlorid, Ethylacetat und Dioxan. Das vorzugsweise verwendete Kondensationsmittel ist N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid.

Das bevorzugt verwendete Ausgangsmaterial ist ein Gemisch, welches durch Umsetzung einer Verbindung der Formel III mit einer Verbindung der Formel IV erhalten wurde.

Verbindungen der Formel I, bei denen Z die Gruppe

bedeutet, werden hergestellt durch Umsetzung eines Thiolimidats der Formel

worin R² und A die zuvor genannten Bedeutungen besitzen, mit einem Pyridyldisulfid der Formel R¹-S-S-R¹, worin R¹ die zuvor genannte Bedeutung besitzt, in einem organischen Lösungsmittel. Das Lösungsmittel kann z. B. Methanol sein, welches etwa 10% Eisessig enthält.

Die Verwendung dieser Reaktanden kann durch folgendes Reaktionsschema veranschaulicht werden, bei dem als Beispiel für einen geeigneten bifunktionellen Reaktanden N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat gewählt wurde:

In den obigen Formeln steht -NH₂ beispielhaft für eine immunochemische reaktionsfähige Komponente I oder eine andere Komponente I mit einer biospezifischen Affinität zu einer Komponente II, während -NH₂ beispielhaft für eine nachweisbare Gruppe, wie z. B. ein Enzym oder eine ein oder mehrere radioaktive Atome enthaltende Gruppe, steht. Es ist möglich, bei der Reduktion in der Stufe C, oben, Dithiothreit (im folgenden als DTT abgekürzt) zu verwenden. Mit diesem Reduktionsmittel ist es möglich, z. B. eine proteingebundene Pyridyldisulfidstruktur ohne gleichzeitige Reduktion nativer Disulfidbrücken, welche im Protein auftreten können, zu reduzieren. Dies wird dadurch erreicht, daß man die Reduktion bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 5 mit einem Überschuß an DTT oder bei einem höheren pH-Wert mit einem geringeren Überschuß oder äquimolaren Mengen an DTT durchführt.

Der Substitutionsgrad von Thiol- oder Disulfidgruppen in beispielsweise einem Protein kann verhältnismäßig leicht bei dieser Derivatisierungsmethode (Formel B, oben) reguliert werden, indem man den molaren Überschuß an Reagens oder den pH-Wert innerhalb des Bereichs von 5 bis 8 variiert.

Beispielsweise können bimolekulare Konjugate, welche z. B. ein Enzymmolekül (als die nachweisbare Gruppe) und ein anderes Proteinmolekül mit biospezifischer Affinität (wie z. B. einen Antikörper) enthalten, hergestellt werden, indem man 1 Thiolgruppe und 1 Disulfidstruktur in die jeweiligen Moleküle einführt und die modifizierten Moleküle mittels Thiol-Disulfid-Austausch zur Reaktion bringt. Da der Thiol-Disulfid-Austausch ein Thiol und eine reaktionsfähige Disulfidstruktur erfordert, und nur eine dieser Gruppen in jedem Molekül anzutreffen ist, können Konjugate, welche lediglich eine Molekülart umfassen, vermieden werden. Auf ähnliche Weise können oligomolekulare oder polymolekulare Konjugate erhalten werden.

Besonders vorteilhaft ist die Auswahl eines Enzyms als nachweisbare Gruppe, welches zumindest eine native HS-Gruppe enthält, von der man für die Bildung einer spaltbaren Disulfidbrücke Gebrauch macht; in diesem Fall kann eine Derivatisierung vermieden und das Enzym in seiner nativen Form mit voller Aktivität nach Reduktion der Disulfidbrücke erhalten werden.

Natürlich können auf ähnliche Weise andere markierte Komponenten I mit anderen nachweisbaren Gruppen mit einer spaltbaren Bindung zwischen der nachweisbaren Gruppe und der Komponente I erhalten werden. Auch können Komponenten II an einen unlöslichen Träger über eine spaltbare Bindung unter Anwendung ähnlicher Verfahren gebunden werden.

Die zuvor genannten Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen können in einer wäßrigen Umgebung bei einem pH-Wert von 2 bis 8 und einer Temperatur von 15 bis 30°C durchgeführt werden.

In manchen Fällen kann es erwünscht sein, eine direkte Konjugation der analytisch nachweisbaren Gruppe an Komponenten mit biospezifischer Aktivität zu vermeiden. Z. B. können die beiden Molekülarten in nachteiliger Weise auf ihre gegenseitige Aktivität, beispielsweise durch eine hydrophobe Wechselwirkung und/oder Ladungseffekte, einwirken. In derartigen Fällen kann es geeignet sein, einen löslichen Träger sowohl für die analytisch nachweisbare Gruppe als auch die Komponente I mit biospezifischer Affinität zu verwenden, wobei diese Gruppe und diese Komponente jeweils über Brücken der zuvor genannten Art, welche die Gruppe -S-S- enthalten, an den löslichen Träger gekuppelt werden, wodurch sie voneinander getrennt werden. Die Empfindlichkeit eines Tests auf Basis derartiger Konjugate kann erhöht werden, indem man eine große Anzahl analytisch nachweisbarer Gruppen an einen löslichen Träger bindet, an den auch ein Molekül oder wenige Moleküle der Komponente I mit biospezifischer Affinität gekuppelt werden.

Der zuvor genannte lösliche Träger kann z. B. Dextran, ein Dextranderivat, ein Biopolymer, das in dem System inert ist, oder ein anderes Polymeres, welches in der Flüssigkeit, in deren Gegenwart die biospezifische Affinitätsreaktion durchgeführt wird, löslich ist, sein. (In diesem Fall kann eine Bindung in dem löslichen Träger eine spaltbare Bindung, wie z. B. eine glycosidische Bindung sein, die leicht durch eine Glycosidase, wie Dextranase, wenn der lösliche Träger Dextran umfaßt, gespalten werden kann.)

Die Kupplung wird z. B. durch Einführung von Disulfidstrukturen in den Träger und von HS-Gruppen in die Markierung und in die Komponente I bewirkt, welche sodann an das Polymere durch eine Thiol-Disulfid-Austauschreaktion gekuppelt werden. Zur Kupplung sowohl der Komponente I als auch der Markierung an den wasserlöslichen Träger kann man auch andere bekannte Verfahren zum Kuppeln derartiger Substanzen an Träger anwenden, da es für beide Substanzen nicht erforderlich ist, daß sie von dem wasserlöslichen Träger abspaltbar sind.

Die Disulfidbrücke -S-S- kann leicht unter milden Bedingungen mit Hilfe von z. B. DTT als Reduktionsmittel auf solch' eine Weise aufgespalten werden, daß die nachweisbare Gruppe in einer flüssigen Phase freigesetzt wird und dort bestimmt werden kann; infolgedessen ist die Brücke -S-S- als spaltbare Bindung besonders geeignet.

Wenn bei der Analyse eine besonders hohe Empfindlichkeit erwünscht ist, kann gemäß einer wertvollen Ausführungsform der Erfindung eine markierte Komponente I verwendet werden, welche ein Multikonjugat einer Vielzahl von analytisch nachweisbaren Gruppen umfaßt, die über Verbindungsglieder mit erfindungsgemäß verwendbaren spaltbaren kovalenten Bindungen (d. h. Disulfidbrücken -S-S- oder vizinalen Diolstrukturen) miteinander verbunden sind, wobei das Multikonjugat nachweisbarer Gruppen seinerseits an die Komponente I gebunden ist, und zwar vorzugsweise mit Verbindungsgliedern, die erfindungsgemäß verwendbare spaltbare Bindungen, z. B. Disulfidbrücken -S-S-, enthalten.

Bindungen, welche vizinale Diolstrukturen

enthalten, können z. B. mit Hilfe bifunktioneller Mittel der Art

hergestellt werden.

Wenn eine der Komponenten, welche an der Affinitätsreaktion teilnehmen, an einen Träger gebunden ist, der in der Flüssigkeit unlöslich ist, in deren Gegenwart diese Reaktionen durchgeführt werden, kann der Träger prinzipiell ein beliebiges derartiges Trägermaterial umfassen, welches im Zusammenhang mit bislang bekannten Verfahren dieser Art, welche im einführenden Teil erwähnt wurden, bekannt ist. Beispiele für derartige Trägermaterialien sind unlösliche organische oder teilweise anorganische Polymere, wie z. B. Cellulose, vernetztes Dextran, Agarose, vernetztes Polyacrylamid, vernetztes Polystyrol sowie Glasderivate. Wenn die Bindung zwischen diesem Träger und der hieran gebundenen Komponente nicht erfindungsgemäß abgespalten werden soll, kann die Bindung eine herkömmliche Bindung sein, d. h., daß sie eine Bindung kovalenter Art vom herkömmlichen Typ oder eine sogenannte hydrophobe Bindung umfassen kann. Auf entsprechende Weise kann die Bindung zwischen der analytisch nachweisbaren Gruppe und der Komponente I eine herkömmliche Bindung sein, wenn eine erfindungsgemäß spaltbare Bindung zwischen der Komponente II und einem festen Träger vorhanden ist, und wenn es nicht für erforderlich erachtet wird, die zuerst genannte Bindung zu spalten.

Nachfolgende Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 Quantitative Bestimmung von Salmonella-Antikörpern in Humanserum mit Kaninchen-Antihuman-Fcγ-a-Amylase-Konjugat (a) Herstellung von Kaninchen-Antihuman-Fcγ-α-Amylase-Konjugat

Eine durch Ionenaustauschchromatographie an Perlen aus diethylaminoethylhaltigem, mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gereinigte α-Amylase wurde in 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer gelöst. Die Lösung wurde mit 0,7 ml N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (11 mMol in 99,5%igem Ethanol) versetzt. Nach dem Schütteln ließ man die Umsetzung 60 Minuten bei 23°C fortschreiten. Überschüssige Reagentien und andere unerwünchste Komponenten mit niederem Molekulargewicht wurden sodann durch Gelfiltration an Perlen aus Dextran, welches mit Epichlorhydrin vernetzt war, entfernt; (das benutzte Medium war der gleiche zuvor genannte Phosphatpuffer).

4,8 mg Kaninchen-Antihuman-Fcγ-Antikörper (hergestellt aus Kaninchenserum durch Immunsorptionsreinigung) in 2,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 wurden mit 13 µl einer 11 millimolaren N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat-Lösung in 99,5%igem Ethanol 60 Minuten bei +23°C umgesetzt. Überschüssiges Reagens wurde durch Gelfiltration an den zuvor genannten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran entfernt; das benutzte Medium war ein Puffer aus 0,1 M Natriumacetat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 5,0. Das eluierte Material, welches die modifizierten Antikörper enthielt, wurde während 20 Minuten mit 0,2 ml von 20 mMol Dithiothreit (im folgenden als DTT abgekürzt) (pH-Wert 5,0) reduziert. Überschüssiges DTT wurde durch Gelfiltration an den zuvor genannten Perlen entfernt; das verwendete Medium war 0,3 M NaCl. Die so thiolierten Antikörper, annähernd 2,1 mg in 3 ml 0,3 M NaCl, wurden mit dem auf zuvor beschriebene Weise hergestellten α-Amylase-2-pyridyldisulfidderivat (etwa 10 mg in 1,5 ml von 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5) vermischt. Man ließ die Umsetzung während 48 Stunden bei + 4°C fortschreiten, wonach unerwünschte Komponenten niedrigen Molekulargewichtes durch Gelfiltration an dem zuvor genannten mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran entfernt wurden (das verwendete Medium war 0,3 M NaCl).

N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat kann auf folgende Weise hergestellt werden.
1,9 g (8,5 mMol) 2,2′-Dipyridyl-disulfid wird in 10 ml Ethylacetat gelöst. Eine Lösung von 0,9 g (8,6 mMol) 3-Mercaptopropionsäure in 10 ml Ethylacetat wird unter Rühren während 15 Minuten tropfenweise zugegeben, wobei gleichzeitig 0,5 mg (2 Tropfen) Bortrifluoridetherat zum Reaktionsgemisch zugegeben werden. Nach 20 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch in einem Büchi-Umlaufverdampfer bei einer Temperatur von weniger als 40°C zur Trockne eingedampft, und der feste gelbe Rückstand wird in 10 ml Ethylacetat bei einer Temperatur von 4°C aufgeschlämmt und filtriert. Das Filtrat wird mit 0,68 g (5 mMol) N-Hydroxysuccinimid versetzt, wonach 1,03 g (5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 10 ml trockenem Ethylacetat, während 15 Minuten tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben werden. Man läßt bei Raumtemperatur unter Rühren die Umsetzung 5 Stunden fortschreiten, während das Reaktionsgemisch auf +4°C gekühlt wird, wonach das ausgefällte Dicyclohexylcarbamid abfiltriert wird. Die hellgelbe Lösung wird eingedampft, und das Öl wird in Ethanol aufgelöst und bei -20°C auskristallisieren gelassen. Die Ausbeute beträgt 45%; Schmelzpunkt: 78,5 bis 80,5°C.

(b) Quantitative Bestimmung von Salmonella-Antikörpern in Humanserum mit Kaninchen-Antihuman-Fcγ-α-Amylase-Konjugat

Salmponella O-Antigen des Typs D (9.12) wurde in kaltem 0,1 M Natriumcarbonatpuffer vom pH-Wert 9,6 mit einem Gehalt an 0,02% NaN₃ auf 5 µg/ml verdünnt. 1 ml Antigenlösung wurde in Polystyrolröhrchen zum einmaligen Gebrauch eingefüllt, und die Röhrchen wurden 16 Stunden bei 4°C inkubiert.

Humanserum [eine Reihe mit Serum, welches einem Patienten entnommen worden war, der mit Salmonella-Bakterien vom Typ Sero DO infiziert war, und eine Reihe mit normalem Humanserum (HNS)] wurde mit PBS [0,015 M Natriumphosphat vom pH-WErt 7,2, 0,05% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat 0,02% NaN₃ und 0,9% NaCl] auf das 100- bis 100 000fache verdünnt. Eine Anzahl von Röhrchen, welche gemäß den obigen Ausführungen vorbereitet worden waren, wurde mit 0,9% NaCl und 0,05% des zuvor genannten Polyoxyethylen-sorbitanmonooleats gewaschen. Man ließ die mit der Waschlösung gefüllten Röhrchen 1 oder 2 Minuten stehen, wonach man sie durch Absaugen mit einer Wasserstrahlpumpe leerte. Dies wurde 2× wiederholt.

1 ml verdünntes Serum wurde in jedes Röhrchen gefüllt (Doppeltest). Diese Röhrchen wurden sodann 4 Stunden bei 23°C inkubiert. Während dieses Inkubationszeitraumes binden sich Antikörper gegen das Salmonella-Antigen an den Teil der Röhrchenwand, welche mit dem Antigen beschichtet ist. Die Röhrchen wurden sodann abermals gewaschen, um alle anderen Serumkomponenten zu entfernen.

Zu den Röhrchen wurde ein Konjugat zugegeben, welches gemäß Absatz (a), oben, hergestellt worden und mit PBS auf das 100fache verdünnt war (1 ml in jedes Röhrchen). Die Röhrchen wurden sodann 16 Stunden inkubiert. Überschüssiges Konjugat wurde sodann unter Verwendung des Gleichen Waschverfahrens, welches zuvor angewandt worden war, abgewaschen.

Die α-Amylase wurde aus dem immunchemischen Komplex aus Antigen-Antikörper-(Antikörper-Enzym-Konjugat), der an das Röhrchen gebunden war, freigesetzt, indem man zu jedem Röhrchen 1 ml Dithiothreit (5 mM in PBS) gab. Nach der Inkubation während 20 Minuten bei 23°C wurde 1 ml Wasser und eine halbe Tablette einer aus einer wasserunlöslichen, vernetzten blauen Stärke in Tablettenform bestehenden Amylasesubstanz zugegeben. Die Röhrchen wurden kräftig geschüttelt und sodann 1 Stunde bei 37°C stehengelassen, wonach die Umsetzung durch Zugabe von 100 µl 5 M Natronlauge unterbrochen wurde. Nach Entfernung ungelösten Stärkepolymers durch Filtration wurde die Extinktion des blaugefärbten Filtrats bei 620 nm ermittelt, wodurch die freigesetzte Amylase gemessen wird.

Die erhaltenen Extinktionswerte sind in nachfolgender Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Hieraus ergibt sich, daß die Antikörper im auf das 10⁵fache verdünnten Serum des Patienten nachgeweisen werden konnten. Die Blindversuche ergaben sehr niedrige Extinktionen. Entsprechende Versuche, bei denen die reduktive Spaltung der α-Amylase vom an den Röhrchenwänden adsorbierten Immunokomplex ausgeschlossen wurde, ergaben eine Extinktion von [A₆₂₀/h] 0,01.

Beispiel 2 Quantitative Bestimmung von Salmonella-Antikörpern in Humanserum mit Kaninchen-Antihuman-Fcγ-α-Amylase-Konjugat

Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß die Enzymaktivität mit Hilfe löslicher Stärke bestimmt wurde. Zusätzlich wurde ein Paralleltest ausgeführt, ohne die reduktive Abspaltung der α-Amylase.

In diesem Test wurde anstelle einer halben Tablette des zuvor genannten Stärkeproduktes in jedes Röhrchen 1 ml Stärke (2% in PBS) gegeben. Nach Inkubation während 60 Minuten bei 37°C wurden 0,5 ml 3,5-Dinitrosalicylsäurelösung (hergestellt durch Auflösen von 1 g 3,5-Dinitrosalicylsäure in 40 ml NaOH + 30 ml H₂O und anschließende Zugabe von 30 g Kaliumnatriumtartrat und Verdünnen der Lösung mit H₂O auf 100 ml) zugegeben. Die Röhrchen wurden 5 Minuten in einem siedenden Wasserbad erwärmt, und 5 ml von jedem Röhrchen wurden sodann in Röhrchen gebracht, welche 5 ml destilliertes Wasser enthielten. Die Extinktion der erhaltenen Lösungen wurde nach 10 Minuten bei einem g = 500 nm bestimmt.

Die Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Extinktion

(Die Extinctionswerte wurden hinsichtlich der Wirkung des Dithiothreits korrigiert.)

Beispiel 3 Bestimmung von Kaninchen-Antihumanserumalbumin-Antikörpern mit Humanserumalbumin-α-Amylase-Konjugat (a) Herstellung von Albumin-α-Amylase-Konjugat

8 mg Humanserumalbumin in 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 wurden mit 12 µl N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (40 mMol in 99,5%igem Ethanol) vermischt. Nach Umsetzung während 40 Minuten bei 23°C wurde das Reaktionsgemisch an einer Säule mit den in Beispiel 1 (a) verwendeten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert; (das verwendete Medium war der gleiche Phosphatpuffer, wie oben beschrieben). Das eluierte Material, annähernd 2 ml, enthielt das Albumin-2-Pyridyldisulfidderivat. Eine spektrophotometrische Bestimmung der nach der Reduktion des Derivats freigesetzten Menge an 2-Thiopyridon zeigte einen Substitutionsgrad von 2,5 Mol Thiol/Mol Albumin.

20 mg α-Amylase wurden in 1,5 ml eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers vom pH-Wert 7,5 gelöst. 150 µl N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (40 mMol in 99,5%igem Ethanol) wurden zugegeben, und man ließ die Reaktion 60 Minuten bei 23°C fortschreiten. Überschüssiges Reagens und andere unerwünschte Komponenten niedrigen Molekulargewichts wurden durch Gelfiltration an den in Beispiel 1 (a) genannten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran entfernt; (das verwendete Medium war der gleiche Phosphatpuffer, wie oben verwendet).

Das gebildete α-Amylase-2-pyridyldisulfidderivat (20 mg in etwa 2,5 ml) wurde sodann 20 Minuten mit 10 mg Dithiothreit bei 23°C reduziert. Überschüssiges Dithiothreit wurde sodann durch Gelfiltration an Perlen aus dem zuvor genannten Material entfernt (das verwendete Medium war 0,3 M NaCl).

Die thiolierte α-Amylase (etwa 20 mg mit einem Gehalt von etwa 0,7 Mol SH/Mol Protein) in 3,5 ml einer 0,3 M NaCl-Lösung wurde mit 5,6 mg Albumin-2-pyridyldisulfidderivat in 1,4 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 vermischt. Man ließ die Umsetzung 18 Stunden bei 4°C fortschreiten. Das Reaktionsgemisch wurde sodann an vernetztem Dextrangel getrennt; (das verwendete Medium war 0,3 M NaCl-Lösung). Beim Analysieren der verschiedenen Fraktionen wurde aktives α-Amylasematerial mit einem Molekulargewicht gefunden, welches höher war als das von nativer α-Amylase. Das ermittelte Molekulargewicht entsprach Oligomeren, welche 1 Albuminmolekül und 1 bis 2 α-Amylasemoleküle umfaßten.

Diejenigen Fraktionen, welche das Konjugat enthielten, wurden vereint und in 0,3 M NaCl bei 4°C gelagert (annähernd 10 mg Protein/ml).

(b) Bestimmung von Kaninchen-Antihumanserumalbumin-Antikörpern mit Humanserumalbumin-α-Amylase-Konjugat

1 ml von 0,05 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7 mit einem Gehalt an 100 µg Humanserumalbumin (im folgenden abgekürzt als "HSA" bezeichnet) pro ml wurde in Teströhrchen aus Polystyrol zum einmaligen Gebrauch eingefüllt. Die Röhrchen wurden 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Sie wurden sodann 3× mit 2 ml Puffer, der 0,05 M Natriumphosphat vom pH-Wert 7,4, 0,3% Dextran, 0,9% NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat enthielt (im folgenden abgekürzt als "PDT-Puffer" bezeichnet) gewaschen. Das Kaninchen-AntiHSA-Serum wurde mit PDT-Puffer auf das 10- bis 10⁴fache verdünnt. Jeweils 0,5 ml jeder Verdünnung wurden in ein, wie zuvor beschrieben, behandeltes Röhrchen eingefüllt. Eine gleiche Anzahl von Blindversuchen wurde mit 0,5 ml normalem Kaninchenserum (im folgenden abgekürzt als "RNS" bezeichnet), das auf gleiche Weise verdünnt wurde, durchgeführt. Man ließ die Röhrchen 3 Stunden bei 23°C stehen. Sie wurden sodann 3× mit je 2 ml des PDT-Puffers gewaschen, wonach 0,5 ml des HSA-α-Amylase-Konjugats aus Teil (a), oben, zugegeben wurden. Die Röhrchen wurden sodann 16 Stunden bei 23°C inkubiert. Überschüssiges Konjugat wurde 3× mit 1 ml PDT-Puffer abgewaschen. Sodann wurden zu den Röhrchen 0,5 ml von 10 mMol Dithiothreit (DTT) in 0,05 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7 zugegeben. Nach 15 Minuten wurde die flüssige Phase in den Röhrchen in Röhrchen gebracht, welche 0,5 ml destilliertes Wasser mit einem Gehalt einer Vierteltablette der Amylasesubstanz aus Beispiel 1 (b) enthielten. Diese Röhrchen wurden 2 Stunden bei 37°C nach dem Schütteln inkubiert, wonach ungelöstes Stärkesubstrat abzentrifugiert, und die Extinktion des Überstandes bei 620 nm bestimmt wurde.

Die Ergebnisse zeigten, daß Kaninchen-AntiHSA-Antikörper mit dem verwendeten Serum in einem auf das 10⁴fache verdünnten Serum nachgewiesen werden konnten, während die Blindversuche mit RNS A₆₂₀-Werte von 10% der in dem Probenserum gefundenen Werte ergaben. Vergleichsversuche unter Weglassen des reduktiven Abspaltens der α-Amylase von dem an den Röhrchenwänden adsorbierten Immunokomplex ergaben eine Extinktion A₆₂₀ von 0,02.

Beispiel 4 Bestimmung von Kaninchen-Antihumanserumalbumin-Antikörpern mit Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-Dextran-α-Amylase-Konjugat (a) Herstellung von Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-Dextran-α-Amylase-Konjugat

1 g Bromhydroxypropyldextran wurde in 12,5 ml destilliertem Wasser gelöst, wonach 3,8 g Na₂S₂O₃ × 7 H₂O zugegeben wurden. Man ließ die Reaktion 3 Stunden bei 100°C fortschreiten. Das Gemisch wurde sodann gegen Wasser (2 × 2 l 24 Stunden lang und 1 × 10 l 6 Stunden lang) dialysiert.

Der Inhalt des Dialysebeutels wurde gefriergetrocknet; er wird im folgenden als "Buntesalz-Dextran" bezeichnet. Eine Analyse zeigte, daß das Dextranderivat 2,1 mMol S pro g trockenes Derivat enthielt. 1 g des Buntsalz-Dextrans wurde in 10 ml eines Puffers aus 50% Ethanol und 50% 0,1 N Natriumphosphatlösung vom pH-Wert 8,3 gelöst. Es wurden 0,7 g 2,2′-Dipyridyldisulfid zugegeben, und das Gemisch wurde auf 60°C erwärmt und auf dieser Temperatur 24 Stunden gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde sodann gegen 50% Ethanol, 3 × 3 l (jede Dialyse während 6 Stunden), und gegen destilliertes Wasser, 3 × 3 l (jede Dialyse während 2 Stunden), dialysiert.

Es wurden 2,6 mg Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper (hergestellt aus Schafserum durch Fällung mit Na₂SO₄) in 1 ml eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers vom pH-Wert 7,5 gelöst. Sodann wurden 120 µl Natriumsuccinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (1,6 mMol in 99,5%igem Ethanol) zugegeben, und nach dem Schütteln ließ man die Umsetzung 30 Minuten bei 23°C fortschreiten. Das Reaktionsgemisch wurde sodann an Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran [vgl. Beispiel 1 (a)] gelfiltriert; (das verwendete Medium war 0,1 M Natriumacetatpuffer vom pH-Wert 5,0). Das eluierte Material (2,5 ml), d. h. das 2-Pyridyldisulfid-Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-Derivat, wurde mit 64 µl 50 millimolarem Dithiothreit reduziert. Nach 15 Minuten bei 23°C wurde überschüssiges Dithiothreit durch Gelfiltration an Perlen aus dem zuvorgenannten Dextranmaterial gelfiltriert; (das verwendete Medium war 0,3 M NaCl). Hierbei wurde ein Eluatvolumen von 3,5 ml erhalten. 2,4 mg der thiolierten α-Amylase (hergestellt wie in Beispiel 1) in einem Volumen von 1,5 ml und 2,6 mg thiolierte Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper (siehe oben) in 3,5 ml wurden mit 1,6 mg 2-Pyridyldisulfid-dextran in 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 vermischt. Nach dem Schütteln ließ man das Gemisch 10 Minuten stehen, wonach an Perlen aus Agarose mit 0,3 M NaCl als Medium gelfiltriert wurde. Die Fraktionen, welche Konjugate enthielten, wurden vereint.

(b) Bestimmung von Kaninchen-Antihumanserumalbumin-Antikörpern mit Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-Dextran-α-Amylase-Konjugat

50 Scheiben aus Nylonnetz (Durchmesser: 8 mm, Gewicht: 1,5 mg jeweils) wurden in 50 ml 3 M Salzsäure 30 Minuten bei 23°C partiell hydrolysiert und sodann mit 0,1% Glutardialdehyd gemäß J. Immunol., Bd. 113, S. 517 (1974) aktiviert. Die aktivierten Nylonnetze wurden sodann mit 0,05 molarem Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7 gewaschen und sodann in 20 ml einer 0,9%igen Natriumchloridlösung gebracht, welche 0,5 mg pro ml Humanserumalbumin (HSA) enthielt. Nach 60 Minuten bei 23°C wurde das nicht-immobilisierte HSA mit 0,9%iger NaCl-Lösung abgewaschen, und die Nylonnetze mit gebundenem HSA wurden mit 50 ml NaBH₄ (0,4 mg/ml) bei 23°C 30 Minuten behandelt, wobei stabile kovalente Bindungen zwischen HSA und der Nylonmatrix gebildet wurden. Die Nylonscheiben wurden schließlich mit PDT-Puffer gewaschen. Kaninchen-AntiHSA-Serum wurde in dem PDT-Puffer auf das 10- bis 10⁴fache verdünnt. 200 µl jeder Verdünnung wurden mit einer Nylonscheibe in einem Testrohr bei 23°C 3 Stunden inkubiert. Eine gleiche Anzahl von Blindversuchen wurden mit 200 µl normalem Kaninchenserum (RNS), verdünnt auf gleiche Weise, vorbereitet. Die Nylonscheiben wurden sodann 3× mit 2 ml PDT-Puffer gewaschen.

Das Antikörper-Dextran-α-Amylase-Konjugat aus Teil (a), oben, wurde auf das 10fache verdünnt, wonach 20 µl der so erhaltenen Lösung mit Nylonscheiben, welche gemäß den obigen Ausführungen präpariert worden waren, 16 Stunden bei 23°C inkubiert wurden. Überschüssiges Konjugat wurde durch Dekantieren entfernt, und die Nylonnetze wurden 3× mit 2 ml PDT-Puffer gewaschen.

Die α-Amylaseaktivität (mit und ohne Abspalten der α-Amylase) wurde auf eine Weise ermittelt, welche zu der in Beispiel 1 beschriebenen analog war.

Mit dem verwendeten Serum war es möglich, Kaninchen-Antihumanserumalbumin-Antikörper in 10- bis 10⁴fachem Verdünnungsbereich nachzuweisen. Die Blindversuche mit RNS führten zu a-Amylaseaktivitäten von 10% der Meßwerte, welche mit den entsprechenden, innerhalb des vorgenannten Bereiches liegenden Verdünnungen erhalten wurden.

Beispiel 5 Bestimmung von Kaninchen-Antihumanserumalbumin-Antikörpern mit Humanserumalbumin-Glutathion-Fluorescein-Konjugat (a) Herstellung von Albumin-Glutathion-Fluorescein-Konjugat

100 mg Fluorescein-isothiocyanat wurden mit 35 mg oxidiertem Glutathion in 4 ml destilliertem Wasser umgesetzt. Man ließ die Reaktion bei konstantem pH-Wert von 9 90 Minuten fortschreiten.

Das Reaktionsgemisch wurde an einer 100 ml-Kolonne, welche mit Perlen aus dem in Beispiel 1 (a) benutzten, mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran beschickt war, gelfiltriert; das benutzte Medium war eine 0,3 M Natriumchloridlösung. Die dem Gesamtvolumen entsprechenden Fraktionen wurden aufgeschlämmt (10,3 ml mit einem Wert A₄₉₃ von 41,2). Der pH-Wert wurde mit Natriumboratpuffer auf 9 eingestellt. Die Lösung wurde sodann durch eine Kolonne gepumpt, welche 2,2 ml Mercaptohydroxypropylagarose enthielt [hergestellt aus den in Beispiel 4 (a) benutzten Agaroseperlen gemäß Acta Chem. Scand. B. 29, S. 471-474 (1975); es wurde ein Gel mit einem Gehalt von 660 µMol SH/g getrocknetes Gel verwendet] und mit 0,1 M Natriumboratpuffer vom pH-Wert 9 ins Gleichgewicht gebracht war.

Die Strömungsgeschwindigkeit betrug 10 ml/Std. Das Eluat wurde in 1 M Natriumacetat vom pH-Wert 4 aufgeschlämmt, und sein Fluorescein- und Thiolgehalt wurde ermittelt. Im nachfolgenden Test wurde eine Fraktion von 3 ml verwendet, welche eine Thiolkonzentration von 1,19 mMol und eine Fluorescein-Konzentration von 0,60 mMol aufwies.

Es wurden 20 mg Humanserumalbumin, gelöst in 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5, mit 150 µl von 40 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in 99,5%igem Ethanol versetzt. Nach dem Schütteln ließ man das Gemisch 40 Minuten bei 23°C stehen. Überschüssiges Reagens wurde sodann durch Gelfiltration an Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran [vgl. Beispiel 1 (a)] entfernt; das verwendete Medium war 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5. 3 ml des eluierten Materials (19 mg 2-Pyridyldisulfidalbumin) wurden mit 3 ml Glutathion-Fluorescein vermischt. Man ließ das Gemisch 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Sodann wurde es an Perlen aus dem zuvor genannten, mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran gelfiltriert, wobei 0,9%ige Natriumchloridlösung als Medium verwendet wurde. Die Analyse ergab, daß das Eluat (9 ml) 17,1 mg Albumin mit annähernd 3,5 mMol Fluorescein pro Mol Albumin enthielt.

(b) Bestimmung von Kaninchen-Antihumanserumalbumin-Antikörpern mit Humanserumalbumin-Glutathion-Fluorescein-Konjugat

Das Beschichten der Röhrcheninnenwände mit HSA und die Inkubation mit Kaninchen-AntiHSA-Serum wurde auf eine zu Beispiel 3 analoge Weise durchgeführt.

In die so erhaltenen Röhrchen wurden 0,5 ml eines gemäß Teil (a) hergestellten Konjugats eingebracht (1,9 ml Konjugat/ml). Die Röhrchen wurden sodann 16 Stunden bei 23°C inkubiert, wonach überschüssiges Konjugat abdekantiert und 3× mit 2 ml PDT-Puffer gewaschen wurde.

1 ml Dithiothreit (25 mMol in destilliertem Wasser, ph-Wert 7) wurde zu den Röhrchen gegeben. Nach 15 Minuten wurde die flüssige Phase in Küvetten für fluorimetrische Messungen gebracht, und die Fluoreszensintensität wurde bei einer Erregungswellenlänge von 473 nm und einer Emissionswellenlänge von 530 nm bestimmt.

Mit dem verwendeten Serum war es möglich, Fluoreszens in dem Serumsverdünnungsbereich des 1- bis 50fachen nachzuweisen. Beim RNS waren die erhaltenen Fluoreszensintensitäten 10% der jeweils entsprechenden Testwerte. Aufgrund der Art und Weise, nach der der Test durchgeführt wurde (d. h. unter Binden an die Röhrchenwände) war es selbstverständlich nicht möglich, die Messung ohne Abspalten der fluoreszierenden Markierungen durchzuführen. Die Fluoreszensmessungen, welche allein mit dem Konjugat durchgeführt wurden, zeigten jedoch, daß nach Spalten des Konjugats eine beträchtlich höhere Fluoreszensintensität erhalten wurde.

Beispiel 6 Bestimmung von gegen Hundeserumalbumin spezifischem IgE mit Dextran-Hundeserumalbumin-Konjugat und ¹²⁵I-markiertem Kaninchen-Antihuman-IgE-Antikörpern Herstellung von Dextran-Hundeserumalbumin-Konjugat

36 g Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran wurden in 200 ml 0,5 M Natronlauge suspendiert. 17 ml 1-Chlor-2,3-epoxypropan wurden innerhalb von 5 Minuten bei 23°C tropfenweise zugegeben. Die Temperatur wurde auf 60°C erhöht, und die Umsetzung wurde 2 Stunden fortgesetzt. Das Produkt wurde sodann mit Wasser und 0,5 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 6,5 gewaschen und in 200 ml dieses Puffers suspendiert. 100 g Na₂S₂SO₃ × 7 H₂O wurden zugegeben, und die Reaktion wurde 2 Stunden fortgesetzt, wonach das Produkt auf einem Büchner-Trichter gewaschen wurde. Danach wurde es mit 2,8 g Dithiothreit (DTT) in 0,1 M NaHCO₃-Lösung vom pH-Wert 8,3 behandelt; das Gesamtvolumen betrug 200 ml. Nach Umsetzung während 60 Minuten wurde das Produkt mit 1 mM Essigsäure und danach mit einem 50% Aceton enthaltenden Gemisch von 0,05 Mol NaHCO₃ und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gewaschen. Das Produkt wurde in 40 ml der zuletzt genannten Lösung suspendiert, in der 2,2′-Dipyridyldisulfid in einer Konzentration von 0,15 Mol gelöst war. Die Umsetzung wurde 60 Minuten bei 23°C fortgesetzt. 600 ml Wasser wurden dann zugegeben, und die Umsetzung wurde weitere 60 Minuten fortgesetzt, wonach das Produkt mit Wasser gewaschen, mit Aceton geschrumpft und sodann über Blaugel getrocknet wurde. Es wurde nachgewiesen, daß das so erhaltene Produkt annähernd 40 µMol 2-Pyridylsulfidstrukturen pro g trockenes Derivat enthielt.

20 mg Hundeserumalbumin wurden in 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gelöst, was hinsichtlich Mercaptoethanol 25 mMol waren. Nach 60 Minuten wurde überschüssiges Mercaptoethanol durch Gelfiltration an den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert; das verwendete Medium war 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5.

1 g des weiter oben hergestellten Dextran-Derivates wurde in 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gequollen und gewaschen und sodann in 2 ml dieses Puffers suspendiert. 3,5 ml Albumin, das wie oben beschrieben behandelt worden war, wurden zur Suspension zugegeben. Die Umsetzung wurde unter Rühren durchgeführt, indem man die Suspension in einem geschlossenen Gefäß 36 Stunden bei 23°C rotieren ließ. Das so erhaltene Dextran-Albumin-Konjugat wurde sodann auf einem Glasfiltertrichter mit 0,1 M Natriumacetat-0,3 M Natriumchloridlösung vom pH-Wert 5,0 gewaschen und sodann in 10 ml dieser Lösung suspendiert, wonach 40 mg Glutathion zur Entfernung nicht umgesetzter Pyridyldisulfidstrukturen zugegeben wurden. Nach 3stündiger Umsetzung bei 23°C wurde das Produkt mit 0,9%iger Natriumchloridlösung gewaschen und in Form einer Suspension in 0,9%iger Natriumchloridlösung gelagert.

(b) Bestimmung von gegen Hundeserumalbumin spezifischem IgE mit Dextran-Hundeserumalbumin-Konjugat und ¹²⁵I-markierten Kaninchen-Antihuman-IgE-Antikörpern

Die Suspension aus Teil (a) wurde zentrifugiert, und der Überstand durch Absaugen entfernt. Dextran-Albumin-Konjugat wurde mit 10 ml PDT-Puffer gewaschen und wieder in 10 ml PDT-Puffer suspendiert. 200 µl der Suspension wurden in Ellerman-Röhrchen gefüllt. Das Volumen wurde mit PDT-Puffer auf 400 µl eingestellt, wonach 100 µl Humanserum, welches gegen Hundeserumalbumin spezifisches IgE enthielt, zugegeben wurden. Die so erhaltene Suspension wurde unter Rotieren 3 Stunden bei 23°C inkubiert. Nach 3maligem Waschen mit Zentrifugieren, Entfernung durch Absaugen und Zugabe von PDT wurden 15 mg ¹²⁵I-Anti-IgE mit 94 200 cpm zugegeben.

Die Röhrchen wurden über Nacht bei 23°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen auf die zuvor beschriebene Weise wurde die an das Dextran-Konjugat gebundene Radioaktivität auf herkömmliche Weise mit einem γ-Zähler bestimmt. Der ¹²⁵I-haltige Immunkomplex wurde sodann vom Träger abgespalten, indem man 0,5 ml einer Lösung von 20 mMol DTT in 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 und 0,3 M Natriumchloridlösung zugab (Umsetzung während 3 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren). Nach Abzentrifugieren des Produktes wurden 200 µl des Überstandes entnommen, und die freigesetzte Radioaktivität wurde gemessen.

Es wurde ein Meßergebnis von 28 149 cpm beim Messen des Dextran-Konjugats vor dem Abspalten des ¹²⁵I-haltigen Immunkomplexes und von 6248 cpm (in 200 µl Überstand) nach dem Abspalten des Immunkomplexes erhalten, was zeigt, daß 78% der Aktivität durch Spalten in die flüssige Phase übergeführt worden waren.

Beispiel 7 Bestimmung von Human-γ-globulin mit Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-α-Amylase-Multikomplex- Konjugat (a) Herstellung von Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-α-Amylase-Multikomplex-Konjugat

30 mg α-Amylase (von der gleichen Art und Vorbehandlung wie in Beispiel 1) wurden in 4,5 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 aufgelöst. In Abständen von 5 Minuten wurden in Portionen zu 25 µl 100 µl einer Lösung von 50 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in absolutem Ethanol zugegeben. Nach 40 Minuten bei 25°C wurde das Reaktionsgemisch an den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert (das verwendete Medium war ein Puffer aus 0,1 Mol Natriumphosphat und 0,3 Mol NaCl vom pH-Wert 7,5), wobei überschüssiges Reaktionsmittel und niedermolekulare Reaktionsprodukte entfernt wurden. Das eluierte Material mit einem Gehalt an modifizierter α-Amylase [d. h. 2-Pyridyldisulfid-α-Amylase] wies nach der Vereinigung ein Volumen von 8 ml auf. Es wurde gefunden, daß der Substitutionsgrad bezüglich des Gehalts an 2-Pyridylsulfidgruppen 3,7 µMol dieser Gruppen pro 50 mg α-Amylase betrug.

Nach dem zuvor beschriebenen Verfahren wurde ein anderes 2-Pyridyldisulfid-α-amylase-Derivat hergestellt, jedoch mit dem Unterschied, daß 400 µl einer 50 millimolaren Lösung von N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in absolutem Ethanol in Abständen von 5 Minuten in Portionen von 100 µl zugegeben wurden. Es wurde ermittelt, daß der Substitutionsgrad dieses Derivates 7,5 µMol 2-Pyridyldisulfidgruppen pro 50 mg α-Amylase betrug.

2,5 mg 2-Pyridyldisulfid-a-amylase mit einem Gehalt von 3,7 µMol 2-Pyridyldisulfidgruppen pro 50 mg α-Amylase in 0,75 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 wurden mit 50 µl 50 mMol Dithiothreit vermischt und 10 Minuten bei 25°C reduziert. Überschüssiges Dithiothreit und niedermolekularere Reaktionsprodukte wurden durch Gelfiltration an den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert; das verwendete Medium war 0,3 M NaCl.

Das Eluat, 2,5 ml mit einem Gehalt an 2,3 mg Thiol-α-Amylase, wurde mit 1,5 mg 2-Pyridyldisulfid-α-amylase mit einem Gehalt von 7,5 µMol 2-Pyridyldisulfidgruppen pro 50 mg in 0,75 ml 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vermischt. Nach 60minütiger Umsetzung bei 25°C wurde die Umsetzung durch Zugabe von 50 µl einer Lösung von 20 mMol 2,2′-Dipyridyldisulfid in absolutem Ethanol abgebrochen. Es wurde 1 Tropfen Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat zugegeben, und das Gemisch wurde an einer Säule chromatographiert (80 ml Gesamtvolumen), welche mit den in Beispiel 4 (a) benutzten Perlen aus Agarose gefüllt war. Das verwendete Medium war ein Gemisch aus 0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat. Das eluierte Material (etwa 15 ml) mit einem Gehalt an etwa 0,19 mg α-Amylase-Aggregat pro ml, das 2,4 µMol 2-Pyridyldisulfidgruppen enthielt, wurde vereint und bei 4°C gelagert.

6 mg Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper [durch Immunsorption gereinigt mit Gammaglobulin-Agarose­ sorbens, hergestellt durch Kupplung von elektrophoretisch gereinigtem Humangammaglobulin an mit CNBr-aktivierte Agarose] in 2,4 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 6,0 wurden mit 20 µl einer Lösung von 50 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in absolutem Ethanol vermischt. Nach 20 Minuten bei 25°C wurde das überschüssige Reaktionsmittel durch Gelfiltration des Reaktionsgemisches an den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert; das verwendete Medium war ein Puffer aus 0,1 M Natriumacetat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 5,0. Das Eluat, etwa 3,0 ml, mit einem Gehalt an etwa 5,5 mg 2-Pyridyldisulfid-Antikörpern wurde vereint und mit 0,2 ml einer Lösung von 50 mMol Dithiothreit in destilliertem Wasser umgesetzt. Nach 25minütiger Umsetzung wurde überschüssiges Dithiothreit durch Gelfiltration des Reaktionsgemisches an den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran entfernt; das verwendete Medium war eine 0,3 M Natriumchloridlösung. Das Eluat, 5,0 ml mit einem Gehalt an etwa 5 mg modifizierten Antikörpern mit einem Substitutionsgrad von etwa 2 µMol SH-Gruppen pro 160 mg Protein wurde vereint.

Etwa 0,2 mg der auf diese Weise thiolierten Antikörper in 0,2 ml einer 0,3 M Natriumchloridlösung wurden mit 0,4 mg des α-Amylase-Aggregats (siehe oben) in 2,0 ml eines Gemisches aus 0,1 M Natriumphosphat, 0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat vermischt. Das Reaktionsgemisch, welches Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-α-Amylase-Multikomplex-Konjugat enthielt, wurde bei 4°C gelagert.

(b) Bestimung von Human-γ-globulin unter Verwendung von Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-α-Amylase-Multikomplex-Konjugat

Etwa 50 µg (getrocknetes Drivat) Agarose-Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Derivat (hergestellt durch Kuppeln von durch Immunosorption gereinigten Schaf-Antihuman-IgG-Antikörpern an CNBr-aktivierte Agarose) mit einem Gehalt von etwa 400 ng Antikörpern, suspendiert in 300 µl eines Gemischs aus 0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat wurde in jedes einer Reihe von Polystyrolröhrchen (3 ml) gegeben, die verschiedene Mengen (1 bis 500 ng) Human-γ-globulin enthielten, welches in 100 µl eines Gemisches von 0,1 M Natriumphosphat, 0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat vom pH-Wert 7,4 gelöst war. Eine Anzahl von Röhrchen, die lediglich Puffer enthielten, und eine Anzahl von Röhrchen, die Aminoethyl-agarose (hergestellt durch Kuppeln von Ethanolamin an CNBr-aktivierte Agarose enthielten, wurden als Blindproben benutzt.

Die Röhrchen wurden etwa 18 Stunden bei 25°C unter sorgfältigem Schütteln inkubiert. Das Agarosegel jedes Röhrchens wurde sodann durch ein wiederholtes Zentrifugations-Dekantierungsverfahren mit 6 × 2 ml 0,3 M NaCl - 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat gewaschen.

Nach dem letzten Waschen wurde der Überstand bis auf 0,3 ml abgesaugt, und 100 µl des Reakationsgemisches aus Beispiel 7 (a), oben, mit einem Gehalt an Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-α-Amylase-Multikomplex-Konjugat (etwa 400 ng bezüg­ lich der Antikörper) wurden in jedes Röhrchen gegeben, welche sodann während 4 Stunden unter sorfältigem Schütteln bei 25°C inkubiert wurden. Das Feststoffmaterial eines jeden Röhrchens wurde abermals, wie zuvor beschrieben, mit 6 × 2 ml eines Gemischs aus 0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat gewaschen.

1,0 ml einer Lösung von 10 mMol Dithiothreit in 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 8 wurde in die Röhrchen gegeben (0,3 ml Suspension). Nach Reduktion während 60 Minuten (während denen der α-Amylase-Multikomplex aus dem immobilisierten Immunokomplex freigesetzt und in kleinere Einheiten gespalten wurde) wurde 1,0 ml einer Suspension der Amylasetestsubstanz aus Beispiel 1 (1 Tablette/4 ml) zugegeben, und die Röhrchen wurden abermals 60 Minuten bei 25°C inkubiert, wonach die Umsetzung durch Zugabe von 0,5 ml einer 0,5 M Natronlauge abgebrochen wurde. Nach Abfiltrieren ungelösten Stärkepolymers wurde die Extinktion des blau gefärbten Filtrats bei 620 nm ermittelt. Die Extinktionswerte sind auf die freigesetzte a-Amylaseaktivität bezogen, welche sich auf die Menge an gebundenem Konjugat bezieht, die ihrerseits auf die Menge an gebundenem γ-Globulin bezogen ist, und somit ein Maß für die γ-Globulinkonzentration der Testlösungen darstellen. Human-γ-globulin konnte bis auf eine Konzentration herab zu weniger als 1 ng/ml auf diesem Weg nachgewiesen werden.

Beispiel 8 Bestimmung von Humangammaglobulin mit Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-β-Galactosidase-Konju­ gat (a) Herstellung von Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-β-Galactosidase-Konjugat

20 µl einer Lösung von 8 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in 99,5%igem Ethanol wurde langsam zu 2 mg Schaf-Antihuman-IgG-Antikörpern (durch Immunsorption gereinigt mit Agarose-Humangammaglobulin als Sorbens, hergestellt durch Kupplung von elektrophoretisch gereinigtem Humangammaglobulin an CNBr-aktivierte Agarose) in 0,6 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,1 mMol MgCl₂ vom pH-Wert 7,0 zugegeben während 60 Minuten bei 25°C gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde sodann an einer Säule gelfiltriert, welche mit den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen von mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gefüllt war; das verwendete Medium war der gleiche Phosphatpuffer wie der zuvor beschriebene. Das eluierte Material mit einem Gehalt an etwa 1,8 mg 2-pyridyldisulfid-substituierten Antikörpern wurde vereint (1,5 ml).

1,3 mg β-Galactosidase in 0,5 ml eines Gemischs von 0,1 M Natriumphosphat und 1 mMol MgCl₂ vom pH-Wert 7,0 wurde an einer Kolonne mit den zuvor genannten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert. Das eluierte Material, etwa 1,2 mg in 1,5 ml, wurde mit 1,8 mg 2-pyridyldisulfid-enthaltenden Antikörpern (siehe oben) in 1,5 ml eines Gemisches aus 0,1 M Natriumphosphat und 1 mMol MgCl₂ vermischt. Die Umsetzung wurde sodann etwa 48 Stunden fortgesetzt, wonach das Reaktionsgemisch an einer Kolonne gelfiltriert wurde, welche mit den in Beispiel 4 (a) benutzen Perlen aus Agarose gefüllt war; das benutzte Medium war eine 0,3 M Natriumchloridlösung. Die Fraktionen mit einem Gehalt an β-Galactosidase-Antikörper-Oligomeren mit einem Molekulargewicht von 650 000 bis 800 000 wurden vereint. Das vereinte Material wurde bei 4°C gelagert.

(b) Bestimmung von Humangammaglobulin mit Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-β-Ga­ lactosidase-Konjugat

Die Bestimmung wurde unter Anwendung der Schicht-Technik durchgeführt. 50 µl einer Suspension eines Agarose-Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Derivats (hergestellt durch Kupplung von Schaf-Antihuman-IgG-Antikörpern, welche durch Immunsorption gereinigt worden waren, an CNBr-aktivierte Agarose) mit einem Gehalt von etwa 0,45 mg Antikörpern/ml Suspension wurden in jedes einer Reihe von Teströhrchen mit verschiedenen Mengen an Humangammaglobulin (0,1 bis 250 ng), gelöst in 100 µl eines Gemisches aus 0,1 M Natriumphosphat, 0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat vom pH-Wert 7,5 gebracht. Als Blindproben wurde eine Anzahl von Röhrchen verwendet, welche lediglich Puffer, und eine Anzahl von Röhrchen, welche Aminoethylagarose enthielten (hergestellt durch Kupplung von Ethanolamin an CNBr-aktivierte Agarose). Die Röhrchen wurden sodann 18 Stunden bei 25°C unter sorgfältigem Schütteln inkubiert. Das Agarosegel eines jeden Röhrchens wurde sodann, wie in Beispiel 7 beschrieben, gewaschen.

In jedes Röhrchen, welches die gewaschenen Agarosesuspensionen enthielt (etwa 0,3 ml/Röhrchen) wurden sodann 20 µl einer 0,3 M Natriumchloridlösung gebracht, welche Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-β-Galactosidase-Konjugat -(das zuvor hergestellte oligomere Konjugat) enthielt. Unter sorgfältigem Schütteln wurden die Röhrchen sodann 4 Stunden bei 25°C inkubiert. Das Agarosegel eines jeden Röhrchens wurde sodann, wie in Beispiel 7 beschrieben, gewaschen. Zu jeder Agarosesuspension wurden sodann 0,1 ml 1 M β-Mercaptoethanol zugegeben. Die Reduktion wurde 30 Minuten bei 25°C fortgesetzt. Diese Reduktion führte zur Freisetzung der β-Galactosidase in nativer Form aus dem an dem Agarosederivat immobilisierten Immunkomplex.

Es wurden sodann 0,2 ml o-Nitrophenyl-β-D-galactosid (10,5 mg/ml) in einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und 1 mMol MgCl₂ vom pH-Wert 7,0 zugegeben, und die freigesetzte β-Galactosidaseaktivität wurde durch spektrophotometrische Messung (bei 420 nm) der pro Zeiteinheit gebildeten Menge an o-Nitrophenolat bestimmt. Die freigesetzte β-Galactosidaseaktivität ist proportional zur Menge an gebundenem Konjugat, welche ihrerseits proportional zur Menge an gebundenem Gammaglobulin ist; infolgedessen stellt sie ein Maß für die Gammaglobulinkonzentrationen der Testlösungen dar. Auf diesem Weg konnte Humangammaglobulin bis herab zu einer Konzentration von weniger als 1 ng/ml bestimmt werden.

Beispiel 9 Bestimmung von Dextran mit einem 2-Pyridyldisulfid-Dextranderivat in einem Konkurrenzsystem unter Anwendung von Agarose-Concanavalin

100 µl von abgesetztem Agarose-Concanavalin und 200 µl eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 wurden jeweils in 8 Ellerman-Röhrchen gegeben. Jedem Röhrchen wurden sodann 0,2 mg 2-Pyridyldisulfid-Dextran (hergestellt gemäß Beispiel 4) in 50 µl destilliertem Wasser zugegeben. Die Röhrchen wurden sodann unter sorgfältigem Schütteln 20 Minuten bei 25°C inkubiert, wonach 100 µl eines Puffers aus 0,3 M NaCl und 0,1 M Natriumphosphat vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an verschiedenen Dextranmengen zu 6 der Röhrchen zugegeben wurden. Den restlichen beiden Röhrchen wurden lediglich 100 µl des vorgenannten Puffers zugegeben. Die Röhrchen wurden sodann unter sorgfältigem Schütteln 60 Minuten bei 25°C inkubiert und sodann durch wiederholtes Zentrifugieren und Dekantieren mit 3 × 2 ml dieses Puffers gewaschen.

Die Suspensionen aller Röhrchen wurden sodann mit diesem Puffer auf ein Volumen von 2 ml verdünnt. Es wurden 0,1 ml 50 mM Dithiothreit zugegeben, und die Röhrchen wurden 10 Minuten bei 25°C geschüttelt. Das Agarosegel eines jeden Röhrchens wurde sodann durch Zentrifugieren abgetrennt, und die Konzentrationen an 2-Thiopyridon der Überstände wurden spektrophotometrisch bei 343 nm gemessen. Die Menge an freigesetztem 2-Thiopyridon ist proportional zur Menge an 2-Pyridyldisulfid-Dextran, das an das Agarose-Concanavalin gebunden ist, und infolgedessen umgekehrt proportional zur Konzentration des Dextrans der Testlösung. Die Dextrankonzentration konnte auf diesem Werge bis zu einem Konzentrationsbereich von 0,03 bis 100 mg/ml bestimmt werden.

Beispiel 10 Bestimmung von Humangammaglobulin mit ¹²⁵I-markierten Schaf-Antihuman-IgG-Antikörpern unter Verwendung eines spaltbaren Human-IgG-Glasderivates (a) Herstellung von Human-IgG-Glasderivat

50 mg Thiolglas wurden in 5 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 30 mM Dithiothreit reduziert. Das reduzierte Glas wurde sorgfältig mit einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl gewaschen und in 1 ml dieses Puffers suspendiert, wonach 20 µl 1,2-3,4-Diepoxybutan zugegeben wurden. Nach 60minütiger Umsetzung wurden die Glasperlen mit einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 gewaschen.

Das so erhaltene Glasderivat wurde sodann in 0,5 ml eines 0,2 M Natriumcarbonatpuffers vom pH-Wert 9,5 und in 0,5 mg elektrophoretisch gereinigtem Human-IgG suspendiert, welch letzteres in 0,5 ml eines 0,2 M Natriumcarbonatpuffers vom pH-Wert 9,5 gelöst war. Das Reaktionsgemisch wurde sorgfältig 18 Stunden bei 25°C gerührt, wonach 50 µl einer 10%igen Ethanolaminlösung (der pH-Wert wurde mit Salzsäure auf 9,5 eingestellt) zur Entfernung nicht-umgesetzter Epoxygruppen zugegeben wurden. Nach 120 Minuten bei 25°C wurde das Glasderivat mit einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 gewaschen. Die Glasperlen wurden sodann in 20 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,5% Polyoxyethylensorbitanmonooleat suspendiert.

Die Analyse zeigte, daß die Antikörperkonzentration etwa 16 µg/ml Suspension betrug.

(b) Substitution von Schaf-Antihuman-IgG-Antikörpern mit Iod-125

Ein Teströhrchen aus Glas wurde in ein Eisbad gebracht. In das Röhrchen wurden 45 µg Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper [durch Immunosorption gereinigt mit Agarose-Human-IgG-Derivat, hergestellt durch Kuppeln von elektrophoretisch gereinigtem Human-IgG an BrCN-aktivierte Agarose], gelöst in 10 µl einer 0,3 M Natriumchloridlösung, eingebracht. Sodann wurden 40 µl 0,2 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 (0,02% NaN₃), 100 µl Chloramin-T (1,5 mMol) und 0,7 µl Na¹²⁵I (0,36 mCi) zugegeben. Nach 2 Minuten wurde durch Zugabe von 20 µl 0,1 M Na₂S₂O₃ und 50 µl 0,1 M KI die Umsetzung abgebrochen. Das Reaktionsgemisch wurde an einer Säule chromatographiert, welche mit Perlen aus dem in Beispiel 1 (a) benutzten, mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gefüllt war, welche zuvor mit 1 ml 1%igem Rinderserumalbumin präpariert und mit 0,05 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 ins Gleichgewicht gebracht worden war, welcher 0,05% Polyoxyethylensorbitanmonooleat, 0,02% NaN₃, und 0,05 M Na₂S₂O₃ enthielt. Die eluierten Fraktionen wurden vereint und fünffach mit 0,05 M Natriumphosphat vom pH-Wert 7,0 verdünnt. Die Analyse zeigte, daß die vereinten Fraktionen (10 ml) etwa 4 µg markierte Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper pro ml enthielten.

(c) Bestimmung von Humangammaglobulin mit ¹²⁵I-markierten Schaf-Antihuman-IgG-Antikörpern in einem Konkurrenzsystem unter Verwendung eines spaltbaren Human-IgG-Glasderivates

Eine Reihe von Ellerman-Röhrchen, die Glas-Human-IgG (100 µl Suspension gemäß der obigen Beschreibung) bzw. ¹²⁵I-substituierte Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper (100 µl einer Lösung, erhalten durch Verdünnen der zuvor genannten Lösung auf das 10fache in einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat, 0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat vom pH-Wert 7,5) enthielten, wurden vorbereitet. Sodann wurden zu den Röhrchen wechselnde Mengen von Humangammaglobulin, gelöst in 100 µl des zuvor genannten Puffers, zugegeben. Die Röhrchen wurden 4 Stunden bei 25°C auf einem Schütteltisch geschüttelt, wonach die Glasperlen 4 × mit 2 ml des zuvor genannten Puffers gewaschen wurden. Sie wurden sodann in 0,5 ml dieses Phosphatpuffers, welcher 20 mMol Natriumphosphat enthielt, suspendiert. Hierbei wird die vicinale Diolstruktur, welche das Human-IgG an das Glas bindet, gespalten, und der Immunkomplex [Human-IgG-(¹²⁵I-Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper)-Komplex] -geht in die Lösung. Man ließ die Umsetzung auf einem Schütteltisch 60 Minuten bei 25°C fortschreiten, wonach die in dem Überstand freigesetzte Radioaktivität mit einem Gammazähler gemessen wurde. Die Menge an freigesetzter Radioaktivität ist proportional zur Menge der ¹²⁵I-markierten Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper, die an das Glasderivat gebunden sind, und somit umgekehrt proportional zur Konzentration von Gammaglobulin in den Testlösungen.

Durch dieses Verfahren konnte der Nebeneffekt aufgrund unspezifischer Aufnahme von ¹²⁵I-markierten Antikörpern an den Glasperlen herabgesetzt werden.

Beispiel 11 Bestimmung von Sojabohnentrypsininhibitor mit 2-pyridyldisulfid-substituiertem Sojabohnentrypsininhibitor in einem Konkurrenzsystem unter Verwendung von Agarose-Trypsin (a) Herstellung des Agarose-Trypsin-Derivats

20 mg gefriergetrocknetes Trypsin wurden mit einer Suspension von 2 g (trocken gesaugter) CNBr-aktivierter Agarose in 2 ml einer 0,1 M NaHCO₃-Lösung vermischt. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei 4°C gerührt. Das gebildete Gelderivat wurde sodann mit 200 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5; 200 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumacetat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 4,0; 200 ml eines Puffers aus 0,1 M NaHCO₃ und 10 mM Ethanolamin und schließlich mit 200 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 gewaschen. Das Gel wurde als Suspension in der zuletzt genannten Lösung bei 4°C aufbewahrt.

(b) Herstellung von Sojabohnentrypsininhibitor-2-Pyridyldisulfid-Derivat

18 mg gefriergetrockneter Sojabohnentrypsininhibitor wurden in 0,1 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 gelöst. Die Lösung wurde an einer Kolonne mit den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert (das verwen­ dete Medium war der obige Puffer). Das eluierte Material (2,0 ml mit einem Gehalt an etwa 16 mg Protein) wurde mit 150 µl 50 mM N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in Portionen von 50 µl alle 5 Minuten versetzt. Nach Umsetzung während 30 Minuten bei 25°C wurde das Reaktionsgemisch an einer mit vorgenannten Perlen gefüllten Säule gelfiltriert (das verwendete Medium war ein Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5). Das eluierte Material, 3,0 ml, welches das Sojabohnentrypsininhibitor-2-Pyridyldisulfid-Derivat in einer Menge von 4,8 mg/ml mit einem Substitutionsgrad von 4,3 µMol 2-Pyridyldisulfidgruppen pro 20 mg Protein enthielt, wurde bei 4°C aufbewahrt.

(c) Bestimmung von Sojabohnentrypsininhibitor mit 2-pyridyldisulfid-substituiertem Sojabohnentrypsininhibitor

Die Bestimmung wurde unter Anwendung des sogenannten Konkurrenzverfahrens durchgeführt. Zu jedem Röhrchen einer Reihe von Teströhrchen wurden 100 mg von trockengesaugtem Agarose-Trypsin-Derivat (entsprechend etwa 1 mg Trypsin) (siehe oben) und 1,4 mg Sojabohnentrypsininhibitor-2-Pyridyldisulfid-Derivat in 0,3 ml eines Puffers von 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 (siehe oben) zugegeben. Dann wurden in die Röhrchen 0,3 ml von Lösungen des Sojabohnentrypsininhibitors wechselnder Konzentrationen eingebracht, wonach die Röhrchen sorgfaltig während 60 Minuten bei 25°C geschüttelt wurden. Das Agarosegel wurde sodann mit einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 gewaschen und in 2 ml dieses Puffers suspendiert, wonach 0,2 ml 50 mMol Dithiothreit zugegeben wurden. Nach Schütteln der Röhrchen während 10 Minuten bei 25°C wurde das Agarosegel jedes Röhrchens abzentrifugiert, und die Menge an freigesetztem 2-Thiopyridon der Überstände wurde bei 343 nm spektrophotometrisch gemessen. Die Menge an freigesetztem 2-Thiopyridon ist proportional zur Menge an Sojabohnentrypsininhibitor-2-Pyridyldisulfid-Derivat, das an das Agarose-Trypsin-Derivat gebunden ist, und somit umgekehrt proportional zu den Konzentrationen an nativem Sojabohnentrypsininhibitor der Testlösungen. Lösungen mit einem Gehalt an etwa 0,1 bis 10 mg Sojabohnentrypsininhibitor pro ml wurden in diesem Test verwendet.

Beispiel 12 Bestimmung von Humanglobulin mit einem Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Dextran-α-Amylase-Kon­ jugat unter Verwendung von Dextranase zur Freisetzung von α-Amylase aus dem immobilisierten Immunkomplex (a) Herstellung von Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Dextran-α-Amylase-Konjugat

13 mg α-Amylase (siehe Beispiel 1) wurden in 1,1 ml eines Puffers aus 0,05 Mol Natriumphosphat und 0,3 Mol NaCl vom pH-Wert 7,5 gelöst, wonach 110 µl einer Lösung von 5 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in 99,5%igem Ethanol zugegeben wurden. Die Lösung wurde heftig geschüttelt und sodann 15 Minuten stehen gelassen, wonacch 100 µl 50 mM Dithiothreit zugegeben wurden. Nach weiteren 15 Minuten wurde das Reaktionsgemisch an einer Säule gelfiltriert, welche mit den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gefüllt war; als Medium diente eine 0,3 M Natriumchloridlösung. Das eluierte Material, 2,5 ml, mit einem Gehalt an 4,70 mg thiolierter α-Amylase pro ml und einem Substitutionsgrad von 0,9 Mol HS-Gruppen/Mol Protein wurde vereint.

Die auf diese Weise thiolierte α-Amylase (etwa 12 mg in 2,5 ml) wurde mit 12 mg 2-Pyridyldisulfid-Dextran (hergestellt gemäß Beispiel 4) welche in 1,5 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 gelöst waren, vermischt. Die Umsetzung wurde bei 25°C 24 Stunden unter sorgfältigem Rühren fortgesetzt, wobei sich ein Dextran-α-Amylase-Derivat bildete.

0,8 mg Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper (wie in Beispiel 10 (b) durch Immunosorption gereinigt) in 0,3 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 wurden mit 25 µl einer Lösung von 5 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in absolutem Ethanol vermischt. Die Umsetzung wurde bei 25°C vorgenommen, wonach das Reaktionsgemisch an einer Säule mit den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert wurde (das verwendete Medium war eine 0,1 M Natriumacetatlösung vom pH-Wert 5,0). Das eluierte Material, 0,7 mg in 0,7 ml, wurde während 30 Minuten mit 5 mMol Dithiothreit reduziert, wonach überschüssiges Reduktionsmittel durch eine andere Gelfiltration an den zuvor genannten Perlen entfernt wurde (das verwendete Medium war eine 0,3 M Natriumchloridlösung). Die auf diese Weise erhaltenen thiolierten Antikörper [das eluierte Material, 0,55 mg Protein (1,0 ml) mit einem Gehalt an 2 Mol HS pro Mol Protein] wurden mit 0,1 ml Dextran-α-Amylase-Derivat (siehe oben) vermischt, und die Reduktion wurde bei 4°C während 24 Stunden unter Rühren vorgenommen.

Das Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Dextran-α-Amylase- Konjugat wurde bei 4°C aufbewahrt.

(b) Bestimmung von Humangammaglobulin mit Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Dextran-α-Amylase- Konjugat unter Verwendung von Dextranase zur Freisetzung von α-Amylase aus dem immobilisierten Immunkomplex

100 µl einer Suspension eines Agarose-Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Derivats [hergestellt in analoger Weise zu Beispiel 7 (b)] mit einem Gehalt an etwa 50 µg Antikörpern pro ml Suspension wurden in jedes Röhrchen einer Reihe von Teströhrchen mit verschiedenen Mengen von Humangammaglobulin (0,5 bis 300 ng), gelöst in 100 µl eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat, 0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat vom pH-Wert 7,5 gegeben. Eine Anzahl von Röhrchen mit lediglich Puffer, und eine Anzahl von Röhrchen mit einem Gehalt an Aminoethylagarose [hergestellt gemäß Beispiel 7 (b)] dienten als Blindproben. Die Röhrchen wurden unter sorgfältigem Schütteln 18 Stunden bei 25°C inkubiert. Das Agarosegel eines jeden Röhrchens wurde sodann wie in Beispiel 7 (b) beschrieben, gewaschen. Zu jedem Röhrchen, das die gewaschene Agarosesuspension (etwa 0,3 ml/Röhrchen) enthielt, wurden 100 µl einer 100fachen Verdünnung des Reaktionsgemisches zugegeben, welches Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Dextran-α-Amylase-Konjugat (siehe oben) enthielt. Unter sorgfältigem Schütteln wurden die Röhrchen sodann 18 Stunden bei 25°C inkubiert, wonach das Agarosegel jedes Röhrchens, wie in Beispiel 7 (b) beschrieben, gewaschen wurde. 1,0 ml Dextranase (0,5 mg DEX/ml) in einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 wurde dann zu allen Röhrchen gegeben, die sodann 60 Minuten bei 25°C inkubiert wurden. Die Dextranase baut den Träger Dextran ab, wobei vom Konjugat und dem immobilisierten Immunkomplex α-Amylase freigesetzt wird und in die Lösung geht. Die freigesetzte a-Amylaseaktivität wurde sodann, wie in Beispiel 7 (b) beschrieben, bestimmt.

Die Aktivität der freigesetzten α-Amylase ist proportional zur Menge an Antikörper-Dextran-α-Amylase-Konjugat, die an das Agarose-Immunkomplex-Derivat gebunden ist; diese Menge ist ihrerseits proportional zur Menge an Gammaglobulin, das an das Agarose-Antikörper-Derivat gebunden ist. Infolgedessen ist sie ein Maß für die Konzentrationen an Gammaglobulin in den Testlösungen. Auf diesem Weg konnte Humangammaglobulin bis herab zu einer Konzentration von etwa 1 ng/ml nachgewiesen werden.

Claims (7)

1. Verfahren zur Durchführung von Bestimmungsmethoden mit biospezifischen Affinitätsreaktionen, vorzugsweise immunchemischen Reaktionen, bei denen eine mit zumindest einer analytisch nachweisbaren Gruppe markierte und in der Flüssigkeit, in deren Gegenwart die biospezifische Affinitätsreaktion durchgeführt wird, lösliche Komponente I, vorzugsweise eine immunchemische Komponente I mit einer Komponente II, die gegenüber I biospezifische Affinität zeigt, vorzugsweise mit einer immunchemischen Komponente II, und wahlweise ferner einer oder mehreren zusätzlichen Komponenten, welche gegenüber I und/oder II biospezifische Affinität aufweisen, vorzugsweise immunchemischen Komponenten, unter Bildung eines unlöslichen Konjugats, in das die markierte Komponente I eingeschlossen ist, zur Umsetzung gebracht wird, wobei die analytisch nachweisbare Gruppe mit einer spaltbaren Bindung kovalenter Natur an die Komponente I gebunden und/oder eine der Komponenten mit einer spaltbaren Bindung kovalenter Natur an einen in der Flüssigkeit unlöslichen Träger gebunden ist, und wobei die spaltbaren Bindungen die gleich oder verschieden sein können, unter Bedingungen spaltbar sind, welche praktisch keinen störenden Einfluß auf die angewandte Bestimmungsmethode ausüben, dadurch gekennzeichnet, daß als spaltbare Bindung eine Bindung -S-S- oder verwendet wird, die durch Reduktion bzw. Oxidation spaltbar ist, und daß das unlösliche Konjugat von der Flüssigkeitsphase abgetrennt wird und an der spaltbaren Bindung oder den spaltbaren Bindungen in Gegenwart einer Flüssigkeit unter Bildung von Fragmenten gespalten wird, die in der Flüssigkeit löslich sind und die analytisch nachweisbare Gruppe enthalten, welch'letztere sodann in der Flüssigkeitsphase bestimmt wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die analytisch nachweisbare Gruppe eine enzymatisch aktive Gruppe ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die analytisch nachweisbare Gruppe eine fluoreszierende Gruppe ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die spaltbare Bindung eine Disulfidbindung -S-S- ist.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die markierte Komponente I ein Multikonjugat einer Vielzahl analytisch nachweisbarer Gruppen darstellt, welche miteinander über spaltbare Bindungen enthaltende Verbindungsglieder verbunden sind, und, vorzugsweise mit spaltbaren Bindungen, an die Komponente I gebunden sind.

6. Reagens zur Verwendung im Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine markierte immunchemische Komponente I enthält, welche ein Multikonjugat einer Vielzahl von analytisch nachweisbaren Gruppen darstellt, welche über Verbindungsglieder aneinander gebunden sind, die durch Reduktion oder Oxidation spaltbare kovalente Bindungen der Formel -S-S- bzw. enthalten, und welche vorzugsweise mit durch Reduktion oder Oxidation spaltbare Bindungen der Formel -S-S- bzw. enthaltenden Verbindungsgliedern, an die immunchemische Komponente gebunden sind.

7. Reagens gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die spaltbare Bindung eine Disulfidbindung -S-S- ist.