DE2808515C2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- DE2808515C2 DE2808515C2 DE2808515A DE2808515A DE2808515C2 DE 2808515 C2 DE2808515 C2 DE 2808515C2 DE 2808515 A DE2808515 A DE 2808515A DE 2808515 A DE2808515 A DE 2808515A DE 2808515 C2 DE2808515 C2 DE 2808515C2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cleavable
- component
- bound
- buffer
- conjugate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/804—Radioisotope, e.g. radioimmunoassay
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft das in den Patentansprüchen 1 bis 5
beschriebene Verfahren zur Durchführung von Bestimmungsmethoden
mit biospezifischen Affinitätsreaktionen, vorzugsweise
immunchemischen Reaktionen, sowie das in den
Patentansprüchen 6 und 7 beschriebene Reagens zur Verwendung
in diesem Verfahren.
Es sind eine große Anzahl von Bestimmungsmethoden mit
biospezifischen Affinitätsreaktionen bekannt, in erster
Linie solche, welche immunchemische Bestimmungsmethoden
betreffen. Bei einer Gruppe derartiger Methoden wird ein
wasserunlösliches Polymermaterial verwendet, an das ein
Antikörper oder ein Antigen, beispielsweise ein polypeptidhaltiges
Antigen, oder irgendeine andere Komponente,
gebunden wird. So ist es z. B. aus den SE-PS 3 43 949
und 3 41 239, aus Biochim. Biophys. Acta, Bd. 130,
Seite 257 (1966) sowie "Radioimmunoassay Methods"
(herausg.: K. E. Kirkham und W. M. Hunter, Churchil
Livingstone, London 1971), z. B. Seite 405 bis 412 des
Artikels "Solid Phase Antigen Antibody Systems" von L. Wide,
bekannt, ein wasserunlösliches Polymermaterial zu verwenden,
an das ein Antikörper oder ein Antigen mit Bindungen
kovalenter Art gebunden wird. Ferner ist aus der US-PS
36 45 346 eine immunchemische Bestimmungsmethode bekannt,
bei der an die Innenfläche von Kunststoff-Teströhrchen
adsorbierte Antikörper benutzt werden.
Ein weiteres Beispiel der Bildung eines unlöslichen immunchemischen
Konjugats ist in diesem Zusammenhang die sogenannte
"doppelte Antikörper-Methode".
Bei einer Art dieser immunchemischen Bestimmungsmethoden
wird ein an das Polymermaterial gebundener Antikörper gegen
ein Antigen gerichtet, welches bei der Bestimmungsmethode
verwendet wird und immunchemisch an dem Antikörper auf
dem Polymermaterial gebunden ist. Das an den Antikörpergebundene
Antigen kann seinerseits mit einem Antikörper in
Lösung reaktionsfähig sein. Gemäß einer anderen Art
dieser Methoden wird ein an das Polymermaterial gebundenes
Antigen mit einem gegen das Antigen gerichteten
Antikörper zur Umsetzung gebracht, oder das Antigen wird
mit einem derartigen Antikörper umgesetzt, der seinerseits
mit beispielsweise einem Antigen in Lösung umgesetzt werden
kann.
Bei der Durchführung der infragestehenden immunchemischen
Bestimmungsmethoden ist es ferner bekannt, vorzugsweise
eine der bei der Bestimmungsmethode verwendeten Komponenten,
die nicht direkt an das Polymer gebunden ist, mit einem
analytisch nachweisbaren Atom oder einer derartigen Gruppe
zu markieren, beispielsweise mit einem radioaktiven Atom
oder einer radioaktiven Gruppe, einer fluoreszierenden,
lumineszierenden oder chromophoren Gruppe oder aber einer
enzymatisch aktiven Gruppe. Immunchemische Bestimmungsmethoden,
bei denen eine Komponente mit einer enzymatisch
aktiven Gruppe markiert wird, sind aus Clin. Chem.,
Bd. 22, Nr. 8 (1976), S. 1243 bis 1255 bekannt.
Es sind viele Varianten derartiger Bestimmungsmethoden
(einschließlich analoger Methoden unter Verwendung anderer
Komponenten I und II mit gegenseitiger biospezifischer
Affinität als lediglich immunchemische Komponenten)
bekannt, bei denen eine markierte Komponente, z. B. ein
markiertes Antigen, markiertes Hapten, markierter Antikörper
oder markiertes Protein A verwendet werden.
So können beispielsweise (a) polymergebundene Antikörper
mit dem Antigen der Probe und mit markiertem Antigen
umgesetzt werden, oder (b) polymergebundene Antikörper
werden mit dem Antigen der Probe auf solche Weise umgesetzt,
daß das Antigen an den polymergebundenen Antikörper
gebunden wird, wonach markierte Antikörper zugegeben werden,
welche sich an das gebundene Antigen binden, oder
(c) das polymergebundene Antigen wird mit einem Antikörper
der Probe auf solche Weise umgesetzt, daß sich der Antikörper
an das Antigen bindet, wonach markiertes Antigen
zugegeben wird, welches sich an den gebundenen Antikörper
bindet, oder (d) das polymergebundene Antigen wird mit
dem Antikörper der Probe auf solche Weise umgesetzt,
daß sich der Antikörper an das richtige Antigen bindet, wonach
gegen die zuerst genannten Antikörper gerichtete markierte
Antikörper zugegeben werden und sich an diese binden.
Die polymergebundenen Antikörper können auch über
Antigen an das Polymere gebunden sein, und die polymergebundenen
Antigene können auch über Antikörper an das Polymer
gebunden sein. Die Antikörper können einer oder mehreren
Immunglobulinklassen angehören. Was hinsichtlich der Bestimmungsmethoden
mit Antigenen und Antikörpern gesagt wurde,
trifft auch für analoge Bestimmungsmethoden mit anderen
Komponenten I und II zu.
Es ist gut bekannt, daß derartige Bestimmungen vorzugsweise
in Gegenwart einer wäßrigen Flüssigkeit, z. B. einer Pufferlösung
mit einem geeigneten pH-Wert und einer geeigneten
Ionenstärke, durchgeführt werden.
Zur Markierung der Komponente I, z. B. des Antigens oder Antikörpers,
mit einer analytisch nachweisbaren Gruppe ist es
möglich, das Antigen bzw. den Antikörper direkt mit der
markierten Gruppe chemisch zu kuppeln oder eine Brücke
zwischen diesen einzuführen. Um diese chemische Umsetzung
herbeizuführen, können z. B. Aminogruppen in dem einen und
Carboxylgruppen in dem anderen Reaktanden verwendet werden,
oder es können in beiden Reaktanden Aminogruppen benutzt
werden. Beim Kuppeln (Konjugieren) mit Hilfe einer Brücke
ist es bekannt, z. B. solche Reagentien wie Glutardialdehyd,
Bromcyan und Carbodiimide zu verwenden. Die auf diese Weise
zwischen dem Antigen, den Antikörpern oder anderen Komponenten
I und der analytisch nachweisbaren Gruppe gebildeten kovalenten
Bindungen sind von dauernder Art, d. h. es ist nicht beabsichtigt, sie aufzuspalten.
Wenn unlösliche Träger verwendet werden, an die ein Antikörper,
ein Antigen oder irgendeine andere Komponente mittels
kovalenter Bindungen gebunden sind, so sind diese Bindungen
ebenfalls von dauernder Art. In diesem Fall wird der Träger
zuerst durch Einführung reaktionsfähiger Gruppen aktiviert,
wonach der aktivierte Träger mit dem Antikörper, Antigen
usw. zur Umsetzung gebracht wird. Es kann nicht erwartet
werden, daß alle reaktionsfähigen Gruppen Bindungen mit dem
Antikörper, dem Antigen usw. eingehen, und trotz einer nachfolgenden
Behandlung zur Überführung restlicher reaktionsfähiger
Gruppen in inertere Gruppen sind die restlichen
reaktionsfähigen Gruppen ein vermutlicher Grund für das nichtspezifische
Binden von Komponenten, wie z. B. Antigenen und
Antikörpern, in einer Probe und ferner der markierten, auf
den Träger gerichteten Komponente, das bei dieser Art der
Bestimmungsmethode festgestellt wurde. Da eine markierte
Komponente, zusätzlich zur Tatsache, daß sie selbst nichtspezifisch
gebunden wird, fähig ist, bei biospezifischen
Affinitätsreaktionen mit nicht-spezifisch gebundenen Komponenten
zu reagieren, und infolgedessen die nicht-spezifisch
gebundenen Komponenten nicht vom Träger abgewaschen werden
können, können die Meßergebnisse beträchtlich verfälscht
werden, insbesondere dann, wenn die zu bestimmende Komponente
in sehr geringen Konzentrationen vorliegt.
Aus der US-PS 36 52 761 ist ein Verfahren zur Isolierung
eines Antigens aus einer Lösung bekannt, bei dem die Lösung
mit einem Konjugat in Berührung gebracht wird, welches
einen anorganischen Träger enthält, an den kovalent über
ein Silan ein mit dem Antigen komplexbildungsfähiger Antikörper
gekoppelt ist, anschließend das Konjugat aus der
Lösung gewonnen wird und das komplex gebundene Antigen
aus dem Konjugat eluiert wird.
Aus der DE-OS 25 37 275 ist ein immunchemisches Verfahren
zur Bestimmung von Antigenen bzw. Antikörpern in
biologischen Flüssigkeiten bekannt, bei dem man die Antigene
durch Bindung an eine damit eine Reaktion eingehende
Arbeitssubstanz markiert, die selbst oder mittels eines
Bruchstückes davon leicht der Bestimmung zugänglich ist, das
markierte Antigen mit der zu untersuchenden Substanz immunchemisch
reagieren läßt und die freigesetzte Arbeitssubstanz
oder deren der Bestimmung zugängliches Bruchstück
direkt mißt. Bei diesem bekannten Verfahren kann zur Freisetzung des der Bestimmung zugänglichen Bruchstückes der
Arbeitssubstanz, d. h. der analytisch nachweisbaren Gruppe,
eine hydrolytische Spaltung einer kovalenten Bindung
erfolgen. Da jedoch auch Proteine, wie die Antigene und
Antikörper, gegenüber einer Hydrolyse empfindlich sind,
ist dieses Verfahren nicht besonders brauchbar.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
und ein Reagens zur Durchführung von Bestimmungsmethoden mit
biospezifischen Affinitätsreaktionen, vorzugsweise immunchemischen
Reaktionen, bei denen eine mit zumindest
einer analytisch nachweisbaren Gruppe markierte und in
der Flüssigkeit, in deren Gegenwart die biospezifische
Affinitätsreaktion durchgeführt wird, lösliche Komponente
I, vorzugsweise eine immunchemische Komponente I, mit
einer Komponente II, die gegenüber I biospezifische
Affinität zeigt, vorzugsweise mit einer immunchemischen
Komponente II, und wahlweise ferner einer oder mehreren
zusätzlichen Komponenten, welche gegenüber I und/oder
II biospezifische Affinität aufweisen, vorzugsweise
immunchemischen Komponenten, unter Bildung eines unlöslichen
Konjugats, in das die markierte Komponente I eingeschlossen
ist, zur Umsetzung gebracht wird, wobei die
analytisch nachweisbare Gruppe mit einer spaltbaren
Bindung kovalenter Natur an die Komponente I gebunden
und/oder eine der Komponenten mit einer spaltbaren Bindung
kovalenter Natur an einen in der Flüssigkeit unlöslichen
Träger gebunden ist, und wobei die spaltbaren Bindungen,
die gleich oder verschieden sein können, unter Bedingungen
spaltbar sind, welche praktisch keinen störenden Einfluß
auf die angewandte Bestimmungsmethode ausüben, bereitzustellen,
bei dem Störungen, die von unspezifisch gebundenen
Komponenten mit biospezifischer Affinität ausgehen
oder durch hydrolytische Spaltung von Proteinen
bewirkt werden, verhindert oder jedenfalls vermindert werden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß im Hinblick auf das Verfahren
dadurch gelöst, daß als spaltbare Bindung eine
Bindung -S-S- oder
verwendet wird, die
durch Reduktion bzw. Oxidation spaltbar ist, und daß das
unlösliche Konjugat von der Flüssigkeitsphase abgetrennt wird
und an der spaltbaren Bindung oder den spaltbaren Bindungen
in Gegenwart einer Flüssigkeit unter Bildung von Fragmenten
gespalten wird, die in der Flüssigkeit löslich sind und die
analytisch nachweisbare Gruppe enthalten, welch'letztere sodann
in der Flüssigphase bestimmt wird.
Im Hinblick auf das Reagens wird die Aufgabe erfindungsgemäß
dadurch gelöst, daß dieses eine markierte immunchemische
Komponente I enthält, welche ein Multikonjugat
einer Vielzahl von analytisch nachweisbaren Gruppen darstellt,
welche über Verbindungsglieder aneinander gebunden
sind, die durch Reduktion oder Oxidation spaltbare
kovalente Bindungen der
Formel -S-S- bzw.
enthalten, und welche,
vorzugsweise mit durch Reduktion oder Oxidation spaltbare
Bindungen der Formel -S-S- bzw.
enthaltenden Verbindungsgliedern, an die immunchemische
Komponente gebunden sind. Im vorliegenden werden
unter dem Begriff "immunchemische Komponente" Immunglobuline
(einschließlich modifizierter Immunglobuline,
wie z. B. aggregierte Immunglobuline, sowie Fragmente,
wie z. B. Fab- oder Fc-Fragmente), vorzugsweise Antikörper,
und Antigene sowie Haptene verstanden.
Beispiele für Komponenten I und II, welche gegenseitige
biospezifische Affinität zeigen, sind Antigene
(oder Haptene) und gegen diese gerichtete spezifische Antikörper.
Andere Beispiele umfassen (a) Protein A (von S.
aureus) und dessen Fragmente, die den Fc-Teil von zur IgG-Klasse
gehörenden Immunglobulinen binden können; (b) C1q,
welches beispielsweise sich an in der Wärme aggregiertes IgG
binden kann; (c) Lectine (wie z. B. Concanavalin A), die z. B.
an spezifische Kohlenhydratstrukturen in beispielsweise
Biopolymeren gebunden werden können; (d) Enzyminhibitoren,
welche sich an ihre Enzyme binden können; (e) physiologisch
oder pharmazeutisch aktive Substanzen, die fähig sind, sich
an entsprechende Rezeptoren zu binden; (f) Viren, insbesondere
Bakteriophagen, die sich an Zellwand-Substanzen
binden können. Auf dem biochemischen Gebiet gibt es viele
andere Beispiele derartiger Stoffpaare, welche eine gegenseitige
biospezifische Affinität aufweisen.
Im vorliegenden umfaßt die Angabe, daß die markierte Komponente
I in der Flüssigkeit, in deren Gegenwart die biospezifische
Affinitätsreaktion durchgeführt wird (d. h. in der Regel in
Wasser oder in einer wäßrigen Flüssigkeit), löslich ist,
beispielsweise auch, daß sie in dieser Flüssigkeit kolloidal
dispergierbar sein kann oder auf einem anderen Weg in Form
von Teilchen vorliegen kann, welche ausreichend klein sind,
um sich selbst in der Flüssigkeit suspendiert zu halten.
Im vorliegenden werden unter dem Begriff "Bedingungen, die
praktisch keinen störenden Einfluß auf die angewandte Bestimmungsmethode
ausüben" beispielsweise Bedingungen verstanden,
die nicht zu einer beträchtlichen Verminderung der
Aktivität der analytisch nachweisbaren Gruppe führen, sowie
Bedingungen, welche das Reagens, mit dem die analytisch nachweisbare
Gruppe während dem Bestimmungsverfahren umgesetzt
wird, oder andere Teile des angewandten Meßsystems beeinträchtigen.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßeen Verfahrens
liegt darin, daß Strahlungs-Absorptionseffekte, die bei
einem festen Konjugat auftreten, vermieden werden können,
was besonders vorteilhaft ist, wenn beispielsweise eine
fluoreszierende oder lumineszierende Gruppe, eine chromophore
oder radioaktive Gruppe, wie z. B. eine β-Strahlungsgruppe,
als analytisch nachweisbare Gruppe verwendet wird.
In dieser Hinsicht wird besonders bevorzugt die Bindung
zwischen der analytisch nachweisbaren Gruppe und der Komponente
I gespalten und weniger bevorzugt eine Spaltung
zwischen dem Träger und der an ihn gebundenen Komponente
durchgeführt, da im ersteren Fall Strahlungs-Absorptionseffekte
durch andere Bestandteile des Konjugats vermieden
werden können.
Entsprechendes gilt auch dann, wenn die analytisch nachweisbare
Gruppe eine enzymatisch aktive Gruppe ist. So zeigen
Enzyme, welche als analytisch nachweisbare Gruppen an irgendein
anderes Makromolekül gekuppelt sind, oft eine geringere
Aktivität als die entsprechenden nativen Enzyme. Diese
Aktivitätsverminderung beruht auf der Tatsache, daß das
Enzym, als Ergebnis der Kupplung, sterisch daran gehindert
wird, auf sein Substrat einzuwirken. Ein weiterer Grund kann
die Diffusionssteuerung sein, die oft in der dem Enzymkonjugat
am nächsten liegenden Wasserschicht auftritt. Durch
Freisetzung der Enzymmarkierung kann die Aktivität in der
Flüssigphase gemessen werden, wodurch eine optimale Enzymaktivität
erhalten wird. Dies ermöglicht auch die Verwendung
von wasserunlöslichen Substraten für die Enzymbestimmung.
Infolgedessen können erfindungsgemäß als Markierungssubstanz
nicht nur Enzyme (wie z. B. Hydrolasen, Oxidasen und Reduktasen),
welche bisher als Markierungssubstanzen bei immunochemischen
Bestimmungsmethoden verwendet wurden, sondern auch auf
Substrate hohen Molekulargewichtes, sogar unlösliche Substrate
einwirkende Enzyme benutzt werden. Vorzugsweise ist die
enzymatisch aktive Gruppe der einzige Teil im Konjugat, der
über eine der erfindungsgemäß verwendeten spaltbaren Bindungen
gebunden ist.
Das Verfahren bietet auch Vorteile unter dem Gesichtspunkt
der Meßtechnik, da die markierte Substanz in flüssiger Phase
zwischen Gefäßen transportiert werden kann, anstelle der
weniger leicht zu handhabenden festen Form, was eine Automatisierung
der Analyse erleichert. Vorzugsweise ist die
beim Spalten verwendete flüssige Phase eine wäßrige
Flüssigkeit, wie z. B. eine Pufferlösung, von geeignetem pH-Wert
und geeigneter Ionenstärke.
Die in der Mehrzahl der Fälle am meisten bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist diejenige Variante, bei der
lediglich die Bindung zwischen der Komponente I und der
analytisch nachweisbaren Gruppe spaltbar ist, und bei der
diese Bindung im Verlauf der Bestimmung gespalten
wird. Die Ausführungsform mit einer spaltbaren Bindung
zwischen einer Komponente II und einem unlöslichen Träger
ist in solchen Fällen von besonderem Wert, wo eine Störung
infolge unspezifischer Adsorption der markierten Komponente
I an der Feststoffphase auftritt. Die spaltbare Bindung kann
in diesem Fall die einzige spaltbare Bindung sein, jedoch
ist es in vielen Fällen von besonderem Vorteil, daß auch
die Bindung zwischen der Komponente I und der nachweisbaren
Gruppe, bzw. den nachweisbaren Gruppen, spaltbar
ist; in diesem Falle wird für diese Bindung die andere
spaltbare Bindung verglichen mit derjenigen zwischen der
Komponente II und dem unlöslichen Träger ausgewählt, wobei
der besondere Vorteil erhalten wird, daß die beiden Spaltungen
in zwei verschiedenen Stufen durchgeführt werden können.
Die spaltbaren Bindungen können durch Reduktion bzw.
Oxidation gespalten werden. Die erfindungsgemäß bevorzugt
verwendete Disulfidbindung -S-S- kann durch
Reduktion gespalten werden. Die Bindung mit vizinalen
Diol-Strukturen kann oxidativ mit Natriumperiodat
gespalten werden.
Eine -S-S--Bindung kann erhalten werden, indem man eine oder
mehrere Thiolgruppen, falls sie nicht bereits vorliegen,
in eine der beiden miteinander zu kuppelnden Substanzen einführt,
und in das andere Molekül eine oder mehrere Disulfidstrukturen, die für den Thiol-Disulfid-Austausch aktiviert
sind; wenn beispielsweise eine Thiolgruppe in die Markierungssubstanz
eingeführt wird, sollte die Substanz mit biospezifischer
Aktivität, die mit der Markierungssubstanz gekuppelt
wird, mit der Disulfidstruktur versehen werden, und umgekehrt.
Die beiden Arten modifizierter Substanzen werden sodann miteinander
in Berührung gebracht, wobei sie über eine Thiol-Disulfid-Austauschreaktion
mit -S-S--Bindungen aneinander
gebunden werden.
Vorzugsweise befindet sich auf beiden Seiten der -S-S--Brücke ein
Kohlenstoffatom, welches einen Teil einer aliphatischen
oder aromatischen Gruppe bilden kann. Diese Kohlenstoffatome
sind ihrerseits vorzugsweise an zumindest 1 Kohlenstoffatom gebunden. Die
restlichen Bindungen der zuerst genannten Kohlenstoffatome
sind vorzugsweise mit Wasserstoffatomen abgesättigt. Jedes
der zuerst genannten Kohlenstoffatome kann z. B. in die
Gruppe -CH₂- und/oder
einbezogen sein, wo das Kohlenstoffatom
in einem aromatischen Ring, wie z. B. einem Benzolring,
liegt. Infolgedessen liegt die Disulfid-Brücke vorzugsweise
in einer Gruppe der Formel
worin eine der restlichen Bindungen eines jeden dieser
Kohlenstoffatome an ein weiteres Kohlenstoffatom gebunden ist
und restliche Bindungen eines jeden Kohlenstoffatoms an
Wasserstoff und/oder Kohlenstoff gebunden sind.
Zur Einführung der Thiolgruppen können bekannte Thiolierungsmittel
verwendet werden, wie z. B. ein Thiolimidat der
worin R die Methyl- oder Ethylgruppe, und n eine ganze Zahl
von 1 bis 10, vorzugsweise 2 bis 4, bedeuten, oder N-Acetylhomocystein-thiolacton.
Die Umsetzung wird in wäßriger Lösung in schwach alkalischer
Umgebung (pH-Wert: 7 bis 9) und bei einer Temperatur von
15 bis 30°C mit einem hohen Überschuß an Thiolierungsmittel
durchgeführt.
Zur Einführung einer für den Thiol-Disulfid-Austausch aktivierten
Disulfid-Struktur können z. B. bekannte Disulfide
verwendet werden, deren entsprechende reduzierte Form ein
geringes S-nukleophiles Verhalten aufweist, in Abhängigkeit
von der Resonanzstabilisierung oder der Thiol-Thion-Tautomerie,
und die mit den Thiolgruppen aufweisenden Substanzen
umzusetzen sind. Beispiele für derartige Disulfide sind 2,2′-Dipyridyl-disulfid, 4,4′-Dipyridyl-disulfid und entsprechende
Verbindungen, die in der Pyridylgruppe substituiert sind,
bei denen die Substituenten von solcher Art und in einer
solchen Stellung sind, daß die Thiol-Thion-Tautomerie nicht
gestört wird, beispielsweise solche mit einer Nitro- oder
Carboxylgruppe in der 5-Stellung.
Die Umsetzung der thiolhaltigen Substanz mit dem Disulfid
der zuvor genannten Art wird in wäßriger Lösung bei einem
pH-Wert von 2 bis 9 und einer Temperatur von 15 bis 30°C
mit einem hohen Überschuß an Disulfid durchgeführt.
Vorzugsweise wird jedoch sowohl für die Thiolierung als
auch die Einführung einer aktivierten Disulfidstruktur ein
heterobifunktionelles Reagens der Formel
R¹-S-S-A-Z (I)
verwendet, in der R¹ einen 2-Pyridyl-, 5-Nitro-2-pyridyl-
oder 4-Pyridylrest, A einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis
10, vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Z eine der
Gruppen
oder ein Säureanlagerungssalz der zuletzt genannten Gruppen
bedeuten, worin n 2 oder 3, R¹ die gleiche Bedeutung wie
R¹ weiter oben besitzt und diesem gleich ist, und R² die
Methyl- oder Ethylgruppe darstellt.
Die Verbindungen der Formel I können auf eine Anzahl verschiedener
Wege hergestellt werden. Die derzeit bevorzugten
Verfahren sind folgende:
Verbindungen der Formel I, bei denen Z die Gruppe
bedeutet, werden hergestellt, indem man ein Disulfid der
allgemeinen Formel
R¹-S-S-A-COOH (II)
worin R¹ und A die zuvor genannten Bedeutungen besitzen,
falls n = 2 sein soll, mit N-Hydroxysuccinimid (oder, falls
n = 3 sein soll, mit der analogen Verbindung, bei der n = 3
ist) in Gegenwart eines Kondensationsmittels umsetzt.
Die Reaktion wird in einem organischen Lösungsmittel bei
einer Temperatur von 10 bis 30°C durchgeführt. Ein geeignetes
Lösungsmittel ist z. B. Methylenchlorid, Ethylenacetat und
Dioxan. Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von der
Auswahl der Reaktionskomponenten und -temperatur.
Das Kondensationsmittel kann ein solches sein, das üblicherweise
bei Veresterungen benutzt wird, wie z. B. N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid.
Die Ausgangsverbindung der Formel II kann hergestellt werden,
indem man eine Mercaptoalkylcarbonsäure der Formel III
HS-A-COOH (III)
mit einem Dipyridylsulfid der Formel
R¹-S-S-R¹ (IV)
umsetzt, wobei A und R¹ die zuvor genannten Bedeutungen
besitzen.
Diese Umsetzung wird in einem organischen Lösungsmittel bei
einer Temperatur von 10 bis 30°C durchgeführt. Ein geeignetes
Lösungsmittel ist z. B. Ethanol, Ethylacetat und Dioxan.
Die Reaktionszeit schwankt in Abhängigkeit von den ausgewählten
Reaktionskomponenten und der Reaktionstemperatur.
Verbindungen der allgemeinen Formel I, bei denen Z die
Gruppe
bedeutet, werden hergestellt durch Umsetzung eines Disulfids
der Formel II mit einem entsprechenden Thiopyridon in Gegenwart
eines Kondensationsmittels in einem organischen Lösungsmittel
bei einer anfänglich niederen Temperatur, beispielsweise
-20°C, während annähernd 1 bis 2 Stunden, und danach
bei Umgebungstemperatur (z. B. 20°C). Ein in dieser Hinsicht
geeignetes Lösungsmittel ist z. B. Methylenchlorid, Ethylacetat
und Dioxan. Das vorzugsweise verwendete Kondensationsmittel
ist N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid.
Das bevorzugt verwendete Ausgangsmaterial ist ein Gemisch,
welches durch Umsetzung einer Verbindung der Formel III
mit einer Verbindung der Formel IV erhalten wurde.
Verbindungen der Formel I, bei denen Z die Gruppe
bedeutet, werden hergestellt durch Umsetzung eines Thiolimidats
der Formel
worin R² und A die zuvor genannten Bedeutungen besitzen,
mit einem Pyridyldisulfid der Formel R¹-S-S-R¹, worin R¹
die zuvor genannte Bedeutung besitzt, in einem organischen
Lösungsmittel. Das Lösungsmittel kann z. B. Methanol sein,
welches etwa 10% Eisessig enthält.
Die Verwendung dieser Reaktanden kann durch folgendes
Reaktionsschema veranschaulicht werden, bei dem als Beispiel
für einen geeigneten bifunktionellen Reaktanden N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat gewählt wurde:
In den obigen Formeln steht -NH₂ beispielhaft für eine
immunochemische reaktionsfähige Komponente I oder eine
andere Komponente I mit einer biospezifischen Affinität
zu einer Komponente II, während -NH₂ beispielhaft für eine
nachweisbare Gruppe, wie z. B. ein Enzym oder eine ein oder
mehrere radioaktive Atome enthaltende Gruppe, steht. Es
ist möglich, bei der Reduktion in der Stufe C, oben, Dithiothreit
(im folgenden als DTT abgekürzt) zu verwenden.
Mit diesem Reduktionsmittel ist es möglich, z. B. eine proteingebundene
Pyridyldisulfidstruktur ohne gleichzeitige Reduktion
nativer Disulfidbrücken, welche im Protein auftreten können,
zu reduzieren. Dies wird dadurch erreicht, daß man die
Reduktion bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 5 mit einem Überschuß
an DTT oder bei einem höheren pH-Wert mit einem
geringeren Überschuß oder äquimolaren Mengen an DTT durchführt.
Der Substitutionsgrad von Thiol- oder Disulfidgruppen in
beispielsweise einem Protein kann verhältnismäßig leicht
bei dieser Derivatisierungsmethode (Formel B, oben) reguliert
werden, indem man den molaren Überschuß an Reagens
oder den pH-Wert innerhalb des Bereichs von 5 bis 8 variiert.
Beispielsweise können bimolekulare Konjugate, welche z. B.
ein Enzymmolekül (als die nachweisbare Gruppe) und ein
anderes Proteinmolekül mit biospezifischer Affinität (wie
z. B. einen Antikörper) enthalten, hergestellt werden, indem
man 1 Thiolgruppe und 1 Disulfidstruktur in die jeweiligen
Moleküle einführt und die modifizierten Moleküle mittels
Thiol-Disulfid-Austausch zur Reaktion bringt. Da der Thiol-Disulfid-Austausch
ein Thiol und eine reaktionsfähige Disulfidstruktur
erfordert, und nur eine dieser Gruppen in
jedem Molekül anzutreffen ist, können Konjugate, welche
lediglich eine Molekülart umfassen, vermieden werden. Auf
ähnliche Weise können oligomolekulare oder polymolekulare
Konjugate erhalten werden.
Besonders vorteilhaft ist die Auswahl eines Enzyms als nachweisbare
Gruppe, welches zumindest eine native HS-Gruppe
enthält, von der man für die Bildung einer spaltbaren Disulfidbrücke
Gebrauch macht; in diesem Fall kann eine
Derivatisierung vermieden und das Enzym in seiner nativen
Form mit voller Aktivität nach Reduktion der Disulfidbrücke
erhalten werden.
Natürlich können auf ähnliche Weise andere markierte Komponenten
I mit anderen nachweisbaren Gruppen mit einer spaltbaren
Bindung zwischen der nachweisbaren Gruppe und der
Komponente I erhalten werden. Auch können Komponenten II an
einen unlöslichen Träger über eine spaltbare Bindung unter
Anwendung ähnlicher Verfahren gebunden werden.
Die zuvor genannten Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen
können in einer wäßrigen Umgebung bei einem pH-Wert von 2
bis 8 und einer Temperatur von 15 bis 30°C durchgeführt
werden.
In manchen Fällen kann es erwünscht sein, eine direkte Konjugation
der analytisch nachweisbaren Gruppe an Komponenten
mit biospezifischer Aktivität zu vermeiden. Z. B. können die
beiden Molekülarten in nachteiliger Weise auf ihre gegenseitige
Aktivität, beispielsweise durch eine hydrophobe
Wechselwirkung und/oder Ladungseffekte, einwirken. In derartigen
Fällen kann es geeignet sein, einen löslichen Träger
sowohl für die analytisch nachweisbare Gruppe als auch die
Komponente I mit biospezifischer Affinität zu verwenden,
wobei diese Gruppe und diese Komponente jeweils über
Brücken der zuvor genannten Art, welche die Gruppe -S-S-
enthalten, an den löslichen Träger gekuppelt werden,
wodurch sie voneinander getrennt werden. Die Empfindlichkeit
eines Tests auf Basis derartiger Konjugate kann erhöht werden,
indem man eine große Anzahl analytisch nachweisbarer Gruppen
an einen löslichen Träger bindet, an den auch
ein Molekül oder wenige Moleküle der Komponente I mit biospezifischer
Affinität gekuppelt werden.
Der zuvor genannte lösliche Träger kann z. B. Dextran, ein
Dextranderivat, ein Biopolymer, das in dem System inert ist,
oder ein anderes Polymeres, welches in der Flüssigkeit, in
deren Gegenwart die biospezifische Affinitätsreaktion durchgeführt wird, löslich ist, sein. (In diesem Fall kann eine
Bindung in dem löslichen Träger eine spaltbare Bindung, wie
z. B. eine glycosidische Bindung sein, die leicht durch eine Glycosidase,
wie Dextranase, wenn der lösliche Träger Dextran
umfaßt, gespalten werden kann.)
Die Kupplung wird z. B. durch Einführung von Disulfidstrukturen
in den Träger und von HS-Gruppen in die Markierung
und in die Komponente I bewirkt, welche sodann an das Polymere
durch eine Thiol-Disulfid-Austauschreaktion gekuppelt
werden. Zur Kupplung sowohl der Komponente I als auch der
Markierung an den wasserlöslichen Träger kann man auch andere
bekannte Verfahren zum Kuppeln derartiger Substanzen an
Träger anwenden, da es für beide Substanzen nicht erforderlich
ist, daß sie von dem wasserlöslichen Träger abspaltbar
sind.
Die Disulfidbrücke -S-S- kann leicht unter milden Bedingungen
mit Hilfe von z. B. DTT als Reduktionsmittel auf solch' eine
Weise aufgespalten werden, daß die nachweisbare Gruppe in
einer flüssigen Phase freigesetzt wird und dort bestimmt
werden kann; infolgedessen ist die Brücke -S-S- als spaltbare
Bindung besonders geeignet.
Wenn bei der Analyse eine besonders hohe Empfindlichkeit erwünscht
ist, kann gemäß einer wertvollen Ausführungsform der
Erfindung eine markierte Komponente I verwendet werden,
welche ein Multikonjugat einer Vielzahl von analytisch
nachweisbaren Gruppen umfaßt, die über Verbindungsglieder
mit erfindungsgemäß verwendbaren spaltbaren kovalenten
Bindungen (d. h. Disulfidbrücken -S-S- oder vizinalen
Diolstrukturen) miteinander verbunden sind, wobei das
Multikonjugat nachweisbarer Gruppen seinerseits an
die Komponente I gebunden ist, und zwar vorzugsweise
mit Verbindungsgliedern, die erfindungsgemäß verwendbare
spaltbare Bindungen, z. B. Disulfidbrücken -S-S-, enthalten.
Bindungen, welche vizinale Diolstrukturen
enthalten, können z. B. mit Hilfe bifunktioneller Mittel der
Art
hergestellt werden.
Wenn eine der Komponenten, welche an der Affinitätsreaktion teilnehmen,
an einen Träger gebunden ist, der in der Flüssigkeit unlöslich ist,
in deren Gegenwart diese Reaktionen durchgeführt werden, kann der
Träger prinzipiell ein beliebiges derartiges Trägermaterial
umfassen, welches im Zusammenhang mit bislang bekannten Verfahren
dieser Art, welche im einführenden Teil erwähnt wurden, bekannt
ist. Beispiele für derartige Trägermaterialien sind unlösliche
organische oder teilweise anorganische Polymere, wie z. B.
Cellulose, vernetztes Dextran, Agarose, vernetztes Polyacrylamid,
vernetztes Polystyrol sowie Glasderivate. Wenn
die Bindung zwischen diesem Träger und der hieran
gebundenen Komponente nicht erfindungsgemäß abgespalten werden
soll, kann die Bindung eine herkömmliche Bindung sein, d. h.,
daß sie eine Bindung kovalenter Art vom herkömmlichen Typ oder
eine sogenannte hydrophobe Bindung umfassen kann. Auf entsprechende
Weise kann die Bindung zwischen der analytisch
nachweisbaren Gruppe und der Komponente I eine herkömmliche
Bindung sein, wenn eine erfindungsgemäß spaltbare Bindung
zwischen der Komponente II und einem festen Träger vorhanden
ist, und wenn es nicht für erforderlich erachtet wird,
die zuerst genannte Bindung zu spalten.
Nachfolgende Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der
Erfindung.
Eine durch Ionenaustauschchromatographie an Perlen aus
diethylaminoethylhaltigem, mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gereinigte
α-Amylase wurde in 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer gelöst. Die Lösung wurde
mit 0,7 ml N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (11 mMol
in 99,5%igem Ethanol) versetzt. Nach dem Schütteln ließ man
die Umsetzung 60 Minuten bei 23°C fortschreiten. Überschüssige
Reagentien und andere unerwünchste Komponenten mit niederem
Molekulargewicht wurden sodann durch Gelfiltration an Perlen
aus Dextran, welches mit Epichlorhydrin vernetzt war, entfernt;
(das benutzte Medium war der gleiche zuvor genannte
Phosphatpuffer).
4,8 mg Kaninchen-Antihuman-Fcγ-Antikörper (hergestellt aus
Kaninchenserum durch Immunsorptionsreinigung) in 2,5 ml 0,1 M
Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 wurden mit 13 µl einer
11 millimolaren N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat-Lösung
in 99,5%igem Ethanol 60 Minuten bei +23°C umgesetzt.
Überschüssiges Reagens wurde durch Gelfiltration an den zuvor
genannten Perlen aus mit Epichlorhydrin
vernetztem Dextran entfernt; das benutzte Medium
war ein Puffer aus 0,1 M Natriumacetat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert
5,0. Das eluierte Material, welches die modifizierten
Antikörper enthielt, wurde während 20 Minuten mit 0,2 ml von
20 mMol Dithiothreit (im folgenden als DTT abgekürzt) (pH-Wert
5,0) reduziert. Überschüssiges DTT wurde durch Gelfiltration an
den zuvor genannten Perlen entfernt;
das verwendete Medium war 0,3 M NaCl. Die so thiolierten Antikörper,
annähernd 2,1 mg in 3 ml 0,3 M NaCl, wurden mit dem
auf zuvor beschriebene Weise hergestellten α-Amylase-2-pyridyldisulfidderivat
(etwa 10 mg in 1,5 ml von 0,1 M Natriumphosphat
und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5) vermischt. Man ließ die Umsetzung
während 48 Stunden bei + 4°C fortschreiten, wonach unerwünschte
Komponenten niedrigen Molekulargewichtes durch Gelfiltration
an dem zuvor genannten mit
Epichlorhydrin vernetzten Dextran entfernt wurden (das verwendete
Medium war 0,3 M NaCl).
N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat kann auf folgende
Weise hergestellt werden.
1,9 g (8,5 mMol) 2,2′-Dipyridyl-disulfid wird in 10 ml Ethylacetat gelöst. Eine Lösung von 0,9 g (8,6 mMol) 3-Mercaptopropionsäure in 10 ml Ethylacetat wird unter Rühren während 15 Minuten tropfenweise zugegeben, wobei gleichzeitig 0,5 mg (2 Tropfen) Bortrifluoridetherat zum Reaktionsgemisch zugegeben werden. Nach 20 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch in einem Büchi-Umlaufverdampfer bei einer Temperatur von weniger als 40°C zur Trockne eingedampft, und der feste gelbe Rückstand wird in 10 ml Ethylacetat bei einer Temperatur von 4°C aufgeschlämmt und filtriert. Das Filtrat wird mit 0,68 g (5 mMol) N-Hydroxysuccinimid versetzt, wonach 1,03 g (5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 10 ml trockenem Ethylacetat, während 15 Minuten tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben werden. Man läßt bei Raumtemperatur unter Rühren die Umsetzung 5 Stunden fortschreiten, während das Reaktionsgemisch auf +4°C gekühlt wird, wonach das ausgefällte Dicyclohexylcarbamid abfiltriert wird. Die hellgelbe Lösung wird eingedampft, und das Öl wird in Ethanol aufgelöst und bei -20°C auskristallisieren gelassen. Die Ausbeute beträgt 45%; Schmelzpunkt: 78,5 bis 80,5°C.
1,9 g (8,5 mMol) 2,2′-Dipyridyl-disulfid wird in 10 ml Ethylacetat gelöst. Eine Lösung von 0,9 g (8,6 mMol) 3-Mercaptopropionsäure in 10 ml Ethylacetat wird unter Rühren während 15 Minuten tropfenweise zugegeben, wobei gleichzeitig 0,5 mg (2 Tropfen) Bortrifluoridetherat zum Reaktionsgemisch zugegeben werden. Nach 20 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch in einem Büchi-Umlaufverdampfer bei einer Temperatur von weniger als 40°C zur Trockne eingedampft, und der feste gelbe Rückstand wird in 10 ml Ethylacetat bei einer Temperatur von 4°C aufgeschlämmt und filtriert. Das Filtrat wird mit 0,68 g (5 mMol) N-Hydroxysuccinimid versetzt, wonach 1,03 g (5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 10 ml trockenem Ethylacetat, während 15 Minuten tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur zugegeben werden. Man läßt bei Raumtemperatur unter Rühren die Umsetzung 5 Stunden fortschreiten, während das Reaktionsgemisch auf +4°C gekühlt wird, wonach das ausgefällte Dicyclohexylcarbamid abfiltriert wird. Die hellgelbe Lösung wird eingedampft, und das Öl wird in Ethanol aufgelöst und bei -20°C auskristallisieren gelassen. Die Ausbeute beträgt 45%; Schmelzpunkt: 78,5 bis 80,5°C.
Salmponella O-Antigen des Typs D (9.12) wurde in kaltem 0,1 M Natriumcarbonatpuffer vom pH-Wert 9,6 mit einem Gehalt an 0,02%
NaN₃ auf 5 µg/ml verdünnt. 1 ml Antigenlösung wurde in Polystyrolröhrchen
zum einmaligen Gebrauch eingefüllt, und die
Röhrchen wurden 16 Stunden bei 4°C inkubiert.
Humanserum [eine Reihe mit Serum, welches einem Patienten entnommen
worden war, der mit Salmonella-Bakterien vom Typ Sero DO
infiziert war, und eine Reihe mit normalem Humanserum (HNS)]
wurde mit PBS [0,015 M Natriumphosphat vom pH-WErt 7,2,
0,05% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat
0,02% NaN₃ und 0,9% NaCl] auf das 100- bis 100 000fache
verdünnt. Eine Anzahl von Röhrchen, welche gemäß den obigen
Ausführungen vorbereitet worden waren, wurde mit 0,9% NaCl
und 0,05% des zuvor genannten Polyoxyethylen-sorbitanmonooleats
gewaschen. Man ließ die mit der Waschlösung gefüllten Röhrchen
1 oder 2 Minuten stehen, wonach man sie durch Absaugen mit
einer Wasserstrahlpumpe leerte. Dies wurde 2× wiederholt.
1 ml verdünntes Serum wurde in jedes Röhrchen gefüllt (Doppeltest).
Diese Röhrchen wurden sodann 4 Stunden bei 23°C inkubiert.
Während dieses Inkubationszeitraumes binden sich Antikörper gegen
das Salmonella-Antigen an den Teil der Röhrchenwand, welche mit
dem Antigen beschichtet ist. Die Röhrchen wurden sodann abermals
gewaschen, um alle anderen Serumkomponenten zu entfernen.
Zu den Röhrchen wurde ein Konjugat zugegeben, welches gemäß
Absatz (a), oben, hergestellt worden und mit PBS auf das
100fache verdünnt war (1 ml in jedes Röhrchen). Die Röhrchen
wurden sodann 16 Stunden inkubiert. Überschüssiges Konjugat
wurde sodann unter Verwendung des Gleichen Waschverfahrens,
welches zuvor angewandt worden war, abgewaschen.
Die α-Amylase wurde aus dem immunchemischen Komplex aus Antigen-Antikörper-(Antikörper-Enzym-Konjugat),
der an das Röhrchen gebunden
war, freigesetzt, indem man zu jedem Röhrchen 1 ml Dithiothreit
(5 mM in PBS) gab. Nach der Inkubation während 20
Minuten bei 23°C wurde 1 ml Wasser und eine halbe Tablette einer
aus einer wasserunlöslichen, vernetzten blauen Stärke in
Tablettenform bestehenden Amylasesubstanz zugegeben.
Die Röhrchen wurden
kräftig geschüttelt und sodann 1 Stunde bei 37°C stehengelassen,
wonach die Umsetzung durch Zugabe von 100 µl 5 M Natronlauge
unterbrochen wurde. Nach Entfernung ungelösten Stärkepolymers
durch Filtration wurde die Extinktion des blaugefärbten Filtrats
bei 620 nm ermittelt, wodurch die freigesetzte Amylase gemessen
wird.
Die erhaltenen Extinktionswerte sind in nachfolgender Tabelle
I zusammengestellt.
Hieraus ergibt sich, daß die Antikörper im auf das 10⁵fache
verdünnten Serum des Patienten nachgeweisen werden konnten.
Die Blindversuche ergaben sehr niedrige Extinktionen. Entsprechende
Versuche, bei denen die reduktive Spaltung der
α-Amylase vom an den Röhrchenwänden adsorbierten Immunokomplex
ausgeschlossen wurde, ergaben eine Extinktion von
[A₆₂₀/h] 0,01.
Beispiel 1 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß die Enzymaktivität
mit Hilfe löslicher Stärke bestimmt wurde. Zusätzlich
wurde ein Paralleltest ausgeführt, ohne die reduktive Abspaltung
der α-Amylase.
In diesem Test wurde anstelle einer halben Tablette des zuvor
genannten Stärkeproduktes in jedes Röhrchen 1 ml Stärke (2%
in PBS) gegeben. Nach Inkubation während 60 Minuten bei 37°C
wurden 0,5 ml 3,5-Dinitrosalicylsäurelösung (hergestellt durch
Auflösen von 1 g 3,5-Dinitrosalicylsäure in 40 ml NaOH + 30 ml
H₂O und anschließende Zugabe von 30 g Kaliumnatriumtartrat
und Verdünnen der Lösung mit H₂O auf 100 ml) zugegeben. Die
Röhrchen wurden 5 Minuten in einem siedenden Wasserbad erwärmt,
und 5 ml von jedem Röhrchen wurden sodann in Röhrchen gebracht,
welche 5 ml destilliertes Wasser enthielten. Die Extinktion der
erhaltenen Lösungen wurde nach 10 Minuten bei einem g = 500 nm
bestimmt.
Die Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle II zusammengestellt.
(Die Extinctionswerte wurden hinsichtlich der Wirkung des Dithiothreits
korrigiert.)
8 mg Humanserumalbumin in 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom
pH-Wert 7,5 wurden mit 12 µl N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
(40 mMol in 99,5%igem Ethanol) vermischt. Nach
Umsetzung während 40 Minuten bei 23°C wurde das Reaktionsgemisch
an einer Säule mit den in Beispiel 1 (a) verwendeten Perlen
aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert; (das
verwendete Medium war der gleiche Phosphatpuffer, wie oben beschrieben).
Das eluierte Material, annähernd 2 ml,
enthielt das Albumin-2-Pyridyldisulfidderivat. Eine spektrophotometrische
Bestimmung der nach der Reduktion des Derivats
freigesetzten Menge an 2-Thiopyridon zeigte einen Substitutionsgrad
von 2,5 Mol Thiol/Mol Albumin.
20 mg α-Amylase wurden in 1,5 ml eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers
vom pH-Wert 7,5 gelöst. 150 µl N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat (40 mMol in 99,5%igem Ethanol) wurden
zugegeben, und man ließ die Reaktion 60 Minuten bei 23°C fortschreiten.
Überschüssiges Reagens und andere unerwünschte
Komponenten niedrigen Molekulargewichts wurden durch Gelfiltration
an den in Beispiel 1 (a) genannten Perlen aus mit Epichlorhydrin
vernetztem Dextran entfernt; (das verwendete Medium war der
gleiche Phosphatpuffer, wie oben verwendet).
Das gebildete α-Amylase-2-pyridyldisulfidderivat (20 mg in
etwa 2,5 ml) wurde sodann 20 Minuten mit 10 mg Dithiothreit
bei 23°C reduziert. Überschüssiges Dithiothreit wurde sodann
durch Gelfiltration an Perlen aus dem zuvor genannten Material
entfernt (das verwendete Medium war 0,3 M NaCl).
Die thiolierte α-Amylase (etwa 20 mg mit einem Gehalt von etwa
0,7 Mol SH/Mol Protein) in 3,5 ml einer 0,3 M NaCl-Lösung wurde
mit 5,6 mg Albumin-2-pyridyldisulfidderivat in 1,4 ml 0,1 M
Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 vermischt. Man ließ die
Umsetzung 18 Stunden bei 4°C fortschreiten. Das Reaktionsgemisch
wurde sodann an vernetztem Dextrangel getrennt; (das verwendete
Medium war 0,3 M NaCl-Lösung). Beim Analysieren der verschiedenen
Fraktionen wurde aktives α-Amylasematerial mit einem Molekulargewicht
gefunden, welches höher war als das von nativer α-Amylase.
Das ermittelte Molekulargewicht entsprach Oligomeren, welche
1 Albuminmolekül und 1 bis 2 α-Amylasemoleküle umfaßten.
Diejenigen Fraktionen, welche das Konjugat enthielten, wurden
vereint und in 0,3 M NaCl bei 4°C gelagert (annähernd 10 mg Protein/ml).
1 ml von 0,05 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7 mit einem
Gehalt an 100 µg Humanserumalbumin (im folgenden abgekürzt
als "HSA" bezeichnet) pro ml wurde in Teströhrchen aus Polystyrol
zum einmaligen Gebrauch eingefüllt. Die Röhrchen wurden
3 Stunden bei 37°C inkubiert. Sie wurden sodann 3× mit 2 ml
Puffer, der 0,05 M Natriumphosphat vom pH-Wert 7,4, 0,3% Dextran,
0,9% NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat
enthielt (im folgenden abgekürzt als "PDT-Puffer"
bezeichnet) gewaschen. Das Kaninchen-AntiHSA-Serum wurde mit
PDT-Puffer auf das 10- bis 10⁴fache verdünnt. Jeweils 0,5 ml
jeder Verdünnung wurden in ein, wie zuvor beschrieben, behandeltes
Röhrchen eingefüllt. Eine gleiche Anzahl von Blindversuchen
wurde mit 0,5 ml normalem Kaninchenserum (im folgenden abgekürzt
als "RNS" bezeichnet), das auf gleiche Weise verdünnt wurde,
durchgeführt. Man ließ die Röhrchen 3 Stunden bei 23°C stehen.
Sie wurden sodann 3× mit je 2 ml des PDT-Puffers gewaschen,
wonach 0,5 ml des HSA-α-Amylase-Konjugats aus Teil (a), oben,
zugegeben wurden. Die Röhrchen wurden sodann 16 Stunden bei
23°C inkubiert. Überschüssiges Konjugat wurde 3× mit 1 ml
PDT-Puffer abgewaschen. Sodann wurden zu den Röhrchen 0,5 ml
von 10 mMol Dithiothreit (DTT) in 0,05 M Natriumphosphatpuffer
vom pH-Wert 7 zugegeben. Nach 15 Minuten wurde die flüssige
Phase in den Röhrchen in Röhrchen gebracht, welche 0,5 ml
destilliertes Wasser mit einem Gehalt einer Vierteltablette der
Amylasesubstanz aus Beispiel 1 (b) enthielten. Diese Röhrchen wurden
2 Stunden bei 37°C nach dem Schütteln inkubiert, wonach ungelöstes Stärkesubstrat abzentrifugiert, und die Extinktion des
Überstandes bei 620 nm bestimmt wurde.
Die Ergebnisse zeigten, daß Kaninchen-AntiHSA-Antikörper mit
dem verwendeten Serum in einem auf das 10⁴fache verdünnten
Serum nachgewiesen werden konnten, während die Blindversuche
mit RNS A₆₂₀-Werte von 10% der in dem Probenserum gefundenen
Werte ergaben. Vergleichsversuche unter Weglassen des reduktiven
Abspaltens der α-Amylase von dem an den Röhrchenwänden adsorbierten
Immunokomplex ergaben eine Extinktion A₆₂₀ von
0,02.
1 g Bromhydroxypropyldextran wurde in 12,5 ml destilliertem
Wasser gelöst, wonach 3,8 g Na₂S₂O₃ × 7 H₂O zugegeben wurden.
Man ließ die Reaktion 3 Stunden bei 100°C fortschreiten. Das
Gemisch wurde sodann gegen Wasser (2 × 2 l 24 Stunden lang
und 1 × 10 l 6 Stunden lang) dialysiert.
Der Inhalt des Dialysebeutels wurde gefriergetrocknet; er wird
im folgenden als "Buntesalz-Dextran" bezeichnet. Eine Analyse
zeigte, daß das Dextranderivat 2,1 mMol S pro g trockenes
Derivat enthielt. 1 g des Buntsalz-Dextrans wurde in 10 ml
eines Puffers aus 50% Ethanol und 50% 0,1 N Natriumphosphatlösung
vom pH-Wert 8,3 gelöst. Es wurden 0,7 g 2,2′-Dipyridyldisulfid
zugegeben, und das Gemisch wurde auf 60°C erwärmt und
auf dieser Temperatur 24 Stunden gehalten. Das Reaktionsgemisch
wurde sodann gegen 50% Ethanol, 3 × 3 l (jede Dialyse während
6 Stunden), und gegen destilliertes Wasser, 3 × 3 l (jede Dialyse
während 2 Stunden), dialysiert.
Es wurden 2,6 mg Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper (hergestellt
aus Schafserum durch Fällung mit Na₂SO₄) in 1 ml eines 0,1 M
Natriumphosphatpuffers vom pH-Wert 7,5 gelöst. Sodann wurden
120 µl Natriumsuccinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
(1,6 mMol in 99,5%igem Ethanol) zugegeben, und nach dem
Schütteln ließ man die Umsetzung 30 Minuten bei 23°C fortschreiten. Das Reaktionsgemisch wurde sodann an Perlen aus
mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran [vgl. Beispiel 1 (a)]
gelfiltriert; (das verwendete Medium war 0,1 M Natriumacetatpuffer
vom pH-Wert 5,0). Das eluierte Material (2,5 ml),
d. h. das 2-Pyridyldisulfid-Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper-Derivat,
wurde mit 64 µl 50 millimolarem Dithiothreit reduziert.
Nach 15 Minuten bei 23°C wurde überschüssiges Dithiothreit
durch Gelfiltration an Perlen aus dem zuvorgenannten
Dextranmaterial gelfiltriert; (das verwendete Medium war
0,3 M NaCl). Hierbei wurde ein Eluatvolumen
von 3,5 ml erhalten. 2,4 mg der thiolierten α-Amylase (hergestellt
wie in Beispiel 1) in einem Volumen von 1,5 ml und
2,6 mg thiolierte Schaf-Antikaninchen-IgG-Antikörper (siehe
oben) in 3,5 ml wurden mit 1,6 mg 2-Pyridyldisulfid-dextran
in 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 vermischt.
Nach dem Schütteln ließ man das Gemisch 10 Minuten stehen,
wonach an Perlen aus Agarose mit 0,3 M NaCl als Medium
gelfiltriert wurde. Die Fraktionen, welche Konjugate
enthielten, wurden vereint.
50 Scheiben aus Nylonnetz (Durchmesser: 8 mm, Gewicht: 1,5 mg jeweils)
wurden in 50 ml 3 M Salzsäure 30 Minuten bei 23°C partiell
hydrolysiert und sodann mit 0,1% Glutardialdehyd gemäß J.
Immunol., Bd. 113, S. 517 (1974) aktiviert. Die aktivierten
Nylonnetze wurden sodann mit 0,05 molarem Natriumphosphatpuffer
vom pH-Wert 7 gewaschen und sodann in 20 ml einer 0,9%igen
Natriumchloridlösung gebracht, welche 0,5 mg pro ml Humanserumalbumin
(HSA) enthielt. Nach 60 Minuten bei 23°C wurde das
nicht-immobilisierte HSA mit 0,9%iger NaCl-Lösung abgewaschen,
und die Nylonnetze mit gebundenem HSA wurden mit 50 ml
NaBH₄ (0,4 mg/ml) bei 23°C 30 Minuten behandelt, wobei stabile
kovalente Bindungen zwischen HSA und der Nylonmatrix gebildet
wurden. Die Nylonscheiben wurden schließlich mit PDT-Puffer
gewaschen. Kaninchen-AntiHSA-Serum wurde in dem PDT-Puffer
auf das 10- bis 10⁴fache verdünnt. 200 µl jeder Verdünnung
wurden mit einer Nylonscheibe in einem Testrohr bei 23°C
3 Stunden inkubiert. Eine gleiche Anzahl von Blindversuchen
wurden mit 200 µl normalem Kaninchenserum (RNS), verdünnt auf
gleiche Weise, vorbereitet. Die Nylonscheiben wurden sodann
3× mit 2 ml PDT-Puffer gewaschen.
Das Antikörper-Dextran-α-Amylase-Konjugat aus Teil (a), oben,
wurde auf das 10fache verdünnt, wonach 20 µl der so erhaltenen
Lösung mit Nylonscheiben, welche gemäß den obigen Ausführungen
präpariert worden waren, 16 Stunden bei 23°C inkubiert wurden.
Überschüssiges Konjugat wurde durch Dekantieren entfernt, und
die Nylonnetze wurden 3× mit 2 ml PDT-Puffer gewaschen.
Die α-Amylaseaktivität (mit und ohne Abspalten der α-Amylase)
wurde auf eine Weise ermittelt, welche zu der in Beispiel
1 beschriebenen analog war.
Mit dem verwendeten Serum war es möglich, Kaninchen-Antihumanserumalbumin-Antikörper in 10- bis 10⁴fachem Verdünnungsbereich
nachzuweisen. Die Blindversuche mit RNS führten zu a-Amylaseaktivitäten
von 10% der Meßwerte, welche mit den entsprechenden,
innerhalb des vorgenannten Bereiches liegenden Verdünnungen
erhalten wurden.
100 mg Fluorescein-isothiocyanat wurden mit 35 mg oxidiertem
Glutathion in 4 ml destilliertem Wasser umgesetzt. Man ließ die
Reaktion bei konstantem pH-Wert von 9 90 Minuten fortschreiten.
Das Reaktionsgemisch wurde an einer 100 ml-Kolonne, welche mit
Perlen aus dem in Beispiel 1 (a) benutzten, mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran beschickt war, gelfiltriert; das benutzte Medium war eine 0,3 M Natriumchloridlösung. Die dem
Gesamtvolumen entsprechenden Fraktionen wurden aufgeschlämmt
(10,3 ml mit einem Wert A₄₉₃ von 41,2). Der pH-Wert wurde mit
Natriumboratpuffer auf 9 eingestellt. Die Lösung wurde sodann
durch eine Kolonne gepumpt, welche 2,2 ml Mercaptohydroxypropylagarose
enthielt [hergestellt aus den in Beispiel 4 (a) benutzten
Agaroseperlen gemäß Acta Chem. Scand. B. 29, S. 471-474
(1975); es wurde ein Gel mit einem Gehalt von 660 µMol SH/g
getrocknetes Gel verwendet] und mit 0,1 M Natriumboratpuffer
vom pH-Wert 9 ins Gleichgewicht gebracht war.
Die Strömungsgeschwindigkeit betrug 10 ml/Std. Das Eluat wurde
in 1 M Natriumacetat vom pH-Wert 4 aufgeschlämmt, und sein
Fluorescein- und Thiolgehalt wurde ermittelt. Im nachfolgenden
Test wurde eine Fraktion von 3 ml verwendet, welche eine Thiolkonzentration
von 1,19 mMol und eine Fluorescein-Konzentration
von 0,60 mMol aufwies.
Es wurden 20 mg Humanserumalbumin, gelöst in 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer
vom pH-Wert 7,5, mit 150 µl von 40 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
in 99,5%igem Ethanol
versetzt. Nach dem Schütteln ließ man das Gemisch 40 Minuten
bei 23°C stehen. Überschüssiges Reagens wurde sodann durch
Gelfiltration an Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran
[vgl. Beispiel 1 (a)] entfernt; das verwendete Medium war
0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5. 3 ml des eluierten
Materials (19 mg 2-Pyridyldisulfidalbumin) wurden mit 3 ml
Glutathion-Fluorescein vermischt. Man ließ das Gemisch 30 Minuten
bei Raumtemperatur stehen. Sodann wurde es an Perlen aus dem
zuvor genannten, mit Epichlorhydrin vernetzten Dextran gelfiltriert,
wobei 0,9%ige Natriumchloridlösung als Medium verwendet
wurde. Die Analyse ergab, daß das Eluat (9 ml) 17,1 mg
Albumin mit annähernd 3,5 mMol Fluorescein pro Mol Albumin
enthielt.
Das Beschichten der Röhrcheninnenwände mit HSA und die Inkubation
mit Kaninchen-AntiHSA-Serum wurde auf eine zu Beispiel 3 analoge
Weise durchgeführt.
In die so erhaltenen Röhrchen wurden 0,5 ml eines gemäß Teil (a)
hergestellten Konjugats eingebracht (1,9 ml Konjugat/ml).
Die Röhrchen wurden sodann 16 Stunden bei 23°C inkubiert,
wonach überschüssiges Konjugat abdekantiert und 3× mit 2 ml
PDT-Puffer gewaschen wurde.
1 ml Dithiothreit (25 mMol in destilliertem Wasser, ph-Wert 7)
wurde zu den Röhrchen gegeben. Nach 15 Minuten wurde die
flüssige Phase in Küvetten für fluorimetrische Messungen gebracht,
und die Fluoreszensintensität wurde bei einer Erregungswellenlänge
von 473 nm und einer Emissionswellenlänge von
530 nm bestimmt.
Mit dem verwendeten Serum war es möglich, Fluoreszens in dem
Serumsverdünnungsbereich des 1- bis 50fachen nachzuweisen. Beim RNS
waren die erhaltenen Fluoreszensintensitäten
10% der jeweils entsprechenden Testwerte. Aufgrund der Art
und Weise, nach der der Test durchgeführt wurde (d. h. unter
Binden an die Röhrchenwände) war es selbstverständlich nicht
möglich, die Messung ohne Abspalten der fluoreszierenden Markierungen
durchzuführen. Die Fluoreszensmessungen, welche allein
mit dem Konjugat durchgeführt wurden, zeigten jedoch, daß
nach Spalten des Konjugats eine beträchtlich höhere Fluoreszensintensität
erhalten wurde.
36 g Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran
wurden in 200 ml 0,5 M Natronlauge suspendiert. 17 ml
1-Chlor-2,3-epoxypropan wurden innerhalb von 5 Minuten bei
23°C tropfenweise zugegeben. Die Temperatur wurde auf 60°C
erhöht, und die Umsetzung wurde 2 Stunden fortgesetzt.
Das Produkt wurde sodann mit Wasser und 0,5 M Natriumphosphatpuffer
vom pH-Wert 6,5 gewaschen und in 200 ml dieses Puffers
suspendiert. 100 g Na₂S₂SO₃ × 7 H₂O wurden zugegeben, und die
Reaktion wurde 2 Stunden fortgesetzt, wonach das
Produkt auf einem Büchner-Trichter gewaschen wurde. Danach wurde
es mit 2,8 g Dithiothreit (DTT) in 0,1 M NaHCO₃-Lösung vom pH-Wert
8,3 behandelt; das Gesamtvolumen betrug 200 ml. Nach Umsetzung
während 60 Minuten wurde das Produkt mit 1 mM Essigsäure und
danach mit einem 50% Aceton enthaltenden Gemisch von 0,05 Mol NaHCO₃
und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) gewaschen. Das Produkt wurde in
40 ml der zuletzt genannten Lösung suspendiert, in der 2,2′-Dipyridyldisulfid
in einer Konzentration von 0,15 Mol gelöst war.
Die Umsetzung wurde 60 Minuten bei 23°C fortgesetzt.
600 ml Wasser wurden dann zugegeben, und die Umsetzung wurde
weitere 60 Minuten fortgesetzt, wonach das Produkt mit
Wasser gewaschen, mit Aceton geschrumpft und sodann
über Blaugel getrocknet wurde. Es wurde nachgewiesen, daß das
so erhaltene Produkt annähernd 40 µMol 2-Pyridylsulfidstrukturen
pro g trockenes Derivat enthielt.
20 mg Hundeserumalbumin wurden in 2 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer
vom pH-Wert 7,5 gelöst, was hinsichtlich Mercaptoethanol
25 mMol waren. Nach 60 Minuten wurde überschüssiges Mercaptoethanol
durch Gelfiltration an den in Beispiel 1 (a) benutzten
Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert;
das verwendete Medium war 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert
7,5.
1 g des weiter oben hergestellten Dextran-Derivates wurde
in 0,1 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gequollen und
gewaschen und sodann in 2 ml dieses Puffers suspendiert. 3,5 ml
Albumin, das wie oben beschrieben behandelt worden war, wurden
zur Suspension zugegeben. Die Umsetzung wurde unter Rühren
durchgeführt, indem man die Suspension in einem geschlossenen
Gefäß 36 Stunden bei 23°C rotieren ließ. Das so erhaltene
Dextran-Albumin-Konjugat wurde sodann auf einem Glasfiltertrichter
mit 0,1 M Natriumacetat-0,3 M Natriumchloridlösung vom
pH-Wert 5,0 gewaschen und sodann in 10 ml dieser Lösung suspendiert,
wonach 40 mg Glutathion zur Entfernung nicht umgesetzter
Pyridyldisulfidstrukturen zugegeben wurden. Nach 3stündiger
Umsetzung bei 23°C wurde das Produkt mit 0,9%iger Natriumchloridlösung
gewaschen und in Form einer Suspension in 0,9%iger
Natriumchloridlösung gelagert.
Die Suspension aus Teil (a) wurde zentrifugiert, und der Überstand
durch Absaugen entfernt. Dextran-Albumin-Konjugat wurde mit
10 ml PDT-Puffer gewaschen und wieder in 10 ml PDT-Puffer suspendiert.
200 µl der Suspension wurden in Ellerman-Röhrchen
gefüllt. Das Volumen wurde mit PDT-Puffer auf 400 µl eingestellt,
wonach 100 µl Humanserum, welches gegen Hundeserumalbumin
spezifisches IgE enthielt, zugegeben wurden. Die so erhaltene
Suspension wurde unter Rotieren 3 Stunden bei 23°C inkubiert.
Nach 3maligem Waschen mit Zentrifugieren, Entfernung durch Absaugen
und Zugabe von PDT wurden 15 mg ¹²⁵I-Anti-IgE mit
94 200 cpm zugegeben.
Die Röhrchen wurden über Nacht bei 23°C inkubiert. Nach dreimaligem
Waschen auf die zuvor beschriebene Weise wurde die
an das Dextran-Konjugat gebundene Radioaktivität auf herkömmliche
Weise mit einem γ-Zähler bestimmt. Der ¹²⁵I-haltige
Immunkomplex wurde sodann vom Träger abgespalten, indem man
0,5 ml einer Lösung von 20 mMol DTT in 0,1 M Natriumphosphatpuffer
vom pH-Wert 7,5 und 0,3 M Natriumchloridlösung zugab
(Umsetzung während 3 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren).
Nach Abzentrifugieren des Produktes wurden 200 µl des Überstandes
entnommen, und die freigesetzte Radioaktivität wurde gemessen.
Es wurde ein Meßergebnis von 28 149 cpm beim Messen des
Dextran-Konjugats vor dem Abspalten des ¹²⁵I-haltigen Immunkomplexes
und von 6248 cpm (in 200 µl Überstand) nach dem Abspalten
des Immunkomplexes erhalten, was zeigt, daß 78% der Aktivität
durch Spalten in die flüssige Phase übergeführt worden waren.
30 mg α-Amylase (von der gleichen Art und Vorbehandlung wie
in Beispiel 1) wurden in 4,5 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat
und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 aufgelöst. In Abständen
von 5 Minuten wurden in Portionen zu 25 µl 100 µl einer Lösung
von 50 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in
absolutem Ethanol zugegeben. Nach 40 Minuten bei 25°C wurde
das Reaktionsgemisch an den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen
aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert (das
verwendete Medium war ein Puffer aus 0,1 Mol Natriumphosphat
und 0,3 Mol NaCl vom pH-Wert 7,5), wobei überschüssiges Reaktionsmittel
und niedermolekulare Reaktionsprodukte entfernt wurden.
Das eluierte Material mit einem Gehalt an modifizierter α-Amylase
[d. h. 2-Pyridyldisulfid-α-Amylase] wies nach der Vereinigung
ein Volumen von 8 ml auf. Es wurde gefunden, daß der Substitutionsgrad
bezüglich des Gehalts an 2-Pyridylsulfidgruppen
3,7 µMol dieser Gruppen pro 50 mg α-Amylase betrug.
Nach dem zuvor beschriebenen Verfahren wurde ein anderes
2-Pyridyldisulfid-α-amylase-Derivat hergestellt, jedoch mit
dem Unterschied, daß 400 µl einer 50 millimolaren Lösung von
N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in absolutem
Ethanol in Abständen von 5 Minuten in Portionen von 100 µl
zugegeben wurden. Es wurde ermittelt, daß der Substitutionsgrad
dieses Derivates 7,5 µMol 2-Pyridyldisulfidgruppen pro
50 mg α-Amylase betrug.
2,5 mg 2-Pyridyldisulfid-a-amylase mit einem Gehalt von 3,7 µMol
2-Pyridyldisulfidgruppen pro 50 mg α-Amylase in 0,75 ml
eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert
7,5 wurden mit 50 µl 50 mMol Dithiothreit vermischt und
10 Minuten bei 25°C reduziert. Überschüssiges Dithiothreit
und niedermolekularere Reaktionsprodukte wurden durch Gelfiltration
an den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit
Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert; das verwendete
Medium war 0,3 M NaCl.
Das Eluat, 2,5 ml mit einem Gehalt an 2,3 mg Thiol-α-Amylase,
wurde mit 1,5 mg 2-Pyridyldisulfid-α-amylase mit einem Gehalt
von 7,5 µMol 2-Pyridyldisulfidgruppen pro 50 mg in 0,75 ml
0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vermischt. Nach 60minütiger
Umsetzung bei 25°C wurde die Umsetzung durch Zugabe von 50 µl
einer Lösung von 20 mMol 2,2′-Dipyridyldisulfid in absolutem
Ethanol abgebrochen. Es wurde 1 Tropfen Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat
zugegeben, und das Gemisch
wurde an einer Säule chromatographiert (80 ml Gesamtvolumen),
welche mit den in Beispiel 4 (a) benutzten Perlen aus Agarose
gefüllt war. Das verwendete Medium war ein Gemisch aus 0,3 M
NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat.
Das eluierte Material (etwa 15 ml) mit einem Gehalt
an etwa 0,19 mg α-Amylase-Aggregat pro ml, das 2,4 µMol 2-Pyridyldisulfidgruppen
enthielt, wurde vereint und bei 4°C
gelagert.
6 mg Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper [durch Immunsorption gereinigt mit Gammaglobulin-Agarose
sorbens,
hergestellt durch
Kupplung von elektrophoretisch gereinigtem Humangammaglobulin
an mit CNBr-aktivierte Agarose] in 2,4 ml
eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom
pH-Wert 6,0 wurden mit 20 µl einer Lösung von 50 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in absolutem Ethanol
vermischt. Nach 20 Minuten bei 25°C wurde das überschüssige
Reaktionsmittel durch Gelfiltration des Reaktionsgemisches an
den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin
vernetztem Dextran gelfiltriert; das verwendete Medium war
ein Puffer aus 0,1 M Natriumacetat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 5,0.
Das Eluat, etwa 3,0 ml, mit einem Gehalt an etwa 5,5 mg 2-Pyridyldisulfid-Antikörpern
wurde vereint und mit 0,2 ml einer Lösung
von 50 mMol Dithiothreit in destilliertem Wasser umgesetzt.
Nach 25minütiger Umsetzung wurde überschüssiges Dithiothreit
durch Gelfiltration des Reaktionsgemisches an den in Beispiel
1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran
entfernt; das verwendete Medium war eine 0,3 M Natriumchloridlösung.
Das Eluat, 5,0 ml mit einem Gehalt an etwa 5 mg modifizierten
Antikörpern mit einem Substitutionsgrad von etwa
2 µMol SH-Gruppen pro 160 mg Protein wurde vereint.
Etwa 0,2 mg der auf diese Weise thiolierten Antikörper in 0,2
ml einer 0,3 M Natriumchloridlösung wurden mit 0,4 mg des
α-Amylase-Aggregats (siehe oben) in 2,0 ml eines Gemisches aus
0,1 M Natriumphosphat, 0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat
vermischt. Das Reaktionsgemisch,
welches Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-α-Amylase-Multikomplex-Konjugat
enthielt, wurde bei 4°C gelagert.
Etwa 50 µg (getrocknetes Drivat) Agarose-Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Derivat
(hergestellt durch Kuppeln von durch Immunosorption
gereinigten Schaf-Antihuman-IgG-Antikörpern an
CNBr-aktivierte Agarose) mit einem Gehalt von etwa 400 ng
Antikörpern, suspendiert in 300 µl eines Gemischs aus 0,3 M
NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat
wurde in jedes einer Reihe von Polystyrolröhrchen
(3 ml) gegeben, die verschiedene Mengen (1 bis 500 ng) Human-γ-globulin enthielten, welches in 100 µl eines Gemisches von
0,1 M Natriumphosphat, 0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat
vom pH-Wert 7,4 gelöst war.
Eine Anzahl von Röhrchen, die lediglich Puffer enthielten, und
eine Anzahl von Röhrchen, die Aminoethyl-agarose (hergestellt
durch Kuppeln von Ethanolamin an CNBr-aktivierte Agarose
enthielten, wurden als Blindproben benutzt.
Die Röhrchen wurden etwa 18 Stunden bei 25°C unter sorgfältigem
Schütteln inkubiert. Das Agarosegel jedes Röhrchens wurde sodann
durch ein wiederholtes Zentrifugations-Dekantierungsverfahren
mit 6 × 2 ml 0,3 M NaCl - 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat
gewaschen.
Nach dem letzten Waschen wurde der Überstand bis auf 0,3 ml
abgesaugt, und 100 µl des Reakationsgemisches aus Beispiel 7 (a),
oben, mit einem Gehalt an Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-α-Amylase-Multikomplex-Konjugat (etwa 400 ng bezüg
lich der Antikörper)
wurden in jedes Röhrchen gegeben, welche sodann während 4 Stunden
unter sorfältigem Schütteln bei 25°C inkubiert wurden. Das
Feststoffmaterial eines jeden Röhrchens wurde abermals, wie
zuvor beschrieben, mit 6 × 2 ml eines Gemischs aus 0,3 M NaCl
und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat gewaschen.
1,0 ml einer Lösung von 10 mMol Dithiothreit in 0,1 M Natriumphosphat
und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 8 wurde in die Röhrchen gegeben
(0,3 ml Suspension). Nach Reduktion während 60 Minuten (während
denen der α-Amylase-Multikomplex aus dem immobilisierten Immunokomplex
freigesetzt und in kleinere Einheiten gespalten wurde)
wurde 1,0 ml einer Suspension der Amylasetestsubstanz
aus Beispiel 1 (1 Tablette/4 ml)
zugegeben, und die Röhrchen wurden abermals
60 Minuten bei 25°C inkubiert, wonach die Umsetzung durch Zugabe
von 0,5 ml einer 0,5 M Natronlauge abgebrochen wurde. Nach
Abfiltrieren ungelösten Stärkepolymers wurde die Extinktion des
blau gefärbten Filtrats bei 620 nm ermittelt. Die Extinktionswerte
sind auf die freigesetzte a-Amylaseaktivität bezogen,
welche sich auf die Menge an gebundenem Konjugat bezieht, die
ihrerseits auf die Menge an gebundenem γ-Globulin bezogen ist,
und somit ein Maß für die γ-Globulinkonzentration der Testlösungen
darstellen. Human-γ-globulin konnte bis auf eine
Konzentration herab zu weniger als 1 ng/ml auf diesem Weg
nachgewiesen werden.
20 µl einer Lösung von 8 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
in 99,5%igem Ethanol wurde langsam zu 2 mg Schaf-Antihuman-IgG-Antikörpern
(durch Immunsorption gereinigt mit
Agarose-Humangammaglobulin als Sorbens, hergestellt durch Kupplung
von elektrophoretisch gereinigtem Humangammaglobulin an CNBr-aktivierte
Agarose)
in 0,6 ml eines Puffers aus
0,1 M Natriumphosphat und 0,1 mMol MgCl₂ vom pH-Wert 7,0 zugegeben
während 60 Minuten bei 25°C gerührt wurde. Das Reaktionsgemisch
wurde sodann an einer Säule gelfiltriert, welche mit den in
Beispiel 1 (a) benutzten Perlen von mit Epichlorhydrin vernetztem
Dextran gefüllt war; das verwendete Medium war der gleiche
Phosphatpuffer wie der zuvor beschriebene. Das eluierte Material
mit einem Gehalt an etwa 1,8 mg 2-pyridyldisulfid-substituierten
Antikörpern wurde vereint (1,5 ml).
1,3 mg β-Galactosidase
in 0,5 ml eines Gemischs von 0,1 M Natriumphosphat
und 1 mMol MgCl₂ vom pH-Wert 7,0 wurde an einer Kolonne mit
den zuvor genannten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem
Dextran gelfiltriert. Das eluierte Material, etwa 1,2 mg in
1,5 ml, wurde mit 1,8 mg 2-pyridyldisulfid-enthaltenden Antikörpern
(siehe oben) in 1,5 ml eines Gemisches aus 0,1 M Natriumphosphat
und 1 mMol MgCl₂ vermischt. Die Umsetzung wurde sodann
etwa 48 Stunden fortgesetzt, wonach das Reaktionsgemisch
an einer Kolonne gelfiltriert wurde, welche mit den in
Beispiel 4 (a) benutzen Perlen aus Agarose gefüllt
war; das benutzte Medium war eine 0,3 M Natriumchloridlösung.
Die Fraktionen mit einem Gehalt an β-Galactosidase-Antikörper-Oligomeren
mit einem Molekulargewicht von 650 000 bis 800 000
wurden vereint. Das vereinte Material wurde bei 4°C gelagert.
Die Bestimmung wurde unter Anwendung der Schicht-Technik
durchgeführt. 50 µl einer Suspension eines Agarose-Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Derivats (hergestellt durch
Kupplung von Schaf-Antihuman-IgG-Antikörpern, welche durch
Immunsorption gereinigt worden waren, an CNBr-aktivierte
Agarose) mit einem Gehalt von etwa 0,45 mg Antikörpern/ml
Suspension wurden in jedes einer Reihe von Teströhrchen mit
verschiedenen Mengen an Humangammaglobulin (0,1 bis 250 ng),
gelöst in 100 µl eines Gemisches aus 0,1 M Natriumphosphat,
0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat
vom pH-Wert 7,5 gebracht. Als Blindproben
wurde eine Anzahl von Röhrchen verwendet, welche lediglich
Puffer, und eine Anzahl von Röhrchen, welche Aminoethylagarose
enthielten (hergestellt durch Kupplung von Ethanolamin an
CNBr-aktivierte Agarose). Die Röhrchen wurden sodann
18 Stunden bei 25°C unter sorgfältigem Schütteln inkubiert.
Das Agarosegel eines jeden Röhrchens wurde sodann, wie in
Beispiel 7 beschrieben, gewaschen.
In jedes Röhrchen, welches die gewaschenen Agarosesuspensionen
enthielt (etwa 0,3 ml/Röhrchen) wurden sodann 20 µl einer 0,3 M
Natriumchloridlösung gebracht, welche Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-β-Galactosidase-Konjugat
-(das zuvor hergestellte
oligomere Konjugat) enthielt. Unter sorgfältigem Schütteln wurden
die Röhrchen sodann 4 Stunden bei 25°C inkubiert. Das Agarosegel
eines jeden Röhrchens wurde sodann, wie in Beispiel 7 beschrieben,
gewaschen. Zu jeder Agarosesuspension wurden sodann
0,1 ml 1 M β-Mercaptoethanol zugegeben. Die Reduktion wurde
30 Minuten bei 25°C fortgesetzt. Diese Reduktion
führte zur Freisetzung der β-Galactosidase in nativer Form
aus dem an dem Agarosederivat immobilisierten Immunkomplex.
Es wurden sodann 0,2 ml o-Nitrophenyl-β-D-galactosid (10,5 mg/ml)
in einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und 1 mMol MgCl₂ vom
pH-Wert 7,0 zugegeben, und die freigesetzte β-Galactosidaseaktivität
wurde durch spektrophotometrische Messung (bei
420 nm) der pro Zeiteinheit gebildeten Menge an o-Nitrophenolat
bestimmt. Die freigesetzte β-Galactosidaseaktivität ist proportional
zur Menge an gebundenem Konjugat, welche ihrerseits
proportional zur Menge an gebundenem Gammaglobulin ist; infolgedessen
stellt sie ein Maß für die Gammaglobulinkonzentrationen
der Testlösungen dar. Auf diesem Weg konnte Humangammaglobulin
bis herab zu einer Konzentration von weniger als 1 ng/ml
bestimmt werden.
100 µl von abgesetztem Agarose-Concanavalin
und 200 µl eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M
NaCl vom pH-Wert 7,5 wurden jeweils in 8 Ellerman-Röhrchen gegeben.
Jedem Röhrchen wurden sodann 0,2 mg 2-Pyridyldisulfid-Dextran
(hergestellt gemäß Beispiel 4) in 50 µl destilliertem
Wasser zugegeben. Die Röhrchen wurden sodann unter sorgfältigem
Schütteln 20 Minuten bei 25°C inkubiert, wonach 100 µl eines
Puffers aus 0,3 M NaCl und 0,1 M Natriumphosphat vom pH-Wert 7,5
mit einem Gehalt an verschiedenen Dextranmengen zu 6 der Röhrchen
zugegeben wurden. Den restlichen beiden Röhrchen wurden lediglich
100 µl des vorgenannten Puffers zugegeben. Die Röhrchen wurden
sodann unter sorgfältigem Schütteln 60 Minuten bei 25°C inkubiert
und sodann durch wiederholtes Zentrifugieren und Dekantieren
mit 3 × 2 ml dieses Puffers gewaschen.
Die Suspensionen aller Röhrchen wurden sodann mit diesem Puffer
auf ein Volumen von 2 ml verdünnt. Es wurden 0,1 ml 50 mM
Dithiothreit zugegeben, und die Röhrchen wurden 10 Minuten
bei 25°C geschüttelt. Das Agarosegel eines jeden Röhrchens
wurde sodann durch Zentrifugieren abgetrennt, und die Konzentrationen
an 2-Thiopyridon der Überstände wurden spektrophotometrisch
bei 343 nm gemessen. Die Menge an freigesetztem 2-Thiopyridon
ist proportional zur Menge an 2-Pyridyldisulfid-Dextran,
das an das Agarose-Concanavalin gebunden ist, und
infolgedessen umgekehrt proportional zur Konzentration des
Dextrans der Testlösung. Die Dextrankonzentration konnte auf
diesem Werge bis zu einem Konzentrationsbereich von 0,03 bis
100 mg/ml bestimmt werden.
50 mg Thiolglas wurden in 5 ml eines Puffers aus
0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 mit einem
Gehalt an 30 mM Dithiothreit reduziert. Das reduzierte Glas
wurde sorgfältig mit einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und
0,3 M NaCl gewaschen und in 1 ml dieses Puffers suspendiert,
wonach 20 µl 1,2-3,4-Diepoxybutan zugegeben wurden. Nach
60minütiger Umsetzung wurden die Glasperlen mit einem Puffer
aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 gewaschen.
Das so erhaltene Glasderivat wurde sodann in 0,5 ml eines
0,2 M Natriumcarbonatpuffers vom pH-Wert 9,5 und in 0,5 mg
elektrophoretisch gereinigtem Human-IgG suspendiert, welch letzteres
in 0,5 ml eines 0,2 M Natriumcarbonatpuffers vom
pH-Wert 9,5 gelöst war. Das Reaktionsgemisch wurde sorgfältig
18 Stunden bei 25°C gerührt, wonach 50 µl einer 10%igen
Ethanolaminlösung (der pH-Wert wurde mit Salzsäure auf 9,5
eingestellt) zur Entfernung nicht-umgesetzter Epoxygruppen
zugegeben wurden. Nach 120 Minuten bei 25°C wurde das Glasderivat
mit einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M
NaCl vom pH-Wert 7,5 gewaschen. Die Glasperlen wurden sodann
in 20 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M
NaCl vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,5% Polyoxyethylensorbitanmonooleat
suspendiert.
Die Analyse zeigte, daß die Antikörperkonzentration etwa 16 µg/ml
Suspension betrug.
Ein Teströhrchen aus Glas wurde in ein Eisbad gebracht. In das
Röhrchen wurden 45 µg Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper [durch
Immunosorption gereinigt mit Agarose-Human-IgG-Derivat, hergestellt
durch Kuppeln von elektrophoretisch gereinigtem
Human-IgG an BrCN-aktivierte Agarose],
gelöst in 10 µl einer 0,3 M
Natriumchloridlösung, eingebracht. Sodann wurden 40 µl 0,2 M
Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 (0,02% NaN₃), 100 µl
Chloramin-T (1,5 mMol) und 0,7 µl Na¹²⁵I (0,36 mCi) zugegeben.
Nach 2 Minuten wurde durch Zugabe von 20 µl 0,1 M Na₂S₂O₃ und
50 µl 0,1 M KI die Umsetzung abgebrochen. Das Reaktionsgemisch wurde an
einer Säule chromatographiert, welche mit Perlen aus dem in Beispiel 1
(a) benutzten, mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gefüllt war,
welche zuvor mit 1 ml 1%igem Rinderserumalbumin präpariert und
mit 0,05 M Natriumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 ins Gleichgewicht
gebracht worden war, welcher 0,05% Polyoxyethylensorbitanmonooleat,
0,02% NaN₃, und 0,05 M
Na₂S₂O₃ enthielt. Die eluierten Fraktionen wurden vereint und fünffach
mit 0,05 M Natriumphosphat vom pH-Wert 7,0 verdünnt.
Die Analyse zeigte, daß die vereinten Fraktionen (10 ml)
etwa 4 µg markierte Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper pro ml
enthielten.
Eine Reihe von Ellerman-Röhrchen, die Glas-Human-IgG (100 µl
Suspension gemäß der obigen Beschreibung) bzw. ¹²⁵I-substituierte
Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper (100 µl einer Lösung, erhalten
durch Verdünnen der zuvor genannten Lösung auf das 10fache
in einem Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat, 0,3 M NaCl und
0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat
vom pH-Wert 7,5) enthielten, wurden vorbereitet. Sodann wurden
zu den Röhrchen wechselnde Mengen von Humangammaglobulin, gelöst
in 100 µl des zuvor genannten Puffers, zugegeben. Die Röhrchen
wurden 4 Stunden bei 25°C auf einem Schütteltisch geschüttelt,
wonach die Glasperlen 4 × mit 2 ml des zuvor genannten Puffers
gewaschen wurden. Sie wurden sodann in 0,5 ml dieses Phosphatpuffers,
welcher 20 mMol Natriumphosphat enthielt, suspendiert.
Hierbei wird die vicinale Diolstruktur, welche das Human-IgG
an das Glas bindet, gespalten, und der Immunkomplex [Human-IgG-(¹²⁵I-Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper)-Komplex]
-geht in die
Lösung. Man ließ die Umsetzung auf einem Schütteltisch 60 Minuten
bei 25°C fortschreiten, wonach die in dem Überstand freigesetzte
Radioaktivität mit einem Gammazähler gemessen wurde.
Die Menge an freigesetzter Radioaktivität ist proportional zur
Menge der ¹²⁵I-markierten Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper, die
an das Glasderivat gebunden sind, und somit umgekehrt proportional
zur Konzentration von Gammaglobulin in den Testlösungen.
Durch dieses Verfahren konnte der Nebeneffekt aufgrund unspezifischer
Aufnahme von ¹²⁵I-markierten Antikörpern an den
Glasperlen herabgesetzt werden.
20 mg gefriergetrocknetes Trypsin wurden mit einer Suspension
von 2 g (trocken gesaugter) CNBr-aktivierter Agarose
in 2 ml einer 0,1 M NaHCO₃-Lösung vermischt. Das Reaktionsgemisch
wurde 24 Stunden bei 4°C gerührt. Das gebildete Gelderivat
wurde sodann mit 200 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat
und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5; 200 ml eines Puffers aus 0,1 M
Natriumacetat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 4,0; 200 ml eines
Puffers aus 0,1 M NaHCO₃ und 10 mM Ethanolamin und schließlich
mit 200 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M
NaCl vom pH-Wert 7,5 gewaschen. Das Gel wurde als Suspension
in der zuletzt genannten Lösung bei 4°C aufbewahrt.
18 mg gefriergetrockneter Sojabohnentrypsininhibitor
wurden in 0,1 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat und
0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 gelöst. Die Lösung wurde an einer
Kolonne mit den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran gelfiltriert (das verwen
dete
Medium war der obige Puffer). Das eluierte Material (2,0 ml mit
einem Gehalt an etwa 16 mg Protein) wurde mit 150 µl 50 mM
N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat in Portionen von
50 µl alle 5 Minuten versetzt. Nach Umsetzung während 30 Minuten
bei 25°C wurde das Reaktionsgemisch an einer mit vorgenannten
Perlen gefüllten Säule gelfiltriert (das verwendete Medium war
ein Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert
7,5). Das eluierte Material, 3,0 ml, welches das Sojabohnentrypsininhibitor-2-Pyridyldisulfid-Derivat in einer Menge von
4,8 mg/ml mit einem Substitutionsgrad von 4,3 µMol 2-Pyridyldisulfidgruppen
pro 20 mg Protein enthielt, wurde bei 4°C aufbewahrt.
Die Bestimmung wurde unter Anwendung des sogenannten Konkurrenzverfahrens
durchgeführt. Zu jedem
Röhrchen einer Reihe von Teströhrchen wurden 100 mg von
trockengesaugtem Agarose-Trypsin-Derivat (entsprechend etwa 1 mg
Trypsin) (siehe oben) und 1,4 mg Sojabohnentrypsininhibitor-2-Pyridyldisulfid-Derivat
in 0,3 ml eines Puffers von 0,1 M
Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 (siehe oben)
zugegeben. Dann wurden in die Röhrchen 0,3 ml von Lösungen des
Sojabohnentrypsininhibitors wechselnder Konzentrationen eingebracht,
wonach die Röhrchen sorgfaltig während 60 Minuten bei
25°C geschüttelt wurden. Das Agarosegel wurde sodann mit einem
Puffer aus 0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5
gewaschen und in 2 ml dieses Puffers suspendiert, wonach 0,2 ml
50 mMol Dithiothreit zugegeben wurden. Nach Schütteln der
Röhrchen während 10 Minuten bei 25°C wurde das Agarosegel jedes
Röhrchens abzentrifugiert, und die Menge an freigesetztem 2-Thiopyridon
der Überstände wurde bei 343 nm spektrophotometrisch
gemessen. Die Menge an freigesetztem 2-Thiopyridon ist proportional
zur Menge an Sojabohnentrypsininhibitor-2-Pyridyldisulfid-Derivat,
das an das Agarose-Trypsin-Derivat gebunden ist,
und somit umgekehrt proportional zu den Konzentrationen an
nativem Sojabohnentrypsininhibitor der Testlösungen. Lösungen
mit einem Gehalt an etwa 0,1 bis 10 mg Sojabohnentrypsininhibitor
pro ml wurden in diesem Test verwendet.
13 mg α-Amylase (siehe Beispiel 1) wurden in 1,1 ml eines Puffers
aus 0,05 Mol Natriumphosphat und 0,3 Mol NaCl vom pH-Wert 7,5
gelöst, wonach 110 µl einer Lösung von 5 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
in 99,5%igem Ethanol zugegeben
wurden. Die Lösung wurde heftig geschüttelt und sodann 15 Minuten
stehen gelassen, wonacch 100 µl 50 mM Dithiothreit zugegeben
wurden. Nach weiteren 15 Minuten wurde das Reaktionsgemisch
an einer Säule gelfiltriert, welche mit den in Beispiel 1 (a)
benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran
gefüllt war; als Medium diente eine 0,3 M Natriumchloridlösung.
Das eluierte Material, 2,5 ml, mit einem Gehalt an 4,70 mg
thiolierter α-Amylase pro ml und einem Substitutionsgrad von
0,9 Mol HS-Gruppen/Mol Protein wurde vereint.
Die auf diese Weise thiolierte α-Amylase (etwa 12 mg in 2,5 ml)
wurde mit 12 mg 2-Pyridyldisulfid-Dextran (hergestellt gemäß
Beispiel 4) welche in 1,5 ml eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat
und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 gelöst waren, vermischt.
Die Umsetzung wurde bei 25°C 24 Stunden unter sorgfältigem
Rühren fortgesetzt, wobei sich ein Dextran-α-Amylase-Derivat
bildete.
0,8 mg Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper (wie in Beispiel 10 (b)
durch Immunosorption gereinigt) in 0,3 ml eines Puffers aus
0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 wurden
mit 25 µl einer Lösung von 5 mMol N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-propionat
in absolutem Ethanol vermischt. Die Umsetzung
wurde bei 25°C vorgenommen, wonach das Reaktionsgemisch an einer
Säule mit den in Beispiel 1 (a) benutzten Perlen aus mit Epichlorhydrin
vernetztem Dextran gelfiltriert wurde (das verwendete
Medium war eine 0,1 M Natriumacetatlösung vom pH-Wert 5,0).
Das eluierte Material, 0,7 mg in 0,7 ml, wurde während 30 Minuten
mit 5 mMol Dithiothreit reduziert, wonach überschüssiges Reduktionsmittel
durch eine andere Gelfiltration an den zuvor genannten
Perlen entfernt wurde (das verwendete Medium war eine 0,3 M
Natriumchloridlösung). Die auf diese Weise erhaltenen thiolierten
Antikörper [das eluierte Material, 0,55 mg Protein (1,0 ml)
mit einem Gehalt an 2 Mol HS pro Mol Protein] wurden mit 0,1 ml
Dextran-α-Amylase-Derivat (siehe oben) vermischt, und die
Reduktion wurde bei 4°C während 24 Stunden unter Rühren vorgenommen.
Das Reaktionsgemisch mit einem Gehalt an Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Dextran-α-Amylase-
Konjugat
wurde bei 4°C aufbewahrt.
100 µl einer Suspension eines Agarose-Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Derivats
[hergestellt in analoger Weise zu Beispiel 7 (b)]
mit einem Gehalt an etwa 50 µg Antikörpern pro ml Suspension
wurden in jedes Röhrchen einer Reihe von Teströhrchen mit verschiedenen
Mengen von Humangammaglobulin (0,5 bis 300 ng),
gelöst in 100 µl eines Puffers aus 0,1 M Natriumphosphat,
0,3 M NaCl und 0,5% Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat
vom pH-Wert 7,5 gegeben. Eine Anzahl von Röhrchen
mit lediglich Puffer, und eine Anzahl von Röhrchen mit
einem Gehalt an Aminoethylagarose [hergestellt gemäß Beispiel
7 (b)] dienten als Blindproben. Die Röhrchen wurden unter sorgfältigem
Schütteln 18 Stunden bei 25°C inkubiert. Das Agarosegel
eines jeden Röhrchens wurde sodann wie in Beispiel 7 (b)
beschrieben, gewaschen. Zu jedem Röhrchen, das die gewaschene
Agarosesuspension (etwa 0,3 ml/Röhrchen) enthielt, wurden 100 µl
einer 100fachen Verdünnung des Reaktionsgemisches zugegeben, welches
Schaf-Antihuman-IgG-Antikörper-Dextran-α-Amylase-Konjugat
(siehe oben) enthielt. Unter sorgfältigem Schütteln wurden
die Röhrchen sodann 18 Stunden bei 25°C inkubiert, wonach das
Agarosegel jedes Röhrchens, wie in Beispiel 7 (b) beschrieben,
gewaschen wurde. 1,0 ml Dextranase (0,5 mg DEX/ml)
in einem Puffer aus
0,1 M Natriumphosphat und 0,3 M NaCl vom pH-Wert 7,5 wurde dann
zu allen Röhrchen gegeben, die sodann 60 Minuten bei 25°C
inkubiert wurden. Die Dextranase baut den Träger Dextran ab,
wobei vom Konjugat und dem immobilisierten Immunkomplex α-Amylase
freigesetzt wird und in die Lösung geht. Die freigesetzte
a-Amylaseaktivität wurde sodann, wie in Beispiel 7 (b) beschrieben,
bestimmt.
Die Aktivität der freigesetzten α-Amylase ist proportional zur
Menge an Antikörper-Dextran-α-Amylase-Konjugat, die an das
Agarose-Immunkomplex-Derivat gebunden ist; diese Menge ist
ihrerseits proportional zur Menge an Gammaglobulin,
das an das Agarose-Antikörper-Derivat gebunden ist. Infolgedessen
ist sie ein Maß für die Konzentrationen an Gammaglobulin in
den Testlösungen. Auf diesem Weg konnte Humangammaglobulin bis
herab zu einer Konzentration von etwa 1 ng/ml nachgewiesen werden.
Claims (7)
1. Verfahren zur Durchführung von Bestimmungsmethoden mit
biospezifischen Affinitätsreaktionen, vorzugsweise immunchemischen
Reaktionen, bei denen eine mit zumindest
einer analytisch nachweisbaren Gruppe markierte und in der
Flüssigkeit, in deren Gegenwart die biospezifische Affinitätsreaktion
durchgeführt wird, lösliche Komponente I, vorzugsweise
eine immunchemische Komponente I mit einer Komponente II, die gegenüber I biospezifische Affinität zeigt, vorzugsweise mit einer immunchemischen
Komponente II, und wahlweise ferner einer oder
mehreren zusätzlichen Komponenten, welche gegenüber I und/oder
II biospezifische Affinität aufweisen, vorzugsweise immunchemischen
Komponenten, unter Bildung eines unlöslichen Konjugats,
in das die markierte Komponente I eingeschlossen ist,
zur Umsetzung gebracht wird,
wobei die analytisch nachweisbare Gruppe mit einer spaltbaren
Bindung kovalenter Natur an die Komponente I gebunden
und/oder eine der Komponenten mit einer spaltbaren
Bindung kovalenter Natur an einen in der Flüssigkeit unlöslichen Träger gebunden ist,
und wobei die spaltbaren Bindungen die gleich oder verschieden sein können,
unter Bedingungen spaltbar sind, welche praktisch keinen
störenden Einfluß auf die angewandte Bestimmungsmethode ausüben,
dadurch gekennzeichnet, daß als spaltbare Bindung eine
Bindung -S-S- oder
verwendet wird, die
durch Reduktion bzw. Oxidation spaltbar ist, und daß das
unlösliche Konjugat von der Flüssigkeitsphase abgetrennt wird
und an der spaltbaren Bindung oder den spaltbaren Bindungen
in Gegenwart einer Flüssigkeit unter Bildung von Fragmenten
gespalten wird, die in der Flüssigkeit löslich sind und die
analytisch nachweisbare Gruppe enthalten, welch'letztere sodann
in der Flüssigkeitsphase bestimmt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die analytisch nachweisbare Gruppe eine enzymatisch aktive
Gruppe ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
die analytisch nachweisbare Gruppe
eine fluoreszierende Gruppe ist.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch
gekennzeichnet, daß die spaltbare Bindung eine Disulfidbindung
-S-S- ist.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die markierte Komponente I ein Multikonjugat
einer Vielzahl analytisch nachweisbarer Gruppen
darstellt, welche miteinander über spaltbare Bindungen enthaltende
Verbindungsglieder verbunden sind, und,
vorzugsweise mit spaltbaren Bindungen, an die Komponente I gebunden sind.
6. Reagens zur Verwendung im Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß es eine markierte immunchemische
Komponente I enthält, welche ein Multikonjugat einer Vielzahl von analytisch
nachweisbaren Gruppen darstellt, welche
über Verbindungsglieder aneinander gebunden sind, die durch
Reduktion oder Oxidation spaltbare kovalente Bindungen der
Formel -S-S- bzw.
enthalten, und welche
vorzugsweise mit durch Reduktion
oder Oxidation spaltbare Bindungen der Formel -S-S- bzw.
enthaltenden Verbindungsgliedern, an die immunchemische
Komponente gebunden sind.
7. Reagens gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
die spaltbare Bindung eine Disulfidbindung -S-S- ist.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SE7702465A SE404553B (sv) | 1977-03-04 | 1977-03-04 | Sett vid bestemningsmetoder involverande biospecifika affinitetsreaktioner |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2808515A1 DE2808515A1 (de) | 1978-09-07 |
DE2808515C2 true DE2808515C2 (de) | 1987-11-12 |
Family
ID=20330626
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19782808515 Granted DE2808515A1 (de) | 1977-03-04 | 1978-02-28 | Verfahren und reagens zur durchfuehrung von bestimmungsmethoden mit biospezifischen affinitaetsreaktionen |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4231999A (de) |
JP (1) | JPS53130424A (de) |
DE (1) | DE2808515A1 (de) |
FR (1) | FR2382696A1 (de) |
GB (2) | GB1597758A (de) |
NL (1) | NL188919C (de) |
SE (1) | SE404553B (de) |
Families Citing this family (49)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4492751A (en) * | 1978-04-10 | 1985-01-08 | Miles Laboratories, Inc. | Heterogenous specific binding assay employing an enzyme substrate as label |
SE7812237L (sv) * | 1978-11-28 | 1980-05-29 | Pharmacia Diagnostics Ab | Koncentrationsbestemning av substanser med formaga att biospecifikt binda molekyler med biologiskt ursprung |
US4576912A (en) * | 1978-11-30 | 1986-03-18 | Technicon Instruments Corporation | Fluoroimmunoassaying |
JPS55136261A (en) * | 1979-04-12 | 1980-10-23 | Toyo Jozo Co Ltd | Novel compound and kit comprising it |
SE445116B (sv) * | 1979-09-12 | 1986-06-02 | Pharmacia Fine Chemicals Ab | Sett att odla celler pa mikroberare med fibronektinytskikt |
SE8003732L (sv) * | 1980-05-19 | 1981-11-20 | Pharmacia Diagnostics Ab | Sett vid bestemningsmetoder involverande biospecifika affinitetsreaktioner |
EP0040728A1 (de) * | 1980-05-19 | 1981-12-02 | Pharmacia Diagnostics Ab | Prüfverfahren, welche biospezifische Affinitätsreaktionen umfassen |
US4849353A (en) * | 1980-09-30 | 1989-07-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Immunocapture of enzyme inhibitor, enzyme complexes and uses thereof |
JPS5930373Y2 (ja) * | 1980-12-03 | 1984-08-30 | 株式会社日立製作所 | 冷蔵庫 |
JPS5794780U (de) * | 1980-12-03 | 1982-06-10 | ||
JPS5798269U (de) * | 1980-12-08 | 1982-06-16 | ||
US4563305A (en) * | 1981-01-07 | 1986-01-07 | University Of Miami | Radiolabelled substrates for assaying mammalian enzymes |
SE8102194L (sv) * | 1981-04-06 | 1982-10-07 | Pharmacia Ab | Terapeutiskt aktiv organisk forening och farmaceutisk beredning innehallande denna |
US4560649A (en) * | 1981-10-15 | 1985-12-24 | Cornell Research Foundation | Assaying for hLH or hCG with immobilized hormone receptors |
US4753875A (en) * | 1981-11-02 | 1988-06-28 | Ryan James W | Method for assaying proteases with tagged proteinaceous inhibitors |
JPS5880558A (ja) * | 1981-11-09 | 1983-05-14 | Sekisui Chem Co Ltd | 免疫化学的測定試薬 |
US4732852A (en) * | 1981-11-20 | 1988-03-22 | Cetus Corporation | Site directed peptidase cleavage |
US5650270A (en) * | 1982-02-01 | 1997-07-22 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
US4650750A (en) * | 1982-02-01 | 1987-03-17 | Giese Roger W | Method of chemical analysis employing molecular release tag compounds |
US4709016A (en) * | 1982-02-01 | 1987-11-24 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
US4504585A (en) * | 1982-04-05 | 1985-03-12 | Aalto Scientific, Ltd. | Affinity immunoassay system |
US4614712A (en) * | 1983-02-25 | 1986-09-30 | The Upjohn Company | Immunoassays with luciferase labeled ligands or receptors |
US4879249A (en) * | 1983-02-25 | 1989-11-07 | Baldwin Thomas O | Linker compounds, linker-compound-ligands and linker-compound-receptors |
US4629694A (en) * | 1983-07-12 | 1986-12-16 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detecting and distinguishing between plasminogen activators |
JPS61501047A (ja) * | 1984-01-27 | 1986-05-22 | モレキュラ−・バイオシステムズ,インコ−ポレイテッド | 固定化したリポ−タ−グル−プ類の測定方法 |
US4804625A (en) * | 1984-09-27 | 1989-02-14 | Amoco Corporation | Assay procedures |
EP0177023A3 (de) * | 1984-10-02 | 1987-08-12 | The Calpis Food Industry Co., Ltd. | An eine Substanz gebundenes Komplement-Bestandteil C1q |
ATE107031T1 (de) * | 1984-12-03 | 1994-06-15 | Hoechst Celanese Corp | Verfahren zur bestimmung eines liganden. |
US4780409A (en) * | 1985-05-02 | 1988-10-25 | Genetic Systems Corporation | Thermally induced phase separation immunoassay |
FR2586813B1 (fr) * | 1985-08-30 | 1989-05-12 | Inst Nat Sante Rech Med | Supports proteiques modifies aptes a immobiliser de facon reversible des anticorps ou des substances immunologiquement actives, et leurs applications au dosage et a la purification d'antigenes ou similaires. |
US4780421A (en) * | 1986-04-03 | 1988-10-25 | Sclavo Inc. | Cleavable labels for use in binding assays |
US4975532A (en) * | 1986-11-28 | 1990-12-04 | Sclavo, Inc. | Method to derivatize dextran |
ATE124719T1 (de) * | 1987-07-17 | 1995-07-15 | Modrovich Ivan Endre | Stabiles alpha-amylase-reagenz. |
US5053054A (en) * | 1988-09-12 | 1991-10-01 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Methods and reagents for staining intracellular components |
US5139933A (en) * | 1989-09-26 | 1992-08-18 | Vicam, L.P. | Assay method for detecting listeria |
US5324650A (en) * | 1990-03-20 | 1994-06-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Situ process for production of conjugates |
AU8951191A (en) * | 1990-10-29 | 1992-05-26 | Dekalb Plant Genetics | Isolation of biological materials using magnetic particles |
DE4219159A1 (de) * | 1992-06-11 | 1993-12-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Selbst assemblierende Monoschicht mit kurzkettigen Linkern |
DE4041080A1 (de) * | 1990-12-21 | 1992-06-25 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung eines analyten |
IE920778A1 (en) * | 1991-03-12 | 1992-09-23 | Du Pont | Method for specific binding assays using a releasable ligand |
US5369006A (en) * | 1991-08-20 | 1994-11-29 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Determination of CK isoenzymes and CK isoforms |
AU3941893A (en) * | 1992-04-06 | 1993-11-08 | Biosite Diagnostics Incorporated | Novel opiate derivatives and protein and polypeptide opiate derivative conjugates and labels |
US5331109A (en) * | 1992-04-06 | 1994-07-19 | Biosite Diagnostics Incorporated | Phencyclidine derivatives and protein and polypeptide phencyclidine derivative conjugates and labels |
US5536820A (en) * | 1993-02-26 | 1996-07-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Avidin-binding azo reagents |
CA2274587A1 (en) | 1996-12-10 | 1998-06-18 | Genetrace Systems Inc. | Releasable nonvolatile mass-label molecules |
AU2002319613A1 (en) * | 2001-07-19 | 2003-03-03 | Signet Laboratories, Inc. | Human tissue specific drug screening procedure |
US20060177350A1 (en) * | 2003-03-19 | 2006-08-10 | Nec Corporation | Microchip, sampling method, sample separating method, sample analyzing method, and sample recovering method |
US20070134739A1 (en) * | 2005-12-12 | 2007-06-14 | Gyros Patent Ab | Microfluidic assays and microfluidic devices |
EP2237037A1 (de) | 2005-12-12 | 2010-10-06 | Gyros Patent Ab | Mikrofluid-Vorrichtung und deren Verwendung |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3652761A (en) * | 1969-09-04 | 1972-03-28 | Corning Glass Works | Immunochemical composites and antigen or antibody purification therewith |
US3896217A (en) * | 1973-03-19 | 1975-07-22 | Summa Corp | Method and apparatus for radioimmunoassay with regeneration of immunoadsorbent |
US4041146A (en) * | 1975-05-01 | 1977-08-09 | General Electric Company | Method for detection of biological particles |
DE2537275C3 (de) * | 1975-08-21 | 1980-12-18 | Watzek, Karl, 8120 Weilheim | Immunchemisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten |
US4108975A (en) * | 1977-03-04 | 1978-08-22 | Becton, Dickinson And Company | Radioimmunoassay system |
US4108976A (en) * | 1977-03-04 | 1978-08-22 | Becton, Dickinson And Company | Automated direct serum radioimmunoassay |
-
1977
- 1977-03-04 SE SE7702465A patent/SE404553B/xx not_active IP Right Cessation
-
1978
- 1978-02-28 DE DE19782808515 patent/DE2808515A1/de active Granted
- 1978-03-02 US US05/882,678 patent/US4231999A/en not_active Expired - Lifetime
- 1978-03-03 FR FR7806164A patent/FR2382696A1/fr active Granted
- 1978-03-03 GB GB30930/79A patent/GB1597758A/en not_active Expired
- 1978-03-03 GB GB8452/78A patent/GB1597755A/en not_active Expired
- 1978-03-04 JP JP2406578A patent/JPS53130424A/ja active Granted
- 1978-03-06 NL NLAANVRAGE7802452,A patent/NL188919C/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NL188919B (nl) | 1992-06-01 |
JPS6147381B2 (de) | 1986-10-18 |
NL7802452A (nl) | 1978-09-06 |
US4231999A (en) | 1980-11-04 |
FR2382696A1 (fr) | 1978-09-29 |
GB1597755A (en) | 1981-09-09 |
GB1597758A (en) | 1981-09-09 |
DE2808515A1 (de) | 1978-09-07 |
FR2382696B1 (de) | 1984-04-06 |
JPS53130424A (en) | 1978-11-14 |
SE404553B (sv) | 1978-10-09 |
NL188919C (nl) | 1992-11-02 |
SE7702465L (sv) | 1978-09-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2808515C2 (de) | ||
DE2808476C2 (de) | Reagens zur Verwendung in immunochemischen Untersuchungsmethoden | |
DE68924345T2 (de) | Reagenzien zum Ionenfangen und Verfahren zur Verrichtung von Bindungsmessungen. | |
DE69429345T2 (de) | Überzug für hydrophobe oberflächen um diese proteinresistent zu machen unter ermöglichung der kovalenten bindung spezifischer liganden | |
EP0280211B1 (de) | Verfahren zur Bestimmung von Antikörpern | |
DE69620902T2 (de) | Fluoreszent- und lumineszentmarkierungszusammensetzungen und verfahren zu ihrer verwendung | |
DE69029873T2 (de) | Kovalente Kupplung von spezifischen Bindungspartnern an einer Festphase | |
DE3788356T2 (de) | Monomere phthalocyanin-reagenzien. | |
DE69423601T2 (de) | Elektrochemische Bestimmungsmethode und neue p-Phenylendiamin-Verbindung | |
DE60031570T2 (de) | Immunoassay für neonicotinylinsektizide | |
US6306665B1 (en) | Covalent bonding of molecules to an activated solid phase material | |
EP0040365B1 (de) | Biospezifische Affinitätsreaktionen umfassendes Prüfverfahren | |
DE69116236T2 (de) | Bestimmung von Analyten, die Bindungsstellen für mindestens zwei Bindungsgruppen haben | |
DE2830862C2 (de) | ||
DE68913086T2 (de) | Qualitativer Enzymtest zur visuellen Auswertung. | |
DE68919828T2 (de) | Nanoteilchen mit gebundenen enzym und ligand zur verwendung bei analysen. | |
EP0697021B1 (de) | Photoaktivierbare biotinderivate und deren einsatz zum entstören von immunoassays | |
EP0001223A2 (de) | Mit einer Polyhydroxyverbindung beschichteten Latex, Verfahren zur Herstellung dieses Latex, immunologisches Reagenz enthaltend diesen Latex, Verfahren zur Herstellung dieses Reagenzes, Verwendung dieses Reagenzes, Bestimmungsverfahren unter Verwendung dieses Reagenzes und Reagenziengarnitur enthaltend dieses Reagenz. | |
EP0491362A2 (de) | Verwendung von Peptidpaaren mit extrem hoher spezifischer Affinität zueinander im Bereich der in vitro Diagnostik | |
CH641570A5 (en) | Process for the determination of an immunologically active material and reagent for carrying out this process | |
DE69636013T2 (de) | Verfahren zum erlangen von rezeptor-freigabeligand (reland)-komplexen und testansätze | |
DE3876146T2 (de) | Verfahren zur deponierung von metallpartikeln auf einen marker. | |
EP0374620A2 (de) | Verfahren und Mittel zur Bestimmung von Maleimidgruppen | |
DE2924249C2 (de) | Spezifische bindungs-untersuchungsmethode zur bestimmung eines liganden in einem fluessigen medium und reagentien zur durchfuehrung dieser methode | |
DE3738721C2 (de) | Immobilisierte Antikörper |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
D2 | Grant after examination | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |