DE69116236T2 - Bestimmung von Analyten, die Bindungsstellen für mindestens zwei Bindungsgruppen haben - Google Patents

Bestimmung von Analyten, die Bindungsstellen für mindestens zwei Bindungsgruppen haben

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Description

    EINLEITUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Enzym-Immunoassays und insbesondere Immunoassays, bei denen β-Galactosidase als Enzymmarkierung verwendet wird.
  • Enzym-Immunoassays sind ein sehr erfolgreicher Typ eines homogenen Immunoassays. Eine Anzahl solcher Assays basiert auf der Fähigkeit von Fragmenten von β- Galactosidase, einander zu ergänzen und aktives Enzym zu bilden. Insbesondere verbindet sich ein β-Galactosidase-Enzymdonor (ED) mit einem β-Galactosidase- Enzymrezeptor (EA), um aktives β-Galactosidase-Enzym zu bilden. Das Konjugieren eines kleinen Analyten oder eines Analytanalogs an den ED an bestimmten Stellen beeinflußt die Komplementierung von ED mit EA oder die Rate der β-Galactosidasekatalysierten Aktivität nicht. Wenn jedoch ein ED-Analytkonjugat durch Anti-Analyt- Antikörper gebunden ist, werden die Komplementierung und die Rate der enzymkatalysierten Reaktion während der Anfangsphase der Reaktion verringert. Diese Verringerung der Rate der enzymkatalysierten Reaktion ist herangezogen worden, um Analyten in einer Situation zu quantifizieren, wo sowohl das in einem Assaymedium vorhandene ED-Analytkonjugat, als auch der in der Probe vorhandene Analyt vor der Zugabe von EA um Anti-Analyt-Antikörper konkurrieren. Die Rate der β-Galactosidasekatalysierten Reaktion steigt, wenn die Menge des in der Probe vorhandenen Analyten zunimmt, da mehr Analyt in der Probe die Wechselwirkung zwischen dem ED- Analytkonjugat und dem Anti-Analyt-Antikörper verringert, wodurch zugelassen wird, daß mehr ED-Analytkonjugat mit dem EA reagiert, um aktives β-Galactosidase-Enzym zu bilden.
  • Diese Technik war allgemein auf Analyten mit geringem Molekulargewicht beschränkt. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mit dem Analyten mit hohem Molekulargewicht gemessen werden können. Modifizierte β-Galactosidase-Enzymdonoren und -Enzymakzeptoren wurden durch chemische Synthese und rekombinantes DNA-Engineering hergestellt. Die modifizierten Fragmente behalten nach der Komplementierung β-Galactosidase-Aktivität bei. Siehe beispielsweise die US-A-4,708,929 und 3,378,428 und die darin zitierten Artikel. Von β-Galactosidase abgeleitete mutante Polypeptide werden von Langley und Zabin, "Bio.Chem." (1976) 15:4866 geoffenbart, die Enzymaktivität komplementieren oder spontan wiederherstellen können, wenn sie Extrakten geeigneter negativer β- Galactosidase-Mutanten hinzugefügt werden. Siehe auch Lin et al., "Bio.Chem.Biophys.Res.Comm." (1970) 40:249.
  • Die EP-A-315364 offenbart Assays, bei denen zwei verschiedene bindende Gruppen, die unterschiedlich markiert sind, verwendet werden, um die Spezifität zu erhöhen.
  • Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und Reagenzien zum Nachweisen und zur quantitativen Analyse von Analyten, insbesondere Analyten mit hohem Molekulargewicht, bereitzustellen, die Bindungsstellen für zumindest zwei Bindungsgruppen aufweisen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren und solche Reagenzien bereit, indem modifizierte β-Galactosidase-Enzymdonoren und -Enzymakzeptoren eingesetzt werden. Im speziellen wird das Vorhandensein oder die Menge eines Analyten mit Bindungsstellen für zumindest zwei bindende Gruppen in einer Probe nachgewiesen, indem komplementäre Fragmente von β-Galactosidase eingesetzt werden, welche Fragmente als Enzymdonoren (ED) und Enzymakzeptoren (EA) definiert sind und, wenn sie verbunden, d.h. zusammengebracht werden, aktive β-Galactosidase bilden, worin die ED und EA modifiziert sind, um getrennte ED- und EA-Komplexe zu bilden, indem jedes an ein bindendes Element und eine bindende Gruppe gebunden wird, die für eine Bindungsstelle auf dem Analyten spezifisch ist. Die ED- und EA-Komplexe können in Abwesenheit des Analyten kein aktives Enzym bilden. Wenn aber Analyt vorhanden ist, werden ED- und EA-Komplexe, die sich an einen gemeinsamen Analyten in einer Probe binden, zusammengebracht, sodaß sie aktives β-Galactosidase-Enzym bilden.
  • Die resultierende Enzymaktivität kann auf eine Vielzahl wohlbekannter Arten nachgewiesen oder gemessen werden, wie z.B. unter Verwendung eines Enzymsubstrats, das bei Umsetzung mit β-Galactosidase ein meßbares Produkt liefert. Die in der Probe vorhandene Analytmenge kann ermittelt werden, indem die Menge an meßbarem Produkt mit der aus einer bekannten Analytmenge gebildeten verglichen wird.
  • Spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen Verfahren und Reagenzien zum Nachweisen und Quantifizieren der Menge eines Analyten in einer Probe. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Analyten mit Bindungsstellen für zumindest zwei bindende Gruppen in einer Probe unter Einsatz komplementärer Fragmente von β-Galactosidase bereit, welche Fragmente als Enzymdonor (ED) und Enzymakzeptor (EA) definiert sind und in gebundenem Zustand aktive β-Galactosidase bilden, welches Verfahren umfaßt:
  • (a) das Bereitstellen eines ED-Komplexes, der ED umfaßt, der über ein bindendes Element an eine erste Bindungsgruppe gebunden ist, und eines EA-Komplexes, der EA umfaßt, der über ein Bindungselement an eine zweite bindende Gruppe gebunden ist, worin die erste und die zweite bindende Gruppe für Bindungsstellen auf dem Analyten spezifisch sind und der ED-Komplex und der EA-Komplex in Abwesenheit des Analyten nicht zur Bildung von aktivem Enzym fähig sind,
  • (b) das In-Kontakt-Bringen des ED-Komplexes und des EA-Komplexes mit der Probe, und
  • (c) das In-Beziehung-Setzen des Analyten in der Probe mit der Bildung von aktivem Enzym.
  • Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren befaßt sich weiters mit dem In-Kontakt- Bringen des ED-Komplexes, des EA-Komplexes und der Probe mit einem Enzymsubstrat, das bei Umsetzung mit β-Galactosidase ein meßbares Produkt liefert, sodaß die Analytmenge in der Probe ermittelt werden kann, indem die Menge an meßbarem Produkt mit der in Gegenwart einer bekannten Analytmenge gebildeten verglichen wird. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Sets zur Verwendung bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
  • Die vorliegende Erfindung ist zumindest teilweise auf dem Prinzip begründet, daß der ED/Bindungselement/Bindungsgruppen-Komplex und der EA/Bindungselement/Bindungsgruppen-Komplex nur aktives Enzym bilden, wenn jeder sich durch seine jeweiligen bindenden Gruppen an einen gemeinsamen Analyten gebunden hat. Die Analytmenge ist daher direkt proportional zur Enzymaktivität, die auf jede geeignete Weise gemessen werden kann, wie durch die Verwendung eines Enzymsubstrats. Die Unfähigkeit des ED-Komplexes, in Abwesenheit von Analyt den EA-Komplex zu ergänzen, unterscheidet sich deutlich vom β-Galactosidase- Komplementierungsphänomen, das bei einer Anzahl zuvor beschriebener Assays beobachtet wird, bei denen ED- und EA-Konjugate eingesetzt werden. Beispielsweise ergänzt in den in der US-A-4,708,929 beschriebenen Assays an Analyt konjugierter ED EA, es sei denn, dem Assaygemisch werden Anti-Analyt-Antikörper zugegeben. Es wird angenommen, daß dieser Unterschied aus der großen Größe der bindenden oder Linkergruppen im Verhältnis zur Größe der Analyten resultiert, die in den Assays, die nach diesem unterschiedlichen Prinzip durchgeführt wurden, an den ED- und EA- Gruppen angefügt wurden.
  • Die ED- und EA-Komponenten sind Teilsequenzen von β-Galactosidase. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der N-terminale Abschnitt der β-Galactosidase als Enzymdonor (ED) bezeichnet, und der C-proximale Abschnitt ist der Enzymakzeptor (EA). Der Enzymakzeptor und der Enzymdonor sind dadurch gekennzeichnet, daß sie einen aktiven Enzymkomplex bilden, wenn sie zusammengebracht werden. Die Herstellung von β-Galactosidase-Enzymdonoren und -akzeptoren wird in der US-A- 4,708,929 beschrieben.
  • Die Bindungselemente der ED- und EA-Komplexe können die gleichen oder voneinander verschieden sein und können jedes beliebige Material umfassen, das in Kombination mit der bindenden Gruppe verhindert, daß die EA- und ED-Komplexe ohne Bindung an einen gemeinsamen Analyten ein aktives Enzym bilden. Die Bindungselemente umfassen vorzugsweise Perlenteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 0,01 µ bis etwa 0,1 µ, am meisten bevorzugt etwa 0,05 µ bis etwa 0,08 µ. Geeignete Bindungsmaterialien für die Bindungselemente sind beispielsweise organische Polymere, sowohl natürliche als auch synthetische, wie z.B. Polysaccharide, Styrolpolymere, Polyacrylate, z.B. Polyacrylamid, Hydroxyethylpolymethacrylate, Glas, Keramik, Kohlenstoff, Polyvinylchlorid, Protein und dergleichen. Styrolpolymere sind z.B. Polystyrol, Polymere, die aromatische Gruppen enthalten, und höhere aromatische Verbindungen, wie z.B. Naphthalin, Anthracen usw. Die Bindungselemente der ED- und EA-Komplexe sind vorzugsweise die gleichen und bestehen aus einer Latexverbindung.
  • Alternativ dazu können bifunktionale organische bindende Gruppen verwendet werden, um die EA- oder ED-Komponente an der Bindungsgruppe zu befestigen. Beispiele für solche Gruppen, die in der Proteinchemie wohlbekannt sind, sind Dialdehyde, wie z.B. Glutaraldehyd, und Diamine, wie z.B. 1,6-Diaminohexan. Solche bifunktionale organische bindende Gruppen werden vorzugsweise verwendet, wenn die Bindungsgruppe ausreichend groß ist, um Komplementierung zu verhindern, ohne daß das Vorhandensein eines großen Bindungselements erforderlich ist.
  • Die verschiedenen Bindungselemente können funktional isiert oder nichtfunktionalisiert sein und sind vorzugsweise zur kovalenten Bindung an die Bindungsgruppe funktionalisiert. Wenn das Bindungselement ein Polymermaterial ist, sind nach dem Stand der Technik verschiedene Verfahren zur Aktivierung der Polymeroberflächen und der Befestigung von Immunoglobulinen, Glykoproteinen, saccharidhältigen organischen und 3,860,486 sowie die EP-A-0,145,386 und Scouten, W.H. (Hrsg.) "Solid Phase Biochemistry, Analytical and Synthetic Aspects" (1983), Wiiey & Sons, New York, S. 779.
  • Die Bindungsgruppen sind Komponenten, die zur Bindung an den speziellen interessierenden Analyten fähig sind. Die Bindung zwischen den Bindungsgruppen und dem Analyten ist vorzugsweise nicht-kovalent. Geeignete Bindungsgruppen haben vorzugsweise eine höhere Affinität und Spezifität für den Analyten als für die anderen Komponenten in einer Probe zur Analyse. Geeignete Bindungsgruppen können einer Vielzahl von Molekularkategorien angehören, einschließlich Antikörpern, insbesondere und, vorzugsweise, monoklonalen Antikörpern, die für einen Abschnitt des Analyten spezifisch sind; Bindungsproteine, die sich natürlich an den Analyten binden, z.B. Lectine für Analyten, die einen Kohlenhydratabschnitt umfassen; und Ligandrezeptoren, wenn der Analyt einen komplementären Liganden umfaßt.
  • Die Bindungsgruppe des ED-Komplexes und die Bindungsgruppe des EA-Komplexes können der gleichen oder unterschiedlichen Kategorien angehören; z.B. können beide Bindungsgruppen Antikörper sein, oder die Bindungsgruppenkomponente des EA- Komplexes kann ein Antikörper sein und die Bindungsgruppenkomponente des ED- Komplexes kann ein Lektin sein.
  • Wenn der Analyt eine Nukleinsäure ist, kann die Bindungsgruppe ssDNA, RNA oder irgendeine andere natürliche oder synthetisierte einstrangige Nukleinsäure sein. Alternativ dazu könnte die Bindungsgruppe ein Nicht-Nukleinsäuremolekül sein, das eine spezifische Nukleotidsequenz erkennt, wie z.B. ein Antikörper oder ein spezifisches DNA-bindendes Protein am Analyten.
  • Verfahren zur Herstellung von Antikörpern oder monoklonalen Antikörpern zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind in der Literatur bekannt. Siehe z.B. die US-A-4,574,116 und die darin zitierten Verweise. Alternativ dazu können die monoklonalen Antikörper oder Bindungsfragmente im Handel erworben werden.
  • Wenn die Bindungsgruppe ein Nukleinsäuremolekül ist, umfaßt die Gruppe üblicherweise zumindest 8 Nukleotide, häufiger 10 Nukleotide und vorzugsweise zumindest etwa 12 Nukleotide. Die Größe der Bindungsgruppe variiert je nach der Beschaffenheit des Analyten, der Analytmenge in der Probe und den beim Nachweisverfahren eingesetzten Bedingungen. Die Nukleinsäuresequenzen zur Verwendung in einer Bindungsgruppe können durch Isolierung aus einer natürlichen Quelle, Synthese oder auf andere nach dem Stand der Technik bekannte Arten bereitgestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Assays mit höherer Spezifität als jener bereit, die sich aus einer einzelnen Bindungswechselwirkung zwischen der Bindungsgruppe entweder des ED- oder des EA-Komplexes und dem Zielanalyten ergibt. Somit können Bindungsgruppen mit relativ geringer Spezifität für den Analyten in ED und EA verwendet werden, die so ergänzt sind, daß sie ein hochspezifisches Assay liefern. Die hohe Spezifität der vorliegenden Erfindung wird erzielt, weil die Erzeugung von β- Galactosidase-Aktivität vom Auftreten zweier unabhängiger Bindungsvorgänge abhängt. Eine spezifische Bindungswechselwirkung muß zwischen dem Analyten und beiden der Bindungsgruppen auftreten, damit ED und EA einander ergänzen.
  • Das erfindungsgemäße Assayverfahren kann verwendet werden, um jeglichen Analyten nachzuweisen, der dazu fähig ist, sich gleichzeitig an die Bindungsgruppen des ED- und des EA-Komplexes zu binden. Im allgemeinen ist der Analyt ein Polypeptid, Protein, Polysaccharid, eine Nukleinsäure oder eine Kombination daraus. Größtenteils haben die gemäß vorliegender Erfindung nachgewiesenen oder quantifizierten Analyten vorzugsweise ein Molekulargewicht von zumindest etwa 5.000, häufiger zumindest etwa 10.000. Polypeptide, die von Interesse sind, haben im allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5.000 bis etwa 5.000.000, häufiger von etwa 10.000 bis 1.000.000. Wenn der Analyt ein Nukleinsäuremolekül ist, hat das Molekül im allgemeinen von etwa 12 bis etwa 2x20&sup6; Nukleotide. Die Nukleinsäureprobe kann DNA umfassen, die chromosomal oder extrachromosomal sein kann, z.B. Plasmide, Viren, synthetische Konstrukte oder dergleichen, oder RNA, wie z.B. Messenger-RNA, Transfer-RNA, ribosomale RNA, Viren oder dergleichen. Die Nukleinsäuresequenzen können Strukturgene oder translatierte Bereiche, regulierende Bereiche, Introne, Exone und dergleichen umfassen. Analyten zum Nachweis oder zur Quantifizierung gemäß vorliegender Erfindung können auch ein Molekulargewicht von weniger als etwa 5.000 aufweisen. Beispiele für geeignete Analyten mit einem Molekulargewicht unter 5.000 sind kleine Polynukleotide, kleine Polypeptidhormone, Steroidhormone, Cholesterin, Arzneimittel und Toxine. Jedoch müssen solche kleine Analyten in der Lage sein, sich an zwei getrennte Bindungsgruppen, wie hierin beschrieben, zu binden.
  • Die Vorschrift für das Assay kann je nach dem eingesetzten System, der Empfindlichkeit des Assays, der Geschwindigkeit, mit der das Assay durchzuführen ist, der Beschaffenheit des Analyten und dergleichen stark variiert werden. Die EA- und ED- Komplexe und die Probe werden unter geeigneten strengen Bedingungen miteinander zusammengebracht, um die Bindung zuzulassen. Die Reagenzien können gleichzeitig zusammengebracht oder der Reihe nach zugegeben werden. Bei sequentieller Abfolge wird das Reaktionsgemisch aus Probe, ED-Komplex, EA-Komplex und Puffer vor der Zugabe von Enzymsubstrat vorzugsweise etwa 5 bis 25 Minuten, üblicherweise etwa 15 Minuten, lang inkubiert.
  • Die Probe kann vorheriger Vorbereitung unterzogen oder ohne Vorbehandlung verwendet werden. In dem Fall, daß der Analyt in der Probe sich mit den Bindungsgruppen verbinden kann, ist im allgemeinen keine vorherige Vorbereitung der Probe erforderlich. In dem Fall, daß der Analyt in der Probe sich nicht sofort mit den Bindungsgruppen verbinden kann, ist vorherige Vorbereitung der Probe erforderlich. Beispielsweise ist es, wenn der Analyt eine doppelstrangige Nukleinsäure ist und die Bindungsgruppen komplementäre Nukleinsäurestränge sind, notwendig, die Probe zu behandeln, um die doppelstrangigen Moleküle vor dem Mischen mit den ED- und EA- Komplexen zu denaturieren. Denaturierung kann am leichtesten erreicht werden, indem die Probe für etwa 3 bis etwa 15 Minuten einer hohen Temperatur, im allgemeinen von etwa 90ºC bis etwa 100ºC, unterworfen wird. Es können auch andere Mittel zur Denaturierung eingesetzt werden, wie z.B. die Behandlung der Probe mit alkalischen Lösungen oder konzentrierten Formamidlösungen oder der Einsatz anderer nach dem Stand der Technik bekannter Verfahren.
  • Das Assaymedium wird vorzugsweise bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis 9 mit einem zweckmäßigen Puffer, wie z.B. Phosphat, Tris oder dergleichen gepuffert. Der signifikante Faktor bei der Auswahl eines geeigneten Puffers ist, daß der Puffer die Enzymreaktion oder Bindung nicht hemmt.
  • Das Assay kann bei jeder geeigneten Temperatur durchgeführt werden, die die gewünschten Reaktionen nicht hemmt, im allgemeinen bei etwa 20ºC, aber vorzugsweise bei einer erhöhten Temperatur unter etwa 40ºC. Die Assays werden im allgemeinen und vorzugsweise bei atmosphärischem Druck durchgeführt.
  • Die Zeiten, die für den Abschluß der gewünschten Reaktionen erforderlich sind, variieren je nach den Gegebenheiten der Assays. In den Situationen, in denen beispielsweise die Bindungsgruppe eine Nukleinsäure ist, hängt die für die Hybridisierung oder Bindung erforderliche Zeit von der Konzentration und Sequenzkomplexität der Nukleinsäuresonde ab, sowie von der Assaytemperatur, dem Lösungsmittel und Salzkonzentrationen. Im allgemeinen wird die Hybridisierung bei einer Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 50ºC in etwa 0,15 M Natriumchlorid und 0,01 5 M Natriumzitrat für einen Zeitraum von etwa ½ Stunde bis etwa 18 Stunden durchgeführt, um die Bildung von Hybriden zuzulassen.
  • Die Techniken zur Hybridisierung von DNA sind in vielen Literaturstellen geoffenbart, darunter Walker und Gaastra (Hrsg.) "Techniques in Molecular Biology" (1983) Macmillan Publishing Company, New York, S.113-135 und 273-283; Maniatis et al., (Hrsg.) "Molecular Cloning" (1982) Cold Spring Harbor Laboratory, S.309; E. Southern, "J.Mol.Biol." (1975) 98:503; Botchan et al., "Cell" (1976) 9:269; Jeffreys et al., "Cell" (1977) 12:429.
  • Die Menge an Probe, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, hängt unter anderem von der Konzentration des Analyten, der Beschaffenheit der Probe und der Empfindlichkeit des Assays ab.
  • Bei Verwendung der vorliegenden Erfindung kann jedes geeignete Mittel eingesetzt werden, um die Menge an aktivem Enzym nachzuweisen und zu quantifizieren und die Information mit dem Nachweis und der Bestimmung der in der Probe vorhandenen Analytmenge in Beziehung zu setzen. Für einen solchen Zweck wird im allgemeinen und vorzugsweise ein Enzymsubstrat verwendet, indem ein meßbares Produkt nach der Reaktion mit aktivem β-Galactosidase-Enzym bereitgestellt wird. Die Analytmenge in der Probe kann dann ermittelt werden, indem die Menge an meßbarem Produkt mit der in Gegenwart einer bekannten Analytmenge gebildeten verglichen wird.
  • Das typischerweise und vorzugsweise eingesetzte Enzymsubstrat führt zu einer Änderung des Ausmaßes an Lichtabsorption (optischer Dichte) oder -emission des Assaymediums, wenn es vom aktiven Enzym gespalten wird. Das heißt, die Spaltung des Substrats führt zum Erscheinen oder Verschwinden eines farbigen oder fluoreszierenden Produktes. Bevorzugte Enzymsubstrate sind beispielsweise o- Nitrophenylgalaktosid (ONPG) und Chlorphenol-rot-β-Galactosidase (CPRG). ONPG, CPRG und andere vergleichbare Enzymsubstrate sind im Handel erhältlich. ONPG wird im allgemeinen in einer Konzentration von etwa 0,5 bis etwa 2,0 mg/ml verwendet. Andere Substrate werden in Konzentrationen verwendet, um mit ONPG vergleichbare Signale zu liefern.
  • Wenn die ED- und EA-Komplexe in einem geeigneten Assaymedium mit dem Enzymsubstrat kombiniert werden, wobei die Probe daraufhin zugegeben wird, kann eine erste Ablesung vorgenommen werden, um eine Hintergrundmessung für die Enzymaktivität zu liefern. Größtenteils ergibt ein Gemisch aus den ED- und EA- Komplexen keine Umsetzung, obwohl ein geringes Maß an Enzymaktivität, das aus der Komplementierung resultiert, akzeptabel ist. Das unentbehrliche Erfordernis für diese Hintergrundaktivität ist, daß sie sich von der Aktivität in Gegenwart der nachweisbaren Analytgrenze unterscheiden läßt.
  • Nach der Zugabe der Probe können nach dem Inkubieren eine oder mehrere zusätzliche Ablesungen vorgenommen werden, wobei der Intervall von etwa 1 Minute bis zu etwa 1 Stunde, üblicherweise etwa 5 Minuten bis etwa 15 Minuten zwischen den Ablesungen variiert. Es kann zwar eine einzelne Ablesung vorgenommen werden, aber üblicherweise ist es wünschenswert, mehr als eine Ablesung vorzunehmen, sodaß übliche Fehler ausgeschaltet werden können. Vorzugsweise werden Standardlösungen aus bekannten Analytkonzentrationen hergestellt, um als Standards für den Vergleich mit der Probe zu dienen. Auf diese Weise können präzise quantitative Bestimmungen erhalten werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Set, das Reagenzien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält. Das Set umfaßt in zumindest einem Behälter, üblicherweise in getrennten Behältern, einen β-Galactosidase-Enzymdonorkomplex und einen -Enzymakzeptorkomplex. Der/die Behälter von Enzymdonorkomplex und Enzymakzeptorkomplex kann/können zusätzlich Enzymsubstrat enthalten, oder Enzymsubstrat kann getrennt bereitgestellt sein. Alternativ dazu können die Sets eine solche Konfiguration haben, daß sie ED und EA ohne ihre jeweiligen Bindungsgruppen getrennt an Bindungselementen befestigt aufweisen. Nach dem Befestigen bestimmter Bindungsgruppen an den ED- und EA-Bindungselementen des Sets kann der gewünschte interessierende Analyt einem Assay unterzogen werden.
  • Das folgende Beispiel dient der Veranschaulichung und nicht der Einschränkung der vorliegenden Erfindung.
    • BEISPIEL Assayprinzip
  • Zwei Latexpräparate wurden in diesem Assayformat für die Messung von hCG (menschlichem Choriongonadotropin) verwendet. Ein Latexpräparat wurde mit ED (Enzymdonor) und MAb (monoklonalem Antikörper) an α-Untereinheit von hCG latexgekoppelt und das andere Latexpräparat wurde mit EA (Enzymakzeptor) und MAb an β-Untereinheit von hCG latexgekoppelt. Das Gemisch aus den Latexpräparaten ergibt keine Umsetzung oder Assayhintergrund, wenn im Assay kein Antigen (hCG) vorhanden ist. Bei verschiedenen Antigenkonzentrationen im Assay wurden ED und EA zusammengebracht, um durch Antigen-Antikörper-Bindung aktives Enzym zu bilden, wodurch Enzymaktivität proportional zur Antigenkonzentration auftrat. Eine Assay- Eichkurve wurde aus dem Assay-Absorptionsvermögen bei verschiedenen Antigenkonzentrationen konstruiert, und der unbekannte hCG wurde unter Bezugnahme auf die Eichkurve gemessen.
    • Materialien
  • Carboxyl-modifizierter Latex (70 nm Durchmesser) in einer 15% Feststoffe enthaltenden Lösung wurde von Polymer Laboratories, Ltd., Essez Road, Church Stretton, U.K., erworben. Menschliches Chorion-Gonadotropin (hCG) wurde von Sigma Chemical Company erhalten. EDAC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid) und Sulfo- NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid) wurde bei Pierce Chemical Company gekauft. Monoklonale Antikörper gegen α- und β-Untereinheit von hCG wurden bei Medix Biochemica, Helsinki, Finnland, gekauft. CPRG (Chlorphenol-rot-β-Galactosidase) erhielt man bei Boehringer Mannheim. Enzymdonor und -akzeptor wurden hergestellt, wie in der US-PS-4,708,929 beschrieben. Andere Chemikalien wurden von der Sigma Chemical Company gekauft.
    • Latex konjugatpräparat 1. Latexaktivierung
  • 1 ml Latexlösung wurde unter Verwendung einer Amicon-Konzentratorvorrichtung mit 50 ml 0,1 M Natriumkarbonat, pH 9,6 gewaschen. Der Waschschritt wurde einmal wiederholt. Der Latex wurde dann zweimal jeweils mit 50 ml 0,02 M Natriumphosphat, pH 4,5, gewaschen. Der Latex wurde in 2ml 0,02 M Natriumphosphat, pH 4,5, erneut suspendiert, und einem gleichen Volumen an 2%iger EDAC im gleichen Puffer zugegeben. Das Gemisch wurde in einem Ende-zu-Ende-Mischer 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Ein gleiches Volumen an 3%igem Sulfo-NHS kann zugegeben werden, um die Kopplungseffizienz zu erhöhen. Nach dem Inkubieren wurde der aktivierte Latex zweimal jeweils mit 50 ml 0,2 M Boratpuffer, pH 8,5, gewaschen und dann in 4 ml des gleichen Puffers erneut suspendiert.
    • 2. Latexkopplung mit ED und MAb an α-Untereinheit von hCG
  • Ein Gemisch von 1,2 ml aus 1 mg ED4 und 1 mg MAb zu einer α-Untereinheit wurde zu 2 ml aktiviertem Latex dazugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC in einem End-zu-Ende-Mischer inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde der Latex zweimal jeweils mit 50 ml 0,2 M Boratpuffer, pH 8,5, gewaschen und dann in 2 ml des gleichen Puffers erneut suspendiert. Der Latexsuspension wurden 50 pl 0,25 Ethanolamin pro ml Lösung zugegeben, und das Gemisch wurde dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Latexlösung wurde zweimal mit 50 ml 0,2 M Boratpuffer, pH 8,5, gewaschen und in 5 ml des gleichen Puffers erneut suspendiert. Ein gleiches Volumen an Boratpuffer, das 2% Rinderserumalbumin (BSA), 2% L-Aspartyl-L- Phenylalaninmethylester und 0,2% PVP (Polyvinylpyrrolidon) enthielt, wurde der Latexsuspension zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert. Der Latex wurde zweimal mit 50 ml Boratpuffer gewaschen und bis zur Verwendung in 5 ml Lagerungspuffer (0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4, 0,15 M NACl, 1% BSA, 5% Glycerin und 0,1 % Natriumazid) bei 4ºC erneut suspendiert.
  • 3. Latexkopplung mit EA und MAb an β-Untereinheit von hCG
  • 1 ml von 5 mg Ovomucoid in 0,2 M Boratpuffer, pH 8,5, wurde zu 2 ml aktiviertem Latex zugegeben und das Gemisch bei 4ºC über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation wurden pro ml Latexsuspension 50 µl 0,25 M Ethanolamin zugegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und dann unter Verwendung einer Amicon-Konzentratorvorrichtung zwei mal jeweils mit 50 ml phosphatgepufferter Salzlösung (20 mM Natriumphosphat, pH 7,5, und 0,15 M NACl) gewaschen. Der Latex wurde mit 50 ml 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 4,5, gewaschen, und ein Endvolumen von 5 ml wurde behalten. Ein gleiches Volumen an 0,2 M Natriumperjodat in 0,1 M Natriumacetat, pH 4,5, wurde der Latexsuspension zugegeben. Das Gemisch wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur 20 Minuten lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde der Latex mit 30 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 4,5, und 30 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 6,5, gewaschen. Der Latex wurde dann in 5 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 6,5, erneut suspendiert. 1 ml Lösung, die 1 mg EA und 1 mg MAb zur 13-Untereinheit von hCG enthielt, wurde der Latexsuspension zugegeben. Festes Natriumcyanoborhydrid wurde sofort bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben und das Gemisch über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Latexsuspension wurde zweimal mit 50 ml 0,2 M Boratpuffer, pH 8,5, gewaschen und in 5 ml des gleichen Puffers erneut suspendiert. Ein gleiches Volumen an Boratpuffer, der 2% BSA, L-Aspartyl-L-Phenylalaninmethylester und 0,2% PVP enthielt, wurde der Latexsuspension zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert. Der Latex wurde mit 30 ml Boratpuffer gewaschen und bis zur Verwendung bei 4ºC in Lagerungspuffer (0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4, und 0,15 M NACl, 1% BSA, 5% Glycerin, und 0,1% Natriumazid) erneut suspendiert.
    • Assayverfahren
  • Für die HCG-Messung wurden zwei Verfahren eingesetzt. Vor dem Assay wurden beide Latexpräparate getrennt mit 50 ml EA-Puffer gewaschen und auf ein geeignetes Volumen erneut suspendiert. EA-Puffer besteht aus 60 mM MOPS-Puffer, pH 6,85, 200 mM NACl, 10 mM EGTA, 3% Ethylenglykol, 0,05% Tween 20, 0,05 mM DTT, 3 mM Magnesiumacetat und 0,1% Natriumazid.
    • 1. Verfahren 1
  • Verfahren 1 umfaßte die gleichzeitige Zugabe aller Reagenzien. Jeder Röhre wurden 20 µl Eichungsmittel (0, 500, 1000 und 2000 MlE/ml hCG) in menschlicher Serumbasis, 120 µl EA-Puffer, 20 µl EA/MAb/Latex (1 µl Latexäquivalent), 20 µl ED/MAb/Latex (1 µl Latexäquivalent) und 20 µl CPRG (1 mg/ml in EA-Puffer) zugegeben, und die Gemische Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden die Reaktionsgemische 10 Minuten lang in einer Microfuge bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt. Die verbleibenden Pellets wurden jeweils in 100 µl EA- Puffer erneut suspendiert und auf Mikrotiterplattennäpfe übertragen. Nach dem Mischen wurde das Absorptionsvermögen eines jeden Napfes bei 570 nm Wellenlänge unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesegeräts abgelesen.
    • 2. Verfahren 2
  • Verfahren 2 umfaßte die aufeinanderfolgende Zugabe von Substrat. Jeder Röhre wurden 20 µ1 Eichungsmittel (0, 1000 und 5000 mlE/ml hCG) in menschlicher Serumbasis, 10µl EA/MAb/Latex (1 µl Latexäquivalent) 10 µl ED/MAb/Latex (1 µl Latexäquivalent) und 100 µl EA-Puffer zugegeben und 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionsgemische wurden dann 6 Minuten lang bei 4ºC in einer Mikrofuge zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt. Die verbleibenden Pellets wurden jeweils mit 150 µl CPRG (1 mg/ml) in FA-Puffer erneut suspendiert und auf Mikrotiterplattennäpfe übertragen. Nach 60minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Absorptionsvermögen einer jeden Röhre unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesegeräts bei 570 nm Wellenlänge abgelesen.
    • Ergebnisse
  • Unter Einsatz von Verfahren 1 (gleichzeitige Substratzugabe) wurden die folgenden Ergebnisse erzielt. TABELLE 1
  • Aus den Ergebnissen kann eine Eichkurve für das HCG-Assay konstruiert werden. Die Farbentwicklung aufgrund der Bildung von aktivem Enzym aus zwei durch Antigen- Antikörper-Wechselwirkung zusammengebrachten Latexkonjugaten war proportional zur Konzentration von HCG im Assaysystem.
  • Wenn Verfahren 2 (aufeinanderfolgende Substratzugabe) angewandt wurde, wurden die folgenden Ergebnisse erzielt. TABELLE 2
  • Aus den obigen Ergebnissen geht hervor, daß das vorliegende Verfahren eine präzise, empfindliche und rasche Technik zum Nachweisen von Analytmengen, insbesondere in einem komplexen Gemisch, liefert. Die beobachtete Enzymaktivität ist proportional zur Analytmenge in der Probe. Das Verfahren eignet sich besonders gut für die Messung von Analyten mit hohem Molekulargewicht, die nicht leicht durch bekannte Assaytechniken gemessen werden können.

Claims (14)

1. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines Analyten mit Bindungsstellen fir zumindest zwei Bindungsgruppen in einer Probe unter Einsatz komplementärer Fragmente von β-Galactosidase, welche Fragmente als Enzymdonor (ED) und Enzymakzeptor (EA) definiert sind, die, wenn sie miteinander verbunden werden, aktive β-Galactosidase bilden, welches Verfahren umfaßt:
(a) das Bereitstellen eines ED-Komplexes, der ED umfaßt, der über ein erstes Bindungselement an eine erste Bindungsgruppe gebunden ist, sowie eines EA- Komplexes, der EA umfaßt, der über ein zweites Bindungselement an eine zweite Bindungsgruppe gebunden ist, worin die erste und die zweite Bindungsgruppe für Bindungsstellen auf dem Analyten spezifisch sind und der ED-Komplex und der EA- Komplex daran gehindert werden, in Abwesenheit des Analyten aktives Enzym zu bilden,
(b) das In-Kontakt-Bringen des ED-Komplexes und EA-Komplexes mit der Probe, und
(c) das In-Beziehung-Setzen des Vorhandenseins des Analyten in der Probe mit der Bildung von aktivem Enzym.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der ED-Komplex, der EA-Komplex und die Probe mit einem Enzymsubstrat in Kontakt gebracht werden, das bei der Umsetzung mit β- Galactosidase ein meßbares Produkt liefert, das durch die Umsetzung des Enzymsubstrats und des aktiven Enzyms gelieferte, meßbare Produkt gemessen wird und die Menge des Analyten in der Probe durch Vergleichen der Menge an meßbarem Produkt mit jener aus einer bekannten Analytmenge gebildeten ermittelt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Analyt ein Polypeptid ist.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, worin der Analyt ein Molekulargewicht von zumindest 5.000 aufweist.
5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, worin der Analyt ein Molekulargewicht von zumindest 10.000 aufweist.
6. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Analyt eine Nukleinsäure ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Bindungsgruppen Antikörper sind.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 6, worin die Bindungsgruppen Nukleinsäuren sind.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das erste und das zweite Bindungselement Latexperlen sind.
10. Set zur Verwendung beim Nachweisen des Vorhandenseins eines Analyten mit Bindungsstellen für zumindest zwei Bindungsgruppen in einer Probe unter Einsatz komplementärer Fragmente von β-Galactosidase, welche Fragmente als Enzymdonor (ED) und Enzymakzeptor (EA) definiert sind, und in gebundenem Zustand aktive β- Galactosidase bilden, welches Set umfaßt:
einen ED-Komplex, der ED umfaßt, der über ein erstes Bindungselement an eine erste Bindungsgruppe gebunden ist, und
einen EA-Komplex, der FA umfaßt, der über ein zweites Bindungselement an eine zweite Bindungsgruppe gebunden ist, worin die erste und die zweite Bindungsgruppe für Bindungsstellen auf dem Analyten spezifisch sind und der ED-Komplex und der EA-Komplex daran gehindert werden, in Abwesenheit des Analyten aktives Enzym zu bilden.
11. Set nach Anspruch 10, das weiters ein Enzymsubstrat umfaßt, das bei Umsetzung mit β-Galactosidase ein meßbares Produkt liefert und die Bestimmung der Menge des Analyten in der Probe durch Vergleich mit der aus einer bekannten Analytmenge gebildeten Menge an meßbarem Produkt ermöglicht.
12. Set nach Anspruch 10 oder 11, worin die Bindungsgruppen Antikörper sind.
13. Set nach Anspruch 12, worin die Antikörper monoklonale Antikörper sind.
14. Set nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin das erste und das zweite Bindungselement Latexperlen sind.
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