DE69220080T2

DE69220080T2 - Reagenzzusammensetzung in form von benutzer-einheiten für spezifische bindungstests

Info

Publication number: DE69220080T2
Application number: DE69220080T
Authority: DE
Inventors: Sharon Devereaux
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1991-10-11
Filing date: 1992-09-22
Publication date: 1997-12-11
Anticipated expiration: 2012-09-23
Also published as: CA2120701A1; EP0609265A4; US6267969B1; ES2103969T3; JP3290660B2; WO1993007461A2; EP0609265B1; JP2002504985A; EP0609265A1; DE69220080D1

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Gebiet der Erfindung.

Die Erfindung handelt im allgemeinen von dem Gebiet der Assay-Reagenzien und von deren Verwendung in diagnostischen Assays. Insbesondere handelt die vorliegende Erfindung von lyophilisierten Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzungen, die besonders vorteilhaft bei diagnostischen Assays sind.

2. Beschreibung der zugrundeliegenden Technik.

Verschiedene analytische Verfahren werden normalerweise in diagnostischen Assays zum Nachweis des Vorhandenseins und/oder zur Bestimmung der Menge an interessierenden oder klinisch signifikanten Substanzen in Testproben wie Körperflüssigkeiten eingesetzt. Diese klinisch signifikanten oder interessierenden Substanzen werden für gewöhnlich als Analyte bezeichnet. Diagnostische Assays sind zu einem unentbehrlichen Mittel zum Nachweis von Analyten in Testproben geworden, indem die wechselseitige Reaktion zwischen dem Analyt und einem spezifisch bindenden Glied verwendet wird, wofür die Immunreaktion zwischen einem Antigen und einem Antikörper gegen dieses Antigen als typisches Beispiel dient.
Kommerziell erhältliche Testvorrichtungen für die Ausführung von spezifischen Bindungsassays bestehen normalerweise aus einem Testkit mit abgepackten Kombinationen von Behältern, die einzelne Lösungen der Reagenzien enthalten, die für die Ausführung des Assays benötigt werden. Zur Ausführung der gewünschten Assaytechnik werden aliquote Anteile solcher Reagenzlösungen von Hand oder instrumentell in einem Reaktionsgefäß mit der Testprobe zusammengebracht. Bei Reagenzaufgabe von Hand erfordert der Assay die Arbeitszeit und die Erfahrung einer technisch versierten Fachkraft, bei instrumenteller Reagenzaufgabe sind die Anschaffungs- und Wartungskosten für eine Dispenservorrichtung erforderlich.
Testvorrichtungen mit einer mit Reagenz imprägnierten festen Phase wurden für spezifische Bindungsassays entwickelt, um die Notwendigkeit des Reagenzabmessens und der Aufgabe der einzelnen Reagenzien zu beseitigen. Zu den für gewöhnlich verwendeten Festphasenvorrichtungen dieses Typs gehören Tauchstäbe, Teststreifen, Gefäße und Durchflußvorrichtungen, worin die meisten oder alle erforderlichen Reagenzien innerhalb der festen Phase enthalten sind. Die Assayreagenzien werden im allgemeinen aufgebracht und auf der festen Phase getrocknet, um reaktive Stellen zu bilden.
Tauchstabvorrichtungen umfassen im allgemeinen einen Plastikstreifen mit einem Überzug aus reagenzenthaltender Matrix. Typischerweise wird eine Testprobe auf die Vorrichtung aufgegeben, und das Vorhandensein von Analyt wird durch eine Reaktion in der Matrixschicht zwischen dem Analyt und dem Assayreagenz angezeigt, die ein sichtbares nachweisbares Signal wie eine Farbbildung hervorruft. Hochstrasser (U.S. Pat. 4.059.407) offenbart eine Tauchstabvorrichtung, die in ein biologisches Fluid eingetaucht wird, um Analyt in dem Fluid nachzuweisen. Ebenfalls interessant im Bereich der Tauchstabvorrichtungen sind die U.S. Patente Nr. 3.802.842, 3.915.639 und 4.689.309 und WO Nr. 8.600.670.
Als Beispiele für Teststreifenvorrichtungen seien die Vorrichtungen von Deutsch et al. genannt, zu denen chromatographische Teststreifen (U.S. Pat. Nr. 4.094.647, 4.235.601 und 4.361.537) gehören. Die typische Vorrichtung besteht aus einem Material, das in der Lage ist, eine Lösung durch Kapillarwirkung, d.h. Dochtwirkung, zu befördern. Verschiedene Bereiche oder Zonen auf dem Streifen enthalten die Assayreagenzien, die für die Bildung eines nachweisbaren Signals beim Transport von Analyt zu oder durch diese Zonen benötigt werden. Die Vorrichtung eignet sich für chemische Assays ebenso wie für Bindungsassays, für die die Bindungsreaktion zwischen einem Antigen und einem komplementären Antikörper als typisches Beispiel dienen soll. Viele Varianten der Deutsch-Vorrichtung sind offenbart worden. Ebenfalls interessant auf dem Gebiet der Teststreifen sind die U.S. Patente Nr. 4.168.146, 4.298.688, 4.435.504, 4.461.829, 4.517.288 und 4.740.468; die Europäischen Patentveröffentlicheungen Nr. 88.636, 259.157 und 267.006 und das Deutsche Patent Nr. 3.445.816.
Durchflußvorrichtungen enthalten im allgemeinen ein poröses Material, in dem ein immobilisiertes Assayreagenz eingelagert ist. Testprobe wird aufgebracht und fließt durch das poröse Material, und der Analyt in der Probe reagiert mit dem Reagenz und bildet einen immobilisierten Komplex, der danach auf dem porösen Material nachgewiesen werden kann. Tom et al. (U.S. Pat. Nr. 4.366.241) offenbaren ein saugfähiges Material mit einer immunsorbierenden Zone, die einen immobilisierten analytspezifischen Antikörper enthält, auf die die Testprobe direkt aufgebracht wird. Andere Durchflußvorrichtungen sind beschrieben in den U.S. Patenten Nr. 3.825.410, 3.888.629, 4.446.232, 4.587.102, 4.632.901, 4.637.978 und 4.727.019 und den Europäischen Patentveröffentlichungen Nr. 212.603, 217.403 und 249.851.
Bisher bekannte Bindungsassayvorrichtungen werden allgemein als schwer herzustellen angesehen. Typischerweise werden die Reagenzien einzeln auf die feste Phase aufgebracht, um reaktive Stellen auszubilden, indem sie nach jeder Zugabe auf der festen Phase getrocknet werden, d.h. der Hersteller muß die für die Assays notwendigen Meß- und Dispensionsfertigkeiten zur Verfügung stellen. Die Tauchstab-, Teststreifen- und Durchflußvorrichtungen sind ebenfalls kompliziert, da die chemischen oder physikalischen Reaktionen in der festen Phase stattfinden, wenn die Testprobe durch die feste Phase fließt oder sich an ihr entlang bewegt, und deshalb muß die feste Phase so ausgelegt sein, daß sie die geeigneten Inkubations- und Reaktionszeiten für jede reaktive Stelle ermöglicht. Desweiteren müssen solche Vorrichtungen, wenn sie hergestellt werden, mit den Reagenzien versetzt werden, die für den nachzuweisenden Analyten spezifisch sind. Dies führt zu der Notwendigkeit, die Produktionstechniken für jeden interessierenden Analyt zu ändern. Darüberhinaus unterliegen die Reagenzien, die durch direktes Aufbringen und Trocknen in die feste Phase eingebaut werden, während der Lagerung der Vorrichtung Veränderungen in der Stabilität.

Zusammenfassung der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung umfaßt Reagenzzusammensetzungen für spezifische Bindungsassays und Verfahren für deren Herstellung. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verwendungseinheits-Reagenzzusammmensetzungen für spezifische Bindungsassays bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die, stabile Reagenzzusammensetzungen bereitzustellen, die über ausgedehnte Zeiträume unter Lagerbedingungen aufbewahrt werden können. Die neuartigen Reagenzzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können mit der Testprobe umgesetzt werden, und die resultierenden interessierenden Bindungskomplexe können aus dem Reaktionsgemisch durch jedes geeignete Abtrennungsmittel für den nachfolgenden Nachweis entfernt werden. Die neuartigen Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzungen beseitigen die Notwendigkeit des Abmessens und Aufbringens der einzelnen Reagenzien während der Assaydurchführung. Darüberhinaus verfügen die Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung über eine gesteigerte Stabilität bei der Langzeitlagerung.
Die Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzung für einen spezifischen Bindungsassay enthält wenigstens ein Assayreagenz, wobei das Reagenz ein spezifisch bindendes Glied in einer ausreichenden Menge für die Durchführung eines einzelnen Bindungsassays umfaßt, und ein poröses Material. Das Assayreagenz wird im porösen Material eingelagert, und das poröse Material wird danach beschichtet oder mit einer Trägermatrix eingekapselt. Die Trägermatrix wird dann getrocknet, wodurch das Assayreagenz stabilisiert wird. Die Trägermatrix kann durch Kontakt mit einem Lösungsmittel rekonstituiert werden und dabei das Assayreagenz aus dem porösen Material freisetzen. Die formbare Trägermatrix besteht typischerweise aus Gelatine wie Kalbshautgelatine, Fischgelatine, Schweinehautgelatine oder einer pflanzlichen Gelatine.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bildung einer Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzung für einen spezifischen Bindungsassay. In dem Verfahren wird ein Assayreagenz mit einer Trägermatrixlösung zusammengegeben, wobei ein Gemisch gebildet wird. Ein aliquoter Anteil der Mischung wird auf ein poröses Material aufgebracht und abgekühlt oder trocknen gelassen. Das poröse Material wird dann lyophilisiert. Nach Kontakt mit einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. einer Testprobe, rehydratisiert die Zusammensetzung und setzt das Assayreagenz für eine spezifische Bindungsreaktion frei.

Eingehende Beschreibung der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzung und Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung. Die Reagenzzusammensetzung kann über einen längeren Zeitraum bei Raumtemperatur gelagert werden und von einer technischen Fachkraft aufgebracht werden, ohne daß mehrere Reagenzabmessungen und Zugaben zu dem Reaktionsgefäß oder der Testvorrichtung erforderlich sind.
Bevor die Beschreibung der verschiedenen Ausführungen der vorliegenden Erfindung fortgesetzt wird, werden einige Begriffe definiert. Einige Assaytechniken, in denen die Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, werden ebenfalls beschrieben.

I. DEFINITIONEN

Der Ausdruck "spezifisch bindendes Glied", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein Glied eines spezifischen Bindungspaars, das aus zwei verschiedenen Molekülen besteht, wobei ein Molekül chemisch oder physikalisch spezifisch an das zweite Molekül bindet. Neben spezifischen Bindungspaaren aus Antigen und Antikörper bestehen weitere spezifische Bindungspaare aus Biotin und Avidin, Kohlenhydraten und Lectinen, komplementären Nucleotidsequenzen (einschließlich Sonden- und Einfangnucleinsäuresequenzen in DNA- Hybridisierungsassays zur Bestimmung einer Zielnucleinsäuresequenz), komplementären Peptidsequenzen, Effektor- und Rezeptormolekülen, Enzymcofaktoren und Enzymen, Enzyminhibitoren und Enzymen und dergleichen. Darüberhinaus können spezifische Bindungspaare Glieder enthalten, die Analoga des eigentlichen spezifisch bindenden Gliedes sind. Zum Beispiel kann ein Derivat oder Fragment des Analyts, d.h. ein Analyt- Analogon, verwendet werden, so lange es mindestens ein Epitop mit dem Analyten gemeinsam hat.
Zu den immunreaktiven spezifisch bindenden Gliedern gehören Antigene, Haptene, und Teile oder Komplexe davon, einschließlich solcher, die durch rekombinante DNA-Methoden, Fragmentierungsmethoden oder Peptidsynthesen gebildet werden. Typischerweise besitzt das immunreaktive spezifisch bindende Glied die Fähigkeit, entweder an den Analyt wie in einem Sandwich-Assay, an das Einfangreagenz wie in einem kompetitiven Assay oder an ein spezifisch bindendes Hilfsglied wie in einem indirekten Assay zu binden. Wenn ein Antikörper verwendet wird, kann es sich um einen monoklonalen Antikörper, einen polyklonalen Antikörper, ein Antikörperfragment, einen rekombinanten Antikörper, ein Gemisch hieraus oder eine Mischung aus einem Antikörper und anderen spezifisch bindenden Gliedern handeln. Die Einzelheiten der Präparation solcher Antikörper und deren Eignung für die Verwendung als spezifisch bindende Glieder sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
Der Ausdruck "Analyt", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet die interessierende Substanz in einer Testprobe, die in einem Assay nachgewiesen oder gemessen werden soll. Der Analyt kann jede Substanz sein, für die ein natürlich vorkommendes spezifisch bindendes Glied (z.B. ein Antikörper) existiert, oder für die ein spezifisch bindendes Glied hergestellt werden kann. Der Analyt kann an ein oder mehrere spezifisch bindende Glieder in dem Assay gebunden werden. Unter "Analyt" fallen auch alle antigenen Substanzen, Haptene, Antikörper und Kombinationen hieraus. Zu den interessierenden Analyten gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Proteine, Peptide, Aminosäuren, Hormone, Steroide, Vitamine, Drogen einschließlich solcher, die für therapeutische Zwecke verabreicht werden, sowie solcher, die illegal eingenommen werden, ein Bakterium, ein Virus und Metabolite von oder Antikörper gegen irgendeine der oben genannten Substanzen.
Der Ausdruck "Indikatorreagenz", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen nachweisbaren Marker, der direkt oder indirekt an ein spezifisch bindendes Glied gebunden ist. Der Marker kann vor dem Assay oder während der Ausführung eines Assays an das spezifisch bindende Glied gebunden werden. Das Indikatorreagenz erzeugt ein nachweisbares Signal, das zum Vorhandensein oder der Menge an Analyt in der Testprobe in Bezug steht. Im allgemeinen wird das Indikatorreagenz nachgewiesen oder gemessen, nachdem es auf einer festen Phase eingefangen worden ist, aber auch ungebundenes Indikatorreagenz kann nachgewiesen oder gemessen werden, um das Ergebnis eines Assays zu bestimmen. Das spezifisch bindende Glied des Indikatorreagenzes kann ein Glied von jedem spezifischen Bindungspaar sein, einschließlich Immunreaktanten. Der Marker des Indikatorreagenzes ist in der Lage, ein visuell oder mit instrumentellen Mitteln nachweisbares Signal zu erzeugen. Eine Vielzahl von verschiedenen Indikatorreagenzien kann durch Variation entweder des Markers oder des spezifisch bindenden Glieds gebildet werden.
Der Ausdruck "Marker", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jede Substanz, die an ein spezifisch bindendes Glied gebunden ist oder wird, und die die Fähigkeit besitzt, ein Signal zu erzeugen, das visuell oder instrumentell nachgewiesen werden kann. Zu diesen Markern gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Chromogene, Katalysatoren, fluoreszente Verbindungen, chemilumineszente Verbindungen, radioaktive Marker, direkt sichtbare Marker, einschließlich kolloidaler Metalle, nicht-metallische Partikel, Farbpartikel, Enzyme oder Substrate, sowie organische polymere Latexpartikel, Liposome oder andere Vesikel, die signalproduzierende Substanzen und dergleichen enthalten. Die Auswahl eines bestimmten Markers ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch, jedoch sollte der Marker die Fähigkeit besitzen, ein nachweisbares Signal entweder selbst zu erzeugen oder in Verbindung mit einer oder mehreren weiteren Substanzen, wie in einem signalproduzierenden Enzym/Substrat-System.
Der Ausdruck "Signalproduzierendes System", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine Gruppe von Assayreagenzien, die benötigt wird, um das gewünschte Reaktionsprodukt oder Signal zu bilden. Zum Beispiel können ein oder mehrere signalproduzierende Verbindungen verwendet werden, um mit einem Marker zu reagieren und das nachweisbare Signal zu erzeugen. Wenn zum Beispiel der Marker ein Enzym ist, erhält man eine Verstärkung des nachweisbaren Signals durch die Enzymreaktion mit einem oder mehreren Substraten oder weiteren Enzymen unter Bildung eines nachweisbaren Reaktionsprodukts. "Nachweisbares Signal", wie hierin verwendet, wird im weitesten Sinne verstanden als jede beobachtbare Änderung eines Systemparameters, wie eine Änderung eines Reaktanten oder das Erscheinen eines Reaktanten, ein beobachtbarer Niederschlag einer beliebigen Komponente in der Testprobe oder eine Änderung eines anderen Parameters, die direkt durch visuelle Beobachtung oder mit instrumentellen Mitteln festgestellt werden kann.
Der Ausdruck "Einfangreagenz", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein spezifisch bindendes Glied, das entweder für den Analyt, wie in einem Sandwich-Assay, für das Indikatorreagenz und den Analyten, wie in einem kompetitiven Assay oder für ein spezifisch bindendes Hilfsglied, das seinerseits für den Analyten spezifisch ist, wie in einem indirekten Assay, spezifisch ist. Daher kann das spezifisch bindende Glied jedes Molekül sein, das die Fähigkeit besitzt, spezifisch an ein anderes zu binden, genau wie bei den spezifisch bindenden Gliedern des Indikatorreagenzes. Bei einem Festphasenassay ist das Einfangreagenz direkt oder indirekt an ein im wesentlichen festes Material gebunden. Die feste Phase erleichert die Trennung des Analyten und/oder der Assayreagenzien oder deren Komplexen, die von der Probenlösung abzutrennen sind. Typischerweise ist die Anlagerung des spezifisch bindenden Glieds an das Festphasenmaterial im wesentlichen irreversibel und kann kovalente oder nicht- kovalente Mechanismen umfassen. Das Einfangreagenz kann durch Adsorbtion direkt an die Festphasenpartikel angelagert sein, jedoch wird das Einfangreagenz vorzugsweise indirekt an die feste Partikel über ein Quervernetzungsagens gebunden. Das Quervernetzungsagens wird vorzugsweise gewählt aus Glutaraldehyd, Formaldehyd, Glyoxal, Acrolein und Acetaldehyd. Am besten wird das Einfangreagenz über ein Sensibilisierungsverfahren unter Verwendung von Glutaraldehyd kovalent an die Partikel gebunden.
Der Ausdruck "spezifisch bindendes Hilfsglied", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet jedes Glied eines spezifischen Bindungspaars, das in dem Assay zusätzlich zu den spezifisch bindenden Gliedern von Eingangreagenz und Indikatorreagenz verwendet wird, um das Vorhandensein oder die Menge an Analyt in der Testprobe zu bestimmen. Eines oder mehrere spezifisch bindende Hilfsglieder können bei einem Assay verwendet werden. Beispielsweise kann ein spezifisch bindends Hilfsglied die Fähigkeit besitzen, den Analyt zu binden oder ein zweites spezifisch bindendes Glied, an das sich der Analyt selbst nicht anlagern kann.

II. DIAGNOSTISCHE ASSAYS

Die neuartigen Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden vorteilhafterweise in einer Vielzahl von Immunoassayformaten verwendet. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf Immunoassays beschränkt. Jede Assaykonfiguration, die spezifisch bindende Glieder und einen nachweisbaren Marker verwendet, kann unter Verwendung der Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzungen durchgeführt werden, jedoch werden zur Vereinfachung der Offenbarung Immunoassayformen hierin beschrieben.
Bindungsassays sind im allgemeinen in einer von zwei Hauptklassen kategorisiert, und zwar in homogene und heterogene Assays. In einem homogenen Assay bilden der Analyt und die Assayreagenzien eine Probelösung und werden vor der Bestimmung des Signals, das von dem Indikatorreagenz produziert wird, getrennt. Bei einem heterogenen Assay wird entweder eine feste Phase verwendet, die die Trennung von gebundenen und ungebundenen Reaktionskomponenten ermöglicht, oder ein Reagenz der Initiallösung wird ausgefällt und anschließend aus der Probenlösung entfernt. Diese Assays können weiter unterteilt werden in Sandwich-Assays und kompetitive Assays und in Varianten hiervon.
Schematische Darstellungen von Beispielen mehrerer solcher Assaytypen sowohl für Antigen- als auch Antikörperanalyte werden nachfolgend aufgeführt. Es versteht sich jedoch von selbst, daß sich der Fachmann viele weitere Assaytypen vorstellen kann, zu denen Assays für andere Analyte als Antigene oder Antikörper gehören, auf die die Konzepte der vorliegenden Erfindung angewendet werden können.

Heterogene Assays

1. Direkter Assay

Das spezifisch bindende Glied des Indikatorreagenzes kann das gleiche spezifisch bindende Glied wie das Einfangreagenz sein oder nicht. Antigen- und Antikörperanalyte sind unter Verwendung des vorgenannten Reaktionsschemas bestimmbar. Zu den Varianten des Reaktionsschemas gehören die folgenden, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein:

2. Indirekter Assay

In dieser Gruppe von Assays wird ein zusätzliches spezifisch bindendes Glied zusammen mit denen von Indikator- und Einfangreagenz verwendet, um den nachweisbaren Bindungskomplex zu bilden. Zum Beispiel kann ein spezifisch bindendes Hilfsglied verwendet werden, wobei das Indikatorreagenz spezifisch an das spezifisch bindende Hilfsglied bindet, das seinerseits an den Analyten bindet. Es ist manchmal auch wünschenswert, den Analyt direkt auf der festen Phase einzufangen.

3. Kompetitiver Assay

Zu den Beispielen für kompetitive Assayformate gehören folgende:
In diesen Beispielen besitzen sowohl der Analyt in der Testprobe als auch das spezifisch bindende Glied des Indikatorreagenzes die Fähigkeit, konkurrierend an das Einfangreagenz zu binden. Die Menge an so gebundenem Indikatorreagenz gibt die Menge an Analyt in der Testprobe wieder. Spezifische bindende Hilfsglieder können ebenfalls in kompetitiven Assays eingesetzt werden. Verallgemeinerte Beispiele von Sandwich-Assays und kompetitiven Assays, die die Reagenzzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwenden können, sind weiter unten dargestellt. Ausführliche Beschreibungen von Sandwich- Assayprozeduren unter Verwendung der Reagenzzusammensetzung der Erfindung werden in den nachfolgenden Beispielen dargestellt.
Ein Festphasen-Sandwich-Assay verwendet ein Einfangreagenz, d.h. ein spezifisch bindendes Glied, das an eine feste Phase angebunden ist. Das Einfangreagenz wird mit einer Testprobe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, und einem Indikatorreagenz mit einem zweiten spezifisch bindenden Glied, das markiert worden ist, zusammengebracht. Die Reagenzien und die Testprobe können gleichzeitig oder nacheinander zugesetzt werden, entweder einzeln oder in Kombination. Eine Bindungsreaktion führt zu der Bildung eines Einfangreagenz/Analyt/Indikatorreagenz-Komplexes, der auf der festen Phase immobilisiert ist. Der Assay kann auch den Schritt der Abtrennung des resultierenden Komplexes von überschüssigen Reagenzien und Testprobe enthalten. Der Komplex, der an dem Festphasenmaterial zurückgehalten wird, wird durch Untersuchung der festen Phase im Hinblick auf das Indikatorreagenz bestimmt. Wenn Analyt in der Probe vorhanden ist, befindet sich Marker auf dem Festphasenmaterial. Die Menge an Marker auf der festen Phase ist eine Funktion der Menge an Analyt in der Probe.
Die Reagenzsammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden vorteilhafterweise bei Sandwich-Assayformaten verwendet, einschließlich der Vorwärts-, Umkehr- und Simultantechnik. Typischerweise umfaßt ein Vorwärtsassay das In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit dem Einfangreagenz, gefolgt von einer bestimmten Inkubationszeit, auf die wiederum die Zugabe des Indikatorreagenzes folgt. Ein Umkehrassay umfaßt das Zusetzen des Indikatorreagenzes zu der Testprobe, gefolgt von der Zugabe des Einfangreagenzes nach einer bestimmten Inkubationszeit. Ein Simultanassay umfaßt einen einzigen Inkubationsschritt, da das Einfangreagenz und das Indikatorreagenz gleichzeitig mit der Testprobe zusammengebracht werden, z.B. wenn sowohl Einfangreagenz als auch Indikatorreagenz in einer Trägermatrix in einer Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingekapselt sind.
Zusätzlich kann die vorliegende Erfindung in einem indirekten Sandwich-Assay mit der Bildung eines Komplexes aus Einfangreagenz/Analyt/Analyt-spezifisches bindendes Glied/Indikatorreagenz verwendet werden. In diesem Fall handelt es sich beim zusätzlichen analytspezifischen bindenden Glied um ein spezifisch bindendes Hilfsglied, das getrennt zugesetzt werden kann oder in der eingekapselten Reagenzzusammensetzung umfaßt ist.
Die Reagenzzusammenstzungen der vorliegenden Erfindung können auch in einem kompetitiven Assay verwendet werden. In einer kompetitiven Festphasenkonfiguration ist das Einfangreagenz wieder an das Festphasenmaterial gebunden und wird mit Testprobe sowie einem Indikatorreagenz zusammengebracht. Das Indikatorreagenz ist aus einem Analyt oder Analyt-Analogon ausgebildet, der/das markiert ist. Eine Bindungsreaktion findet statt und führt zu der Bildung von Komplexen aus (1) fester Phase:Einfangreaganz/Analyt-Komplex und aus (2) fester Phase:Einfangreagenz/Indikatorreagenz-Komplex. Beim kompetitiven Assay verhält sich die Menge an Marker auf der festen Phase umgekehrt zu der Menge an Analyt in der Probe. Daher führt eine positive Testprobe zu einer Signalabnahme. Zum Beispiel kann in einem Theophyllin-Assay ein Anti-Theophyllin- Antikörper (entweder ein monoklonales oder polyklonales Einfangreagenz) auf einem festen Träger immobilisiert sein. Eine Konkurrenz um die Bindung an diesen Antikörper kann zwischen einem Indikatorreagenz aus markiertem Theophyllin und unmarkiertem Theophyllin in der Testprobe herbeigeführt werden. Die Immunreaktion führt zu einem feste Phase:Einfangreagenz/Indikatorreagenz-Komplex, wenn Theophyllin oder ein bestimmter Schwellenwert für die Menge an Theophyllin nicht in der Probe vorhanden ist. Zunehmender Gehalt an Theophyllin in der Testprobe führt zur Abnahme von an die feste Phase gebundenem Indikatorreagenz.

Homogene Assays

Bei homogenen Assays ist keine Abtrennung der Probelösung von dem Indikatorreagenz vor Beobachtung des Indikatorreagenzes erforderlich. Zu dieser breiten Klassifizierung gehören viele Formate wie jene, die später beschrieben werden, sowie andere, die für den Fachmann unter Verwendung der neuartigen Reagenzzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung offensichtlich sind.
Eine Hauptkategorie von homogenen Assays sind die Agglutinations-Assays, die auch unter Verwendung der Reagenzzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden können. Agglutinationsreaktionen und deren Verfahrensweisen sind im allgemeinen gut bekannt. Eine typische Agglutinationsreaktion besteht aus dem Zusammenklumpen von Analyt in der Gegenwart eines analytspezifischen bindenden Glieds. Dieses Verklumpen oder Agglutinieren von Reaktionskomponenten wird überwacht, um das Vorhandensein oder die Menge des Analyts zu bestimmen, der nachgewiesen werden soll. Die Agglutinationsreaktion kann durch Markieren einer Reaktionskomponente, z.B. eines spezifisch bindenden Glieds, und Nachweis des Signals, das entweder mit den agglutinierten oder nicht agglutinierten Reagenzien verbunden ist, überwacht werden. Der Nachweis ist visuell möglich durch Beobachtung der Klumpung des Reaktionsmediums, durch Absetzenlassen oder Pellettieren des Indikatorreagenzes in einem Gravitationsfeld, durch Änderungen der Lichtstreuung oder durch Änderung der Spektraleigenschaften des Indikatorreagenzes.

1. Direkter Assay

In einem direkten Agglutinationsassay können, wenn ein polyvalenter Analyt vorhanden ist, zwei oder mehrere spezifisch bindende Glieder an den Analyt binden, wodurch das Indikatorreagenz und der Analyt zur Bildung eines Aggregats gezwungen werden. Eine zunehmende Aggregation kann eine Zunahme der Menge an Analyt in der Testprobe anzeigen. Die mit Einfangreagenz überzogene Partikel kann auch als nachweisbarer Marker dienen. Zum Beispiel kann die mit Reagenz überzogene Partikel ein farbiges Teilchen sein, das den Nachweis von Partikelagglomeraten in Agglutionationsassays erleichtert.

2. Indirekter/Kompetitiver Assay

Ein indirekter Agglutinationsassay kann unter Verwendung eines bindenden Hilfsglieds aufgebaut werden, das mit dem Analyt um die Bindung an das Indikatorreagenz konkurriert. Eine solche Assaykonfiguration ist besonders hilfreich bei der Analyse eines monovalenten Analyten. In diesem Assay ist mehr als ein bindendes Hilfsglied an ein unlösliches Material gebunden und wird mit dem Indikatorreagenz und der Testprobe zusammengebracht. Wenn der Analyt fehlt oder seine Konzentration unterhalb eines Schwellenwertes liegt, dann kommt es zu Agglutination infolge der Bindung von mehr als einem Indikatorreagenz an das unlösliche Material. Wenn der Analyt in der Testprobe vorhanden ist, lagert sich der Analyt konkurrierend an das Indikatorreagenz an und blockiert dabei die Bindung des Indikatorreagenzes an das unlösliche Material, und das Vorhandensein von Analyt wird durch eine Abnahme der Agglutination des Indikatorreagenzes angezeigt.

III. LYOPHILISIERTE REAGENZZUSAMMENSETZUNGEN

Die vorliegende Erfindung umfaßt die Einkapselung einer mit Einfangreagenz beschichteten Partikel oder von Partikeln in einer Trägermatrix, die vorteilhafterweise verwendet wird, um die Reagenzzusammensetzung in der Menge aufzubringen, wie sie für einen einzelnen Assay benötigt wird. Vorzugsweise können das Trägermatrixmaterial und die eingekapselten Reagenzien lyophilisiert sein. Die lyophilisierte Reagenzzusammensetzung wird während der Durchführung des diagnostischen Assays rehydratisiert, wodurch das/die Assayreagenz(ien) freigesetzt werden. Die Assayreagenzien können in der Verwendungseinheits- Reagenzzusammensetzung enthalten sein für die Ausbildung verschiedener Nachweis- oder Meßformate einschließlich Sandwich- Assays, kompetitiver Assays und Agglutinationsassays, wobei alle oder die meisten für den Assay benötigten Reagenzien vorzugsweise in der Trägermatrix enthalten sind. Die Lyophilisierung der Reagenzzusammensetzung ist bei der vorliegenden Erfindung nicht kritisch, es wurde jedoch herausgefunden, daß sie die Reagenzstabilität steigert und die Handhabung und Verpackung der Reagenzzusammensetzungen erleichtert. Die neuartigen Reagenzzusammensetzungen können in Diagnosegeräten anstelle von mehreren flüssigen Reagenzien verwendet werden, oder sie können in manuellen Assayvorrichtungen verwendet werden, wobei sie eine einzige Zugabe von Assayreagenzien durch den Anwender ohne die Notwendigkkeit ermöglichen, die Menge dieser Reagenzien abmessen zu müssen.
Die Trägermatrix kann jede Substanz umfassen, in die ein oder mehrere spezifisch bindende Assayreagenzien eingelagert werden können. In einer Ausführung ist die Trägermatrix ein formbares Material, das die Verwendung von einzelnen Formhöhlungen für die Ausbildung von einzeln geformten Einheiten ermöglicht, die ausreichende aliquote Anteile an Reagenzien für einen einzelnen Assay enthalten. Alternativ ermöglicht die Trägermatrix die Bildung von Platten oder ähnlichen Massen, die aus einer einzelnen Formhöhlung herausgelöst werden können, die dann wiederum in Verwendungseinheitsblöcke oder -zapfen geteilt oder aufgetrennt werden können. In allen Fällen können die Einheiten dann lyophilisiert werden, und man erhält eine getrocknete Reagenzzusammensetzung mit hoher struktureller Integrität. Bei einer anderen Ausführungsform kann die Trägermatrix dazu verwendet werden, eine geeignete Menge an Assayreagenz auf ein saugfähiges Material, das Teil einer Assayvorrichtung ist, aufzubringen oder darin einzulagern. Zum Beispiel kann ein Indikatorreagenz in einer Trägermatrix auf ein poröses Filter aufgebracht werden, wodurch das Reagenz eingeschlossen wird. Durch die Zugabe einer flüssigen Testprobe auf das poröse Filter wird das Assayreagenz von der Trägermatrix für eine Reaktion mit der Testprobe oder anderen Assayreagenzien freigesetzt. Bei noch einer weiteren Ausführungsform kann das so freigesetzte Assayreagenz auch vom porösen Material zu einem anderen Teil der Assayvorrichtung wandern.
Geeignete Materialien für die Trägermatrix sind aus Substanzen gewählt, die bei Zugabe einer Testprobe oder eines anderen geeigneten Lösungsmittels rehydratisiert werden, die jedoch bezüglich der Assayreagenzien inert sind, und die getrocknet oder lyophilisiert werden können. Es wird bevorzugt, daß die Trägermatrix schnell rehydratisiert und gelöst wird, wenn sie mit dem Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, wodurch alle darin enthaltenen Assayreagenzien freigesetzt werden. Die gelöste Trägermatrix kann dann am Ende der Inkubationszeit des Assays weggewaschen werden.
Es wurde herausgefunden, daß Gelatine das geeignetste Trägermatrixmaterial ist. Zu den Gelatinquellen gehören Kalbshautgelatine und Schweinehautgelatine mit verschiedener Bloomzahl (Die Bloomzahl ist ein Indikator für die Stärke der produzierten Gele, wobei gilt, daß die Bloomzahl umso höher ist, je stärker das Gel ist). Fischgelatine und pflanzliche Gelatine können ebenfalls verwendet werden. Assayreagenzien werden einfach mit Gelatinelösungen gemischt, und die abgekühlte Gelatine bildet eine gelierte Masse, die einfach formbar ist. Die Einheiten der in Gelatine eingekapselten Reagenzzusammensetzungen können lyophilisiert werden, was zur Bildung eines getrocknetenn Proteins mit hoher struktureller Integrität führt. Die lyophilisierte Gelatine läßt sich schnell rehydratisieren und lösen, wenn sie mit einem Lösungsmittel in Kontakt gebracht wird, und sie setzt dabei alle in ihr enthaltenen Reagenzien frei, und die Gelatine kann weggewaschen werden.
Die Testprobe kann aus jeder beliebigen Quelle gewonnen werden, wie z.B. aus einer physiologischen Flüssigkeit einschließlich Blut, Speichel, Augenlinsenflüssigkeit, Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit, Schweiß, Harn, Milch, Ascites- Flüssigkeit, Schleim, Synovialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit, Fruchtwasser und dergleichen. Die Flüssigkeit kann vor der Verwendung vorbehandelt werden, z.B. durch Präparation von Plasma aus Blut, Verdünnen viskoser Fluide oder dergleichen. Zu den möglichen Behandlungsverfahren zählen Filtration, Destillation, Aufkonzentrierung, Inaktivierung interferierender Komponenten und die Zugabe von Reagenzien wie zusätzlicher Lösungsmittel. Neben physiologischen Flüssigkeiten können andere flüssige Proben wie Wasser, Nahrungsmittel und dergleichen verwendet werden. Zusätzlich kann ein Feststoff verwendet werden, sobald das Probenmaterial unter Ausbildung eines flüssigen Mediums abgewandelt worden ist.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Einfangreagenz an eine Vielzahl von Partikel, z.B. Mikropartikel, gebunden, die als Festphasenmaterial dienen. Die Partikel können von einem Fachmann auf diesem Gebiet aus jedem geeigneten partikelförmigen Material gewählt werden, einschließlich, jedoch nicht darauf eingeschränkt, solchem aus Polystyrol, Polyacrylamid, Polyurethan, Polymethylacrylat, Polypropylen, Polytetrafluorethylen, Polyacrylnitril, Polycarbonat oder ähnlichen Materialien. Bei einer Ausführungsform können die Partikel aus einem magnetischen oder magnetisierbaren Material ausgebildet sein oder ein solches enthalten, wodurch die Partikel aus einem Reaktionsgemisch durch Anlegen eines Magnetfelds entfernt werden können.
Die mit dem Einfangreagenz beschichteten Partikel werden in der Trägermatrix eingekapselt, die dann lyophilisiert werden kann. Die lyophilisierte Reagenzzusammensetzung wird während der Durchführung des Assays zur ursprünglichen Konzentration rückverdünnt, und die Trägermatrix setzt die mit dem Einfangreagenz beschichteten Partikel für eine Reaktion mit dem Analyt und dem Indikatorreagenz frei. Die Partikel können dann von der Probelösung abgetrennt werden. Zum Beispiel können die Partikel durch Zentrifugieren, Ausfällen, Agglutinieren, Anlegen eines Magnetfelds, Filtrieren oder Einschluß mit Hilfe eines weiteren Festphasengrundmaterials von der Probelösung abgetrennt werden. Zu den geeigneten Festphasengrundmaterialien gehören alle porösen, absorbierenden oder saugfähigen Materialien, mit denen die Partikel von der Probelösung für die Beobachtung abgetrennt werden können. Bevorzugte Festphasengrundmaterialien umfassen Glasfaser-, Cellulose- oder Nylonbäusche, durch die die Probelösung und ungebundene Reagenzien hindurchtreten können. Die Größe der Partikel ist nicht kritisch, obwohl der mittlere Durchmesser vorzugsweise kleiner als die mittlere Porengröße des Festphasengrundmaterials sein sollte.
Bei einer alternativen Ausführungsform ist das Einfangreagenz auf einer einzelnen Partikel immobilisiert, z.B. einem Kügelchen von etwa 6 mm (1/4") Durchmesser. In diesem Fall kann der Assay in einem Reaktionsgefäß wie einer Küvette, einer Mikrotiterplatte, einem Reagenzglas oder Plastiktestrohr durchgeführt werden, wovon die Probelösung, ungebundene Reagenzien und Waschlösungen entfernt werden können.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Indikatorreagenz sowie die mit Einfangreagenz überzogene Partikel in einer Trägermatrix eingekapselt. Es wurde herausgefunden, daß durch Einschluß eines Zuckeradditivs das Indikatorreagenz während des Lyophilisierungsvorgangs geschützt wird und die Stabilitätseigenschaften der Markerkomponente des Indikatorreagenzes gesteigert werden. Zum Beispiel wurde festgestellt, daß d-Trehalose-Dihydrat die beste stabilisierende Wirkung für Enzymmarker ergibt. Weitere vorteilhafte Zucker für die Produktion der Reagenzzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind Dextran, Lactose, Saccharose, Maltose, Xylose, Arabitol und Xylitol. Vorzugsweise ist das Zuckeradditiv in der Endzusammensetzung in einer Konzentration von etwa 0,1% bis etwa 50% vorhanden. In noch bevorzugterer Wesie beträgt die Konzentration des Zuckeradditivs etwa 0,1% bis etwa 20%.
Wie oben beschrieben können verschiedene Formen dazu verwendet werden, die gewünschte Trägermatrixeinheit zu bilden. Auch wenn nicht unbedingt erforderlich, so kann die Form mit einem Trennmittel vorbehandelt werden, um das Herauslösen der neu gebildeten Reagenzzusammensetzungseinheiten zu erleichtern. Die Vorbehandlung der Formen der vorliegenden Erfindung erfolgte typischerweise durch Beschichten oder leichtes Besprühen der Oberfläche der Form mit Lecithin.
Die Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzungen können luftgetrocknet oder lyophilisiert werden. Die Einzelheiten verschiedener Lyophilisierungsprozeduren sind dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt. Allgemein sollte das zu lyophilisierende Material unter seine eutektische Temperatur gebracht werden, bevor Vakuum angelegt wird. Bei wäßrigen Materialien sorgt eine Temperatur von weniger als -40º F für ein adäquates Einfrieren. Dies läßt sich erreichen durch Aussetzen der Vorrichtung gegenüber Trockeneis, Eintauchen der Vorrichtung in ein Trockeneis-Aceton-Bad oder Aussetzen der Vorrichtung gegenüber einer Gefrieroberfläche, die in vielen kommerziellen Gefriertrocknungsgeräten vorhanden ist. Das Vakuum, das an das Material angelegt wird, sollte groß genug sein, damit sichergestellt ist, daß das Wasser durch Sublimation entfernt werden kann.

Beispiele

Die folgenden Beispiele veranschaulichen, wie die neuartigen Reagenzzusammensetzungen der vorliegenden Erfindung hergestellt und wie Assayverfahren unter Verwendung dieser Reagenzzusammensetzungen durchgeführt werden können. Die Beispiele sollen jedoch nur illustrativ sein und sind nicht so auszulegen, daß sie den Schutzumfang der Erfindung einschränken, der alleinig durch die beigefügten Ansprüche definiert ist.

Beispiel 1

Präparation einer lyophilisierten Reagenzzusammensetzung für einen Carcinoembryonischen-Antigen-(CEA)-Enzym-Immunoassay

a) Präparation der Assayreagenzien

Zehn Gramm d-Trehalose-Dihydrat (Aldrich, Milwaukee, WI) und zwei Gramm Kalbshautgelatine (60 Bloom, Sigma, St. Louis, MO) wurden in destilliertem Wasser (etwa 10 ml) in einem 50 ml- Zentrifugenröhrchen aus Plastik mit Meßskala zusammengebracht. Das Volumen wurde mit destilliertem Wasser auf etwa 30 ml gebracht, und die Mischung durch Verwirbelung gemischt. Das Gemisch wurde durch Eintauchen des Glases in ein mit Wasser gefülltes Becherglas auf einer heißen Platte erhitzt. Das Wasser wurde zum Kochen gebracht. Das Gläschen wurde entfernt, und das Lösungsvolumen wurde mit destilliertem Wasser auf 50 Milliliter aufgefüllt und weiter vermischt. Die resultierende Lösung mit 4% Gelatine und 20% Trehalose wurde später mit einem Volumenteil pro Teil Testreagenz vermischt.
Die mit Einfangreagenz beschichteten Partikel umfaßten eine feste Mikropartikelphase aus Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose 4B (Sigma), beschichtet mit monoklonalem Anti-CEA- Maus-Antikörper (2 mg/ml). Die mit Einfangreagenz beschichteten Partikel wurden zu 5% in einem Pobeverdünnungspuffer [SDB; Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (Tris) mit Gentamicin als Konservierungsmittel] suspendiert. Das Indikatorreagenz war ein Konjugat aus Anti-CEA-Antikörper (Maus-monoklonal) und Merrettichperoxidase (HRPO) (150 ng/ml).
Eine Reagenzmischung wurde durch Kombination gleicher Volumina an suspendierten, mit Einfangreagenz beschichteten Partikeln und dem Indikatorreagenz (100 µl Indikatorreagenz pro 100 µl mit Einfangreagenz überzogenen Partikeln in SDB) ausgebildet. Die Reagenzmischung wurde dann mit einem gleichen Volumen an Trägermatrixlösung (200 µl Gelatinelösung pro 100 µl Indikatorreagenz und 100 µl mit Einfangreagenz beschichteten Partikeln in SDB) zur Bildung der Reagenzzusammensetzung kombiniert.

b) Lyophilisierung der Reagenzzusammensetzung

Die Trägermatrixform war eine 0,6 cm (1/4") dicke Plastikplatte mit einzelnen Vertiefungen von 0,9 cm (3/8"). Die Form wurde leicht mit Lecithin eingesprüht, um das Herauslösen der Reagenzzusammensetzungseinheiten zu erleichtern.
Ein aliquoter Anteil der Reagenzzusammensetzung (400 µl) wurde in jede Formvertiefung mit Hilfe einer Präzisionspipette aufgebracht. Die Form wurde einer Temperatur von -70ºC in einem Gefrierschrank etwa 3 Stunden lang ausgesetzt. Die Formen wurden dann auf -50ºC kalte Gefrierplatten überführt, wo sie 3,5 Stunden lang unter Vakuum gehalten wurden. Die Plattentemperatur wurde dann auf -35ºC angehoben und 16 Stunden lang beibehalten. Der Lyophilisierungszyklus wurde durch Sublimation bei einer Plattentemperatur von -10ºC für 5 Stunden, gefolgt von einer Temperatur von +30ºC für etwa 18 Stunden beendet. Die lyophilisierten Reagenzzusammensetzungseinheiten wurden aus der Form herausgenommen und in Glasgefäßen mit Silicagel als Trockenmittel aufbewahrt. Lagerung bei 4ºC sorgte für eine ausgedehnte Stabilität. Reagenzzusammensetzungen, die bei Raumtemperatur gelagert wurden, zeigten jedoch eine stabile Leistung bei nur geringen Leistungsunterschieden gegenüber Reagenzzusammensetzungen, die bei 4ºC aufbewahrt wurden, und eine bessere Leistung als flüssige Reagenzkontrollzusammensetzungen.

c) Akzeptierbarkeit der lypohilisierten Reagenzzusammensetzung im CEA-Assay

Eine Einheit der lyophilisierten Reagenzzusammensetzung wurde in ein Reaktionsgefäß mit Filter gebracht, das auf einer Temperatur von 40ºC gehalten und während der Inkubation für gesteigerte Assaykinetik rotiert werden konnte. Die lyophilisierte Reagenzzusammensetzung wurde mit einer Testprobe oder CEA-Assay-Standardlösung in dem Reaktionsgefäß zusammengebracht. Die CEA-Standardlösungen enthielt Proben von 0, 4, 24, 44 und 84 Nanogramm Antigen pro Milliliter Tris- Puffer. Die Testproben oder Standards und die lyophilisierte Reagenzzusammensetzung wurden bei 40ºC unter Rotation 20 Minuten lang inkubiert. Wenn CEA vorhanden war, wurde ein Einfangreagenz/Antigen/Indikatorreagenz-Komplex während der Inkubationszeit ausgebildet. Nach der Inkubation wurde das ungebundene Indikatorreagenz mit 0,9% Natriumchloridlösung oder phosphatgepufferter Salzlösung aus dem Reaktionsgefäß ausgewaschen; ein Waschlösungsvolumen von drei Milliliter wurde durch das Reaktionsgefäß geleitet, und dieser Vorgang wurde neunmal wiederholt.
Die Leistung der Reagenzzusammensetzung wurde durch Bestimmen der Menge an während der Inkubation gebildetem Einfangreagenz/Antigen/Indikatorreagenz-Komplex gemessen. Je mehr Antigen in der Testprobe vorhanden war, umso mehr ternärer Komplex wurde ausgebildet, und deshalb umso mehr Indikatorreagenz im Reaktionsgefäß zurückgehalten. Tetramethylbenzidin (TMB) wurde als farbbildendes Substrat verwendet, mit dem die HRPO des Indikatorreagenzes reagieren würde. Dreihundert Mikroliter TMB-Substrat wurden in jedes Reaktionsgefäß ausgegeben. Die Reaktionsgefäße wurden acht Minuten bei 40ºC unter Rotation inkubiert. Eine blaue Farbe wurde in Gegenwart von HRPO erzeugt, d.h. in denjenigen Proben, in denen sich Einfangreagenz/Antigen/Indikatorreagenz-Komplex gebildet hatte. Die Farbentwicklung wurde durch Zugabe von Schwefelsäure (1 ml, 1 N H&sub2;SO&sub4;) gestoppt und mit einem Spektrophotometer (450 nm) abgelesen. Die Farbmessungen zeigten, daß, wenn die Menge an Analyt in der Testprobe zunahm, die Menge an Indikatorreagenz, die an das Einfangreagenz gebunden war, ebenfalls zunahm, wie dies durch eine Zunahme der Extinktion angezeigt wurde. Es wurde herausgefunden, daß das nachweisbare Signal für lyophilisierte Reagenzzusammensetzungen sowie für unlyophilisierte Reagenzien im wesentlichen das gleiche war, wodurch gezeigt wurde, daß keine wesentlichen Veränderungen der Reagenzien während des Lyophilisierungsvorgangs stattgefunden hatten.

Beispiel 2

Lyophilisierte Reagenzzusammensetzung

Eine lyophilisierte Reagenzzusammensetzung wurde im wesentlichen gemäß dem Protokoll aus Beispiel 1 oben präpariert, mit der Ausnahme, daß ein einzelnes Polystyrolkügelchen anstelle der Mikropartikel verwendet wurde. Die geformten Reagenzzusammensetzungen wurden durch Einbringen eines einzelnen mit Einfangreagenz beschichteten Polystyrolkügelchens in jede Formvertiefung, gefolgt von der Zugabe des Indikatorreagenzes und der Gelatinelösung hergestellt. Ein CEA-Assay wurde im wesentlichen gemäß dem Protokoll aus Beispiel 1 durchgeführt, und ähnliche Ergebnisse wurden erhalten.
Die Assayergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt, worin die CEA-Konzentration in den Proben dem Ausmaß an Farbentwicklung gegenübergestellt ist. Die Ergebnisse zeigten, daß, wenn die Menge an Analyt in der Testprobe zunahm, die Menge an Indikatorreagenz, die an dem mit Einfangreagenz beschichteten Kügelchen gebunden wurde, ebenfalls zunahm, wie dies durch eine Zunahme der Lichtextinktion angezeigt wird. Tabelle 1 Feste Phase: Polystyrolkügelchen

Beispiel 3

Präparation einer lyophilisierten Reagenzzusammensetzung für einen Humanchoriongonadotropin (hCG)-Enzym-Immunoassay

a) Präparation der Assayreagenzien

Einhundert Mikroliter Konjugat (anti-hCG-Antikörper/m- Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester) wurden mit einem gleichen Volumen Matrixlösung mit 0,5% Gelatine und 6% Saccharose gemischt, die im wesentlichen gemäß dem Verfahren hergestellt worden war, das in Beispiel 1a oben beschrieben ist.

b) Lyophilisierung der Reagenzzusammensetzung

Ein aliquoter Teil der Reagenzzusammensetzung (400 µl) wurde auf ein poröses Filtermaterial mit Hilfe einer Präzisionspipette aufgebracht. Das Filter wurde in einem Gefriergerät etwa zwei Stunden lang einer Temperatur von -70ºC ausgesetzt. Die Einheiten wurden dann auf -44ºC kalte Gefrierplatten überführt, wo sie eine Stunde unter Vakuum gehalten wurden. Die Plattentemperatur wurde dann auf -20ºC angehoben und auf dieser Temperatur etwa zwei Stunden gehalten. Der Lyophilisierungszyklus wurde durch Sublimation bei einer Plattentemperatur von 0ºC über einen Zeitraum von etwa 12 Stunden, gefolgt von einer Plattentemperatur von +30ºC für etwa eine Stunde, beendet. Die lyophilisierten Reagenzzusammensetzungseinheiten wurden aus der Form herausgelöst und bei Raumtemperatur in Glasgefäßen mit Silicagel als Trockenmittel aufbewahrt.

c) Akzeptierbarkeit der lypohilisierten Reagenzzusammensetzung im hCG-Assay

Eine hCG-Assay-Standardlösung wurde mit der lyophilisierten Reagenzzusammensetzung zusammengebracht, die über einem porösen Bausch mit immobilisiertem Anti-hCG-Antikörper stand. Die hCG- Standards enthielten Proben von 0 und 100 Nanogramm Antigen pro Milliliter Tris-Puffer. Die Testproben oder Standards und die Assayreagenzien wurden 90 Sekunden lang inkubiert. Der Inkubation folgte die Entfernung des lyophilisierten Reagenzzusammensetzungsfilters und das Waschen des porösen Bausches. Eine farbbildende Lösung von entweder 5-Brom-4-chlor- 3-indolylphosphat (0,5 mg/ml in Tris-Puffer) oder Nitroblautetrazolium (0,2 mg/ml in Tris-Puffer) wurde dann auf den porösen Bausch aufgebracht. Wenn hCG vorhanden war, dann wurde während der Inkubationszeit ein Einfangreagenz/Antigen/Indikatorreagenz-Komplex ausgebildet, und die Zugabe des Chromogens führte zu der Bildung eines visuell nachweisbaren farbigen Reaktionsprodukts.

Beispiel 4

Stabilität der lyophilisierten Reagenzzusammensetzung

a) Präparation der Assayreagenzien

Eine Matrixlösung wurde im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem Verfahren präpariert, das in Beispiel 1a oben beschrieben ist. Anti-hCG-Antikörper/Alkaliphosphat-Konjugat (200 ml) wurde mit Gelatine (2,3 ml), Dextran (4 g) und Saccharose (4 g) zusammengebracht.

b) Lyophilisierung der Reagenzzusammensetzung

Die lyophilisierten Reagenzzusammensetzungseinheiten wurden im wesentlichen gemäß dem Verfahren präpariert, das in Beispiel 3b oben beschrieben ist. Diese Einheiten wurden insgesamt 111 Tagen lang Temperaturbelastungen von 45ºC ausgesetzt.

c) Akzeptierbarkeit der lyophilisierten Reagenzzusammensetzung im hCG-Assay

Assays wurden unter Verwendung der lyophilisierten Reagenzzusammensetzungseinheiten im wesentlichen in Übereinstimmung mit dem Verfahren durchgeführt, das in Beispiel 3c oben beschrieben ist. Die Ergebnisse der während des Temperaturbelastungszeitraums durchgeführten Assays (an den Tagen 3, 7, 17, 21, 28 und 111) lieferten identische Ergebnisse bei Bildung eines visuell nachweisbaren Signals in Gegenwart von Analyt.
Die Konzepte der vorliegenden Erfindung sind in unterschiedlichen Typen von Bindungsassays anwendbar. Es versteht sich jedoch von selbst, daß sich ein Fachmann auf diesem Gebiet auch andere Assays vorstellen kann, einschließlich Assays für andere Analyten als Antigene oder Antikörper, auf die die vorliegenden erfinderischen Konzepte angewendet werden können. Die beschriebenen Ausführungen und die dargestellten alternativen Ausführungsformen sind als Beispiele und nicht als Einschränkungen zu verstehen.

Claims

1. Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzung für einen spezifischen Bindungsassay, die im wesentlichen aus folgendem besteht:

a) einem porösen Material;

b) einem Indikatorreagenz, wobei das Indikatorreagenz ein markiertes spezifisch bindendes Glied in einer ausreichenden Menge zur Durchführung eines einzelnen Bindungsassays ist; und

c) einer Trägermatrix,

wobei die Trägermatrix lyophilisierbar ist, wodurch das Indikatorreagenz stabilisiert wird,

und wobei die Trägermatrix bei Kontakt mit einem Lösungsmittel rehydratisiert wird, wodurch das Assayreagenz für eine spezifische Bindungsreaktion durch das poröse Material angeboten oder aus diesem freigesetzt wird.

2. Reagenzzusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die formbare Trägermatrix eine Gelatine ist.

3. Reagenzzusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Gelatine aus der Gruppe gewählt ist, die aus Kalbshautgelatine, Fischgelatine, Schweinehautgelatine und aus Pflanzengelatinen besteht.

4. Reagenzzusammensetzung nach Anspruch 1, die des weiteren einen Stabilisator für das Indikatorreagenz umfaßt.

5. Reagenzzusammensetzung nach Anspruch 4, worin der Stabilisator ein Zucker ist.

6. Reagenzzusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der Zucker in einer Konzentration von ungefähr 0,1% bis ungefähr 50% vorhanden ist.

7. Reagenzzusammensetzung nach Anspruch 6, worin der Zucker aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: Trehalose, Dextran, Lactose, Maltose, Xylose, Arabitol, Xylitol und Saccharose.

8. Verfahren zur Ausbildung einer Reagenzzusammensetzung für einen spezifischen Bindungsassay, das folgendes umfaßt:

a) Zusammengeben eines Indikatorreagenzes mit einer Trägermatrixlösung, wodurch eine Mischung ausgebildet wird, wobei das Indikatorreagenz ein markiertes spezifisch bindendes Glied in einer Menge umfaßt, die zur Ausführung eines einzelnen Bindungsassays ausreichend ist;

b) Dispergieren eines aliquoten Anteils der Mischung auf einem porösen Material;

c) Kühlen des porösen Materials unter Ausbildung einer Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzung; und

d) Lyphilisieren der Verwendungseinheits-Reagenzzusammensetzung, wobei die Zusammensetzung bei Kontakt mit einem Lösungsmittel rehydratisiert, wodurch sie das Indikatorreagenz für eine spezifische Bindungsreaktion anbietet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Trägermatirix eine Gelatine ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: Kalbshautgelatine, Fischgelatine, Schweinehautgelatine und pflanzlichen Gelatinen.

10. Verfahren nach Anspruch 8, das des weiteren den Schritt umfaßt, einen Stabilisator mit dem Indikatorreagenz zu kombinieren, wobei der Stabilisator ein Zucker ist, der aus der Gruppe gewählt ist, die aus folgendem besteht: Trehalose, Dextran, Lactose, Maltose, Xylose, Arabitol, Xylitol und Saccharose, und wobei der Zucker in einer Konzentration von ungefähr 0,1% bis ungefähr 50% anwesend ist.