DE4041300A1 - Verfahren zur trennung von komponenten in einer mischung - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Trennung einer Komponente, welche teilchenförmig sein kann oder nicht, von anderen Komponenten in einer Mischung. Die Erfindung ist insbesondere zur Trennung für beispielsweise den Nachweis von Zellen aus biologischen Flüssigkeiten wie Blut, lymphatischer Flüssigkeit, Urin, Zellkulturen oder suspendierten Exkrementen, von Mikroorganismen, Organellen, Molekülaggregaten, Nukleinsäuren und Liganden anwendbar.

Der Nachweis und die Identifizierung von Mikroorganismen, insbesondere in biologischen Proben, Nahrungs- und Arzneimitteln, sind zur klinischen Diagnose von Krankheiten, zur Vorbeugung von Krankheitsübertragung und zur Aufrechterhaltung der Nahrungsmittelqualität erforderlich.

Üblicherweise werden Bakterien und Pilze durch Kulturverfahren, die bekanntermaßen langsam und mühsam sind, nachgewiesen und identifiziert. Vor kurzem sind immunologische Nachweisverfahren für mikrobielle Antigene und Nachweisverfahren mit Nukleinsäuresonden entwickelt worden. Jedoch erlauben diese Verfahren üblicherweise nur den Nachweis eines speziellen Organismus. Bei der Bestimmung von Septikämie, wird oft ein Nachweisverfahren für einen allgemeinen Wachstumsindikator wie Kohlendioxid verwendet. Darauf folgen Kulturverfahren, um den Organismus zu identifizieren und anschließende Tests auf Antibiotika-Sensitivität. Es besteht ein Bedürfnis, Testergebnisse schneller und mit geringerem Arbeitsaufwand zu erhalten.

Es sind verschiedene Techniken bekannt, um Trennungen auszuführen. Beispielsweise sind Zentrifugationen und Waschschritte; unterschiedliche Wanderung gebundener und freier Fraktionen, z. B. Chromatoelektrophorese oder Gelfiltration; Chemische Präzipitation der gebundenen oder freien Fraktion, z. B. mittels organischen Lösungsmitteln, Salzen oder Säuren, gefolgt von Filtration oder Zentrifugation; immunologische Präzipitation der gebundenen Fraktion, z. B. durch Doppel-Antikörper-Technik, gefolgt von Filtration oder Zentrifugation; Absorption der gebundenen oder freien Fraktion an selektiv absorbierende Medien, z. B. Holzkohle, Silikate oder Harze; magnetische Trennungstechniken und dgl. anwendbar.

Viele der Trennungstechniken, einschließlich der in immunologischen Nachweisverfahren verwendeten, sind relativ lange komplizierte Prozeduren. Solche Prozeduren reduzieren die Effizienz des ausführenden Personals, verringern den Durchsatz und erhöhen die Kosten der Tests. Andere Trennungstechniken, die schnell und einfach sind, unterscheiden nicht in ausreichendem Maß zwischen den gebundenen und freien Fraktionen und sind deshalb für immunologische Nachweisverfahren ungeeignet oder können nur in einer begrenzten Anzahl von Tests verwendet werden.

Kürzlich veröffentliche Microdrop Co. ein Verfahren zur Überführung einer gesamten Probe von Urin in kleine Kügelchen aus Agarose oder einem anderen Gel derart, daß jedes Kügelchen höchstens einen Organismus einschließt (Weaver et al., Bio/Technology (1988), Band 6, Seiten 1084- 1089). Die Kügelchen schlossen ein Kulturmedium ein und waren in Öl dispergiert. Das Wachstum wurde direkt durch die Bildung eines Indikatorfarbstoffs in den infizierten Partikeln nachgewiesen. Das Verfahren eröffnet die Möglichkeit, einzelne Organismen nachzuweisen, zu sortieren, zu zählen und zu untersuchen, jedoch ist das Verfahren mühsam und die Trennung der Bakterien von Wachstums-inhibierenden Substanzen in der Probe geschieht lediglich durch Verdünnung und Diffusion.

Zellen werden im allgemeinen durch Zentrifugation in Medien hoher Dichte oder hoher Viskosität getrennt, und Lysosome mit inkorporierten Goldpartikeln sind aufgrund ihrer erhöhten Dichte durch die Verwendung von Sucrose-Dichtegra­ dienten-Geschwindigkeitszentrifugation isoliert worden (Henning et al., Biochim. Biophys. Acta., Band 354 (1974), Seiten 114 bis 120). Außerdem haben Dorn et al., J. Clin. Micro, Band 3 (1976), Seiten 251 bis 257, gezeigt, daß Bakterien zusammen mit unlöslichen Zellbruchstücken von den löslichen Komponenten einer lysierten Blutprobe getrennt werden können, indem die Suspension mit einer darunterliegenden Schicht aus Sucrose-Lösung zentrifugiert wird. Dies ist die Grundlage eines "ISOLATOR" genannten Produkts von I.E. DuPont de Nemours Company. Weiterhin trennten Leduc et al. (Biochim. Biophys. Acta., Band 885 (1986), Seite 248) Polynukleosomen, welche Poly-ADP-Ribose- Synthetase auf ihrer Oberfläche trugen, von ungebundenen Polynukleosomen, indem spezifische Antikörper für die Synthetase zur Bindung veranlaßt wurden, die Mischung mit Gold-markiertem Protein A zusammengebracht wurde und eine Trennung durch Sucrosegradienten-Geschwindigkeits­ sedimentation durchgeführt wurde, wodurch sich die an Gold gebundenen Polynukleosomen schneller trennten. Courtoy et al., (J. Cell Biology, Band 98 (1984), Seiten 870 bis 876) haben die durch 3,3′-Diaminobenzidin-Zytochemie induzierte Verschiebung der Gleichgewichtsdichte in einem Verfahren zur Analyse und Reinigung von Peroxidase-enthaltenden Organellen beschrieben.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung betrifft die Trennung eines Materials von Interesse aus einer Mischung, welche das Material von Interesse sowie weitere unlösliche und/oder lösliche Komponenten enthält. Das Verfahren umfaßt die Bindung des Materials von Interesse an ein Kügelchen (MI-Kügelchen) in einem ersten flüssigen Medium und die Bereitstellung des MI-Kügelchens in einem flüssigen System, worin das MI-Kügelchen eine größere Dichte als das flüssige System hat, welches das flüssige Medium enthält. Die Dichte mindestens eines Teils des flüssigen Systems ist größer als die der anderen unlöslichen Komponenten in dem flüssigen System. Als nächstes wird das flüssige System einer Zentrifugalkraft ausgesetzt, die ausreicht, um das MI- Kügelchen von den unlöslichen Komponenten zu trennen. Wenn das Material von Interesse von anderen löslichen Komponenten getrennt werden soll, ist ein zweites flüssiges Medium als Schicht neben dem ersten flüssigen Medium vorhanden.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist insbesondere auf die Trennung von organischen und biochemischen Materialien von Interesse aus beispielsweise Zellkulturen oder Körperflüssigkeiten anwendbar.

Eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur Trennung eines Materials von Interesse aus einer Mischung, welche das Material von Interesse und andere Komponenten enthält. Das Verfahren umfaßt die Bindung des Materials von Interesse an ein Kügelchen (MI- Kügelchen) in einem wäßrigen Medium. Das wäßrige Medium hat, oder wird im folgenden auf eine Dichte gebracht, welche geringer als die der MI-Kügelchen ist, aber größer als die irgendeiner der anderen Komponenten, die in dem Medium unlöslich sind. Das Medium wird einer Zentrifugation unterworfen, um die MI-Kügelchen in einem Bereich innerhalb oder außerhalb des Mediums getrennt von den anderen Komponenten zu sammeln, unter mit der Maßgabe, daß, falls die anderen Komponenten in dem wäßrigen Medium löslich sind, sich die MI-Kügelchen nur außerhalb des Mediums ansammeln.

Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Trennung eines Mikroorganismus aus einer Mischung, welches den Mikroorganismus und anderen Komponenten enthält. Das Verfahren umfaßt die Bindung des Mikroorganismus an Kügelchen in einem wäßrigen Medium, um Mikroorganismus- Kügelchen zu bilden. Die Kügelchen haben eine Dichte größer als 1,2 g/cm³ und einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 1 bis 50 000 nm. Als nächstes wird das Medium einer Zentrifugation unterworfen, um die Mikroorganismus- Kügelchen zu konzentrieren. In einer weiteren Ausführungsform des obigen Verfahrens wird die Dichte des wäßrigen Mediums so eingestellt, daß sie größer ist als die irgendeiner der anderen Komponenten, die in dem Medium unlöslich sind, aber geringer als diejenige der Mikroorganismus-Kügelchen. In einer weiteren Ausführungsform veranlaßt die Zentrifugation die Mikroorganismus-Kügelchen dazu, sich in einem Bereich außerhalb des Mediums anzusammeln. Der Bereich ist von dem der anderen Komponenten getrennt. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Medium von höherer Viskosität mit dem wäßrigen Medium überschichtet, bevor das wäßrige Medium der Zentrifugation unterworfen wird.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Trennung eines Mikroorganismus aus einer Mischung, welche den Mikroorganismus und andere Komponenten enthält. Das Verfahren umfaßt die Bindung des Mikroorganismus an eine Vielzahl von Kügelchen in einem ersten wäßrigen Medium, um Mikroorganismus-Kügelchen zu bilden. Die Kügelchen haben eine Dichte größer als 10 g/cm³ und einen durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 1 bis 50 nm. Das erste Medium wird mit einem zweiten Medium in Kontakt gebracht, welches eine größere Dichte als das erste Medium aufweist, aber die geringer ist als diejenige der Mikroorganismus-Kügelchen. Die zusammengebrachten ersten und zweiten Medien werden einer Zentrifugation unterworfen, um die Mikroorganismus-Kügelchen in einem Bereich außerhalb des ersten Mediums zu sammeln. Der Bereich ist von dem der anderen Komponenten getrennt.

In einer weiteren Ausführungsform des obigen Verfahrens werden das erste wäßrige Medium und das zweite Medium kombiniert und überschichten ein drittes Medium, welches eine Viskosität größer als die der kombinierten ersten und zweiten Medien besitzt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung beinhaltet ein Verfahren zur Trennung von Mikroorganismen aus einem wäßrigen Medium, wobei das Verfahren einen Zentrifugationsschritt einschließt und dadurch gekennzeichnet ist, daß (a) ein wäßriges Medium dichter als das der genannten Mikroorganismen bereitgestellt wird, und (b) die Mikroorganismen vor der Zentrifugation zur Bindung an Kügelchen veranlaßt wird, um Aggregate zu bilden, die aus einem Einzelmikroorganismus und einer Vielzahl von Kügelchen bestehen. Die genannte Methode kann auch das Überschichten des wäßrigen Mediums über ein zweites flüssiges Medium einschließen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung eines Nachweisverfahrens für einen Analyten. Das Verfahren umfaßt die Bindung des Analyten oder einer Substanz, deren Anwesenheit in Bezug zur Anwesenheit des Analyts steht, an ein Kügelchen (A- Kügelchen) in einem wäßrigen Medium. Das wäßrige Medium hat, oder wird im folgenden auf eine Dichte gebracht, welche geringer als die des A-Kügelchens ist, aber größer als die irgendeiner der anderen Komponenten, die in dem Medium unlöslich sind. Das Medium wird einer Zentrifugation unterworfen, um die A-Kügelchen in einem Bereich innerhalb oder außerhalb des Mediums getrennt von den anderen Komponenten zu sammeln, unter der Maßgabe daß, falls die anderen Komponenten im Medium löslich sind, die A-Kügelchen sich außerhalb des Mediums ansammeln. Der Analyt oder die andere Substanz wird dann nachgewiesen.

Die Erfindung umfaßt weiterhin Zusammensetzungen und Ausrüstungen, um die Verfahren und Nachweisverfahren der Erfindung durchzuführen.

In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 eine Dichtekalibrierung eines Percoll- Gradienten.

Fig. 2 eine gravimetrische Dichtekalibrierung des Percoll-Diatrazoat-Gradienten.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf ein Verfahren zur Trennung eines Materials von Interesse (MI) von anderen Komponenten in einer Probe. Das zu trennende MI wird an ein Kügelchen gebunden (MI-Kügelchen). Der bevorzugte Ansatz, um Bindungen zwischen den Kügelchen und dem MI zu erreichen, sind Ladungswechselwirkungen oder eine Ligand-Rezeptor-Bindung. Das MI kann auch mittels Nukleinsäurehybridisierung an die Kügelchen gebunden sein. Das MI-Kügelchen hat eine größere Dichte als das flüssige Medium, in dem es suspendiert ist. Die Dichte mindestens eines Teils des flüssigen Mediums ist größer als die Dichte anderer unlöslicher Komponenten in dem Medium. Das Medium wird einer Zentrifugalkraft ausgesetzt, die ausreicht, um das MI-Kügelchen von den anderen Komponenten zu trennen. Das abgetrennte MI-Kügelchen kann weiterhin gewaschen und durch physikalische oder chemische Verfahren untersucht werden. Das MI-Kügelchen kann auch behandelt werden, um die Bindung mit dem MI rückgängig zu machen. Nach dem Rückgängigmachen der Bindung kann die Abtrennung der freien Kügelchen erfolgen, um so ein Mittel zur Abtrennung des MIs von den Kügelchen bereitzustellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren bietet breite Anwendungsmöglichkeiten auf dem Gebiet der Trennung und des Nachweises eines Materials von Interesse von anderen Komponenten in einer Probe, insbesondere zur Trennung biologischer Materialien, etwa teilchenförmigen Materialien, z. B. Zellen, Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze, Organellen, Molekülaggregate, und nicht­ teilchenförmigen Materialien, z. B. Liganden und Nukleinsäuren. Das Material von Interesse kann z. B. in biologischen Proben wie Zellkulturen und Körperflüssigkeiten, in Nahrungs- oder Arzneimitteln enthalten sein. Im allgemeinen ist das Material von Interesse in einem breiten Bereich von teilchenförmigen Materialien zu finden, welche in biologischen Flüssigkeiten oder solubilisierten biologischen Feststoffen und anderen löslichen Komponenten vorhanden sind. Die Erfindung stellt ein Trennungsverfahren bereit, welches bequemer und schneller als bloße Zentrifugation, Filtration und bekannte Trennungsverfahren ist, und es ist insbesondere bei der Vorbehandlung von Suspensionen anwendbar, wenn es wünschenswert ist, eine Analyse eines Materials von Interesse auszuführen, das von anderen Komponenten getrennt ist. Die Erfindung ist für das Nachweisverfahren eines Analyts in einer Probe anwendbar, wenn ein Trennungsschritt erforderlich ist.

Bevor mit einer Beschreibung besonderer Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung fortgefahren wird, soll eine Anzahl von Ausdrücken definiert werden.

Material von Interesse (MI) - die Verbindung oder Zusammensetzung, die getrennt werden soll. Das Material von Interesse kann teilchenförmig oder nicht teilchenförmig sein. Nicht teilchenförmiges MI kann ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares (sbp) umfassen und ein Ligand sein, der ein- oder mehrwertig ist, üblicherweise ein Antigen oder Hapten, und es ist entweder eine Einzelverbindung oder eine Vielzahl von Verbindungen, die mindestens ein gemeinsames Epitop oder eine Determinante teilen. Das MI kann auch ein Teilchen sein. Ein Beispiel für ein teilchenförmiges MI ist eine Zelle, die ein Blutgruppenantigen wie A, B, D oder ein HLA-Antigen trägt, oder ein Mikroorganismus z. B. ein Bakterium, ein Pilz, ein Einzeller oder ein Virus.

Das MI kann ein Analyt sein, der entweder einwertig (monoepitopisch) oder mehrwertig (polyepitopisch) ist. Der mehrwertige Liganden-Analyt wird normalerweise entweder aus Polyaminosäuren, d. h. Polypeptiden und Proteinen, oder Polysacchariden, Lipiden, Nukleinsäuren und Kombinationen davon bestehen. Solche Kombinationen schließen Bestandteile z. B. von Bakterien, Pilzen, Viren, Chromosomen, Genen, Mitochondrien, Zellkernen oder Zellmembranen ein.

Größtenteils werden die polyepitopischen Liganden-Analyte, auf die die vorliegende Erfindung angewendet werden kann, ein Molekulargewicht von mindestens ungefähr 5000, üblicherweise mindestens ungefähr 10 000, aufweisen. Bei den Polyaminosäuren wird das Molekulargewicht im allgemeinen von ungefähr 5000 bis 5 000 000, üblicherweise von ungefähr 20 000 bis 1 000 000 reichen; bei den Hormonen von Interesse wird das Molekulargewicht üblicherweise von etwa 5000 bis 60 000 reichen.

Eine große Vielfalt von Proteinen kann als Familien von Proteinen mit ähnlichen Strukturmerkmalen betrachtet werden; z. B. Proteine mit besonderen biologischen Funktionen, Proteine, die spezifische Mikroorganismen betreffen, insbesondere krankheitsverursachende Mikroorganismen.

Die monoepitopischen Liganden-Analyte werden im allgemeinen ein Molekulargewicht von ungefähr 100 bis 2000 aufweisen, üblicher von 125 bis 1000. Die Analyte schließen z. B. Arzneistoffe, Metabolite, Pestizide, Schadstoffe und dgl. ein. Unter den Arzneistoffen von Interesse sind die Alkaloide eingeschlossen. Unter den Alkaloiden sind Morphin-Alkaloide, einschließlich Morphium, Codein, Heroin, Dextromethorphan und deren Derivate und Metabolite; Kokain- Alkaloide, einschließlich Kokain und Benzoyl-Ecgonin, deren Derivate und Metabolite, Ergot-Alkaloide, einschließlich Lysergsäurediethylamid; Stereoid-Alkaloide; Iminazoyl- Alkaloide; Chinazolin-Alkaloide; Isochinolin-Alkaloide, Chinolin-Alkaloide, einschließlich Chinin und Chinidin; Diterpen-Alkaloide und deren Derivate und Metabolite.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen beinhaltet Steroide, einschließlich Östrogene, Androgene, adrenocortikale Steroide, Gallensäuren, cardiotonische Glykoside und Aglykone, einschließlich Digoxin und Digoxigenin, Saponine und Sapogenine, deren Derivate und Metabolite. Ebenfalls eingeschlossen sind die Steroid-mimetischen Substanzen, wie beispielsweise Diethylstilböstrol.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Lactame mit 5 bis 6 Ringgliedern, einschließlich der Barbiturate, z. B. Phenobarbital und Secobarbital, Diphenylhydantonin, Primidon, Ethosuximid und deren Metabolite.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Aminoalkylbenzole mit Alkylgruppen von 2 bis 3 Kohlenstoffatomen, einschließlich der Amphetamine, Catecholamine, welche Ephedrin, L-Dopa, Epinephrin, Narcein, Papaverin und deren Metabolite einschließen.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Benzheterocyclen, einschließlich Oxazepam, Chlorpromazin, Tegretol, Imipramin, deren Derivate und Metaboliten, wobei die heterocyclischen Ringe Azepine, Diazepine und Phenothiazine sind.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind die Purine, einschließlich Theophyllin, Coffein und deren Metabolite und Derivate.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind die Derivate von Marihuana, einschließlich Cannabinol und Tetrahydrocannabinol.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen beinhaltet die Vitamine wie A, B, z. B. B₁₂, C, D, E und K, Folsäure und Thiamin.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind die Prostaglandine, welche sich hinsichtlich Grad und Lokalisation der Hydroxylierung und der ungesättigten Bindungen unterscheiden.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind Antibiotika, einschließlich Penicillin, Chloromycetin, Actinomycetin, Tetracyclin, Terramycin und die Metabolite und Derivate davon.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind die Nukleoside und Nukleotide, einschließlich ATP, NAD, FMN, Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytidin mit deren entsprechenden Zucker- und Phosphatsubstituenten.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind unterschiedliche Arzneistoffe, einschließlich Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Amitriptylin, Nortriptylin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin, Valproesäure, Butyrophenone, Antihistamin, anticholinerge Arzneistoffe, wie z. B. Atropin, und deren Metabolite und Derivate.

Metabolite, die mit Krankheitszuständen verknüpft sind, schließen Spermin, Galactose, Phenylbenztraubensäure und Porphyrin Typ 1 ein.

Die nächste Gruppe von Arzneistoffen sind die Aminoglycoside, z. B. Gentamicin, Kanamicin, Tobramycin und Amikacin.

Unter den Pestiziden von Interesse sind polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide und deren Metabolite und Derivate.

Bei Rezeptoren als Analyten werden die Molekulargewichte im allgemeinen im Bereich von 10 000 bis 2×10⁸ liegen, üblicherweise im Bereich von 10 000 bis 10⁶. Bei den Immunglobulinen IgA, IgG, IgE und IgM werden die Molekulargewichte im allgemeinen von 160 000 bis ungefähr 10⁶ variieren. Das Molekulargewicht von Enzymen wird normalerweise im Bereich von 10 000 bis 1 000 000 liegen. Natürliche Rezeptoren variieren stark, das Molekulargewicht beträgt im allgemeinen mindestens ungefähr 25 000 und kann 10⁶ oder höher sein. Eingeschlossen sind solche Materialien wie Avidin, DNA, RNA, Thyroxin-bindendes Globulin, Thyroxin-bindendes Prealbumin und Transcortin.

Beispiele für Mikroorganismen

Beispiele für Mikroorganismen (Fortsetzung)

Beispiele für Mikroorganismen (Fortsetzung)

Mitglied eines spezifischen Bindungspaares ("sbp- Mitglied") - eines von zwei verschiedenen Molekülen, das einen Bereich auf der Oberfläche oder in einer Kavität aufweist, welcher spezifisch an eine besondere räumliche und polare Organisation des anderen Moleküls bindet und damit als komplementär oder reziprok definiert wird. Die Mitglieder des spezifischen Bindungspaares werden als Ligand und Rezeptor (Antiligand) bezeichnet. Sie werden üblicherweise Mitglieder eines immunologischen Paars wie Antigen-Antikörper sein, obwohl andere spezifische Bindungspaare wie Biotin-Avidin, Hormon-Hormonrezeptoren, Lektin-Kohlehydrate, Nukleinsäuredoppelstränge, IgG- Protein A, DNA-DNA oder DNA-RNA keine immunologischen Paare, aber trotzdem von der Erfindung eingeschlossen sind.

Ligand - jede organische Verbindung, für die ein Rezeptor in der Natur existiert oder hergestellt werden kann.

Ligandenanalogon - ein modifizierter Ligand, der mit dem analogen Liganden um einen Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifizierung üblicherweise das Mittel liefert, um ein Ligandenanalogon mit einem anderen Molekül zu verbinden. Das Ligandenanalogon wird üblicherweise vom Liganden stärker differieren als nur durch den Ersatz eines Wasserstoffatoms durch eine Bindung, die das Ligandenanalogon mit einer Markierung verbindet, aber muß es nicht. Das Ligandenanalogon kann an den Rezeptor in einer ähnlichen Weise wie der Ligand binden. Das Analogon könnte z. B. ein Antikörper sein, der gegen den Idiotyp eines Antikörpers für den Liganden gerichtet ist.

Rezeptor ("Antiligand") - jede Verbindung oder Zusammensetzung, die imstande ist, eine besondere räumliche oder polare Organisation eines Moleküls, z. B. eine Epitop oder eine Determinanate zu erkennen. Illustrative Rezeptoren schließen natürlich vorkommende Rezeptoren, z. B. Thyroxin-bindendes Globulin, Antikörper, Enzyme, Fab- Fragmente, Lektine, Nukleinsäuren, Protein A oder Komplementbestandteil Clq ein.

Teilchenförmiges MI - teilchenförmiges MI hat im allgemeinen einen Durchmesser von mindestens 0,1 µm und nicht mehr als ungefähr 100 µm, üblicherweise 0,5 bis 25 µm. Das teilchenförmige MI kann organischer oder anorganischer Natur sein, quellfähig oder nicht quellfähig, porös oder nicht porös, und besitzt üblicherweise eine Dichte annähernd der von Wasser, im allgemeinen von ungefähr 0,7 bis 1,5 g/ml. Üblicherweise wird das teilchenförmige MI eine Ladung aufweisen, entweder positiv oder negativ, und kann spb-Mitglieder der Oberfläche tragen. Normalerweise wird das teilchenförmige MI biologisches Material, z. B. Zellen wie Erythrozyten, Leukozyten, Lymphozyten, Hybridomazellen; Mikroorganismen wie Streptococcus, Staphylococcus aureus, E. coli, Viren; Organellen wie z. B. Zellkerne, Mitochondrien, Nukleosomen; und dgl. darstellen. Das teilchenförmige MI kann auch Teilchen, die organische und anorganische Polymere, Liposome, Latex-Partikel, Phospholipid-Vesikel, Chylomicro­ ne, Lipoproteine und dgl. umfassen, darstellen.

Die Polymere werden normalerweise entweder Additions- oder Kondensations-polymere sein. Teilchenförmiges MI, das sich davon ableitet, wird absorptionsfähig sein oder funktionell so adaptierbar, daß sie entweder direkt oder indirekt an ein spb-Mitglied binden.

Das teilchenförmige MI kann ein Analyt sein oder einen daran gebundenen Analyten tragen oder ein Analyt kann daran vor oder nach der Trennung gebunden werden. Das teilchenförmige MI kann von Teilchen gebildet werden, die anfangs nicht an den Analyten gebunden sind und sich von natürlich vorkommenden Materialien, synthetisch modifizierten, aber natürlich vorkommenden Materialien und synthetischen Materialien ableiten. Unter den organischen Polymeren von besonderem Interesse sind Polysaccharide, insbesondere vernetzte Polysaccharide, wie Agarose, welche als Sepharose erhältlich ist, Dextran, wie Polystyrol, Polyvinylalkohol, Homopolymere und Copolymere von Derivaten von Acrylat und Methacrylat, insbesondere Ester und Amide mit freien funktionellen Hydroxylgruppen.

Die Teilchen zur Verwendung in Nachweismethoden werden üblicherweise polyfunktionell sein und werden spezifisch nicht-kovalent an ein spb-Mitglied wie Antikörper, Avidin, Biotin, Lektine oder Protein gebunden sein oder zu einer Bindung in der Lage sein. Eine große Vielfalt funktioneller Gruppen sind verfügbar oder können inkorporiert werden. Die funktionellen Gruppen schließen z. B. Carbonsäuren, Aldehyde, Amino, Cyano, Ethylen, Hydroxyl und Mercapto ein. Die Art und Weise, auf die eine große Vielzahl von Verbindungen mit Teilchen verknüpft werden kann, ist wohlbekannt und ausführlich in der Literatur erläutert (z. B. Cuatrecasas, J. Biol. Chem., Band 245, Seite 3059, 1970). Die Länge einer verbundenen Gruppe kann stark variieren, z. B. abhängig von der Natur der zu verknüpfenden Verbindung, der Wirkung des Abstands zwischen der zu verknüpfenden Verbindung und dem Teilchen auf die Bindung der spb-Mitglieder und des Analyts.

Das teilchenförmige MI kann positive oder negative Elektronenladung aufweisen. Das Teilchen kann inhärent geladen sein oder chemisch oder physikalisch behandelt werden, um eine Ladung einzuführen. Beispielsweise können Gruppen wie Carboxyl, Sulfonat, Phosphat und Amino chemisch an die Teilchen gebunden oder darauf durch bekannte Techniken gebildet werden. Zellen sind normalerweise aufgrund der Anwesenheit von Sialsäureresten auf der Zelloberfläche negativ geladen. Latex-Partikel können positiv oder negativ geladen sein, aber sie werden normalerweise eine negative Ladung als Ergebnis der Einführung von funktionellen Gruppen oder der Absorption von geladenen Polymeren wie Polypeptiden, Proteinen oder Polyacrylaten aufweisen.

Die Teilchen können gefärbt sein, fluoreszierend oder nicht fluoreszierend, üblicherweise nicht fluoreszierend, aber wenn sie fluoreszieren, können sie entweder auf direkte Weise fluoreszieren oder mittels fluoreszierender Verbindungen oder Fluoreszenzmittel, welche auf konventionellem Wege an das Teilchen gebunden sind.

Marker - ein Mitglied eines Signal-erzeugenden Systems, welches an MI-enthaltende Analyte oder an eine Substanz, deren Anwesenheit in Beziehung zur Anwesenheit des MI steht, gebunden sein oder dazu veranlaßt werden kann. Der Marker kann ein Isotop sein oder nicht, üblicherweise ist er es nicht und schließt Katalysatoren wie z. B. ein Enzym, ein Chromogen, z. B. ein Fluoreszenzmittel, Farbstoff oder Chemolumineszenzmittel oder ein Teilchen ein.

Signal-erzeugendes System - das Signal-erzeugende System kann eine oder mehrere Komponenten haben, wobei mindestens eine Komponente ein Marker ist. Das Signal-erzeugende System erzeugt ein Signal, welches abhängig von der Anwesenheit oder der Menge des MI oder einer Substanz, deren Anwesenheit in Beziehung zur Anwesenheit eines MI steht, in einer Probe ist. Das Signal-erzeugende System schließt alle Reagenzien ein, die erforderlich sind, um ein meßbares Signal zu erzeugen. Andere Komponenten des Signal­ erzeugenden Systems schließen Substrate, Verstärker, Aktivatoren, chemolumineszierende Verbindungen, Co- Faktoren, Inhibitoren, Abfangreagenzien, Metallionen, spezifisch bindende Substanzen, die zur Bindung von Signal­ erzeugenden Substanzen erforderlich sind und dgl. ein. Andere Komponenten des Signal-erzeugenden Systems können Co-Enzyme, Substanzen, die mit Enzymprodukten reagieren, andere Enzyme und Katalysatoren und dgl. sein. Das Signal­ erzeugende System liefert ein Signal, welches durch äußere Mittel nachweisbar ist, vorzugsweise durch die Messung des Aggregationsgrades von Teilchen oder unter Verwendung elektromagnetischer Strahlung und wünschenswerterweise durch visuelle Untersuchung. Eine große Anzahl von Enzymen und Co-Enzymen, die in einem Signal-erzeugenden System nützlich sind, sind in US-PS 42 75 149 und US-PS 43 18 980 genannt, eine Anzahl von Enzymkombinationen sind in US-PS 42 75 149 veröffentlicht. Diese Kombinationen können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Kügelchen - Partikel, welche im allgemeinen mindestens 1 bis 50 000 nm, üblicherweise mindestens 20 bis 10 000 nm Durchmesser aufweisen. Kügelchen mit einer Dichte von weniger als 8 g/cm³ haben vorzugsweise einen mittleren Durchmesser von 100 bis 50 000 nm. Dichtere Kügelchen weisen üblicherweise einen mittleren Durchmesser von 5 bis 30 nm, vorzugsweise 1 bis 50 nm auf. Das Kügelchen kann organischer oder anorganischer Natur sein, quellfähig oder nicht quellfähig, porös oder nicht-porös. Die Kügelchen können aus einem Material bestehen, welches transparent, partiell transparent oder opak ist. Die Kügelchen können jede Gestalt haben, die für ihre Verwendung geeignet ist, z. B. rund, oval oder unregelmäßig.

Die Kügelchen werden imstande sein, das (teilchenförmige oder nicht-teilchenförmige) MI zu binden. Deshalb werden die Kügelchen auf ihrer Oberfläche üblicherweise ein Mittel aufweisen, das eine solche Bindungsfähigkeit gewähr­ leistet. Die Bindung kann spezifisch oder unspezifisch, kovalent oder nicht-kovalent sein. Das Mittel kann eine sbp-Mitglied, z. B. ein spezifischer Rezeptor oder eine Nukleinsäure sein. Die Kügelchen könnten beispielsweise Anti-Immunglobulin an ihrer Oberfläche tragen und Antikörper gegen einen Mikroorganismus könnten dazu verwendet werden, eine Bindung zu bewirken. Als Alternative könnte das Mittel ein Lektin oder ein polyionisches Reagenz sein, insbesondere, wenn das MI ein Mikroorganismus ist. Die Kügelchen können eine positive oder negative Ladung aufweisen und können auch sbp-Mitglieder auf ihrer Oberfläche tragen.

Die Kügelchen sind so ausgewählt, daß sie eine höhere Dichte als irgendeine andere unlösliche Komponente in der Mischung aufweisen, aus der das MI zu trennen ist. Üblicherweise sind Dichten der Kügelchen von mindestens 1,2 g/cm³ erforderlich und viel höhere Dichten, üblicherweise mindestens 4 g/cm³ sind bevorzugt, insbesondere wenn teilchenförmiges MI zu trennen ist und die Kügelchen kleiner sind sind als das teilchenförmige MI. Das Haupterfordernis ist, daß das Aggregat aus einem oder einer Vielzahl von Kügelchen, welche an das MI gebunden sind, in der Dichte die anderen unlöslichen Komponenten in der Mischung, aus der das MI zu trennen ist, übertrifft.

Die Kügelchen können erhalten werden aus natürlich vorkommenden Materialien, natürlich vorkommenden Materialien, die synthetisch modifiziert sind, sowie synthetischen Materialien. Eine Gruppe von Kügelchen enthält ein Schwermetall, d. h. ein Metall mit einer Atomzahl größer als 20, wie z. B. ein Metall der Gruppe IB wie Gold oder Silber. Das Schwermetall kann in der Form eines Metall-Sols (kolloidale Suspension von z. B. Silber, Gold, Quecksilber, Blei oder Palladium) auftreten oder ein Metallsalz wie z. B. ein Oxid, Sulfid, unlösliches Phosphat oder Sulfat eines Schwermetalls, z. B. von Blei, Barium, Calcium oder Titan darstellen. Eine weitere Gruppe von Kügelchen sind Polyol-Kügelchen, d. h. Kügelchen, welche polymere Verbindungen mit mehr als einer Hydroxylgruppe umfassen. Unter den organische Polymeren von besonderem Interesse sind z. B. Polysaccharide, insbesondere vernetzte Polysaccharide wie Agarose, welche als Sepharose erhältlich ist, Dextran, das als Sephadex und Sephacryl erhältlich ist, Cellulose und Stärke; Additionspolymere wie Polystyrol, Polyvinylalkohol, Homopolymere und Copolymere von Derivaten und Acrylat und Methacrylat, insbesondere Ester und Amide mit freien funktionellen Hydroxylgruppen. Andere Beispiele von Kügelchen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind Silica-Kügelchen, umfassend z. B. Glas, Latex, Polyacrylamid, Kohlenstoff, Bornitrid, Carboran, Siliziumcarbid, Metallsilicate.

Die relativ beträchtliche Größe von Zellen und Mikroorganismen erfordert die Bindung von Kügelchen besonders hoher Dichte, wenn die Kügelchen wesentlich kleiner sind als die Zellen oder Mikroorganismen. Bevorzugte Kügelchen enthalten Metall-Sole, insbesondere Gold und Metalloxide und -sulfide und unlösliche Sulfate, wie diejenigen von Barium und Calcium, mit einem Durchmesser von 5 bis 70 nm und Dichten über 10 g/cm³.

Als Alternative können größere Kügelchen verwendet werden, die z. B. Latex, Silica, Glas, Agarose, Cellulose, Sephadex umfassen können, vorausgesetzt, daß sie unlöslich sind und dichter als das flüssige Medium, wenn sie an das Material von Interesse gebunden sind.

Höhere Geschwindigkeitsraten und Effizienz der Bindung von Kügelchen an das Material von Interesse, welches getrennt werden soll, werden mit höheren Konzentrationen an Kügelchen erreicht. Wenn es wünschenswert ist, übermäßig große Sedimente zu vermeiden und trotzdem eine maximale Konzentration von Kügelchen zu erreichen, ist es vorzuziehen, kleine, extrem dichte Kügelchen, üblicherweise im Bereich von 1 bis 50 nm mit spezifischen Gewichten von 10 bis 20 g/cm³ zu verwenden.

Die Kügelchen sind üblicherweise polyfunktionell und haben daran ein sbp-Mitglied, z. B. Antikörper, Avidin, Biotin, Lektine oder Protein A gebunden, oder sind zu einer solchen spezifischen, nicht-kovalenten Bindung imstande. Eine große Vielfalt von funktionellen Gruppen sind verfügbar oder können inkorporiert werden. Die funktionellen Gruppen sind z. B. Carbonsäuren, Aldehyde, Amino, Cyano, Ethylen, Hydroxyl oder Mercapto. Die Art und Weise, auf die eine große Vielfalt von Verbindungen mit Teilchen verknüpft werden kann, ist wohlbekannt und ausführlich in der Literatur erläutert (z. B. Cuatrecases, J. Biol. Chem., Band 245, Seite 3059, 1970). Die Länge einer verbindenden Gruppe kann stark variieren, z. B. abhängig von der Natur der zu verknüpfenden Verbindung, der Wirkung des Abstandes zwischen der zu verknüpfenden Verbindung und dem Teilchen auf die Bindung der sbp-Mitglieder und des Analyts.

Das Kügelchen kann eine positive oder negative elektronische Ladung aufweisen. Die Kügelchen können inhärent geladen sein oder chemisch oder physikalisch behandelt werden, um eine Ladung einzuführen. Beispielsweise können Gruppen wie Carboxyl, Sulfonat, Phosphat oder Amino chemisch an die Partikel gebunden oder durch bekannte Techniken darauf gebildet werden. Latexpartikel können positiv oder negativ geladen sein, aber sie werden normalerweise eine negative Ladung als Ergebnis der Einführung von funktionellen Gruppen oder der Absorption von geladenen Polymeren wie Polypeptiden, Proteinen oder Polyacrylaten aufweisen.

Die Kügelchen können fluoreszierend oder nicht fluoreszierend sein, üblicherweise nicht fluoreszierend, aber wenn sie fluoreszieren, können sie entweder direkt fluoreszieren oder mittels fluoreszierender Verbindungen oder Fluoreszenzmittel, welche auf konventionelle Weise an das Kügelchen gebunden sind. Die Fluoreszenzmittel sind üblicherweise im Kügelchen gelöst oder kovalent oder nicht­ kovalent daran gebunden und werden häufig im wesentlichen gleichmäßig durch das Kügelchen gebunden sein.

Fluoreszeinierte Latexpartikel werden in US-PS 38 53 987 offenbart.

Die Fluoreszenzmittel von Interesse werden im allgemeinen Licht mit einer Wellenlänge über 350 nm, üblicherweise über 400 nm und vorzugsweise über 450 nm emittieren. Vorzugsweise haben die Fluoreszenzmittel eine hohe Quanten­ ausbeute, eine große Stokes-Verschiebung und sind unter den Bedingungen ihrer Konjugation und Verwendung chemisch stabil. Der Ausdruck Fluoreszenzmittel soll Substanzen beinhalten, welche Licht bei Aktivierung mittels elektromagnetischer Strahlung oder chemischer Aktivierung emittieren und schließt fluoreszierende und phosphoreszierende Substanzen, Scintillatoren und chemolumineszierende Substanzen ein.

Die Fluoreszenzmittel von Interesse fallen in eine Vielfalt von Klassen mit gewissen primären Funktionalitäten. Diese Funktionalitäten schließen 1- und 2-Aminonaphthalin, Pyrene, quaternäre Phenanthridinsalze, 9-Aminoacridine, p,p′-Diaminostilbene, Imine, Anthracene, Oxacarbocyanine, Merocyanine, 3-Aminoequilenin, Perylen, Bis-benzoxazole, Bis-p-oxazolylbenzol, 1,2-Benzophenazin, Retinol, Bis-3- aminopyridinsalze, Hellebrigenin, Tetracyclin, Sterophenol, Benzimidazoloylphenylanin, 2-Oxo-3-chromen, Indol, Xanthen, 7-Hydroxycumarin, 4,5-Benzimidazole, Phenoxazin, Salicylat, Strophanthidin, Porphyrine, Triarylmethane, Flavin und Chelate, Oxide und Salze von Seltenen Erden ein. Beispielhafte Fluoreszenzmittel werden in US-PS 43 18 707 aufgezählt. Squarain-Farbstoffe, die in US-PS 48 06 488 beschrieben sind, sind ebenfalls als Fluoreszenzmittel verwendbar. Weiterhin können lichtabsorbierende Kügelchen, die feste unlösliche Teilchen sind, verwendet werden. Die Kügelchen werden hier manchmal als Partikel bezeichnet, wenn ein allgemeiner Ausdruck zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung angebracht ist.

Spezifische Bindung - die spezifische Erkennung von ein oder zwei verschiedenen Molekülen bezüglich des anderen und dem Ausschluß anderer Moleküle. Im allgemeinen haben die Moleküle einen auf der Oberfläche oder in einer Kavität, der für die spezifische Erkennung zwischen den Molekülen verantwortlich ist. Der primäre Bindungseinfluß geht von der Wasserstoffbindung aus. Beispiele spezifischer Bindung sind z. B. Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen und Enzym- Substrat-Wechselwirkungen.

Nicht-spezifische Bindung - Nicht-kovalente Bindung zwischen beispielsweise teilchenförmigem MI und Kügelchen, die relativ unabhängig von spezifischen Oberflächenstrukturen ist. Eine derartige nicht­ spezifische Bindung wird sich üblicherweise aus Ladungs- oder elektronischen Wechselwirkungen zwischen gegensätzlich geladenen Partikeln ergeben oder zwischen Partikeln mit derselben Ladung, wo ein polyionisches Reagens mit einer gegensätzlichen Ladung verwendet wird. Nicht-spezifische Bindung kann sich auch aus hydrophoben Wechselwirkungen von Molekülen oder Teilchen mit einer Oberfläche ergeben.

Polyionisches Reagens - eine Verbindung, Zusammensetzung oder ein Material, entweder anorganisch oder organisch, natürlich vorkommend oder synthetisch, welches mindestens zwei Reste mit derselben Ladung, entweder polyanionisch oder polykationisch, vorzugsweise mindestens zehn mit derselben Ladung aufweist, z. B. ein Polyelektrolyt.

Beispiele von polykationischen Reagenzien sind Polyalkylenamine wie Polyethylenimin und Polypropylenimin und deren Niederalkyl-Ammoniumsalze wie Poly­ bren(-N⁺(CH₃)₂CH₂CH₂N*(CH₃)₂CH₂CH₂CH₂CH₂-)_n, Metallionen wie Calcium- und Bariumionen, Aminodextrane, Protamine, positiv geladene Liposomen oder Polylysine.

Beispiele von polyanionischen Reagenzien sind Heparin, Dex­ transulfat, negativ geladene Phospholipid-Vesikel, Polycarbonsäuren, wie z. B. Polyacrylat oder Polyglutamat. Die obigen Materialien und deren Herstellung oder Isolation sind technisch wohlbekannt und viele sind im Handel erhältlich.

Freisetzendes Mittel - eine Verbindung, Zusammensetzung oder Material, entweder natürlich vorkommend oder synthetisch, organisch oder anorganisch, welches imstande ist, die nicht-spezifische oder spezifische Bindung zwischen MI und Kügelchen rückgängig zu machen, d. h. die Dissoziation des MI von den Kügelchen veranlaßt. Die freisetzenden Mittel wirken auf die spezifische oder nicht­ spezifische Bindung zwischen dem MI und den Kügelchen ein. Wenn sich beispielsweise die nicht-spezifische Bindung aus Ladungswechselwirkungen ergibt, kann das freisetzende Mittel eine Änderung des pH-Werts zu einem Wert, der ungünstig oder unverträglich mit den Ladungs-wechselwir­ kungen ist, bewirken. Das freisetzende Mittel kann deshalb eine Säure, z. B. eine Mineralsäure oder eine organische Säure, oder eine Base, z. B. eine Mineralbase oder eine organische Base sein. Als Alternative kann das freisetzende Mittel eine Abschirmung von ionischen Wechselwirkungen bewirken und kann deshalb auch eine Lösung mit hoher Ionenstärke oder eine Lösung eines neutralen Polymers wie Dextran sein. Als Alternative kann das freisetzende Mittel eine Ladung haben, welche die nicht­ spezifische Bindung zwischen dem teilchenförmigen MI und den Kügelchen unterbricht. Beispiele des letzteren sind polyelektrolytische Salze wie z. B. Citrat, Polyacrylat, oder Dextransulfat. Wenn die Teilchen durch eine polyionische Brücke verbunden sind, kann das freisetzende Mittel ein polyionisches Reagenz der entgegengesetzten Ladung sein oder ein Reagenz, welches das polyionische Reagenz depolymerisiert. Wenn das MI und die Kügelchen von entgegengesetzter Ladung sind, können andere positiv oder negativ geladene Polyelektrolyte oder Lösungen hoher Ionenstärke verwendet werden.

Im Falle von spezifischer Bindung kann das freisetzende Mittel eines sein, das die spezifischen Wechselwirkungen unterbricht, z. B. ein Überschuß eines Liganden oder Rezeptors oder ein Liganden- oder Rezeptor-ähnliches Molekül, wenn eine Ligand-Rezeptor-Bindung involviert ist; chelatbildende Reagenzien, z. B. Ethylendiamintetraacetat (EDTA), welches Metall-Ligand-Bindungen unterbrechen kann; reduzierende Reagenzien wie Mercaptoethanol, das Disulfidbrücken unterbrechen kann; oder nucleophile Agenzien wie Hydroxylamin, die Esterbindungen unterbrechen können.

Unlösliche Komponenten - Komponenten in einer Mischung außer dem MI, die im allgemeinen von der biologischen Probe oder dem Nahrungs- oder Arzneimittel, welches untersucht wird, herstammt. Diese Komponenten sind üblicherweise teilchenförmige Materialien und können beispielsweise Zellbruchstücke, Zellkerne, Mitochondrien, Nucleosome, Chylomicrone oder "low density"-Lipoproteine (LDL) sein. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist besonders nützlich für Blutuntersuchungen und kann die Vorbehandlung von Proben durch Lösungsvermittler und Mittel zur Zellyse mit sich bringen. Diese Verfahren können z. B. die Verwendung milder Detergenzien oder die Zellyse durch osmotischen Schock, Ultraschallbehandlung, Antikörper und Komplement, Druck etc. beinhalten. Die so hergestellten Suspensionen werden üblicherweise lösliche Verunreinigungen und Zellbruchstücke ebenso wie das Material von Interesse, welches abgetrennt werden soll, enthalten.

Hilfsmaterialien - Verschiedene Hilfsmaterialien werden häufig bei einer Trennung gemäß der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Beispielsweise werden oft Puffer im flüssigen Medium anwesend sein ebenso wie Stabilisatoren für das flüssige Medium und die anderen Komponenten.

Häufig können zusätzlich zu diesen Additiven weitere Proteine eingeschlossen sein, z. B. Albumine, oder oberflächenaktive Mittel, insbesondere nicht-ionische oberflächenaktive Mittel oder Bindungsverstärker, z. B. Polyalkylenglykole.

Wie oben erwähnt, betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Trennung eines MI aus einer Mischung, welche MI und unlösliche Komponenten erhält. Das Verfahren umfaßt die Bereitstellung von MI, das an ein Kügelchen in einem wäßrigen Medium gebunden ist (MI-Kügelchen). Das MI-Kügelchen hat eine Dichte, die größer ist als die des Mediums. Das Medium ist dichter als die unlöslichen Komponenten in der Mischung. Das zu trennende MI wird an die Kügelchen durch spezifische oder nicht-spezifische Bindung, abhängig von der Natur des MIs, gebunden sein. Spezifische Bindung wird häufiger für die Bindung von nicht-teilchenförmigem MI an Kügelchen zur Bildung von MI-Kügelchen verwendet. Jedoch kann spezifische Bindung auch bei der Bindung von teilchenförmigem MI an Kügelchen involviert sein. Üblicherweise wird eine Ligand-Rezeptor- Bindung verwendet. Die Kügelchen können ein daran gebundenes sbp-Mitglied, welches zum nicht-teilchenförmigen MI komplementär ist, aufweisen. Nicht-spezifische Bindung wird üblicherweise günstig für teilchenförmiges MI angewandt und ist vorzugsweise das Ergebnis von Ladungswechselwirkungen. Beispielsweise können das teilchenförmige MI und die Kügelchen entgegengesetzte elektronische Ladungen haben und eine nicht-spezifische Bindung wird spontan auftreten. Wenn das teilchenförmige MI und die Kügelchen dieselbe Ladung haben, kann ein polyionisches Reagenz mit der entgegengesetzten Ladung zu dem Medium gegeben werden, um nicht-spezifische Bindung zwischen dem teilchenförmigen MI und den Kügelchen zu verursachen.

Als nächstes wird das Medium einer Zentrifugalkraft unter­ worfen, welche ausreicht, um die unlöslichen Komponenten und das MI-Kügelchen zu trennen.

Bei der Ausführung des Verfahrens wird ein flüssiges Medium, welches ein wäßriges Medium umfaßt, angewandt. Der Ausdruck "wäßriges Medium", wie er hier verwendet wird, schließt Medien ein, bei denen das einzige vorhandene Lösungsmittel Wasser ist, oder Medien, die Wasser und andere polare Lösungsmittel, üblicherweise sauerstoffhaltige organische Lösungsmittel mit 1 bis 6, üblicherweise von 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, ein­ schließlich Alkoholen, Ethern und dergleichen, enthalten. Üblicherweise werden diese Cosolventien, falls sie vorhanden sind, in einer Menge von weniger als etwa 40 Gewichtsprozent, üblicherweise in weniger als etwa 20 Gewichtsprozent, vorhanden sein. Der pH des Mediums wird üblicherweise so eingestellt sein, daß die spezifische oder nicht-spezifische Bindung der MI an die Kügelchen vor der Trennung gefördert wird. Wenn die Kügelchen negativ geladen sind, wird eine Vergrößerung des pH-Werts eine Vergrößerung der Ladung fördern und spontane Aggregation, die durch nicht-spezifische hydrophobe und Van der Waals- Wechselwirkungen verursacht wird, verhindern. Das Umgekehrte ist der Fall für positiv geladene Kügelchen. Wenn ein gegensätzlich geladener Polyelektrolyt zugegeben wird um eine Bindung zu bewirken, wird eine Änderung im pH, welcher die Ladung des Polyelektrolyten vergrößert, häufig die Ladung der Kügelchen verringern und ein pH-Optimum muß so ausgewählt werden, daß die Verwendung von übermäßigen Mengen dieses Reagenzes vermieden wird. Im allgemeinen wird ein pH-Bereich von 5 bis 10, üblicherweise 6 bis 9 angewandt. Für eine Ligand-Rezeptor-Bindung ist bezüglich des pH-Werts zusätzlich zu berücksichtigen, daß ein signifikantes Niveau der Bindung von beispielsweise sbp- Mitgliedern oder Nukleinsäuren aufrechterhalten wird. Es können verschiedene Puffer verwendet werden, um den gewünschten pH zu erreichen und den pH während der Bestimmung aufrechtzuerhalten. Beispiele für Puffer sind Borat, Phosphat, Carbonat, Tris oder Barbital. Der speziell verwendete Puffer ist für die Erfindung nicht kritisch; jedoch kann bei individuellen Trennungen ein Puffer gegenüber anderen vorgezogen werden. Wenn teilchenförmiges MI involviert ist, kann ein Reagens, welches das Rückgängigmachen der Bindung des teilchenförmigen MIs und der Kügelchen fördert, zugegeben werden, nachdem die Trennung durchgeführt ist.

Mäßige Temperaturen werden normalerweise bei der Ausführung des Verfahrens angewandt und die Temperaturen sind üblicherweise während des Zeitraums zur Durchführung der Methode konstant. Im allgemeinen werden die Temperaturen so gewählt, daß die spezifische oder nicht-spezifische Bindung des MIs an die Kügelchen vor der Trennung gefördert wird. Die Temperatur für das Verfahren wird im allgemeinen im Bereich von 0 bis 50°C liegen, üblicherweise von ungefähr 15°C bis 40°C. Wiederum kann nach der beendeten Trennung eine Temperatur, welche die Umkehr der Bindung des MIs und der Kügelchen fördert, gewählt werden.

Die Konzentration der Kügelchen im Medium wird von der Menge des MIs im Medium abhängen, welches getrennt werden soll, ob es teilchenförmig ist oder nicht, von der Größe und Bindungskapazität der Kügelchen, der gewünschten Trennungsgeschwindigkeit, der Stärke der Zentrifugalkraft und der relativen Dichte des MI-Kügelchens, des Mediums und der unlöslichen Komponenten. Im allgemeinen ergeben höhere Konzentrationen an Kügelchen schnellere Bindungen an das MI und, falls das MI teilchenförmig ist und die Teilchen kleiner als das MI, können höhere Konzentrationen der Kügelchen auch effizientere und schnellere Trennungen ermöglichen. Jedoch kann eine zu hohe Konzentration der Kügelchen starke Überladung des Mediums hervorrufen. Die Konzentration wird normalerweise empirisch bestimmt und variiert im allgemeinen von 10⁴ bis über 10¹⁴ pro ml, üblicherweise von ungefähr 10⁶ bis 10¹² pro ml, am häufig­ sten von ungefähr 10⁷ bis 10¹⁰ ml.

Wenn teilchenförmiges MI von einem Medium getrennt werden soll, kann die Konzentration des teilchenförmigen MIs je nach Notwendigkeit stark variieren. Beispielsweise kann bei der Trennung von Blutzellen von Plasma, das Zellvolumen 50% des Gesamtvolumens des Bluts repräsentieren. Im Gegensatz dazu kann es wünschenswert sein, nur ein einziges Bakterium pro ml aus einer Probe von Wasser abzutrennen. Wenn es notwendig ist, teilchenförmiges MI zu erhalten, das relativ frei vom wäßrigen Medium ist, wie in einem Nachweisverfahren, sollte das Gesamtvolumen des teilchenförmigen MIs üblicherweise geringer als 20% des Mediums sein. Wenn das MI nicht teilchenförmig ist und an ein Kügelchen gebunden wird, wird die Konzentration des MIs im allgemeinen von ungefähr 10^-4 bis 10^-14 M variieren, vorzugsweise von ungefähr 10^-6 bis 10^-12 M. Parameter wie die Konzentration des MIs, spezifische und nicht­ spezifische Bindungseffekte, gewünschte Reaktionsge­ schwindigkeit, Temperatur, Löslichkeit, relative Dichte, Zentrifugalkraft und dergleichen werden normalerweise die Konzentration der anderen Reagenzien bestimmen.

Während die Konzentration der verschiedenen Reagenzien im allgemeinen durch den Konzentrationsbereich des MIs, welches getrennt werden soll, bestimmt wird, wird die Endkonzentration eines jeden der Reagenzien normalerweise empirisch bestimmt, um die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Trennung des MIs zu optimieren.

Wenn nicht-spezifische Bindung involviert ist, werden chemische Mittel zur Bildung nicht-spezifischer Bindungen zwischen dem teilchenförmigen MI und den Kügelchen üblicherweise im wäßrigen Medium eingeschlossen sein. Außer wenn teilchenförmiges MI getrennt werden soll, das die entgegengesetzte Ladung als die Kügelchen aufweist, wird dieses chemische Mittel üblicherweise ein polyionisches Reagens mit einer Ladung gegensätzlich zu der der Kügelchen sein. Die Menge des zugegebenen polyionischen Reagens sollte dafür ausreichend sein, daß im wesentlichen das gesamte teilchenförmige MI an die Kügelchen gebunden wird. Diese Konzentration sollte empirisch bestimmt werden. Überschüssiges Reagens sollte im allgemeinen vermieden werden, falls es die vollständige Bindung zwischen dem teilchenförmigen MI und den Kügelchen beeinträchigt. Im allgemeinen wird das polyionische Reagens eine Konzentration im flüssigen Medium besitzen, die ausreicht, um eine Anzahl von Ionen zu ergeben, die mit dem Polymer assoziiert sind und die der Gesamtanzahl der Ladungen des entgegengesetzten Zeichens auf allen Partikeln im Medium entspricht. Wenn teilchenförmiges MI getrennt werden soll, welches eine gegensätzliche Ladung gegenüber den Kügelchen aufweist, wird das chemische Mittel zur Bildung von nicht-spezifischer Bindung zwischen den Teilchen häufig ein Puffer niedriger Ionenstärke sein.

Die Bindung des MI oder teilchenförmigen MIs an die Kügelchen kann durch den pH beeinflußt werden. Die Bindung kann auch durch andere Faktoren, z. B. Ionenstärke und die Anwesenheit von ionischen und nicht-ionischen Polymeren beeinflußt werden. Im allgemeinen, wenn die nicht­ spezifische Bindung auf Ladungswechselwirkung beruht, sollte die Ionenstärke am Amfang so gewählt werden, daß die Bindung zwischen den Teilchen erleichtert wird. Für diesen Zweck ist die Ionenstärke im allgemeinen niedrig und kann im Bereich von 0,001 bis 0,5 M, vorzugsweise 0,005 bis 0,1 M liegen. Nachdem die Trennung beendet ist, kann die Ionenstärke nach oben eingestellt werden, um die Umkehr der Kupplung zwischen dem teilchenförmigen MI und den Kügelchen zu erleichtern. Für diesen Zweck wird die Ionenstärke des Mediums normalerweise 0,1 bis 10 M betragen, vorzugsweise 0,15 bis 1 M. Die Prinzipien, mit denen Partikel zur Aggregation oder zum Verbleib in einer Suspension gebracht werden, sind in der Kolloidwissenschaft wohlbekannt. Wenn spezifische Bindung involviert ist, ist die Ionenstärke im allgemeinen nicht kritisch und wird üblicherweise im Be­ reich von 10^-3 bis 10 M oder größer liegen.

Nachdem die Kügelchen zum wäßrigen Medium zugegeben wurden, und spezifische Bindung des MI an die Kügelchen ausgenutzt wird, wird das wäßrige Medium für einen Zeitraum, der für diese Bindung ausreichend ist, inkubiert. Normalerweise erfordert dies 0,1 bis 120 Minuten, häufiger 1 bis 60 Minuten. Wenn chemisch induzierte, nicht-spezifische Bindung von teilchenförmigem MI an Kügelchen involviert ist, wird die Bindung üblicherweise sehr schnell geschehen umd es reicht üblicherweise aus, die Mischung für einige wenige Minuten stehenzulassen, oft für nur 60 Sekunden, häufiger weniger als 15 Sekunden. Vorzugsweise wird die Zentrifugalkraft ummittelbar nach der Zugabe der Kügelchen und der anderen Reagenzien zum wäßrigen Medium angewandt. Das Ausmaß der Bindung zwischen dem MI oder dem teilchenförmigen MI und den Kügelchen ist ein Faktor zur Kontrolle der Effizienz der Trennung.

Die Dichte mindestens eines Teils eines flüssigen Mediums, welche das wäßrige Medium umfaßt, ist größer als die der unlöslichen Komponenten der Mischung. Das flüssige Medium kann ein homogenes wäßriges Medium sein, eine wäßrige Suspension von Teilchen, die imstande sind bei Zentrifugation einen Dichtegradienten zu ergeben, ein wäßriges Medium, das ein zweites üblicherweise stärker viskoses wäßriges oder nicht-wäßriges flüssiges Medium überschichtet. Das zweite Medium wird mindestens so dicht und üblicherweise dichter als das wäßrige Medium sein. Im allgemeinen beträgt die Dichte mindestens eines Teils des flüssigen Mediums, vorzugsweise des wäßrigen Mediums, mindestens 1,05 mal die Dichte der unlöslichen Komponenten. Im allgemeinen wird die Dichte der unlöslichen Komponenten ungefähr 0′7 bis 1,2 g/cm³, üblicherweise 1,0 bis 1,15 g/cm³ betragen. Natürlich sollte, wie schon oben erwähnt, die Dichte des flüssigen Mediums geringer sein als die des MI-Kügelchens.

Relativ höhere Dichten der wäßrigen Medien können auf eine Anzahl verschiedener Wege erreicht werden. Beispielsweise kann ein gelöster Stoff hoher Dichte dem wäßrigen Medium zugegeben werden, um die gewünschte Dichte zu erreichen. Vorzugsweise wird der gelöste Stoff hoher Dichte nicht leicht durch die Zellmembranen treten (wenn Zellen zu trennen sind) oder wesentlich zur Ionenstärke des Mediums beitragen. Beispiele solcher gelösten Stoffe hoher Dichte sind nicht-ionische oder neutrale, wasserlösliche polyiodierte organische Stoffe, die im Handel unter den Handelsnamen HYPAQUE^(R) und NYCODENZ^(R) erhältlich sind. Andere gelöste Stoffe hoher Dichte sind z. B. Salze mit hohem Molekulargewicht, d. h. Salze die Atome mit einer Atomzahl größer als 34 enthalten, z. B. Cäsiumchlorid; und Sucrose. Die Verwendung von Salzen mit hohem Molekulargewicht kann weniger wünschenswert sein, wenn lebensfähige Mikroorganismen getrennt werden sollen.

Ein anderer Ansatz zur Erzeugung eines Mediums hoher Dichte ist die Zugabe von teilchenförmigen Suspensionen zum Medium, z. B. Silicapartikelsuspensionen (im Handel unter dem Handelsnamen PERCOLL^(R) erhältlich). Nicht-wäßrige Medien hoher Dichte können organische oder anorganische Flüssigkeiten wie halogenierte Kohlenstoffverbindungen, Siliconflüssigkeiten und dergleichen umfassen.

Bei jedem der obigen Präparate kann das wäßrige Medium gegebenenfalls nach Zugabe des geeigneten Mittels und vor der Zentrifugation bewegt werden, um eine gleichmäßige Verteilung des Mittels im wäßrigen Medium zu gewährleisten und auf diese Weise eine gleichmäßige Dichte im wäßrigen Medium zu erreichen. Natürlich sollte die Bewegung nicht so stark sein, daß das MI, insbesondere teilchenförmiges MI wie Zellen oder Mikroorganismen, beeinträchtigt wird.

In einer alternativen Ausführungsform kann das wäßrige Medium über ein zweites Medium überschichtet werden, welches mindestens so dicht wie das wäßrige Medium ist und eine höhere Viskosität als das wäßrige Medium aufweist, um eine Mischung der Schichten zu minimieren. Das zweite Medium ist wäßrig oder nicht-wäßrig und, falls es wäßrig ist, kann es polare Lösungsmittel wie oben für das wäßrige Medium beschrieben, enthalten.

Die Viskosität des zweiten Mediums ist mindestens 1,5 mal so groß wie die Viskosität des wäßrigen Mediums, üblicherweise ungefähr 2 bis 100 mal so groß, vorzugsweise ungefähr 2,5 bis 75 mal so groß. Im allgemeinen liegt die Viskosität des wäßrigen Mediums im Bereich von 0,6 bis 1,3 und die des zweiten Mediums im Bereich von 1,5 bis 100 mPa.s.

Eine höhere Viskosität des zweiten Mediums kann dadurch er­ reicht werden, daß man als Teil des Mediums einen gelösten Stoff zur Erhöhung der Viskosität einschließt, beispielsweise ein Polyol wie Glykol oder Polyvinylalkohol, ein Saccharid, z. B. Mono- und Polysaccharide einschließlich Mannit, Glucose, Agar, Agarose, Sucrose, Stärke, Dextran oder hydrophile Polymere wie Polyethylenglykol, Polyacrylat oder Polyvinylpyrrolidon. Die Viskosität des zweiten Mediums kann nicht nur durch die Konzentration und Art des gelösten Stoffs kontrolliert werden, sondern auch durch die Temperatur, wenn es wünschenswert ist, eine solche Kontrolle zu erreichen. Die Viskosität des zweiten Mediums kann durch das Einstellen der Temperatur kontrolliert werden, wobei ein Ansteigen der Temperatur üblicherweise zu einer niedrigen Viskosität des Mediums führt. So können bei einer bestimmten Temperatur Schichten gebildet werden, worin die untere Schicht gelartig oder relativ viskos oder fest ist, und die Zentrifugation bei einer anderen, üblicherweise höheren, Temperatur ausgeführt werden, bei der die Viskosität niedriger ist oder das Medium flüssig wird und die Kügelchen die Schicht schneller passieren können. Die Trennung der Schichten kann dadurch erleichtert werden, daß die untere Schicht auf die ursprüngliche Temperatur zurückgebracht wird.

Als nächstes wird eine Zentrifugalkraft auf das wäßrige Medium ausgeübt, welches entweder alleine oder als Schicht neben dem anderen Medium wie oben ausgeführt, vorliegt. Die Intensität der Zentrifugalkraft ist ausreichend, um die MI-Kügelchen von den unlöslichen Komponenten zu trennen. Die Anwendung einer Zentrifugalkraft auf das Medium kann auf jede übliche Weise ausgeführt werden, die zu einer solchen Zentrifugalkraft führt, beispielsweise konventionelle Zentrifugation oder schnelles Drehen des Gefäßes, welches das Medium enthält, um seine Achse. Das Verfahren kann in einem Behälter aus beispielsweise Glas oder Kunststoff ausgeführt werden. Bei der Anwendung der Zentrifugalkraft kann der Reaktionsbehälter in eine Zentrifuge eingebracht werden. Je größer die Zentrifu­ galkraft ist, desto schneller ist die Trennung der MI-Kügelchen und der unlöslichen Komponenten. Vorzugsweise wird der Behälter um seine Achse gedreht, wobei es günstig ist, die Trennung in einer Röhre mit einem Durchmesser von 1 bis 10, vorzugsweise 1,5 bis 5 cm, durchzuführen. Die erforderliche Zentrifugalkraft, d. h., die Rotationsgeschwindigkeit und -verhältnisse wird variieren, abhängig von der Auftriebsdichte der MI-Kügelchen in dem flüssigen Medium, der Viskosität des flüssigen Mediums und der gewünschten Trennungszeit. Die Zentrifugalkraft wird für eine Zeit ausgeübt, die ausreicht, um den gewünschten Trennungsgrad der MI-Kügelchen und der unlöslichen Komponenten zu erreichen.

Wenn das wäßrige Medium dichter ist als die unlöslichen Komponenten, werden die MI-Kügelchen und die unlöslichen Komponenten unter der Anwendung einer Zentrifugalkraft getrennt, dadurch daß die MI-Kügelchen und die unlöslichen Komponenten sich im Medium in entgegengesetzter Richtung bewegen. Die dichteren MI-Kügelchen werden im Medium nach außen wandern, beispielsweise zum Boden eines Behälters, der das Medium enthält, während die unlöslichen Komponenten zum oberen Teil des wäßrigen Mediums oder zur Zentrifugationsachse wandern werden.

Wenn ein zweites Medium verwendet wird, werden die MI-Kügelchen unter der geeigneten Zentrifugalkraft in das zweite Medium wandern, während die unlöslichen Komponenten im wäßrigen Medium verbleiben.

In einer weiteren Ausführungsform kann das wäßrige Medium anstatt einer Behandlung zur Einstellung der Dichte, mit einem Medium überschichtet werden, welches eine geringere Dichte als das der MI-Kügelchen aufweist, aber größer als das aller unlöslichen Komponenten im wäßrigen Medium ist. In dieser Ausführungsform wird die Anwesenheit einer Zentrifugalkraft genügender Stärke die MI-Kügelchen veranlassen, in das dichtere Medium zu wandern, während die unlöslichen Komponenten und die löslichen Komponenten im wäßrigen Medium verbleiben.

Beispielsweise kann ein Mikroorganismus von einer Mischung, welche die den Mikroorganismus und andere Komponenten enthält, durch die Bindung des Mikroorganismus an eine Vielzahl von Kügelchen in einem ersten Medium um Mikroorganismus-Kügelchen zu bilden, getrennt werden. Das erste Medium wird mit einem zweiten Medium, welches eine größere Dichte als das erste Medium, aber geringer als die der Mikroorganismus-Kügelchen aufweist, in Kontakt gebracht. Die zusammengebrachten ersten und zweiten Medien werden in einer Zentrifugation unterworfen, um die Microorganismus-Kügelchen zu veranlassen, sich in einem Bereich außerhalb des ersten Mediums zu sammeln. Der Bereich ist von dem der anderen Komponenten getrennt.

In einer weiteren Ausführungsform werden das erste wäßrige Medium und das zweite Medium kombiniert und über ein drittes Medium geschichtet, das eine höhere Viskosität als die kombinierten ersten und zweiten Medien hat. In einem Beispiel enthält das dritte Medium ein Saccharid und die Schichten werden bei einer Temperatur gebildet, bei der das dritte Medium von höherer Viskosität ein Gel ist, und mindestens ein Teil der Zentrifugation wird bei einer Temperatur ausgeführt, bei der das Medium von höherer Viskosität kein Gel ist. Nach diesem Teil der Zentrifugation kann das Medium der höheren Viskosität wieder Gelform annehmen und die Schichten können getrennt werden.

In einer weiteren Ausführungsform ist das wäßrige Medium dichter als die unlöslichen Komponenten und liegt als Schicht neben einem zweiten Medium einer höheren Viskosität und mindestens gleicher Dichte wie das wäßrige Medium vor. Dieses letztere Medium höherer Viskosität wird ähnliche Charakteristiken aufweisen wie oben für das zweite Medium beschrieben.

Die Anwesenheit einer Zentrifugalkraft ausreichender Stärke wird die MI-Kügelchen dazu veranlassen, in das zweite Medium zu wandern, während die unlöslichen Komponenten ebenso wie die löslichen Komponenten im wäßrigen Medium verbleiben.

Sobald die MI-Kügelchen von den unlöslichen Komponenten ge­ trennt sind, können die MI-Kügelchen vom Medium mit den unlöslichen Komponenten durch übliche Mittel, z. B. Dekantieren oder Pipettieren entfernt werden.

Die MI-Kügelchen können aus dem zweiten Medium ,falls ein zweites Medium verwendet wird, durch übliche Methoden, bei­ spielsweise Filtration, Dekantieren oder Pipettieren, entfernt werden. Die abgetrennten MI-Kügelchen können behandelt werden, um die Bindung zwischen dem MI und den Kügelchen aufzuheben. Die Aufhebung der Bindung zwischen dem MI, teilchenförmig oder nicht, und den Kügelchen hängt von der Natur der Bindung zwischen den Teilchen ab. Beispielsweise können die MI-Kügelchen in einem flüssigen Medium suspendiert sein, unter Zugabe von Reagenzien, welche die Aufhebung der Bindung erleichtern. Bei einem Ansatz, worin teilchenförmiges MI an Kügelchen durch ionische Wechselwirkung gebunden ist, kann die Ionenstärke und der pH des Mediums zur Erleichterung der Aufhebung der Bindung eingestellt werden. Im allgemeinen wird die Erhöhung der Ionenstärke elektrostatische Bindungen auf­ heben. Wenn das teilchenförmige MI und die Kügelchen gegensätzlich geladen sind, kann eine Änderung des pH-Werts eine der Ladungen neutralisieren und die Bindungswechselwirkungen verringern. Alternativ kann bei Verwendung eines polykationischen Bindungsmittels zur Bindung von negativ geladenem teilchenförmigem MI an negativ geladene Kügelchen ein Verringern des pH-Werts die Ladung neutralisieren und die Bindung aufheben. Auf diese Weise kann es wünschenswert sein, den pH nach höheren oder niedrigeren Werten zu verändern, wie es die Stabilität der Reagenzien erlaubt, üblicherweise nicht niedriger als pH 4 oder größer als pH 10.

Bei nicht-spezifischer Bindung als Ergebnis von Ladungswechselwirkungen kann ein anderes Mittel statt Säure oder Base zugegeben werden, um die für die nicht­ spezifische Bindung verantwortlichen Ladungswechselwirkung aufzuheben. Beispielsweise kann ein freisetzendes Mittel zugegeben werden. Wenn die Teilchen gleiche Ladung haben und ein gegensätzlich geladener Polyelektrolyt das chemische Mittel zur Bindung der Partikel war, kann ein Polyelektrolyt derselben Ladung wie die Partikel dazu verwendet werden, die Partikel zu dissoziieren. Die Polyelektrolyten können beispielsweise Polyanionen wie Dextransulfat, Heparin, Polyglutamat, Polyacrylat, Phospholipid-Vesikel, Carboxymethyldextran oder Citrat sein. Aminodextran, Chitosan, Polybren, Polyethylenimin und kationische Liposomen sind Beispiele von verwendbaren Polykationen.

Wenn ein Polykation zur Einleitung nicht-spezifischer Bindung zwischen dem teilchenförmigen MI und den Kügelchen verwendet worden war, kann ein Polyanion dazu verwendet werden, die Bindung aufzuheben. Als Alternative kann bei Verwendung eines Polyanions zur Bildung nicht-spezifischer Bindung zwischen den Partikeln ein Polykation zur Aufhebung der Bindung verwendet werden. Wurden beispielsweise Polykationen wie Polybren oder Bariumionen verwendet, kann das freisetzende Mittel ein Polyanion wie Citrat oder Sulfat sein. Detergentien können als freisetzende Mittel für Liposome wirken und für Partikel, welche in erster Linie durch hydrophobe Wechselwirkungen nicht-spezifisch aggregiert sind.

Für teilchenförmiges oder nicht-teilchenförmiges MI, das mittels Ligand-Rezeptor-Bindung spezifisch an die Kügelchen gebunden ist (um MI-Kügelchen zu bilden), kann der freie Ligand oder Rezeptor als freisetzendes Mittel wirken. Bei kovalenter Bindung wird üblicherweise ein hydrolytisches oder Redox-Reagenz, das die kovalente Bindung unterbrechen kann, verwendet werden.

Die Konzentration des freisetzenden Mittels sollte ausreichen, um in einer wesentlichen oder vollständigen Aufhebung der Bindung zwischen dem teilchenförmigen MI und dem Kügelchen zu resultieren. Die Konzentration des freisetzenden Mittels ist im allgemeinen abhängig von der Natur der Bindung zwischen dem teilchenförmigen MI und den Kügelchen und der Natur des MI. Im allgemeinen wird für teilchenförmiges MI die Konzentration des freisetzenden Mittels mindestens gleich groß wie die Konzentration der ionischen oder hydrophoben Stellen auf dem teilchenförmigen MI, vorzugsweise mindestens zehnfach höher sein.

Es ist wichtig, das freisetzende Mittel unter Berücksichtigung der Natur des MIs zu wählen, um Beschädigung des MI nach der Freisetzung von den MI-Kügelchen zu minimieren oder zu vermeiden, besonders wenn teilchenförmiges MI, wie Zellen oder Mikroorganismen, involviert ist.

Sobald das MI von den MI-Kügelchen freigesetzt ist, kann es wie gewünscht verwendet werden. Beispielsweise kann das freigesetzte MI auf die Anwesenheit eines nachweisbaren Si­ gnals in Bezug zur Menge eines Analyten in der Probe unter­ sucht werden. Im allgemeinen wird ein Marker verwendet, entweder von Anfang an oder in dem nachfolgenden Nachweis­ schritt. Freigesetztes teilchenförmiges MI können Zellen sein, welche nachfolgend wie gewünscht verwendet werden. Beispielsweise kann das freigesetzte teilchenförmige MI rote Blutkörperchen oder Mikroorganismen sein. Wenn der Nachweis von Zellen oder Mikroorganismen erwünscht ist, kann man ein Mittel verwenden, das in die Membran des nachzuweisenden Materials inkorporiert wird, beispielsweise ein Farbstoff. Zum Beispiel können Interkalationsfarbstoffe wie Squarat-Farbstoffe oder Cyanin-Farbstoffe verwendet werden.

Ein wichtiger Aspekt des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist, daß es möglich ist, ein oder mehrere einer Vielzahl von Materialien von Interesse von unlöslichen Kom­ ponenten in einem Medium zu trennen. Dies kann dadurch er­ reicht werden, daß Sets von Kügelchen verschiedener Größe oder verschiedener Dichte oder beidem verwendet werden. Jedes Set von Kügelchen hat eine Bindungsaffinität, spezifisch oder nicht-spezifisch wie oben beschrieben, für eines der Materialien von Interesse. Das Verfahren wird wie oben beschrieben durchgeführt und die verschiedenen Sets von Kügelchen bilden jeweils ein getrenntes diskretes Aggregat in einem oder mehreren der bei der Trennung verwendeten Medien. Die diskreten Aggregate werden getrennt und, wie oben für ein einzelnes Material von Interesse beschrieben, behandelt.

Eine Anwendung des vorliegenden Verfahrens ist die Entfernung von Mikroorganismen von festen Bruchstücken, beispielsweise Entfernung von Mikroorganismen aus einer Zervixschleimprobe. In dem Verfahren wird beispielsweise eine Zervixschleimprobe in einem wäßrigen Medium mit Kügelchen kombiniert, unter Bedingungen für die spezifische Bindung der Kügelchen an einen Mikroorganismus von Interesse um Mikroorganismus-Kügelchen zu bilden. Die Mikroorganismen tragen ein Antigen auf ihrer Oberfläche. Die Kügelchen tragen einen Antikörper für ein derartiges Antigen an ihre Oberfläche gebunden, mit dem Ergebnis einer spezifischen Bindung zwischen dem Mikroorganismus und den Kügelchen. Das wäßrige Medium wird so ausgewählt, daß es weniger dicht ist als die Mikroorganismus-Kügelchen, aber von größerer Dichte als die anderen unlöslichen Komponen­ ten in dem Medium.

Als nächstes wird das Medium einer Zentrifugalkraft ausge­ setzt, um die Mikroorganismus-Kügelchen zu veranlassen, sich von den unlöslichen Komponenten im Medium zu trennen, und dadurch die Entfernung von den unlöslichen Komponenten beispielsweise durch Dekantieren oder Pipettieren zu ermöglichen.

Die entfernten Mikroorganismus-Kügelchen können dann behandelt werden, um die Mikroorganismen von den Kügelchen wie oben beschrieben freizusetzen.

Die vorliegende Erfindung ist anwendbar bei Nachweisverfahren für einen Analyten in einer Probe, von der man annimmt, daß sie den Analyten enthält. Der Analyt ist ein sbp-Mitglied. Der Analyt kann teilchenförmiges oder nicht-teilchenförmiges MI sein und ein MI-Kügelchen bilden durch die Bindung an ein Kügelchen mittels eines komplementären sbp-Mitglieds, welches an das Kügelchen gebunden ist oder daran gebunden werden wird. Entweder der Analyt oder eine Substanz, deren Anwesenheit in Beziehung zur Anwesenheit des Analyten steht, d. h. z. B. ein von der Oberfläche einer Zelle entferntes Antigen, ein zum Analyt komplementäres sbp-Mitglied oder dergleichen, kann das MI darstellen. Im Nachweisverfahren wird die Probe in einem wäßrigen Medium üblicherweise mit einem dem Analyt komplementären sbp-Mitglied kombiniert. Mindestens entweder der Analyt oder das komplementäre sbp-Mitglied ist ein MI, welches imstande ist, an Kügelchen zu binden, die dem Medium zugegeben wurden, um so MI-Kügelchen zu bilden.

Vorzugsweise kann das wäßrige Medium vor dem Inkontaktbringen mit der Probe behandelt werden, um seine Dichte einzustellen und darauf oder nach dem Kontakt mit der Probe wird das wäßrige Medium mit einem zweiten Medium mit höherer Viskosität als das wäßrige Medium in Kontakt gebracht. Nach der Bindung des MI an die Kügelchen wird das Medium einer Zentrifugalkraft ausgesetzt, welche ausreicht, die MI-Kügelchen von anderen Komponenten in der Probe zu trennen. Das Nachweisverfahren wird normalerweise ein Signal-erzeugendes System zur Erzeugung eines nachweisbaren Signals in Bezug zur Menge des Analyten in der Probe enthalten. Das Signal-erzeugende System schließt üblicherweise ein markiertes sbp-Mitglied ein. Die MI-Kügelchen, üblicherweise nach der Trennung von dem Teil des Mediums, das die anderen Komponenten enthält, kann weiterhin mit einem oder mehreren Mitgliedern des Signal­ erzeugenden Systems kombiniert werden. Dieses kann dann auf die Anwesenheit eines nachweisbaren Signals untersucht werden. Eine derartige Bestimmung kann die Zugabe von irgendwelcnen restlichen Mitgliedern des Signal-erzeugenden Systems erfordern, welche vorher nicht zugegeben wurden. Als Alternative können die MI-Kügelchen behandelt werden, um das MI von den Kügelchen vor der Untersuchung auf die Anwesenheit eines nachweisbaren Signals zu trennen. Nachdem das MI von den Kügelchen getrennt worden ist, kann das MI auf die Anwesenheit eines nachweisbaren Signals, welches im Verhältnis zur Menge des Analyten in der Probe erzeugt worden ist, untersucht werden. Der letztere Ansatz ist am meisten anwendbar auf teilchenförmiges MI. Für diesen Zweck kann das MI mit irgendwelchen restlichen Mit­ gliedern des Signal-erzeugenden Systems, welches vorher nicht zugegeben wurde, kombiniert werden, um ein nachweisbares Signal zu erhalten.

Das Verfahren erlaubt eine schnelle Konzentration und Trennung von nachzuweisenden Substanzen aus Flüssigkeiten, die das Wachstum inhibieren oder anderweitig den Nachweis beeinträchtigen. Andere Trennverfahren, beispielsweise (1) Trennung von Mikroorganismen von festen Bruchstücken durch die Bindung an Kügelchen und Zentrifugation ohne ein Medium hoher Dichte oder (2) Trennung von nicht-teilchenförmigen Materialien von anderen gelösten Stoffen durch die Bindung des Materials an Kügelchen und Zentrifugation ohne die Verwendung einer zweiten flüssigen Schicht, die frei von der Probe ist, erreichen keine gute Trennung. Das Verfahren ist vorteilhaft nicht nur zum Zweck eines Nachweisverfahrens für das zu trennende Material, sondern auch für die Trennung eines Zelltyps von einer Mischung von Zellen z. B. einer Hybridomazelle, die einen spezifischen Antikörper erzeugt, von anderen Hybridomazellen, um damit reine Antikörper herzustellen. Auf diese Weise kann durch die Verwendung von schweren Kügelchen, die nicht wesent­ lich größer sind als die zu trennenden Zellen, z. B. Gold- Sole oder Silicapartikel, die nicht-spezifische Bindung die üblicherweise bei der Trennung von Zellen durch "Panning" auftritt, minimiert werden. Das Verfahren kann auch Verwendung bei der Entfernung metastatischer Zellen und T-Zellen für die Transplantation finden oder um Tumorrückbildung oder Abstoßungsreaktionen bei Gewebetransplantationen zu verhindern.

Die Erfindung betrifft ferner eine Zusammensetzung, umfassend (1) ein wäßriges Medium, welches Kügelchen enthält, an die ein Material von Interesse (MI-Kügelchen) gebunden ist, worin das Medium eine geringere Dichte als die MI-Kügelchen und eine größere als die der anderen unlöslichen Komponenten in dem Medium besitzt. Diese Zusammensetzung kann ferner ein zweites Medium mit mindestens gleicher Dichte und höherer Viskosität als das wäßrige Medium einschließen. Als Alternative kann die Zusammensetzung (1) ein wäßriges Medium mit MI-Kügelchen enthalten und (2) ein zweites flüssiges Medium als Schicht neben dem wäßrigen Medium, worin das zweite Medium eine geringere Dichte als die MI-Kügelchen, aber größer als die anderen unlöslichen Komponenten in dem wäßrigen Medium aufweist. Als Alternative können die Kügelchen in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ein an ein daran gebundenes sbp-Mitglied gebundenes MI aufweisen, oder die Kügelchen können an das MI mittels eines polyionischen Reagens gebunden sein.

Aus Gründen der Bequemlichkeit können die Reagenzien zur Durchführung einer Trennung gemäß der vorliegenden Erfindung in einem Kit in abgepackter Kombination mit vorherbestimmten Mengen zur Verwendung für eine derartige Trennung bereitgestellt werden. Die Komponenten des Kits können getrennt verpackt sein oder eine oder mehrere Komponenten des Kits können zusammen verpackt sein, abhängig von der gegenseitigen Interreaktionsfähigkeit dieser Komponenten. Das Kit kann Kügelchen, Mittel zur Herstellung eines flüssigen Mediums hoher Dichte und Mittel zur Herstellung eines Mediums höherer Viskosität als die des flüssigen Mediums umfassen. Das Kit kann ferner Mittel einschließen, welche die Kügelchen veranlassen, ein Material von Interesse zu binden. Beispielsweise können die Kügelchen ein sbp-Mitglied an ihrer Oberfläche gebunden tragen. Das sbp-Mitglied ist komplementär zu einem MI und liefert das Mittel, um das MI an die Kügelchen zu binden. Das Kit kann ein polyionisches Reagens zur Bindung eines teilchenförmigen MIs an die Kügelchen einschließen. Weiterhin kann ein freisetzendes Mittel zur Freisetzung von teilchenförmigem MI von den Kügelchen eingeschlossen sein.

Für Nachweisverfahren kann das Kit (a) ein sbp-Mitglied komplementär zum Analyten, (b) Kügelchen mit einem daran gebundenen sbp-Mitglied, wobei das sbp-Mitglied komplementär zu dem sbp-Mitglied oder zum Analyten ist, umfassen. Als Alternative kann das Kit geladene Kügelchen und ein polyionisches Reagens mit einer Ladung entgegengesetzt der des teilchenförmigen MI enthalten, wenn alle Partikel dieselbe Ladung tragen. Als Alternative kann das Kit ferner ein freisetzendes Mittel zur Aufhebung der Bindung zwischen den Partikeln enthalten. Das Kit kann außerdem Reagenzien zur Erzeugung eines Signals in Beziehung zur Menge des Analyten in einer Probe enthalten. Gegebenenfalls können weitere Hilfsmittel enthalten sein.

Beispiele

Die Erfindung wird durch die folgende Beispiele weiter erläutert. Alle Teile und Prozentangaben sind auf das Volumen bezogen, wenn nicht anderweitig angegeben. Temperaturangaben sind in °C.

MATERIALIEN UND METHODEN

Escherichia coli, Stamm K-12, ATCC 10 798 wurde für alle be­ schriebenen Experimente verwendet. Die Bakterien wurden auf "Tryptic Soy Agar" (TSA) -Platten über Nacht bei 37°C in einem 5% CO₂-Inkubator gezüchtet. Die Bakterien wurden in 1 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,5, suspendiert und durch Zentrifugation in einer "Microfuge" für 2 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Der Bakterienniederschlag wurde bei 10⁹ CFU/ml in PBS, pH 7,5, welcher 1% BSA (W/V) und 50 µg/ml polyclonalen Kaninchen­ anti-E.coli (DAKO) enthält, suspendiert und die Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bakterien wurden wie oben beschrieben zentrifugiert und dreimal mit PBS-1% BSA, pH 7,5, gewaschen, um überschüssigen ungebundenen Kaninchen-Antikörper zu entfernen.

Bindung von kolloidalem Gold - Die mit Antikörper bedeckten Bakterien wurden in 10 µl von PBS-1% BSA, pH 7,5, der Ziegen-Anti-Kaninchen IgG-kolloidale Gold-Konjugate (10¹² bis 10¹³ Partikel/ml) verschiedener Größen (5, 20 und 30 nm) enthielt, inkubiert. Nach dem Resuspendieren der Bakterien in dem kolloidalen Gold-Reagenz, wurden die Zellen für 30 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Bindung von 4 µm Silicapartikeln - Die mit Antikörper bedeckten Bakterien wurden in 50 µl PBS-1% BSA, pH 7,5, der 4 µm Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Silicapartikel (3.6 × 10⁷/ml) enthielt, inkubiert. Nach dem Suspendieren der Bakterien in der Silicapartikel-Suspension wurden die Proben mit einem Rotationsschüttler für 15 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur gemischt.

Eine Stammlösung von Percoll^(R) (SIGMA Chemical Company, St. Louis, MO) wurde durch Verdünnung des im Handel erhältlichen Percoll hergestellt unter Verwendung von 2,5 M Sucrose in einem Verhältnis 9 : 1. Diese Percoll-Stammlösung wurde in Oak Ridge-Tubes pipettiert und die Gradienten in einer Sorvall RC-5B-Zentrifuge bei 12 500 U/min für 30 Minuten bei 20°C zentrifugiert. Dichtemarker-Kügelchen (Pharmacia, Piscataway, N.J.) wurden dazu verwendet, die Gradienten visuell zu kalibrieren. Für direkte Messungen der Gradientendichte unmittelbar nach der Zentrifugation, wurden 0,5 ml Aliquots nacheinander von der Spitze des Gradienten unter Verwendung einer Auslaufpipette entfernt und auf einer Mettlerwaage gewogen. Die Pipette wurde durch destilliertes Wasser geeicht und die Dichten direkt berechnet.

Eine Stammlösung von Nycodenz (Nycomed, Oslo, Norwegen) wurde durch das Auflösen des Feststoffs in destilliertem Wasser und Einstellen des pH-Werts auf 7,5 hergestellt. Die Stammlösung wurde auf 55,5% (W/V) verdünnt, um Lösungen verschiedener Dichte (1,2 bis 1,3 g/ml) herzustellen, und Polyvinylpyrrolidon (PVP) (90K) zugegeben bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml. 2 ml der Nycodenz/PVP-Lösung wurde zum Boden der Oak Ridge-Tubes zugegeben und die Proben, welche Partikel (Gold oder Silica) und Bakterien in 0,5 ml PBS enthielten, darüber geschichtet und das Röhrchen wie oben für die Percoll-Gradienten beschrieben zentrifugiert.

Für Gradienten, bei denen lebensfähige Bakterien in verschiedenen Fraktionen des Gradienten bestimmt wurden, wurden 1 ml-Fraktionen nacheinander von der Spitze des Gradientenröhrchens entfernt, in Serie mit PBS (zehnfache Verdünnungen) wenn nötig verdünnt, und 1 ml-Proben auf vorher getrocknete TSA-Platten ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C über Nacht inkubiert und sichtbare Kolonien am nächsten Tag gezählt, um so Kolonie-bildende Einheiten (CFU) zu bestimmen.

Zur DNA-Analyse wurden die Proben in 1% SDS mit 25 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA, 250 µg/ml Proteinase K lysiert und für 30 Minuten bei 50°C inkubiert. Dadurch wurden die meisten Zellbruchstücke gelöst und die DNA wurde durch die Dibenzimidazol-Methode unter Verwendung eines Hoefer TKO- Minifluorometers, Cesarone et al., Anal. Biochem. Bd. 100, S. 188-197 (1979), gemessen. Ungeschnittene Lambda-DNA wurde als Standard zur Eichung des Fluorometers benutzt.

Vollblut, welches einigermaßen frisch war (weniger als 1 Woche alt) wurde unter Verwendung eines ISOLATOR^(R) (duPont) für 5 bis 10 Minuten lysiert und EDTA bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben. Diese lysierte Blutprobe wurde für Experimente verwendet, in denen die Trennung von Bakterien von lysierten Blutkomponenten untersucht wurde. In solchen Fällen bestand typischerweise 50% (V/V) der Probe aus lysiertem Blut.

ERGEBNISSE Die Dichte von Bakterien wird durch die Bindung von kolloidalem Gold vergrößert A. Percoll-Gradienten

E. coli-Zellen wurden mit Kaninchen-Antikörpern bedeckt und mit kolloidalen Goldpartikeln, die Ziegen-Anti- Kaninchen-IgG trugen, behandelt; kolloidale Goldpartikel mit 5, 20 und 30 nm wurden verwendet, um die Dichte der Bakterien zu erhöhen, und Percoll- Gradienten (Ausgangsdichte = 1,124 g/ml) wurden dazu verwendet, um überschüssige kolloidale Goldpartikel von den E. coli-Bakterien, die mit kolloidalem Gold bedeckt waren, zu trennen. Die Percoll-Gradienten wurden visuell untersucht. Verschiedene Punkte sind bemerkenswert.

• 1. Die Dichte von Bakterien wird durch die Bindung von kolloidalen Goldpartikeln an die Zellen vergrößert. E. coli, die entweder nicht mit dem kolloidalen Goldkonjugat behandelt wurden oder an ihrer Oberfläche keine Kaninchen-Antikörper gebunden trugen, ergaben Banden an der Spitze des Gradienten, während die Bindung durch kolloidales Gold die Bakterien dazu veranlaßte, Banden an Positionen innerhalb des Gradienten zu ergeben.
• 2. Bei einer Vergrößerung der kolloidalen Goldpartikel, welche an die Bakterien gebunden waren, wurde die scheinbare Dichte der Bakterien ebenfalls vergrößert; 5-nm-Partikel­ beschichtete-Bakterien erschienen als heterogene Bande mit Dichten zwischen 1,119 bis 1,121 g/ml; 20-nm-Partikel-beschichtete Bakterien erschienen als Bande bei 1,152, während 30-nm-P­ artikel-beschichtete Bakterien als Bande bei <1,16 g/ml erschienen. Überschüssige kolloidale Goldpartikel wurden während der Zentrifugation auf den Boden der Röhrchen gezogen.
• 3. Eine Dichte-Kalibrierung des Percoll-Gradienten wurde entwickelt und es zeigte sich, daß die mit 5-nm-Partikel bedeckten Bakterien sich in einer schmalen Region des Gradienten befanden, während die mit 20- und 30-nm-Partikel bedeckten Bakterien in Richtung des Bodens des Gradienten befanden (Fig. 1).

B. Fercoll-Diatrazoat-Gradienten

Um genauere Dichtebestimmungen der E. coli zu erhalten, welche mit den 20- und 30-nm-kolloidalen Goldpartikeln bedeckt waren, wurden Trennungen in Percoll mit Natrium-Ditrazoat (Hypaque) mit einer Ausgangsdichte von 1,19 g/ml ausgeführt. Bei einer Größenzunahme der kolloidalen Goldpartikel wuchs die Dichte. Mit 5-nm-Partikeln bedeckte E. coli erschienen als Bande bei 1,1377, während 20-nm- Partikel in Dichten von 1,1907 und 1,2023 g/ml ergaben; 30-nm-Partikel ergaben Dichten von 1,1963 bis 1,2173 /ml. Die gravimetrische Dichte-Kalibrierung des Percoll-Ditrazoat-Gradienten ist in Fig. 2 gezeigt.

C. Percoll-Gradienten

E. coli-Zellen wurden mit Kaninchen-Antikörpern bedeckt und mit Goldpartikel behandelt, welche Ziegen-Anti- Kaninchen-IgG enthielten. Percoll-Gradienten (Ausgangsdichte = 1,124 g/ml) wurden zur Trennung der freien Bakterien verwendet. Die Gradienten wurden fraktioniert und die Fraktionen ausplattiert, um die Positionen der Bakterien zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Bakterieneinfang in Puffer

Trennung durch Percoll-Gradienten

Die Dichte von Bakterien wird durch die Bindung von 4-µm-Silica-Partikeln erhöht A. Percoll-Gradienten

E.-coli-Zellen wurden mit Kaninchen-Antikörpern bedeckt und mit Silica-Partikeln behandelt, welche Ziegen- Anti-Kaninchen-IgG enthielten. Percoll-Gradienten (Ausgangsdichte = 1,124 g/ml) wurden dazu verwendet, um die freien Bakterien von den Silica-Partikeln (Dichte ungefähr 1,4 g/ml) zu trennen. Die Gradienten wurden fraktioniert und die Fraktion ausplattiert, um die Position der Bakterien zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Die Dichte der Bakterien wurde durch die Bindung an Silica-Partikel vergrößert. E. coli, die entweder nicht mit Silica behandelt wurden oder kein Kaninchen- Antikörper an ihrer Oberfläche gebunden trugen, ergaben Banden an der Spitze des Gradienten während die Bindung an Silica die Bakterien dazu veranlaßte, am Boden des Gradienten zu pelletieren.

Tabelle 2

Bakterieneinfang durch Silica

Percoll-Trennung

Flüssigkeitsschichten mit einer Dichte <1,23 bringen aus Blut erhaltene Zellbruchstücke zum Schwimmen

Die oben erhaltenen Daten zeigen, daß die Markierung von E. coli mit 30 nm kolloidalen Goldpartikeln die Bakteriendichte auf <1,2 g/ml erhöhen kann.

Vollblut wurde unter Verwendung einer ISOLATOR (duPont)- Röhre lysiert und mit dem lysierten Blut die Spitze eines Nycodenz-Polsters gleichen Volumens und verschiedener Dichten überschichtet. Diese Röhren wurden dann einer Zentrifugation unterworfen und das Aussehen der Röhren untersucht. Die Zentrifugation von lysiertem Blut über ein Polster mit einer Dichte von 1,0 ergab ein großes Pellet von aus Blut stammenden Zellbruchstücken. Eine Vergrößerung der Dichte des flüssigen Mediums auf <1,23 veranlaßte die Zellbruchstücke, an der Spitze des Polsters zu verbleiben. Die DNA-Analyse des Pellets zeigte, daß <95% der DNA, die in der ursprünglichen Probe anwesend war, in dem Pellet nach der Zentrifugation im Medium der Dichte <1,23 g/ml, abwesend war.

Flüssigkeitsschichten mit einer Dichte von 1,2 erlauben die Pelletierung von Gold-markierten Bakterien: Nycodenz-Polster

E. coli-Zellen wurden mit Kaninchen-Antikörpern bedeckt und mit kolloidalen Goldpartikeln (30 nm), welche Ziegen-Anti- Kaninchen-IgG enthielten, behandelt. Nycodenz-Polster wurden dazu verwendet, die freien Bakterien von den kolloidalen Goldpartikeln zu trennen. Der Nycodenz- Gradient wurde fraktioniert und die Fraktionen ausplattiert, um die Position der Bakterien zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

Die Dichte der Bakterien wurde durch die Bindung an 30-nm-kolloidalen Goldpartikeln vergrößert. E. coli, die entweder nicht mit kolloidalem Gold behandelt worden waren oder keine Kaninchen-Antikörper an ihrer Oberfläche gebunden trugen, drangen nicht in das Nycodenz-Polster ein, während die Bindung an kolloidales Gold die Bakterien dazu veranlaßte, am Boden des Gradienten zu pelletieren; <93% der Bakterien wurden eingefangen und effektiv am Boden des Röhrchens abgetrennt (Tabelle 3).

Tabelle 3

Bakterieneinfang in Puffer

Trennung durch Nycodenz-Polster

Flüssige Schichten mit einer Dichte von 1,3 erlauben die Pelletierung von Silica-gebundenen Bakterien: Nycodenz- Polster

E.-coli-Zellen wurden mit Kaninchen-Antikörpern bedeckt und mit Silica-Partikeln, welche Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG trugen, in Gegenwart bzw. Abwesenheit von 50% lysiertem Blut behandelt. Nycodenz-Polster wurden dazu verwendet, die freien Bakterien von den Silica-Partikeln zu trennen (Dichte ungefähr 1,4 g/ml). Der Nycodenz-Gradient wurde fraktioniert und die Fraktion ausplattiert, um die Position der Bakterien zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.

Die Dichte der Bakterien wurde durch die Bindung an Silica- Partikel vergrößert. E. coli, die entweder nicht mit Silica behandelt worden waren oder keine Kaninchen- Antikörper an ihrer Oberfläche gebunden trugen, traten nicht in das Nycodenz-Polster (Dichte = 1,3 g/ml) ein, während die Bindung an Silica die Bakterien dazu veranlaßte, am Boden des Gradienten zu pelletieren. Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurden <98% der Bakterien von Silica eingefangen und unter Verwendung von Nycodenz, mit einer Dichte von 1,3 von den Blutkomponenten getrennt.

Tabelle 4

Bakterieneinfang durch Silica

50% lysiertes Blut; Nycodenz-Trennung

Die Erfindung ermöglicht eine einfache, effektive und voll­ ständige Trennung eines Materials von Interesse von anderen in einer Probe enthaltenen Komponenten. Ein signifikanter Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das Waschen des Materials von Interesse frei von anderen Komponenten während der Passage von einem Medium zu einem Medium mit höherer Dichte und/oder höherer Viskosität erfolgen kann.

Claims (15)

1. Verfahren zur Trennung eines Materials von Interesse (MI) aus einer Mischung, die MI und unlösliche Komponenten enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man das MI in der Mischung dazu veranlaßt, in einem wäßrigen Medium an ein Kügelchen (MI-Kügelchen) zu binden;
ein flüssiges System bereitstellt, welches das wäßrige Medium und das MI-Kügelchen umfaßt, worin die Dichte des MI-Kügelchens größer ist als die des flüssigen Systems, und die Dichte mindestens eines Teils des flüssigen Systems größer ist als die der unlöslichen Komponenten; und
das flüssige System einer Zentrifugalkraft aussetzt, die ausreicht, um das MI-Kügelchen von den unlöslichen Komponenten zu trennen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Material von Interesse aus Mikroorganismen, Zellen, Organellen, Molekülaggregaten, Nukleinsäuren und Liganden ausgewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung aus biologischen Proben, Nahrungs- und Arzneimitteln ausgewählt ist.

4. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kügelchen aus Schwermetall-enthaltenden Kügelchen, Latexkügelchen, Silica-Kügelchen, Glaskügelchen, Polyol-Kügelchen und Polyacrylamid-Kügelchen ausgewählt ist.

5. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige System das wäßrige Medium enthält, welches auf eine Dichte gebracht wird, die größer ist als die der unlöslichen Komponenten, aber geringer als die des MI-Kügelchen, indem ein gelöster Stoff hoher Dichte als Komponente des wäßrigen Mediums bereitgestellt wird.

6. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das flüssige System das wäßrige Medium als Schicht neben einer Schicht aus einem Medium mit höherer Viskosität und mindestens gleich großer Dichte wie das erste flüssige Medium enthält, bevor das flüssige System einer Zentrifugalkraft ausgesetzt wird.

7. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Medium als Schicht neben einer Schicht aus einem zweiten Medium mit größerer Dichte vorliegt.

8. Verfahren zur Trennung eines Materials von Interesse (MI) aus einer Mischung, die MI und andere Komponenten enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man das MI zur Bindung an ein Kügelchen (MI-Kügelchen) in einem wäßrigen Medium veranlaßt, wobei das wäßrige Medium eine Dichte hat oder im folgenden auf eine Dichte gebracht wird, die geringer als die der MI- Kügelchen ist, aber größer als die irgendeiner der anderen Komponenten, die in dem Medium unlöslich sind; und
das Medium einer Zentrifugation unterwirft, um die MI- Kügelchen zu veranlassen, sich in einem Bereich innerhalb oder außerhalb des Mediums, getrennt von den anderen Komponenten anzusammeln, mit der Maßgabe, daß, falls die anderen Komponenten löslich sind, die MI- Kügelchen dazu veranlaßt werden, sich außerhalb des Mediums anzusammeln.

9. Kit, dadurch gekennzeichnet, daß es in abgepackter Kombination enthält:

• a) Kügelchen,
• b) Mittel zur Herstellung eines flüssigen Mediums mit hoher Viskosität oder hoher Dichte und
• c) Mittel zur Herstellung eines wäßrigen Mediums mit einer geringeren Dichte als die des flüssigen Mediums von b).

10. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel enthält, um die Kügelchen an ein Material von Interesse zu binden, vorzugsweise ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares, das mit einem Marker konjugiert ist.

11. Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein wäßriges Medium enthält, welches Kügelchen, an die ein Material von Interesse gebunden ist (MI-Kügelchen) enthält, wobei die Dichte des Mediums geringer ist als die der MI-Kügelchen, aber größer als die der anderen unlöslichen Komponenten des Mediums.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin ein zweites flüssiges Medium mit einer geringeren Dichte als die der MI-Kügelchen enthält, welches in Kontakt mit dem wäßrigen Medium steht, aber nicht wesentlich damit vermischt ist.

13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite flüssige Medium eine größere Viskosität und mindestens gleich große Dichte wie das wäßrige Medium besitzt.

14. Verfahren zur Durchführung eines Nachweisverfahrens für einen Analyten, dadurch gekennzeichnet, daß man den Analyten oder eine Substanz, deren Anwesenheit zur Anwesenheit des Analyten in Beziehung steht, zur Bindung an ein Kügelchen (A-Kügelchen) in einem wäßrigen Medium veranlaßt, wobei das wäßrige Medium eine Dichte hat oder im folgenden auf eine Dichte gebracht wird, die geringer als die des A-Kügelchens ist, aber größer als die irgendeiner der anderen Komponenten, die in dem Medium unlöslich sind;
das Medium einer Zentrifugation unterwirft, um die A- Kügelchen zu veranlassen, sich in einem Bereich innerhalb oder außerhalb des Mediums getrennnt von den anderen Komponenten anzusammeln, mit der Maßgabe, daß, falls die anderen Komponenten löslich sind, die A- Kügelchen dazu veranlaßt werden, sich außerhalb des Mediums anzusammeln; und
den Analyten oder die genannte Substanz nachweist.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt oder die Substanz mittels eines Signal­ erzeugenden Systems nachgewiesen werden, wobei das Signal-erzeugende System vorzugsweise einen Marker enthält.