DE69818706T2

DE69818706T2 - Analytisches verfahren mit teilchen und testkit um das verfahren durchzuführen

Info

Publication number: DE69818706T2
Application number: DE69818706T
Authority: DE
Inventors: Ib Mendel-Hartvig; Lena VINTERBÄCK; Ann Jonsson; Jörgen GUSTAFSSON
Original assignee: Pharmacia Diagnostics AB
Current assignee: Phadia AB
Priority date: 1997-12-30
Filing date: 1998-12-30
Publication date: 2004-09-23
Anticipated expiration: 2018-12-31
Also published as: SE9704935D0; EP1044376A1; PT1044376E; DE69818706D1; CA2314870A1; ES2209242T3; WO1999036780A1; JP2002509253A; AU2194999A; CA2314870C; JP4531252B2; US7405084B1; ATE251307T1; DK1044376T3; EP1044376B1; AU750153B2

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung bezieht sich auf Nachweisverfahren unter der Verwendung biospezifischer Affinitätsreaktionen in Kombination mit einem analytisch nachweisbaren Reaktanden (Reaktand*), um einen Analyten in einer Probe zu bestimmen Die Verfahren schließen das Verwenden von Matrices ein, welche einen Flüssigkeitsfluß umgeben, welcher Analyt und Reaktanden zu einer Nachweiszone (DZ) transportiert in/auf der Matrix. In der Nachweiszone gibt es einen biospezifischen Affinitätsreaktanden (Fänger), welcher an der Matrix fest verankert ist, welcher es gestattet, daß ein Komplex (welcher den Reaktanden* und den Fänger enthält) in der Nachweiszone in einer Menge gebildet wird, welche die Menge des Analyten in der Probe widerspiegelt. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf einen Testkit zur Durchführung des Verfahrens. Im Besonderen bezieht sich die Erfindung auf analytische Verfahren und Kits dafür, wie in den anhängigen Ansprüchen definiert.
Mit den Reaktanden (einschließlich des Analyten), welche eine biospezifische Affinität aufweisen (Bioaffinitätsreaktanden), und welche daher in der Erfindung verwendet werden können, sind individuelle Mitglieder der Reaktandenpaare gemeint: Antigen/Hapten-Antikörper, Biotin-Avidin/Strepavidin, zwei komplementäre Einzelketten von Nukleinsäuren etc. Als die Antikörper werden die antigenbindenden Antikörperfragmente wie Fab, F(ab)₂', Einzelketten Fv (scFv) Antikörper betrachtet. Relevante Reaktanden müssen nicht natürlicherweise auftreten, sondern können ebenfalls auf synthetische Weise hergestellte Moleküle/bindende Stoffe sein.
Die Art des fraglichen Testverfahrens wurde zuvor in erster Linie für biospezifische Affinitätsreaktanden verwendet, wo mindestens ein Teil in einem verwendeten Reaktandenpaar eine Proteinstruktur aufwies, insbesondere in Verbindung mit sogenannten immunchemischen Bestimmungsverfahren.
Die biospezifischen Affinitätsreaktionen werden in erster Linie in einem wäßrigen Medium (z. B. Wasser) durchgeführt.
Zuvor verwendetes Verfahren
Es war zuvor bekannt, wie ein Fänger an der relevanten An von Matrices zu verankern ist. Eine Alternative war es, dieses über Teilchen zu erreichen, welche in/auf der Matrix abgeschieden wurden. Der Fänger würde wiederum an diese Teilchen über Bindungen gebunden, welche unter den Bedingungen, die verwendet werden, um einen Reaktanden* in der Nachweiszone zu fangen, stabil sind. Die Bindung zwischen dem Fänger und dem Teilchen war üblicherweise kovalent, aber ebenfalls eine physikalische und biospezifische Adsorption konnte verwendet werden, siehe unter anderem Abbott/Syntex US 4 740 468 , Abbott EP 472 476 , Hybritech EP 437 287 und EP 200 381 , Grace & Co EP 420 053 , Fuji Photo Film US 4 657 739 , Boehringer Mannheim WO 94/06012. Markierungsgruppen, die geeignet für eine Verwendung für einen Reaktanden* in der relevanten Art von Tests sind, sind wohlbekannt, zum Beispiel Teilchen (Pharmacia AB WO 96/22 532, Unilever WO 88/08 534, Abbott Laboratories US 5 120 643 , Becton Dickinson EP 284 232 etc. ). Die Kombination von Teilchen als eine nachweisbare Gruppe und als verankernde Teilchen ist ebenfalls aus verschiedenen der vorausstehend erwähnten Publikationen bekannt. Siehe z. B. Boehringer Mannheim EP 462 376 . Ein Teststreifen zur Ausführung eines Bindungstests zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, welcher aus einem saugfähigen Material gemacht ist und eine Nachweiszone umfaßt, wo der Analyt gefangen wird, ist bekannt von Syntex Inc. EP 422 699 . Abbott Laboratories EP 217 403 offenbart Teilchen, welche in der Lage zu einer Reaktion mit dem Analyten in der Probe sind, umfaßt jedoch nicht ein Zwei-Teilchen-System.
Nachteile bisheriger Verfahren und Ziel der Erfindung
In Verbindung mit zuvor bekannten Nachweisverfahren des anfänglich erwähnten Typs gab es oft einen Bedarf für eine verbesserte Nachweissensitivität. Dies ist ebenfalls oft wünschenswert gewesen mit Systemen, die einfacher herzustellen sind.
Die Erfindung zielt auf Verbesserungen, die diese Probleme betreffen, ab.
Die Erfindung
Wir haben nun gefunden, daß das Verankern des Fängers über Teilchen, die bevorzugtermaßen kleiner als die kleinste innere Abmessung des Fließkanals in einer Fließmatrix sind, in einer überraschenden Weise gut mit einem Reaktanden* zusammenarbeitet, in welchem die analytisch nachweisbare Gruppe Teilchen sind. Daher ist die Erfindung ein Testverfahren gemäß dem anfänglich Gesagten und ist charakterisiert durch:

A) Der analytisch nachweisbare Reaktand (Reaktand*) hat als eine Markierungsgruppe Teichen und
B) Der Fänger ist an die Matrix über Teilchen verankert, welche solche Abmessungen haben, daß sie als solche in dem Fluß, welcher durch die Matrix passagiert, transportiert werden können.

Die Teilchen sollten, insbesondere, wenn sie kleiner als die Fließkanäle in der Matrix sind, auf ihrer Oberfläche bevorzugtermaßen hydrophile Gruppen aufweisen, welche nicht zu dem biospezifischen Affinitätsreaktanden gehören, der an die Teilchen gebunden ist. Bevorzugte hydrophile Gruppen sind ungeladen (gewöhnlich in der Form von alkoholischen Hydroxylgruppen).
Im Prinzip können die Markierungsteilchen und die Verankerungsteilchen von derselben Art sein, wobei nur beachtet wird, daß die verankernden Teilchen nicht mit dem Nachweis des Reaktanden* in der Nachweiszone interferieren.
Teilchen, die dazu gedacht sind, einen Fänger in DZ zu verankern, sollten wie vorausstehend erwähnt bevorzugtermaßen kleiner als die kleinste innere Abmessung der Fließkanäle sein. Geeignete Teilchengrößen (größte äußere Abmessung/Durchmesser) sind in dem Intervall von 0,1–1000 μm, bevorzugtermaßen 0,1–100 μm. In jedem speziellen Fall müssen Erwägungen gemacht werden, welche die kleinste innere Abmessung der Fließkanäle in der zu verwendenden Matrix betreffen. Die verwendeten Teilchen können polydispers oder monodispers sein. Ihre Form kann von sphärisch bis zu völlig irregulär variieren. Geeignete Teilchenmaterialien, welche erwähnt werden können, sind z. B. SiO₂ und andere polymere Materialien, wie organische Polymere, ausgewählt aus

(a) synthetischen Polymeren, z. B. Kondensationspolymere, Additionspolymere etc.. Unter den Additionspolymeren können insbesondere diejenigen erwähnt werden, welche auf Monomeren beruhen ausgewählt unter Alkylvinylether, Arylvinylether, Vinylaren (wie Styrol und Divinylbenzol), Alkylalken, Acrylat, Methacrylat, Acrylamid, Methacrylamid etc. und
(b) Biopolymere z. B. Polysaccharide (Agarose, Dextran, Stärke), die wahlweise synthetisch vernetzt sind (ein Beispiel für ein semi-synthetisches Polymer) etc.

In diesem Zusammenhang sind sogenannte Latexteilchen oft verwendet worden, welche oft polymerisiertes Styrol oder anderes polymerisiertes Alken/Alkadien sind. Die verankernden Teilchen können porös oder nicht porös sein.
Es ist oft wichtig, die Verankerungs-Teichen so auszuwählen, daß sie intermediär sind bezüglich der hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften. Der Grund besteht darin, daß die fraglichen Fließmatrices oft eine merkliche Hydrophobizität aufweisen, obwohl sie in einer hinreichenden Weise hydrophil sind, um einen Fluß eines wäßrigen flüssigen Mediums zu gestatten. Ein merklich hydrophobes Teilchen, z. B. von Polystyrol, wird daher sehr stark an die Nitrocellulosemembranen adsorbiert. Das selbe kann ebenfalls für andere Fließmatrices gesagt werden mit einer vergleichbaren Balance zwischen hydrophilen und hydrophoben Eigenschaften. Unglücklicherweise fördern die hydrophoben Eigenschaften der Teilchen eine unspezifische Adsorption des Reaktanden* und/oder des Analyten. Dies vermindert die Sensitivität des Testverfahrens. In unseren Systemen wählen wir es daher, hydrophobe Teilchen zu hydrophilisieren, z. B. indem auf ihrer Oberfläche hydrophile Gruppen eingeführt werden, wie Hydroxygruppen. Es ist in einem besonderen Maße zweckdienlich, hydrophobe Teilchen mit Polyhydroxypolymeren oder anderen hydrophilen Polymeren zu beschichten, welche bevorzugtermaßen mit hydrophoben Gruppen substituiert sein sollten, z. B. Hydrocarbylgruppen wie Phenyl. Als spezifische Beispiele für verwendbare Hydrocarbylsubstituierte hydrophile Polymere können diejenigen, welche eine Polysaccharid-Struktur haben, z. B. Phenyldextran erwähnt werden. Das Vorhandensein der hydrophoben Gruppen auf einem hydrophilen Polymer erleichtert die Adsorption des Polymers an hydrophobe Teilchen. Dies vermindert wiederum die Notwendigkeit, ein adsorbiertes Polymer über eine Vernetzung zu stabilisieren. Bei der Industrietechnik kann dies von einer großen Wichtigkeit sein, da eine Kreuzvernetzung leicht zu einer Teilchenaggregation führt, insbesondere bei den Teilchen, welche die kleinen Abmessungen haben, welche oft in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Eine Einführung von hydrophilen Gruppen auf den Teilchen bedeutet, daß eine kovalente Bindung eines biospezifischen Affinitätsreaktanden an die Teilchen auf einfachere Weise erreicht werden kann. Die Hydrophilisierung vermindert als solche ebenfalls die Tendenz einer unspezifischen Adsorption in der Nachweiszone.
Teilchen, die für den Reaktanden* gedacht sind, der nachweisbar sein soll, sind gewöhnlicherweise kleiner als diejenigen, die für das Verankern verwendet werden. Geeignete Teilchendurchmesser werden gewöhnlich in dem Intervall von 0,001–5 μm gewählt, oft von kolloidalen Ausmaßen, sogenanntes Sol (d. h. sphärisch und monodispers mit einer Größe in dem Intervall von 0,001–1 μm). Im Prinzip kann das selbe Teilchenmaterial wie für die verankernden Teilchen verwendet werden. Gut bekannte Markierungsteilchen sind Metallteilchen (z. B. Gold-Sol), Nichtmetallteilchen (SiO₂, Kohlenstoff, Latex (Polystyrol) und getötete Erythrozyten und Bakterien). Für Teilchen von nicht-kolloidalen Ausmaßen ist es richtig, daß sie unter den Bedingungen, welche für den Transport in der Matrix gültig sind, nicht sedimentär sind. Daher wurden Kohlenstoffteilchen (< 1 μm), welche mehr oder weniger irregulär sind und mehr oder weniger polydispers, verwendet (Pharmacia AB WO96/22 532). Die Teilchen können mit Gruppen ausgestattet sein, welche ihren Nachweis erleichtern, z. B. indem sie mit einem Chromophor, einem Fluorophor, einer radioaktiven Verbindung, einem Enzym etc. ausgestattet sind. In der Erfindung ist gezeigt worden, daß sie unerwarteterweise vorteilhaft ist mit fluoreszierenden Teilchen anstelle von gefärbten Teilchen, wie Kohlenstoffteilchen.
Die Anforderungen für die Balance zwischen hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften für Markierungsteilchen sind ähnlich zu denjenigen, welche für die verankernden Teilchen richtig sind.
Wenn der Fänger mit seinen verankerten Teilchen in der Nachweiszone abgeschieden wird, ist es wichtig, daß die Bedingungen so gewählt werden, daß eine physikalische Adsorption an der Matrix gefördert wird. Trocknen ist oft wesentlich. Wenn die Bindungen zwischen der Matrix und den verankernden Teilchen einmal gebildet wurden, ist es oft schwer, sie zu brechen. Der Reaktand* soll jedoch unter Bedingungen angewendet werden, welche es fördern, daß der Reaktand in Suspension gehalten wird und keine physikalische Adsorption der Teilchen an die Matrix fördert. Falls der Reaktand* im voraus in die Matrix abgeschieden werden soll, ist es wesentlich, daß es auf eine Weise gemacht wird, welche eine schnelle Resuspendierung für den Transport in die Matrix fördert. Vergleiche nachstehend unter der Überschrift „Anwendungszone für andere biospezifische Affinitätsreaktanden als Analyt (A_RZ)".
In der Nachweiszone kann der Analyt in einer direkten oder indirekten Weise an den Fänger binden. In dem zuletzt erwähnten Fall ist der Fänger ein biospezifischer Affinitätsreaktand, welcher an einen zusätzlichen Reaktanden binden kann, welcher wiederum an den Analyten über eine biospezifische Affinität bindet. In diesem Fall muß dieser zusätzliche Reaktand nicht von Anfang an in der Matrix immobilisiert werden, sondern kann beweglich (in einer diffundierbaren Weise) in der Matrix in einem Bereich oder einer Zone im voraus abgeschieden sein, welcher bzw. welche von der Nachweiszone getrennt ist, oder er kann zusammen mit oder getrennt von der Probe zugegeben werden. Falls dieser zusätzliche Reaktand in einer löslichen Form vorliegt, ist der Fänger vorteilhafterweise ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares, dessen anderes Mitglied an den Reaktanden gekoppelt oder mit ihm konjugiert ist. Beispiele für solche spezifischen Bindungspaare sind immunologische Bindungspaare, wie Antigen-Antikörper und Hapten-Antikörper, Biotin-Avidin oder -Strepavidin, Lektin-Zucker, Nukleinsäureduplex.
Das Teilchensystem gemäß der Erfindung ist in besonderer Weise vorteilhaft für Allergietests, wo das Allergen, mit welchem der Analyt (am häufigstens von der IgE-Klasse) reagieren soll gewöhnlich eine komplexe Mischung von bis zu 100 oder mehr verschiedenen Proteinen ist. Durch das kovalente Koppeln der Proteine an Teilchen und die vorausgehende Abscheidung davon, wird ein in einer sehr robusten Weise immobilisiertes Allergen erhalten, wobei das Allergen im Gegensatz zu einem Allergen, welches passiv an eine Matrix adsorbiert ist, nicht in einer selektiven Weise mehr von bestimmten Bestandteilen verliert. Dies in Kombination mit der Tatsache, daß Markierungsteilchen ein sehr gutes Signal ergeben, resultiert in einem außergewöhnlichen Testsystem auf Allergie. Das Vorausstehende gilt für alle Tests, worin komplexe bindende Stoffe verwendet werden, z. B. Autoantigene bei der Bestimmung von Autoimmunerkrankungen.
Eine Variante mit löslichem Reaktanden (Allergen), welcher im voraus abgeschieden ist oder zusammen mit der Probe zugegeben wird, kann ebenfalls andere Vorteile bei den Allergietests ergeben, da auf der einen Seite die Inkubationszeit zwischen dem Markierungsteilen und dem Allergen/Analyten beträchtlich länger sein wird und auf der anderen Seite ein lösliches Allergen für eine Reaktion mit dem Analyten verfügbarer ist, als wenn das Allergen an eine feste Phase gebunden ist.
Matrices
Die Matrix definiert den Raum, in welchem die Reaktanden transportiert werden. Die Matrix kann die innere Oberfläche eines einzelnen Fließkanals (z. B. einer Kapillare) sein, die innere Oberfläche einer porösen Matrix mit einem System von sich durch sie hindurch erstreckenden Fließkanälen etc.. Dieser Typ von Matrices wird nachstehend als Fließmatrices bezeichnet. Fließmatrices können in der Form von Monolithen, Blättern, Säulen, Membranen, einzelnen Fließkanälen mit den Abmessungen von Kapillaren oder aggregierten Systemen solcher Fließkanäle existieren. Sie können ebenfalls in der Form von Teilchen, welche in Säulenumhüllungen gepackt sind, komprimierten Fasern etc. existieren. Die innere Oberfläche der Matrices sollte hydrophil sein, so daß wäßriges Medium (gewöhlicherweise Wasser) absorbiert und durch die Matrices transportiert werden kann. Die kleinste innere Abmessung der Fließkanäle sollte in einer hinreichenden Weise groß sein, um einen Transport des verwendeten Reaktanden durch die Matrix zu gestatten. Die Daumenregel ist, daß geeignete Matrices unter denjenigen auswählbar sind, welche Fließkanäle mit der kleinsten inneren Abmessung in dem Intervall von 0,4–1000 μm haben, bevorzugtermaßen 0,4–100 μm, falls die Matrix ein System von wechselseitig kommunizierenden Fließkanälen hat. Fließkanäle mit der kleinsten inneren Abmessung in dem oberen Teil des breiten Intervalls (bis zu 1000 μm) sind in erster Linie von Interesse für einen Fluß, welcher durch einen extern angewendeten Druck/Saugen angetrieben wird.
Matrices von Interesse werden oft aus einem Polymer aufgebaut, z. B. Nitrocellulose, Nylon, etc. Das Material in der Matrix sowie das physikalische und geometrische Design der Fließkanäle können entlang des Flusses variieren, abhängig davon, wofür ein bestimmter Teil der Matrix verwendet werden soll (Pharmacia AB WO 96/22532, Medix WO 94/15 215).
Entlang des Transportflusses in der Matrix kann es definierte Zonen für die Anwendung von Probe (A_SZ), Reaktanden (A_RZ), Puffer (A_BZ) etc. und Zonen für den Nachweis (DZ) und Kalibrator (CZ, siehe nachstehend) geben.
Fließmatrices, welche in dem besonderen Typ von Tests angewendet werden können, werden in früheren Patentveröffentlichungen beschrieben (Behringwerke US 4 861 711 , Unilever WO 88/08 534, Abbott US 5 120 643 und US 4 740 468 , Bekton Dickinson EP 284 232 und US 4 855 240 , Pharmacia AB WO 96/22532 etc.).
Transportfluß
Die Richtung des Transportflusses ist von einer Anwendungszone in Richtung einer Nachweiszone (DZ). Welche Zonen in exakter Weise der Transportfluß passagieren wird, wird durch das besondere Testprotokoll festgelegt. Ein Transportfluß kann von einem Punkt mit einer radialen Ausbreitung starten und einer Fließfront in Form einer zirkulären Peripherie oder eines Teils davon. Ein Transportfluß kann ebenfalls von einer Zone in der Form einer Bande starten und kann eine gerade Fließfront rechtwinklig zu der Richtung des Flusses haben. In einer weniger bevorzugten Variante schreitet der Transportfluß in einer Anwendungszone für eine Probe voran, welche zu der selben Zeit eine Nachweiszone ist. Der Fluß in dieser Variante wird ausgebreitet von der Anwendungs-/Nachweiszone, bevorzugtermaßen in radialer Weise und kann möglicherweise zusätzliche stomabwärtsliegende Nachweiszonen passagieren.
Der Transportfluß durch die besonderen Arten einer Matrix kann erreicht werden durch den Einfluß von Kapillarkräften, z. B. durch das Starten mit einer im wesentlichen trockenen Matrix. Als eine Hilfe kann ein Saugkörper am Ende des Flusses plaziert werden. Der Fluß, welcher hauptsächlich den Transport nur von gelösten Bestandteilen bedeutet, kann erreicht werden, falls ein elektrisches Feld über die Matrix (in der Flußrichtung) angelegt wird.
Der verwendete Fluß ist bevorzugterweise lateral, d. h. parallel zu der oberen Oberfläche der Matrix. Es können ebenfalls andere Arten von Fluß (in der Tiefe in der Matrix) verwendet werden.
Relevante Testprotokolle
Die Erfindung kann in erster Linie bei nicht-kompetitive (Nicht-Inhibition-) Testvarianten angewendet werden, aber ebenfalls an kompetitiven (Inhibitions-) Testvarianten. Die gebildeten Komplexe in den unterschiedlichen Testprotokollen werden in einer schematischen Weise nachstehend beschrieben. Es wurde angenommen, daß relevante Reaktanden monovalent sind unter Bezug auf die verwendeten Bindungsstellen. Die Protokolle können als gleichzeitige oder als sequentielle Varianten unter Bezug auf den Analyten und einen zugegebenen Reaktanden laufen gelassen werden. Mit den gleichzeitigen Varianten meint man, daß der Analyt (die Probe) und der fragliche Reaktand mit einander wenigstens während eines Teils des Transports migrieren und bevorzugtermaßen die Nachweiszone gleichzeitig erreichen. Mit sequentiellen Varianten meint man, daß der Analyt (die Probe) wenigstens während eines Teils des Transports in Richtung auf die Nachweiszone vor einem Reaktanden migriert und bevorzugtermaßen die Nachweiszone vor dem Reaktanden erreicht. Die Testprotokolle der Erfindung sollten immer gleichzeitig oder sequentiell unter Bezug auf den Analyten und den Reaktanden* sein. „–" bezieht sich auf eine feste Verankerung von Anfang an. „–––" bezieht sich auf eine Bindung über eine biospezifische Affinität.
A. Sandwich-Protokoll
Fänger und Reaktand* haben eine biospezifische Affinität für den Analyten. x ist die Anzahl von Mol des Fängers auf der Matrix. y ist die Anzahl von Mol des Analyten (= die Anzahl von Mol des Reaktanden*), welcher an den Fänger gebunden ist.
In der Nachweiszone gebildeter Komplex:
Matrix (–Fänger)_x–y(–Fänger–––Analyt–––Reaktand*)_y.
B. Sandwich-Protokoll
Der Fänger hat eine biospezifische Affinität für den Reaktanden I, welcher wiederum eine biospezifische Affinität für den Analyten hat. Der Reaktand* hat eine biospezifische Affinität für den Analyten. x ist die Anzahl von Mol des Fängers auf der Matrix. y ist die Anzahl von Mol des Analyten (= die Anzahl von Mol des Reaktanden*), welcher an den Fänger über den Reaktanden I gebunden ist. y + z ist die Anzahl von Mol von Reaktand I, welcher an den Fänger gebunden ist.
In der Nachweiszone gebildeter Komplex:
Matrix (–Fänger)_x–z–y(–Fänger–––Reaktand I)_z(–Fänger–––Reaktand I–––Analyt–––Reaktand*)_y.
C. Inhibitionsprotokoll
Der Fänger ist ein Analogon des Analyten und hat Bindungsstellen, welche äquivalent sind zu den Bindungsstellen auf dem Analyten. Der Reaktand II hat eine biospezifische Affinität für den Analyten und für den Fänger. Der Reaktand* hat eine biospezifische Affinität für den Reaktanden II. x ist die Anzahl von Mol des Fängers auf der Matrix. y ist die Anzahl von Mol des Reaktanden II (= die Anzahl von Mol des Reaktand*), welcher an die Matrix über den Fänger gebunden ist. Der Reaktand II ist Teil des Komplexes, in einer Menge, welche mit der Menge des Analyten in der Probe im Zusammenhang steht.
In der Nachweiszone gebildeter Komplex:
Matrix (–Fänger)_x–y(–Fänger–––Reaktand II–––Reaktand*)_y.
D. Inhibitionsprotokoll
Der Fänger weist eine biospezifische Affinität sowohl für den Analyten als auch für den Reaktanden* auf. Der Reaktand* ist ein nachweisbares lösliches Analogon des Analyten. x und y sind die Anzahl Mol des Reaktanden* bzw. des Analyten, welche an die Matrix über den Fänger gebunden sind. x + y ist die Anzahl von Mol des Fängers auf der Matrix.
In der Nachweiszone gebildeter Komplex:
Matrix (–Fänger–––Reaktand*)_x(–Fänger–––Analyt)_y.
Anwendungszone für die Probe (A_SZ)
Diese An von Zone soll stromaufwärts von der Nachweiszone für den beabsichtigten Analyten gebildet werden.
Anwendungszone für andere biospezifische Affinitätsreaktanden als den Analyten (A_RZ)
Die Abfolge der Anwendungszonen sollte sicherstellen, daß die Testprotokolle gleichzeitig oder sequentiell sind unter Bezug auf den Analyten und den Reaktand*. Dies bedeutet, daß die Anwendungszone für Reaktanden (A_RZ) inklusive für den Reaktand* (A_R*Z) immer stromaufwärts von der Nachweiszone sein sollten. Einer oder mehrere Reaktanden können in der selben Anwendungszone zugegeben werden. Falls die Anwendungszone gemeinsam für die Probe und mindestens einen Reaktanden ist (=A_RZ/A_SZ), z. B. Reaktand* (=A_R*Z/A_SZ), kann die Anwendung gleichzeitig durchgeführt werden, z. B. daß eine Probe und der Reaktand gemischt werden, bevor sie in der Zone angewendet werden. Falls gewünscht, kann die Mischung vorinkubiert werden, so daß der Reaktand in einer beabsichtigten Weise an den Analyten oder an andere Bestandteile in der Probe vor der Anwendung bindet. Ein Fachmann kann mit Kenntnis verschiedener Protokolle leicht bestimmen, welche Zonen benötigt werden und in welcher Reihenfolge sie positioniert werden müssen.
Reaktanden, die in dem Verfahren verwendet werden, können im voraus in den jeweiligen Zonen abgeschieden werden oder können zugegeben werden, wenn das Nachweisverfahren durchgeführt wird. Eine Abscheidung im voraus bedeutet, daß der fragliche Reaktand im voraus und in einer solchen Weise angewendet wird, daß er sich nicht in der Matrix ausbreitet, bis eine Strömung initiiert wird.
Eine Abscheidung im voraus von Reaktanden kann durch Verfahren, die per se bekannt sind, stattfinden. (Siehe z. B. Behringwerke US 4 861 711 , Unilever WO 88/08 534, Abbott US 5 120 643 , Becton Dickinson EP 284 232 ). Es ist wichtig in die Überlegung mit einzubeziehen, daß der fragliche Reaktand in der Lage sein sollte, sich zu lösen, wenn eine Flüssigkeit einen im voraus abgeschiedenen Reaktanden erreicht. Um eine schnelle Lösung sicher zu stellen, ist es verbreitet, relevante Reaktanden in Substanzen einzuschließen, welche schnell durch den Kontakt mit dem verwendeten flüssigen Medium gelöst werden. Diese Art von Substanzen sind oft hydrophil mit polaren und/oder geladenen Gruppen, wie Hydroxy, Carboxy, Amino, Sulphonat etc. Insbesondere können hydrophile schnell lösliche Polymere erwähnt werden, z. B. mit Kohlenhydratstrukturen, einfachen Zuckern, einschließlich von Mono-, Di- und Oligosacchariden und entsprechenden Zuckeralkoholen (Mannitol, Sorbitol etc.). Es ist eine verbreitete Praxis, zuerst die relevante Anwendungszone mit einer Schicht der schnell löslichen Substanz zu beschichten, und dann wird der Reaktand angewendet, wahlweise gefolgt von einer zusätzlichen Schicht der schnell löslichen Substanz. Ein alternativer Weg ist es, den Reaktanden in Teilchen von schnell löslichem Material einzuschließen, welche dann in der relevanten Zone der Matrix abgeschieden werden.
Zone für den Puffer (A_BZ)
Wesentliche Puffersysteme können in Lösungen eingeschlossen werden, welche gleichzeitig mit den Proben und den Reaktanden zugegeben werden. In der herkömmlichen Technik findet die Zugabe von Puffer in der Anwendungszone stromaufwärts von den anderen Anwendungszonen statt, dies war gewöhnlich gleich der Anwendungszone der Probe. In der vorliegenden Erfindung kann die Anwendung von Puffer in einer wahlweisen Position (siehe nachstehend) durchgeführt werden.
In einer gleichzeitig anhängigen PCT-Anmeldung WO 99/36 776 „Analytisches Verfahren umfassend die Zugabe in zwei oder mehr Positionen und eine Vorrichtung und ein Testkit dafür" beschreiben wir eine Erfindung, welche in einer Variante eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereit stellt. Die Erfindung in dieser getrennten Patentanmeldung basiert auf der Erkenntnis, daß Flüssigkeit von zwei auf einander folgenden Zonen (AZ2 und AZ1) in einer Fließmatrix nach einander wandern können, ohne gemischt zu werden, falls die Flüssigkeit an der stromabwärts gelegenen Zone (AZ1) gleichzeitig angewendet wird oder angewendet wird, bevor die Flüssigkeit an der stromaufwärts liegenden Zone angewendet wird. Dies hat zu der Möglichkeit geführt, eine zonenweise Wanderung wahlweiser Reaktanden zu erreichen, welche in den Flüssigkeiten eingeschlossen sind, in Richtung auf eine Nachweiszone. Falls die Anwendungszone für eine Probe (A_SZ) stromabwärts von der Anwendungszone für den Reaktand* (A_R*Z) plaziert ist, wird das Testprotokoll sequentiell unter Bezug auf den Reaktand*. Indem man eine Anwendungszone nur für die Flüssigkeit (Puffer) (A_BZ) zwischen (A_R*Z) und (A_SZ) hat, wird ein Waschen der Nachweiszone DZ zwischen dem Fangen des Analyten und dem Fangen des Reaktanden* durchgeführt. Solch eine intermediäre Pufferzone (A_BZ) kann ebenfalls sicherstellen, daß ein Reaktand (einschließlich des Analyten), welcher in einer stromabwärts liegenden Zone angewendet wird, DZ vor einem Reaktanden erreicht, welcher von einer stromaufwärts liegenden Anwendungszone für Flüssigkeit startet. Das Letztere kann wichtig sein, falls die Matrix als solche den Reaktanden zurückhält, welcher in der stromabwärts liegenden Zone angewendet wurde.
Reaktanden können in der Flüssigkeit eingeschlossen sein, welche an einer Zone angewendet wird. Alternativ können sie in der Zone im voraus abgeschieden werden, wo die entsprechende Flüssigkeit angewendet werden soll oder in einer Zone positioniert werden zwischen dieser und der nächsten stromabwärts liegenden Zone für die Anwendung von Flüssigkeit.
Diese getrennte Erfindung gestattet es, daß die Anwendung von Puffer in der vorliegenden Erfindung in einer wahlweisen Position durchgeführt wird. Gemäß der herkömmlichen Technik war die Zugabe von Puffer nur in der Anwendungszone möglich, stomaufwärts von den anderen Anwendungszonen.
Diese Ausführungsform der Erfindung ist insbesondere interessant für Verfahren, welche sequentiell in Bezug auf den Reaktand* sind.
Analyte
Die Erfindung ist in erster Linie adaptiert für die Bestimmung von biospezifischen Affinitätsreaktanden der anfänglich erwähnten Typen. Der Analyt kann eine Zelle oder ein Virus oder ein Teil davon sein. Insbesondere kann Antigen erwähnt werden, so wie ein Immunglobulin oder ein Antikörper. Was Immunglobuline betrifft, so kann die Bestimmung sich auf ein bestimmtes Ig und/oder eine bestimmte Ig-Unterklasse beziehen. Was Antikörper betrifft, so kann sich die Bestimmung auf eine bestimmte Spezifität beziehen, wahlweise ebenfalls die Ig-Klasse oder die Ig-Unterklasse des Antikörpers. Relevante Klassen von Ig sind IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Relevante Ig-Unterklassen sind IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4.
In Sandwich-Varianten (gemäß den Protokollen A und B vorausstehend) kann der Analyt ein Antikörper sein, welcher gegen ein Allergen/Antigen/Hapten gerichtet ist, und von einer bestimmten Spezies, einer bestimmten Ig-Klasse oder einer betimmten Ig-Unterklasse stammen. In diesem Fall kann der Reaktand* ein analytisch nachweisbarer Antikörper sein, welcher gegen ein Epitop gerichtet ist, das für die Spezies, die Ig-Klasse oder die Ig-Unterklasse spezifisch ist, wobei der Fänger (Protokoll A) und der Reaktand I (Protokoll B) das Allergen/Antigen/Hapten ist. Alternativ wird das Umgekehrte gewählt, d. h. der Fänger bzw. der Reaktand I ist der Antikörper, welcher gegen den Analyten gerichtet ist. In dem Fall, wenn der Analyt ein Antigen im allgemeinen ist, können für das Protokoll A sowohl der Fänger als auch der Reaktand* Antikörper sein, welche gegen das Antigen gerichtet sind. In dem Protokoll B sind es der Reaktand I und der Reaktand*, welche Antikörper sind, die gegen das Antigen gerichtet sind.
Kompetitive Varianten sind die interessantesten für niedermolekulare Analyten. Erläuternde Beispiele sind Antigen und Hapten. Für das Protokoll C kann der Fänger das Antigen oder das Hapten sein, fest an der Matrix verankert. Der Reaktand II kann ein Antikörper sein, welcher gegen das Antigen gerichtet ist und der Reaktand* kann ein Antikörper sein, welcher gegen den Reaktand II gerichtet ist. Für das Protokoll D kann der Fänger ein Antikörper sein, welcher gegen den Analyten gerichtet ist, und der Reaktand* kann der Analyt sein, markiert mit einer analytisch nachweisbaren Gruppe.
Das Verfahren der Erfindung kann als ein Teil einer Diagnostik von Allergie oder Autoimmunerkrankungen durchgeführt werden.
Für die Erfinder war es insbesondere interessant, Anti-Allergen-Antikörper der IgE- oder IgG-Klasse zu messen, wobei die letztere zu bevorzugen ist, mit der Betonung auf einigen der erwähnten Unterklassen. Die Messung von Allergen-spezifischem Antikörper kann in Verbindung mit einer Diagnose von IgE-vermittelter Allergie verwendet werden.
Die Erfindung hat, wie bereits vorausstehend erwähnt wurde, sich als insbesondere in dem Fall als geeignet erwiesen, bei dem der Fänger aus einer Matrix von verschiedenen Bestandteilen besteht, z. B. Allergen, welches oft aus Mischungen von verschiedenen unterschiedlichen allergenen Bestandteilen besteht, und bei dem der Analyt Antikörper ist, welche gegen einzelne Bestandteile in der Mischung gerichtet sind.
Proben
Relevante Proben können von biologischem Ursprung sein, z. B. von verschiedenen Körperflüssigkeiten (Gesamtblut, Serum, Plasma, Urin, Tränenflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit etc.), aus Zellkulturmedien, Prozessierungsverfahren in der Biotechnologie, von Nahrungsmitteln, aus der Umwelt (Umweltanalyseproben) etc.. Die Proben können im voraus behandelt sein, um z. B. zu der Matrix, dem beteiligten Testprotokoll etc. zu passen.
Kalibratoren
Bestimmungsverfahren des Typs, auf welchen sich die Erfindung bezieht, schließen die Messung des nachweisbaren Signals von dem analytisch nachweisbaren Reaktanden (Reaktand*) ein und das gemessene Signal (Probenwert) wird genommen als ein Maß des Analyten in der Probe. Um das Meßsignal auf die tatsächlichen Mengen des Analyten zu transferieren, wird das Signal gewöhnlich mit dem entsprechenden Signal (Kalibrationswert) von bekannten Standardmengen des Analyten (Kalibratoren) verglichen. In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung ist ein neues Kalibrationssystem entwickelt worden, welches, angewendet auf die vorliegende Erfindung, eine beste Ausführung bildet.
Diese getrennte Erfindung bedeutet, daß der verwendete Kalibrator im voraus an einer Matrix verankert worden ist (Matrixkalibrator), bevorzugtermaßen des selben Typs wie dasjenige, welches für den Probenlauf verwendet wird. Wenn die Kalibratorwerte gemessen werden, läßt man den Matrixkalibrator an den Reaktand* binden, und dann wird das Meßsignal von dem Reaktand* in einer per se bekannten Weise gemessen. Durch das Verwenden verschiedener Mengen von Matrixkalibrator kann eine Reihe von Kalibratorwerten erhalten werden, entsprechend den unterschiedlichen im voraus bestimmten Mengen des Analyten in der Probe (Standardmengen, Dosis-Antwort-Kurve, Kalibrationskurve).
Anstelle, daß der Kalibrator im voraus an der Matrix verankert wird, kann ein Reaktand, der in der Lage ist, den Kalibrator zu binden, verankert werden, und der Kalibrator wird dann in Verbindung mit der Bestimmung des Kalibratorwertes zugegeben. Wenn ein Kalibrator bindendes Mittel an die Matrix gebunden ist, kann der Kalibrator entweder beweglich (in diffusiver Weise) im voraus in der Matrix in einer Zone oder einem Bereich getrennt von der Nachweiszone abgeschieden sein, oder er kann zusammen mit oder getrennt von der Probe zugegeben werden.
Angewendet auf die vorliegende Erfindung schließt unser neues Kalibratorsystem in erster Linie ein, daß der Transportfluß eine oder mehrere Zonen mit einem fest an der Matrix verankerten Kalibrator in der jeweiligen Kalibratorzone (KZ) passagiert.
Das Verankern eines Kalibrators oder eines ein Kalibrator bindenden Mittels an der Matrix in einer Kalibratorzone kann durchgeführt werden gemäß denselben Prinzipien wie für das Verankern von dem Reaktand I an eine Nachweiszone. Das Kalibrator bindende Mittel ist gewöhnlich ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares (Reaktandenpaar), wobei die anderen Mitglieder des Bindungspaares an die Kalibratorsubstanz gekoppelt oder konjugiert sind. Beispiele für solche spezifischen Bindungspaare sind vorausstehend im Zusammenhang mit der Beschreibung des Fängers erwähnt worden.
Die Kalibratorzonen sollten stromabwärts von der Anwendungszone für Flüssigkeit lokalisiert sein, welche für den Transport des Reaktand* gedacht ist. In Verbindung mit der Nachweiszone (DZ) wird die Kalibratorzone bevorzugtermaßen stromaufwärts lokalisiert.
Unsere sich auf Kalibratoren beziehende Erfindung wird im Detail in unserer anhängigen PCT-Anmeldung WO 99/36 777 mit dem Titel „Ein Verfahren unter Verwendung eines neuen Kalibrators und einer Vorrichtung und eines Testkits einschließlich des Kalibrators" beschrieben.
Ein zweiter Hauptaspekt der Erfindung
Dieser Aspekt der Erfindung ist ein Kit, welcher aufweist (a) einen analytisch nachweisbaren biospezifischen Affinitätsreaktanden (Reaktand*) in welchem die Markierungsgruppe Teilchen sind, zusammen mit (b) einer Fließmatrix mit einer Nachweiszone in welcher ein Fänger in fester Weise über Teilchen verankert ist, welche bevorzugtermaßen kleiner sind als die kleinste innere Abmessung der Fließkanäle. Relevante Teilchen und Fließkanäle sind gemäß dem vorausstehend Erwähnten. Die Fließmatrix kann Anwendungszonen aufweisen, im voraus abgelagerte Reaktanden etc. gemäß dem Vorausstehenden.
Die Erfindung wird erläutert im experimentellen Teil und definiert in den Ansprüchen.
Beispiel 1 Vergleich zwischen Birkenallergen, gebunden über Teilchen oder direkt adsorbiert an die Nachweiszone.
Das Beispiel basiert auf dem Nachweis von für Birkenallergen spezifisches IgE. Um die Stärke der Erfindung zu zeigen, wird die mit einer Anzahl von Patientenproben erhaltene Antwort in einer Testvariante verglichen, wo 1.) das Allergenextrakt kovalent an mit Phenyldextran beschichtete Polystyrolteilchen gekoppelt ist, abgeschieden in der Nachweiszone, mit 2.) Allergenextrakt in direkter Weise abgeschieden und passiv an eine Nitrozellulosemembran gebunden.
Methoden und Materialien
Adsorption von Phenyldextran an Polystyrolteilchen:
Phenyldextran (Substitutionsgrad: 1 Phenylgruppe an jeder fünften Monosaccharideinheit = 20%, MW Dextran 40000, Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), gelöst in entionisiertem Wasser in verschiedenen Konzentrationen wurde unter Rühren an Polystyrolteilchen adsorbiert (0,49 μm, Bangs Laboratories): 1.) 4–5 mg/ml, 8–10% Teilchensuspension, Raumtemperatur, 0,5 h, 2.) 5 mg/ml, 5% Teilchensuspension, Raumtemperatur, 1 h, 3.) 20 mg/ml, 2% Teilchensuspension, über Nacht. Die Teilchen wurden dann zweimal in entionisiertem Wasser gewaschen. Die Teilchensuspension wurde zwischen jeder Inkubation zentrifugiert und gewaschen (12100 g, 30 min., Beckmann J2-21).
Extraktion von t3-(Birkenpollen, Betula verrucosa):
Ein Teil (Gewicht) von Bikenpollen (Allergon, Schweden) wurde mit 10 Teilen (Volumen) von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 extrahiert. Die Extraktion wurde 2 Stunden lang auf einem Schütteltisch fortgesetzt (200 Pulse/min) bei +4°C. Der Extrakt wurde bei 4000 U/min während 1,75 Stunden zentrifugiert nach der Zentrifugation wurde der t3-Extrakt auf eine PD-10-Säule (Pharmacia Biotech AB, Schweden) gegeben und in 0,1 M NaHCO₃. pH 8,5 eluiert. Das t3-Eluat (bezeichnet als t3-Extrakt 1/14) wurde für eine Aminosäureanalyse verwendet, zur Bestimmung des Gesamtniveaus an Protein.
Koppeln von t3-Extrakt an Polystyrolteilchen (t3-Teilchen):
Der T3-Extrakt wurde an mit Phenyldextran beschichtete Polystyrolteilchen mit CDAP (1-Cyano-4-dimethylaminopyridiniumbromid) (Kohn J und Wilchek M, FEBS Letters 154 (1) (1983) 209–210) gekoppelt.
Die mit Phenyldextran beschichteten Polystyrolteilchen (2128 mg) in 30%-igem Aceton (bezogen auf das Volumen), 2% Teilchensuspension, wurden mit 954 mg CDAP (100 mg/ml in 30% Aceton) und 7,63 ml 0,2 M Triethylamin (TEA, Riedel de Haen, Deutschland) aktiviert. CDAP wurde unter Rühren zugegeben und TEA wurde tropfenweise während 90 s und Rühren zugegeben bis zu einer Gesamtzeit von 120 s. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 30%-igem Aceton (vierfaches Volumen) gestoppt und durch Zentrifugation bei 12400 g während 35 min. Die Teilchen wurden einmal mit entionisiertem Wasser gewaschen.
640 ml des t3-Extraktes (1/14) in 0,1 M NaHCO₃, pH 8,5 wurden zu den aktivierten Teilchen zugegeben und die Kopplungsreaktion wurde eine Stunde lang auf einem Schütteltisch durchgeführt. Die Suspension wurde zentrifugiert und dekantiert, bevor die Teilchen mit 0,05 M Asparaginsäure und 0,05 M Glutaminsäure in 0,1 M NaHCO₃ deaktiviert wurden, pH 8,5. Die Inkubation wurde auf einem Schütteltisch über Nacht bei +4°C ausgeführt. Die Teilchen wurden durch eine Zentrifugation zweimal mit 50 mM NaPO₄, 0,05% NaN₃ pH 7,4 gewaschen.
Die Konzentration der Teilchen wurde durch ein Spektrometer bei 600 nm mit unbeschichteten Polystyrolteilchen als Referenz bestimmt. T3-gekoppelte Polystyrolteilchen wurden für eine Aminosäureanalyse genommen zur Bestimmung des Gesamtniveaus an Protein.
Ablagerung von t3-Extrakt und t3-Teilchen an der Membran (Nachweiszone): zu
Blättern aus Nitrozellulose mit einer Polyesterrückseite (Whatman, 8 μm, Breite 5 cm wurden Zonen von t3-Extrakt 1/14 mit Linear Striper (IVEK Corporation) angewendet mit einem Fluß von 1 μl/s und 1 μl/cm. Der t3-Extrakt 1/14 wurde unverdünnt abgeschieden und ebenfalls 1 : 1 in 0,1 M NaHCO₃, pH 8,5 verdünnt (t3-Extrakt 1/28). Die T3-Teilchen wurden auf 4% Teilchenniveau in 50 mM NaPO₄, 6% Laktose, 0,05% NaN₃, pH 7,4 verdünnt.
Die Blätter mit dem abgelagerten Material wurden eine Stunde lang bei 30°C getrocknet. Die Blätter wurden in Streifen mit einer Breite von 0,5 cm geschnitte (Matrix 1201 Membrane Cutter, Kinematics Automation).
Kohlenstoffteilchen-Konjugat (Reaktand*):
Monoklonaler anti-Mensch-IgE-Antikörper (anti-hIgE) wurde an Kohlenstoffteilchen adsorbiert (sp 100, < 1 μm, Degussa, Deutschland) gemäß WO 96/22 532. Die in Testpuffer verdünnte Endsuspension enthielt 300 μg/ml Kohlenstoffteilchen.
Testverfahren:
Streifen wurde auf einer etwa 16° von der Laborbankebene geneigten Oberfläche montiert. Saugmembranen (Breite 3 cm, Whatman, 17 Chr) wurden 0,5 cm in das Ende des Streifens hinein plaziert. Um einen konstanten Druck zu erhalten, wurden Metallgewichte auf die Saugmembranen gestellt.
Die Proben und Reagenzien wurden in der nachstehenden Reihenfolge pipettiert. Sowohl das Volumen der Probe als auch des Reagenzes ließ man in die Membran hinein migrieren bevor das nachfolgende Volumen pipettiert wurde.

1) 30 μl vom Testpuffer (0,1 M Tris-HCL, 0,6 M NaCl, 10% Sucrose, 3% Rinderserumalbumin, 0,05% Rindergammaglobulin, pH 7,4).
2) 30 μl Serumprobe.
3) 20 μl Testpuffer (derselbe wie in Schritt 1)
4) 20 μl Kohlenstoffteilchenkonjugat (anti-hIgE-Antikörper adsorbiert an Kohlenstoffteilchen, 300 μg/ml verdünnt in Testpuffer)
5) 2 × 30 μl Testpuffer
6) Die Kohlenstoffschwärzung der Nachweiszone wurde gemessen als der Absorptionswert mit Ultroscan XL, Enhanced Laser Densiometer (LKB).

Ergebnisse Menge an Protein in der Nachweiszone Tabelle 1 Abgeschiedene Menge von t3 in der Nachweiszone
Tabelle 2
Laterale Immunchromatographie mit (i) in direkter Weise adsorbiertem t3-Extrakt und (ii) t3-gekoppelten Teilchen in der Nachweiszone. Aufnahme von t3-positiven und -negativen Serumproben, bestimmt die Konzentration betreffend mit Pharmacia CAP System (Pharmacia and Upjohn Diagnostic AB, Schweden).
Folgerung
Die Experimente zeigten, daß dieselbe Menge an Birkenallergen, abgeschieden in Form von gekoppelten Teilchen eine in signifikanter Weise höhere Bindung von Birken-spezifischem IgE-Antikörpern ergab im Vergleich zu dem Allergen, wenn es in direkter Weise an der Membran abgeschieden wird.
In ähnlichen Experimenten wurden verschiedene monodisperse Polystytrolteilchen (Bangs Laboratories) als die verankernden Teilchen verwendet und anstelle von Kohlenstoffteilchen wurden verschiedene Durchmesser von fluoreszenten Polystyrol verwendet. Die Durchmesser der verankernden Teilchen variierten in den verschiedenen Experimenten in dem Intervall von 0,28–3 μm. Die Durchmesser der markierten Teilchen variierten in den verschiedenen Experimenten in dem Intervall von 0,1 bis 0,5 μm. Die Ergebnisse folgten im allgemeinen den Ergebnissen für Kohlenstoffteilchen, wie im Detail vorausstehend präsentiert.
Beispiel 2: Bestimmung von Birken-spezifischem IgE mit Testvarianten, wo Allergene in der Anwendungszone im voraus abgeschieden wurden.
Methoden und Materialien
Biotinylierung von Birkenpollenallergen:
Die Extraktion von t3 (Birkenpollen; Betula verrucosa) wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben, außer daß die zentrifugierte und filtrierte Lösung auf eine PD-10-Säule gegeben wurde und in entionisiertem Wasser eluiert wurde. Das t3-Eluat wurde gefriergetrocknet (LSL SECFROID, LYOLAB F, Pumpe: LEYBOLD TRIVAC D8B).
Das gefriergetrocknete t3-Material wurde in 0,15 M KPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,8 gelöst. Die Bestimmung des Gehalts wurde durch eine Aminosäureanalyse bestimmt. Zu dem Material wurde ¹²⁵I-markiertes t3 hinzu gegeben und die Mischung wurde auf eine PD-10-Säule, äquilibriert mit 25 ml 0,15 M KPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,8, gegeben. Die Biotinylierung von t3-Allergen wurde ausgeführt gemäß den empfohlenen Bedingungen vom Lieferanten (Pierce). Zu 3 mg des eluierten t3-Extraktes (2,0 ml) wurden dann 0,138 ml Biotin-LC-Sulfo-NHS (3,59 mM, Pierce) hinzu gegeben, und die Inkubation wurde auf einem Schüttler 1 Stunde lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Kopplungsreaktion wurde durch die Zugabe von 50 μl 2 M Glycin gestoppt. Der Extrakt wurde dann auf einer Gelfiltrationssäule PD-10 äquilibriert mit 50 mM NaPO₄, 0,15 M NaCl, pH 7,4, angewendet. Die Erträge und die Proteinendkonzentration wurden aus der erhaltenen Radioaktivität bestimmt.
Koppeln von Straptavidin an Polystyrolteilchen:
Streptavidin (Molecular Probes) wurde kovalent an Phenyldextran-adsorbierte Polystyrolteilchen mit CDAP (1-Cyano-4-dimethylamino-pyrridiniumbromid) gekoppelt (Kohn J und Wilchek, M, FEBS Letters 154 (1) (1983) 209–210).
Das Entsalzen und der Pufferwechsel von Strepavidin wurde durch eine Gelfiltration (PD-10) in NaHCO₃, 0,1 M pH 8,5 durchgeführt. 600 mg von Phenyldextran-beschichteten Polystyrolteilchen in einer 2%igen Lösung in 30%-igem Aceton (bezogen auf das Volumen) wurden aktiviert durch 4,5 ml CDAP (0,44 M) und 3,6 ml TEA (0,2 M, Triethylamin Riedel deHaën). CDAP wurde unter Rühren während 60 Sekunden und TEA während 120 Sekunden zugegeben. Die Teilchen wurden dann mit 30% Aceton (bezogen auf das Volumen) gewaschen und bei 12100 g zentrifugiert (25 min, Beckmann, J-21, JA-20 10000 U/min).
20,6 mg Straptavidin wurden an 350 mg aktivierten Teilchen gekoppelt mit einer Inkubation während 1,5 h bei +–4°C. Die Teilchen wurden dann, bevor eine Deaktivierung mit 0,05 M Glutaminsäure und 0,05 M Asparaginsäure in NaHCO₃-Puffer durchgeführt wurde, zentrifugiert. Die Inkubation wurde ausgeführt unter Rühren über Nacht bei +4°C. Die gekoppelten Teilchen wurden dann zweimal mit 50 mM NaPO₄, 0,05% NaN₃, pH 7,4 gewaschen.
Die Teilchenkonzentration wurde spektrophotometrisch bei A_600nm mit unbehandelten Teilchen als der Referenz bestimmt.
Ablagerung von Strepavidin-gekoppelten Teilchen auf Nitrozellulosemembranen:
Zu Blättern aus Nitrozellulose mit einer Polyesterrückseite (Whatman, 8 μm, 5 cm Breite) wurden Zonen von Strepavidin-gekoppelten Teilchen, verdünnt auf 1% Teilchengehalt in 10 mM NaPO₄, 5% Sucrose, 5% Dextran 5000, pH 7,4 angewendet mit einem Linear Striper (NEC Corporation).
Der Ablagerungsfluß war 2,5 μl/cm und die Rate 20 mm/s. Die Ablagerungen wurden 1 Stunde lang bei 30°C getrocknet, worauf die Blätter in 0,5 cm breite Streifen geschnitten wurden (Matrix 1201 Membrane Cutter, Kinematics Automation).
Ablagerung von biotiyliertem Allergen auf Filterpapier:
10 × 5 mm Filter wurden aus Filterpapieren geschnitten (Whatman 3). 10 μl des biotinylierten t3 (77 ng) in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, BSA 6%, wurden auf die Filter aufgebracht, und die Filter wurden bei 30°C 45 min lang getrocknet.
Koppeln von anti-hIgE-Antikörper an Nachweisteilchen:
Antikörper gegen hIgE, geschnitten mit Pepsin zu Fab'2-Fragmenten wurden an fluoreszente Poystyrolteilchen mit Aldehydgruppen auf ihrer Oberfläche gekoppelt (Molecular Probes C-17177 TransFluo-Spheres, Aldehyd-Sulfat-Microsphären, 0,1 μm, 633/720, 2% Feststoffe). 23 mg des Antikörpers wurden an 66 mg der Teilchen in 50 mM NaPO₄-Puffer, pH 6, über Nacht bei Raumtemperatur gekoppelt. Dann wurden 205 μl NaCNBH₄ (5 M) zugegeben, um das Koppeln während 3 Stunden bei Raumtemperatur zu verringern. Nach einer Zentrifugation bei 20800 × g (50 min in Eppendorf 5417 R, 14000 U/min) wurde eine Deaktivierung in 0,05 M Glutaminsäure und 0,05 M Asparaginsäure in entionisiertem Wasser, pH 6,5 über Nacht unter Rühren bei Raumtemperatur durchgeführt. Eine Zentrifugation wurde dann bei 20800 × g (50 min) durchgeführt. Nach dem Blocken mit 0,2% BSA in 50 mM NaPO₄, pH 7,4 mit 0,05% NaN₃ und einer Inkubation über Nacht bei +4°C wurde wiederum eine Zentrifugation bei 20800 × g (50 min) durchgeführt. Zweimaliges Waschen mit und Lagern in Blockierungspuffer wurde dann durchgeführt. Die Teilchenkonzentration wurde in einem Fluorimeter (Perkin-Elmer LS50B) mit einer Standardkurve, hergestellt mit den Originalteilchen, bestimmt. Die gekoppelte Proteinkonzentration wurde bestimmt, indem radioaktive anti-IgE während des Koppelns vorhanden waren.
Testverfahren:
Die Streifen wurden auf einer Oberflächen, die etwa 16° von der Ebene der Laborbank aus geneigt war, montiert. Saugmembranen (3,5 cm Breite, Schleicher & Schuell, GB004) wurden 0,5 cm in das obere Ende des Streifens hinein plaziert. Um einen konstanten Druck zu erhalten, wurden Metallgewichte auf den Saugmembranen plaziert. Die Proben und Reagenzien wurden auf einander folgend, wie nachstehend beschrieben pipettiert. Jedes Volumen von Probe und Reagenz wurde in die Membran hinein gesaugt, bevor das folgende Volumen pipettiert wurde.

1.) Vorwaschen mit 30 μl 50 mM NaPO₄ 0,15 M NaCl, pH 7,4.
2.) Ein Filter mit im voraus abgelagertem biotiyliertem IgE wurde am Boden des Streifens platziert.
3.) 30 μl Serum wurden auf jeden Filter pipettiert.
4.) 20 μl Testpuffer (0,1 NaPO₄, 0,15 M NaCl, 10% Sucrose, 3% BSA, 0,05% Rindergammaglobulin, 0,05% NaN₃, pH 7,4) wurden zu dem Filter zugegeben.
5.) Der Allergenfilter wurde entfernt
6.) 20 μl des Nachweiskonjugates (75 μg/ml) verdünnt in Testpuffer.
7.) 2 × 30 μl Testpuffer
8.) Die Fluoreszenz der Nachweiszone wurde als ein Antwortbereich (Vmm) mit einem Rotlaser-Scanning-Fluorometer (635 nm) gemessen.

Ausgewählte Serumproben schlossen negatives, schwach positives und stark positives Serum ein.
Ergebnisse
Die Ergebnisse zeigen, daß das Prinzip der im voraus abgelagerten Allergene (oder Antigene) in der Anwendungszone und ein allgemeines bindendes Mittel in der Reaktionszone gut funktionieren.

Claims

Ein Verfahren zur Verwendung in einer Fließmatrix, welches biospezifische Affinitätsreaktionen benutzt, um einen Analyten in einer Probe nachzuweisen, und welches umfasst: i. Wandernlassen der Probe (Analyt) und eines analytisch nachweisbaren Reaktanden (Reaktand*) durch Fließkanäle in einer Fließmatrix zu einer Nachweiszone (DZ), die in der Matrix angeordnet ist, in welcher sich ein fest verankerter biospezifischer Affinitätsreaktand (Fänger) befindet, worin ii. der Reaktand* in der DZ in einer Menge eingefangen wird, die zu der Menge des Analyten in der Probe in Beziehung steht, dadurch gekennzeichnet, dass A) der Reaktand* Teilchen aufweist, die als eine Markierung wirken, wobei die Teilchen mit Gruppen versehen sein können, welche deren Nachweis erleichtern, und B) der Fänger über immobilisierte Teilchen an der Matrix verankert ist, welche hydrophile Gruppen auf ihrer Oberfläche aufweisen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Immobilisierung eines biospezifischen Affinitätsreaktanden durch kovalente Bindung an die hydrophilen Gruppen auf den Fängerteilchen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch die Immobilisierung einer komplexen Mischung aus biospezifischen Affinitätsreaktanden an den hydrophilen Gruppen auf den Fängerteilchen.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–3, gekennzeichnet durch die Immobilisierung der komplexen Mischung aus biospezifischen Affinitätsreaktanden, die in Allergenen gefunden werden, an den hydrophilen Gruppen auf den Fängerteilchen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1–3, gekennzeichnet durch die Immobilisierung der komplexen Mischung der biospezifischen Affinitätsreaktanden, die in biologischem Material gefunden werden, das verwendet wird, um Autoantikörper nachzuweisen, an den hydrophilen Gruppen auf den Fängerteilchen.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophilen Gruppen ungeladen sind.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–4 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt ein Antikörper des Typs IgE oder IgG mit einer Spezifität für Allergene ist.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–4 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt ein Antikörper vom Typ IgG, IgM oder IgA mit einer Spezifität für Autoantigene ist.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–8, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen, welche den Fänger verankern, eine Größe aufweisen, die kleiner als die kleinste Innenabmessung der Fließkanäle der Matrix ist.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–9, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen, welche den Fänger verankern, eine Größe aufweisen, die in dem Bereich von 0,1–1000 μm, vorzugsweise in dem Bereich von 0,1–100 μm liegt.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–10, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungsteilchen in dem Reaktanden* einen Durchmesser in dem Bereich von 0,01–5 μm aufweisen.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–11, dadurch gekennzeichnet, dass die Fließkanäle eine kleinste Innenabmessung in dem Bereich von 0,4–1000 μm, vorzugsweise 0,4–100 μm aufweisen.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–12, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungsteilchen fluoreszierend oder gefärbt sind.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–8 und 12–13, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktand* vorab in der Matrix stromaufwärts der DZ und vorzugsweise stromaufwärts der Probenauftragungsstelle abgeschieden wird.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–14, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen, welche den Fänger an der Matrix verankern, ein synthetisches Polymer oder ein halbsynthetisches Polymer oder ein Biopolymer sind, das auf seiner Oberfläche hydrophile Gruppen aufweist.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–15, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktand* in der DZ durch Bildung des ternären Komplexes Reaktand'-–Analyt––Reaktand* eingefangen wird, wobei der Reaktand' und der Reaktand* in der Lage sind, gleichzeitig den Analyten biospezifisch zu binden, und der Reaktand' der fest verankerte Fänger oder ein Reaktand, an welchen der Fänger über eine biospezifische Affinität binden kann, ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt ein Antigen ist und der Reaktand' und der Reaktand* Antikörper sind, die eine Spezifität für Epitope auf dem Analyten aufweisen.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–17, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in Verbindung mit dem Diagnostizieren einer Allergie oder Autoimmunerkrankung durchgeführt wird.
Ein Testkit, wenn es zur Durchführung analytischer Verfahren in einer Fließmatrix verwendet wird, wobei die Verfahren biospezifische Affinitätsreaktionen benutzen, um einen Analyten in einer Probe nachzuweisen, wobei der Kit umfasst: (i) eine Fließmatrix mit einer Nachweiszone (DZ), in welcher sich ein fest verankerter biospezifischer Affinitätsreaktand (Fänger) befindet, und (ii) einen analytisch nachweisbaren Reaktanden (Reaktand*), dadurch gekennzeichnet, dass A) der Reaktand* Teilchen aufweist, die als eine Markierung wirken, wobei die Teilchen mit Gruppen versehen sein können, die deren Nachweis erleichtern, und B) der Fänger über immobilisierte Teilchen an der Matrix verankert ist, welche hydrophile Gruppen auf ihrer Oberfläche aufweisen.
Der Kit gemäß Anspruch 19, gekennzeichnet durch die Immobilisierung eines biospezifischen Affinitätsreaktanden durch kovalente Bindung an den hydrophilen Gruppen auf den Fängerteilchen.
Der Kit gemäß Anspruch 19 oder 20, gekennzeichnet durch die Immobilisierung einer komplexen Mischung von biospezifischen Affinitätsreaktanden an den hydrophilen Gruppen auf den Fängerteilchen.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–21, gekennzeichnet durch die Immobilisierung der komplexen Mischung aus biospezifischen Affinitätsreaktanden, die in Allergenen gefunden werden, an den hydrophilen Gruppen auf den Fängerteilchen.
Der Kit gemäß den Ansprüchen 19–21, gekennzeichnet durch die Immobilisierung der komplexen Mischung aus biospezifischen Affinitätsreaktanden, die in biologischem Material gefunden werden, das verwendet wird, um Autoantikörper nachzuweisen, an den hydrophilen Gruppen auf den Fängerteilchen.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–23, dadurch gekennzeichnet, dass die hydrophilen Gruppen ungeladen sind.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–22 und 24, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt ein Antikörper vom Typ IgE oder IgG mit einer Spezifität für Allergene ist.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–21 und 23–24, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt ein Antikörper vom Typ IgG, IgM oder IgA mit einer Spezifität für Autoantigene ist.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–23, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen, welche den Fänger verankern, eine Größe aufweisen, die kleiner als die kleinste Innenabmessung der Fließkanäle der Matrix ist.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–23 und 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen, welche den Fänger verankern, eine Größe aufweisen, die in dem Bereich von 0,1–1000 μm, vorzugsweise dem Bereich von 0,1– 100 μm liegt.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–23 und 27–28, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungsteilchen in dem Reaktanden* einen Durchmesser in dem Bereich von 0,01–5 μm aufweisen.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–28, dadurch gekennzeichnet, dass die Fließkanäle eine kleinste Innenabmessung in dem Bereich von 0,4–1000 μm, vorzugsweise 0,4–100 μm aufweisen.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–29, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungsteilchen fluoreszierend oder gefärbt sind.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 18–31, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktand* vorab in der Matrix stromaufwärts der DZ und vorzugsweise stromaufwärts der Probenauftragungsstelle abgeschieden wird.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–24 und 30–32, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen, welche den Fänger an der Matrix verankern, ein synthetisches Polymer oder ein halbsynthetisches Polymer oder ein Biopolymer sind, welches an seiner Oberfläche hydrophile Gruppen aufweist.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–24 und 30–33, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktand* in der DZ durch Bildung des ternären Komplexes Reaktand'––Analyt––Reaktand* eingefangen wird, wobei der Reaktand' und der Reaktand* in der Lage sind, gleichzeitig den Analyten biospezifisch zu binden, und der Reaktand' der fest verankerte Fänger oder ein Reaktand, an welchen der Fänger über biospezifische Affinität binden kann, ist.
Der Kit gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt ein Antigen ist und der Reaktand' und der Reaktand* Antikörper mit einer Spezifität für Epitope auf dem Analyten sind.
Der Kit gemäß irgendeinem der Ansprüche 19–35, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren in Verbindung mit dem Diagnostizieren einer Allergie oder Autoimmunerkrankung durchgeführt wird.