DE69817872T2

DE69817872T2 - Verfahren zur Bestimmung eines Analyts in einer Probe mittels einer Durchflussmatrix bei dem die Reagenzienzugabe an zwei oder mehreren zusätzlichen Stellen der Matrix stattfindet

Info

Publication number: DE69817872T2
Application number: DE69817872T
Authority: DE
Inventors: Ib Mendel-Hartvig; Ilya Zelikman; Gerd RUNDSTRÖM
Original assignee: Pharmacia Diagnostics AB
Current assignee: Phadia AB
Priority date: 1997-12-30
Filing date: 1998-12-30
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2018-12-31
Also published as: PT1044372E; EP1044372A1; EP1044372B1; SE9704934D0; DE69817872D1; AU749299B2; JP2002531806A; JP4424848B2; CA2315686A1; ATE249044T1; AU2083399A; ES2207027T3; WO1999036776A1; DK1044372T3

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe unter Anwendung biospezifischer Affinitätsreaktanten (Reaktant 1, Reaktant 2 usw.), von denen einer analytisch nachweisbar ist (Reaktant*) und einer fest in einer Nachweiszone in einer Transportströmungsmatrix (Reaktant I) verankert ist. Die Probe (Analyt) wird durch eine Strömung in der Matrix von einer Anwendungszone für Flüssigkeit (LZS), welche den Analyten (Probe) und oder einen Puffer enthält, zu der Nachweiszone (DZ) transportiert, in der der Reaktant I fest verankert wird. Zur gleichen Zeit, wenn die Probe in der Matrix transportiert wird, werden die löslichen Reaktanten, einschließlich Reaktant*, transportiert. In der Nachweiszone wird der Reaktant* in einer Menge abgefangen, die mit der Menge des in der Probe vorhandenen Analyten in Zusammenhang steht. Um dies zu erreichen, wird der Reaktant* so gewählt, dass er sich biospezifisch direkt an Reaktant I binden kann oder indirekt über einen oder mehrere zugesetzte biospezifische Affinitätsreaktanten (wobei der Analyt eingeschlossen ist.). Die Menge an Analyt wird dann bestimmt aus der Menge des in der Nachweiszone gebundenen Reaktanten*. Die Transportströmung kann Zonen enthalten, in denen verschiedene biospezifische Affinitätsreaktanten (z. B. Reaktant*, aber kein Analyt) zuvor angewendet (zuvor deponiert) worden sind, um gelöst und mit der Strömung in Richtung auf die Nachweiszone transportiert zu werden.
Mit Reaktanten (den Analyten eingeschlossen), die biospezifische Affinität aufweisen (Bioaffinitätsreaktanten), sind individuelle Mitglieder in den Reaktantpaaren: Antigen/Hapten-Antikörper; Biotin-Avidin/Streptavidin; zwei komplementäre Einzelketten von Nukleinsäure etc. gemeint. Als Antikörper werden Antigen-bindende Antikörperfragmente wie Fab, F(ab)₂' und Einzelketten-Fv-Antikörper (scFv) etc. in Betracht gezogen. Relevante Reaktanten müssen nicht natürlich vorkommen, sondern können auch synthetisch hergestellte Moleküle/Binder sein.
Der Typ der vorliegenden Testmethodik ist zuvor primär für biospezifische Affinitätsreaktanten verwendet worden, wo mindestens ein Teil eines verwendeten Reaktantenpaares eine Proteinstruktur aufwies, insbesondere im Zusammenhang mit sogenannten immunchemischen Bestimmungsverfahren.
Die biospezifischen Affinitätsreaktionen werden primär in wässrigem Medium (z. B. Wasser) durchgeführt.
Die vorliegende Technik ist bestens bekannt und wird häufig auf sogenannte Teststreifen angewendet, bei denen der Streifen als eine Durchflussmatrix dient. Der Durchfluss wurde in der Zone initiiert, der die Probe zugesetzt wurde (LZS). Der Durchfluss ist häufig lateral, d. h. parallel zur Oberfläche der Matrix oder anderen Typs, z. B. in der Tiefe der Matrix.
Die Testprotokolle waren vom sogenannten Inhibierungstyp (kompetitiv) oder Nicht-Inhibierungstyp (nicht-kompetitiv, Sandwich). Siehe z. B. Behringwerke US 4 861 711 ; Unilever WO 88/08534; Abbot US 5 120 643 ; Becton Dickinson-EP 284 232 und US-Patent 4 855 240; Abbot/Syntex-US 4 740 468; Pharmacia AB, WO 96/22532 etc.
In diesem Zusammenhang werden häufig bezüglich bestimmter Reaktanten (insbesondere Analyt und Reaktant*) gleichzeitige und sequentielle Methoden (Protokolle) erwähnt. In gleichzeitigen Varianten werden der Analyt (die Probe) und der relevante Reaktant, z. B. der Reaktant*, gleichzeitig in die Nachweiszone transportiert. Es können gleichzeitige Varianten erhalten werden, wenn eine Probe vorinkubiert/mit Reaktant* gemischt wurde oder wenn der Reaktant* zuvor in der Probenanwendungszone oder in einer Zone strömungsabwärts der Probenanwendungszone, aber vor der Nachweiszone deponiert wurde. In sequentiellen Varianten wird der Analyt (Probe) vor einem Reaktanten, z. B. Reaktant*, in die Nachweiszone transportiert. Sequentielle Varianten können erhalten werden, wenn der relevante Reaktant, z. B. Reaktant*, der gleichen Anwendungszone zugesetzt wird wie die Probe, nachdem die Probe (der Analyt) aus der Zone transportiert wurde. Eine Variante sequentieller Methodik wird im US-Patent Nr. 4 855 240 (Becton & Dickinson) besprochen. Als eine Alternative zur vor dem „Tracer" (= Reaktant*) transportierten Probe (Analyt) in der gleichen Transportströmung werden im US-Patent Nr. 4 855 240 separierte Transportströmungen beschrieben, in denen die Zeit des Transports so geregelt ist, dass die Probe (Analyt) die Nachweiszone vor dem „Tracer" (Reaktant*) erreicht. Eine andere Variante se quentieller Methodik wird im EP-Patent Nr. 306 336 von Syntex (U.S.A.) Inc. beschrieben, worin eine Vorrichtung verwendet wird, die ein Gehäuse umfasst, das ein erstes Mittel zum Einführen einer Probe vorsieht sowie ein zweites Mittel zum Einführen eines flüssigen Reagens, das nicht die Probe ist.
Der Begriff „gleichzeitige Tests" hat häufig jede Variante eingeschlossen, in der die Probe und der Reaktant* vorinkubiert/gemischt werden, bevor sie einer Durchflussmatrix zugesetzt werden oder in der die Probe einer Durchflussmatrix zugesetzt wird, in der der Reaktant* zuvor in der Probenanwendungszone oder strömungsabwärts davon deponiert wurde. Der Begriff „sequentielle Tests" hat auf ähnliche Weise jede Variante eingeschlossen, in der der Reaktant* der Probenanwendungszone zugesetzt wurde, nachdem die Probe ihre Anwendungszone verlassen hatte. Somit wurden keine Überlegungen angestellt im Hinblick darauf, ob sich die Reihenfolge von Analyt und Reaktant* während des Transports zur Nachweiszone verändert. Wenn nicht anders vermerkt, wird diese Nomenklatur auch für die vorliegende Erfindung verwendet, wird aber jetzt so angepasst, dass es mehrere Anwendungszonen für Flüssigkeit gibt. Diese Sichtweise bedeutet, dass primär die anfängliche Reihenfolge berücksichtigt wird, wenn sowohl der Analyt als auch der Reaktant* in löslicher Form vorliegen, und nicht die Reihenfolge, in der der Analyt und der Reaktant* in die Nachweiszone transportiert werden.
Nachteile mit dem Stand der Technik und Ziele der Erfindung
Der Stand der Technik hat häufig praktische Probleme bei der Automatisierung mit sich gebracht, primär deswegen, weil eine vorinkubation oder die sequentielle Zugabe von Probe und Reaktanten häufig erforderlich waren, oft in einer bestimmten vorher festgelegten Reihenfolge, die vom verwendeten Testprotokoll definiert wurde. Das Ziel der Erfindung besteht (a) in der Vereinfachung der Automatisierung, (b) in der Vermeidung sequentieller Zugabe der Probe und des analytisch nachweisbaren Reaktanten (Reaktant*) und (c) darin, dass eine vorherige Deponierung von Reaktant* möglich ist, wenn sequentielle Methodik angewendet wird, die sich auf den Analyten und den Reaktant* bezieht. Allgemeinere Ziele bestehen darin, Testergebnisse hoher Qualität zu erzielen, vorzugsweise mit verbesserter Sensitivität und Präzision, als dies durch vorhergehende Varianten der Fall war.
Die Erfindung
Überraschenderweise haben wir nun entdeckt, dass, wenn der Durchfluss durch die fast gleichzeitige Zugabe von Flüssigkeit an zwei benachbarte Zonen in einer Durchflussmatrix initiiert wird, die in der Zone stromabwärts zugegebene Flüssigkeit sich vor der Flüssigkeit in Richtung auf die Nachweiszone in Bewegung setzt, die in der Zone stromaufwärts zugegeben wurde. Unsere Entdeckung schließt ein, dass eine zonenweise Stoffwanderung von Flüssigkeiten auch erhalten werden kann, wenn die Zugabe von Flüssigkeit in einer Zone stromaufwärts nach Zugabe von Flüssigkeit in der am nächsten stromabwärts gelegenen Zone durchgeführt wird. Durch Anwendung dieser Entdeckung auf den relevanten Typ von Analysemethoden können bezüglich der oben erwähnten Ziele Verbesserungen erzielt werden.
Ein erster Hauptaspekt der Erfindung betrifft die eingangs erwähnte Analysemethoden und ist dadurch gekennzeichnet, dass

A. die Durchflussmatrix mindestens zwei Anwendungszonen für Flüssigkeit zeigt, die im Wesentlichen benachbart zueinander angeordnet sind:
worin
a) LZ_n eine Anwendungszone für Flüssigkeit ist, in der n die Position der Anwendungszone LZ_n ist (n ist eine ganze Zahl 2 < n < m)
b) m die Gesamtzahl an Anwendungszonen ist, in welchen die Strömung initiiert wird,
c) eine LZ_n eine Anwendungszone für die Probe (LZ_n'S) ist und eine LZ_n eine Anwendungszone für den Reaktanten* (LZ_n''R*) ist, mit n'' ≥ n';
d) → die Strömungsrichtung ist, und
e) DZ die Nachweiszone ist; und
B. die Strömung durch Zusetzen von Flüssigkeit zu jeder Zone LZ_m .. LZ_n .. LZ₁ initiiert wird, in einer Weise, dass Flüssigkeit_n+1, welche der Anwendungszone LZ_n+1 hinzugefügt wird, durch die Matrix hindurch befördert wird nach der Flüssigkeit, welche der nächsten stromabwärts gelegenen Anwendungszone LZ_n hinzugefügt wird.

Flüssigkeit_n+1 kann leicht unmittelbar nach Flüssigkeit_n wandern, wenn die entsprechenden Zonen für die Anwendung von Flüssigkeit benachbart zueinander sind, oder wenn zugegebene Flüssigkeitsvolumen für diesen Zweck geeignet sind.
Im üblichsten Fall schließt das oben Erwähnte das Zusetzen von Flüssigkeit_n+1 LZ_n+1 ein, vor oder primär gleichzeitig mit dem Zusetzen der Flüssigkeit_n zu LZ_n. Für n = m fehlt LZ_n+1, und für diese Zone ist es deshalb nicht möglich, LZ_m+1 irgendeine Flüssigkeit zuzusetzen. Praktische Vorteile werden erreicht, wenn das Zusetzen primär gleichzeitig für alle Zonen LZ_m .. LZ_n .. LZ₁ vorgenommen wird.
Die Zahl (m) der Anwendungszonen für Flüssigkeit (LZ_m .. LZ_n .. LZ₁) kann im Prinzip jede Zahl mit der Ausnahme von Eins (m 1) sein. Aus praktischen Gründen ist es wahrscheinlich, dass in Zukunft 2 ≤ m ≤ 10, vorzugsweise 2 ≤ m ≤ 6, wie m = 2 oder 3 oder 4 oder 5 ist.
Die zugesetzten Flüssigkeiten (Flüssigkeit₁ .. Flüssigkeit_m) können entweder nur aus Pufferlösung oder Pufferlösung plus einem Reaktanten (Reaktant 1, Reaktant 2 etc.) bestehen, wobei es notwendig ist, dem Reaktant* zu ermöglichen, dass er in der Nachweiszone in einer Menge abgefangen wird, die mit der Menge an Analyt in der Probe in Zusammenhang steht. Der Reaktant* kann auch in einer Flüssigkeitn eingeschlossen sein. In der Regel ist die Zusammensetzung transportierter Komponenten von einer Anwendungszone nicht die gleiche wie von der nächsten benachbarten Anwendungszone, in welcher die Strömung initiiert wird (LZ_n+1 und LZ_n-1 mit der Ausnahme von n = m und n = 1, für die die Zonen LZ_n+1 bzw. LZ_n-1 fehlen).
Mit dem Ausdruck „im Wesentlichen benachbart zueinander" ist gemeint, dass die Anwendungszonen für Flüssigkeit unmittelbar benachbart zueinander sind oder einen dazwischen gelegenen Bereich an Matrix haben, welcher vorzugsweise nicht mehr als etwa 2 mm und insbesondere nicht mehr als etwa 1 mm beträgt.
Eine in einer Anwendungszone zugesetzte Flüssigkeit kann eine Tendenz haben, sich an am oberen Ende der Matrix auf Teile der Matrix auszubreiten, die außerhalb der Zone sind. Für benach barte Zonen bedeutet dies, dass Flüssigkeiten auf unerwünschte Weise miteinander vermischt werden können. Um dies zu vermeiden, werden physikalische Barrieren gesetzt, die zwei benachbarte Anwendungszonen abgrenzen (Zonen-Spacer). Die Barrieren sollten primär am oberen Ende der Matrix gesetzt werden, können aber bis in die Matrix hinein ausgedehnt werden, ohne die Strömung völlig zu unterbrechen. Eine Abgrenzung findet primär gegen eine benachbarte Zone für die Anwendung von Flüssigkeit statt, kann sich aber natürlich um eine ganze Anwendungszone für Flüssigkeit erstrecken. Flüssigkeit kann auch über Kissen oder Materialschichten eingeführt werden, die auf der Matrix aufgebracht sind und aus dem gleichen oder einem anderen Material sind als das Matrixmaterial. In einem solchen Fall besteht kein Bedarf an Zonen-Spacern.
Relevante Reaktanten können in einer Anwendungszone für Flüssigkeit (LZ_n) oder zwischen zwei dieser Zonen vorab deponiert werden. Eine Anwendungszone für Flüssigkeit, die nur zum Transport von Pufferkomponenten und/oder anderen Komponenten dient, die nicht an den biospezifischen Affinitätsreaktionen beteiligt sind (d. h. die Flüssigkeit, die weder Reaktant noch Analyt enthält noch für den Transport von Reaktant oder Analyt vorgesehen ist), wird unten LZ_nB genannt. Eine Anwendungszone für Flüssigkeit (LZ_n), in welcher die Flüssigkeit einen Reaktanten enthält oder die für den Transport eines Reaktanten, z. B. Reaktant*, Reaktant 1, Reaktant 2 etc., vorgesehen ist, wird unten LZ_n''R*, LZ_n'''R1, LZ_n''''R2 etc. genannt. Wenn eine Flüssigkeit_n eine Kombination von Komponenten, z. B. den Reaktant* und den Analyten (Probe), transportieren soll, wird die Anwendungszone für die Komponenten gemeinsam sein und mit LZ_n'''R2/R1 etc. bezeichnet. Für die Kombinationsprobe und den Reaktanten* wird die Anwendungszone LZ_n'R*/S (n' = n'') sein. Dass Flüssigkeit_n für den Transport eines bestimmten Reaktanten gedacht ist, schließt ein, dass der vorliegende Reaktant auch in der Zone LZ_n zuvor deponiert werden kann. Letzteres schließt ein, dass der Reaktant zuvor in einem Bereich stromabwärts der Anwendungszone für die relevante Flüssigkeit, aber stromaufwärts der nächsten stromabwärts gelegenen LZ (LZ_n-1) deponiert werden kann oder, wenn n = 1 ist, nur stromaufwärts der Nachweiszone (weil LZ_n-1 dann fehlt).
Mit vorheriger Deponierung ist gemeint, dass ein Reaktant im Voraus der Matrix zugesetzt wird und in einer Weise, dass er sich nicht in die Matrix ausbreitet, bis er von Flüssigkeit erreicht wird, welche angewendet wurde, um die Strömung zu initiieren. Vorherige Deponierung von Reaktanten kann auf eine an sich bekannte Weise durchgeführt werden. (Siehe z. B. Behring werke US-Patent-Nr. 4 861 711; Unilever WO 88/08534; Abbot US-Patent-Nr. 5 120 643; Becton Dickinson EP-Nr. 284 232). Es ist wichtig, es so einzurichten, dass sich der betreffende Reaktant rasch auflöst, wenn Flüssigkeit durch einen Bereich strömt, welcher zuvor deponierten Reaktanten enthält. Um eine rasche Auflösung zu erreichen, ist es üblich, Reaktanten in Substanzen einzubringen, die sich als solche rasch auflösen. Dieser Typ von Substanzen ist häufig hydrophil mit polaren und/oder geladenen Gruppen, wie Hydroxy, Carboxy, Amino, Sulphonat etc. Insbesondere können hydrophile, rasch lösliche Polymere erwähnt werden, die z. B. eine Kohlehydratstruktur haben, einfache Zucker einschließlich Mono-, Di- und Oligosaccharide und entsprechende Zuckeralkohole (Mannitol, Sorbitol etc.). Es ist allgemein üblich, zuerst die betreffende Anwendungszone mit einer Schicht der rasch löslichen Substanz zu beschichten, und dann wird der Reaktant aufgebracht, wahlfrei gefolgt von einer zusätzlichen Schicht aus rasch löslicher Substanz. Ein alternativer Weg besteht darin, den Reaktanten in Teilchen rasch löslichen Materials einzubringen, die dann in der relevanten Zone der Matrix deponiert werden.
Einige der wichtigsten Ausführungsformen bezüglich der Anwendungszonen für Flüssigkeit können so zusammengefasst werden: 2 ≤ m ≤ 6; n' ist 1, 2 oder 3; n'' > n' oder n'' = n'; LZ_n'S ist die Anwendungszone für die Probe und wahlfrei auch für den Reaktanten* oder einen anderen Reaktanten; LZ_n'+1, LZ_n'+2, L_n'+3, LZ_n'-1, und L_n'-2 sind Anwendungszonen für Flüssigkeiten, die bestimmt sind für den Transport des Reaktanten* oder eines anderen Reaktanten oder von Puffer ohne Reaktanten, so weit es durch m, n'' und n' gestattet ist.
Eine Transportströmung durch die speziellen Matrixtypen kann erreicht werden durch die Wirkung von Kapillarkräften, z. B. durch den Beginn mit einer im Wesentlichen trockenen Matrix. Ein Saugkörper kann als Hilfe am Ende der Strömung angebracht sein. Strömung, in der Bedeutung von Transport von primär nur gelösten Komponenten, kann erreicht werden, wenn ein elektrisches Feld über die Matrix angewendet wird.
Testprotokolle
Durch die Verwendung der Erfindung können die Reaktanten und der Analyt dazu gebracht werden, sich zonenweise als individuelle Komponenten oder zusammen in unterschiedlichen Kombinationen in Richtung auf die Nachweiszone zu bewegen. Die genaue Abfolge von Anwendungszonen wird bestimmt durch das zu verwendende Testprotokoll.
Die Erfindung kann sowohl auf kompetitive (Inhibierung) als auch nicht-kompetitive (Nicht-Inhibierung) Testvarianten angewendet werden, ungeachtet dessen, ob diese bezüglich eines Reaktanten gleichzeitig oder aufeinanderfolgend sind. Veranschaulichende Systeme sind unten schematisch in Form der gebildeten Komplexe dargestellt. „-„ bezieht sich auf festes Verankern mit der Matrix, „---„ bezieht sich auf Verbinden mittels biospezifischer Affinität. Der Einfachheit halber wurde angenommen, dass verwendete Reaktanten bezüglich verwendeter Verbindungsstellen einwertig sind.
A. Sandwich-Protokoll (Nicht-Inhibierung)
Der Reaktant I und der Reaktant* haben beide biospezifische Affinität für den Analyten. x = Molzahl von Reaktant I auf der Matrix und y = Molzahl des Analyten (= Molzahl des Reaktanten*), gebunden an den Reaktanten I.
Komplex in der Nachweiszone:

Matrix (-Reaktant I)_x-y (-Reaktant I ---Analyt ---Reaktant*)_y

Gleichzeitige Varianten:

m = 2: LZ₂R*/S LZ₂B DZ

Aufeinanderfolende Varianten:

m = 2: LZ₂R* LZ₁S DZ.
m = 3: LZ₃R* LZ₂B LZ₁S DZ und Alternativen, bei denen sich die Pufferzone in Position 1 oder 3 befindet.
m = 4: LZ₄B LZ₃R* LZ₂B LZ₁S DZ und Alternativen, bei denen jede der Pufferzonen die Position 1 hat.
m = 5: Die gleiche Abfolge wie für m = 4 mit der Ausnahme, dass sich eine Extra-Pufferzone an Position 1 befindet.

B. Sandwich-Protokoll (Nicht-Inhibierung):
Der Reaktant I weist biospezifische Affinität für den Reaktanten II auf. Sowohl der Reaktant II als auch der Reaktant* weisen biospezifische Affinität für den Analyten auf. x = Molanzahl von Reaktant I auf der Matrix, y = Molanzahl des Analyten (= Molanzahl von Reaktant*), gebunden an den Reaktanten I über Reaktant II. y + z ist die Molanzahl von Reaktant II, der an den Reaktanten I gebunden ist.
Komplex in der Nachweiszone:

Matrix (-Reaktant I)_x-z-y (-Reaktant I --- Reaktant II)_z(-Reaktant I --- Reaktant II --- Analyt --- Reaktant*)_y

Gleichzeitige Varianten:

m = 2: Dasselbe wie für Protokoll A mit der Ausnahme, dass LZ₂R*/S LZ₂R*/S/RII ist oder dass LZ₁B LZ₁RII ist.
m = 3: LZ₃R*/S LZ₂B LZ₁RII DZ oder LZ₃R*/S LZ₂RII LZ₁B DZ.

Aufeinanderfolgende Varianten:

m = 2: Dasselbe wie für Protokoll A mit der Ausnahme, dass LZ_tS durch LZ_tS/RII ersetzt wird.
m = 3: LZ₃R* LZ₂B LZ₁S/RII DZ oder LZ₃R* LZ₂S LZ₁RII DZ oder LZ₃R* LZ₂S/RII LZ₁B DZ.
m = 4, 5, 6: Analog zu Protokoll A können Abfolgen mit bis zu 6 Anwendungszonen für Flüssigkeit berücksichtigt werden.

C. Inhibierungsprotokoll:
Der Reaktant I ist ein Analytanalog, der fest mit der Matrix verankert ist, der Reaktant III weist biospezifische Affinität für den Analyten auf und der Reaktant* hat eine biospezifische Affinität für den Reaktanten III. x = Molanzahl von Reaktant I auf der Matrix. y = Molanzahl von Reaktant III (= Molanzahl von Reaktant*), gebunden an die Matrix über Reaktant I. Die Bedingungen sind so gewählt, dass y ein Maß für die Menge an Analyt in der Probe ist.
Komplex in der Nachweiszone:

Matrix (-Reaktant I)_x-y (-Reaktant I --- Reaktant III --- Reaktant*)_y

Gleichzeitige Varianten:

m = 2: LZ₂R*/RIII/S LZ₁B DZ.

Aufeinanderfolgende Varianten:

m = 2: LZ₂R* LZ₁/RIIVS DZ.
m = 3, 4 oder 5: Können analog zu Protokoll A aufgebaut werden.

D. Inhibierungsprotokoll
Der Reaktant I weist biospezifische Affinität sowohl für den Analyten als auch den Reaktanten* auf. Der Reaktant* ist ein lösliches Analytanalog. x + y sind die Molanzahl von Reaktant I auf der Matrix, x und y sind die Anzahl von Molen von Reaktant* bzw. Analyt, die an die Matrix gebunden sind.
Komplex in der Nachweiszone:

Matrix (-Reaktant I --- Reaktant*)_x (-Reaktant I --- Analyt)_y:

Gleichzeitige Variante:

m = 2: LZ₂R*/S LZ₁B DZ

Aufeinanderfolgende Variante:

m = 2: LZ₂R* LZ, S DZ
m = 3, 4 und 5: Können analog zu Protokoll A aufgebaut werden.

Matrices
Die Matrix definiert den Raum, in welchem die Strömung transportiert wird. Die Matrix kann die innere Oberfläche eines einfachen Strömungskanals sein (z. B. eine Kapillare), die innere Oberfläche einer porösen Matrix, welche ein System von Strömungskanälen (poröse Matrix) besitzt, die sich durch sie hindurch erstrecken. Der Einfachheit halber werden Matrices, die in dieser Variante der Erfindung brauchbar sind, Strömungsmatrices genannt. Poröse Matrices können vorkommen in der Form von Monolithen, Blättern, Säulen, Membranen, Einzelströmungskanälen, die Kapillarabmessungen oder Aggregatsysteme dieser Strömungskanäle etc besitzen. Sie können auch in der Form von Teilchen vorkommen, die in Säulengehäusen, gepressten Fasern etc. gepackt sind. Die innere Oberfläche der Matrices, d. h. die Oberfläche der Strömungskanäle, sollte hydrophil sein, so dass wässrige Medien (gewöhnlich Wasser) absorbiert und durch die Matrices transportiert werden können. Die kleinste innere Abmessung der Strömungskanäle sollte ausreichend groß sein, um den Transport durch die Matrix der verwendeten Reak tanten zu erlauben. Die Faustregel ist, dass geeignete Matrices unter denen ausgewählt werden, die Strömungskanäle mit der kleinsten inneren Abmessung (oft als Durchmesser für runde Kanäle) im Intervall 0,4–1.000 μm, bevorzugt 0,4–100 μm haben, wenn die Matrix ein System von gegenseitig kommunizierenden Strömungskanälen aufweist. Strömungskanäle, die die kleinste innere Abmessung im oberen Teil des Intervalls 0,4–1000 μm haben, sind primär für einfache unverzweigte Kanäle von Interesse, durch welche die Strömung durch einen von außen aufgebrachten Druck oder Sog getrieben wird.
Relevante Matrices werden häufig aus einem Polymer gebildet, z. B. Nitrocellulose, Nylon etc. Das Material in der Matrix wie auch das physikalische und geometrische Design der Strömungskanäle können entlang der Strömung variieren, abhängig davon, wofür ein bestimmter Teil der Matrix zu verwenden ist (Pharmacia AB WO 96/22532; Medix WO 94/15215).
Nachweiszone
In der Nachweiszone wird der Reaktant I mit Bindungen fest mit der Matrix verankert, die einen unbeabsichtigten Transport von Reaktant I unter den Testbedingungen nicht zulassen. Die Befestigung von Reaktant I an der Matrix kann kovalent sein, über physikalische Adsorption, über biospezifische Affinität etc. Wie der Stand der Technik auf diesem Gebiet kann die Erfindung Kombinationen von Bindungstypen verwenden, z. B. kovalente Bindung an die Matrix eines biospezifischen Affinitätsreaktanten, der auf den Reaktanten I gerichtet ist. Insbesondere kann eine Matrix erwähnt werden, die ein physikalisch adsorptiv oder kovalent gebundenes Glied eines spezifischen Bindungspaares (Reaktantenpaares) in Kombination mit dem Reaktanten I aufweist, der mit dem anderen Glied des spezifischen Bindungspaares gekoppelt oder konjugiert ist, oder eine Matrix, die einen ähnlich gebundenen Antikörper aufweist, welcher auf den Reaktanten I gerichtet ist. Als Beispiele für spezifische Bindungspaare können immunologische Bindungspaare erwähnt werden, wie Antigen-Antikörper und Hapten-Antikörper, Biotin-Avidin oder -Streptavidin, Lectin-Zucker, Hormon-Hormon-Rezeptor, Nucleinsäureduplex. Wenn der Reaktant I sich über einen anderen Reaktanten gemäß der obigen Ausführung an die Matrix bindet, braucht der Reaktant I nicht in der Matrix immobilisiert zu werden, sondern er kann entweder beweglich (diffusionsfähig) vorab in einen Bereich oder eine Zone in die Matrix deponiert werden, die von der Nachweiszone abgetrennt ist, oder er kann zusammen mit oder getrennt von der Probe zugesetzt werden. Das Verankern von Reaktant I mit der Matrix kann mittels Teilchen erreicht werden, die in/auf der Matrix abgelagert worden sind und zu denen der Reaktant I kova lent, physikalisch adsorptiv oder biospezifisch etc. gebunden ist. Die Teilchen verbinden sich entweder mit der Matrix, weil ihre Größe so gewählt wurde, dass sie nicht durch die Matrix transportiert werden können, oder mittels physikalischer Adsorption. Siehe unter anderem Abbott/Syntex US-Patent Nr. 4 740 468; Abbott EP-Nr. 472 376; Hybritech EP-Nr. 437 287 und EP-Nr. 200 381; Grace & Co. EP-Nr. 420 053; Fuji Photo Film US-Nr. 4 657 739; Boehringer Mannheim WO 94/06012. Für die Erfindung hat sich die letztere Variante mit kleineren Teilchen, die sich physikalisch an die Matrix adsorbieren, als gut erwiesen.
In ein und derselben Transportströmung können mehrere Nachweiszonen (DZ1, DZ2 etc.) sein. Eine oder mehrere Nachweiszonen können mit dem gleichen oder unterschiedlichen Analyten in Zusammenhang stehen. Wenn die Analyten unterschiedlich sind, ist der Reaktant I gewöhnlich für jede DZ unterschiedlich.
Analytisch nachweisbarer Reaktant (Reaktant*)
In der Endung kann der Reaktant* kein Analyt sein. Gewöhnlich wird analytische Nachweisbarkeit erreicht, weil ein natürlicher Reaktant, z. B. ein Antikörper oder ein Antigen oder ein Hapten, mit einer analytisch nachweisbaren Gruppe versehen wird. Bestens bekannte Beispiele häufig verwendeter Gruppen sind enzymatisch aktive Gruppen (Enzym, Co-Faktor, Co-Enzym, Enzymsubstrat etc.), fluorogene, chromophore, chemilumineszierende, radioaktive Gruppen etc. Gruppen, die durch einen biospezifischen Affinitätsreaktanten nachgewiesen werden, werden gewöhnlich ebenfalls dieser Kategorie zugewiesen, z. B. Biotin, Hapten, Klassen-, Subklassen- und speziesspezifische Determinanten in Immunoglobulinen etc.
Eine bevorzugte Markierungsgruppe sind Teilchen, die wahlfrei irgendeine der obigen Nachweisgruppen enthalten, wie fluorophore Gruppen oder chromogene Gruppen (farbige Teilchen). Brauchbare Teilchen haben oft eine Größe im Intervall von 0,001–5 μm. Die Teilchen können colloidale Abmessungen haben, so genanntes Sol (d. h. gewöhnlich kugelförmig und monodispers mit einer Größe im Intervall von 0,001–1 μm). Besonders Metallteilchen (z. B. Gold-Sol), Nicht-Metall-Teilchen (z. B. SiO₂, Kohlenstoff, Latex und abgetötete Erythrozyten und Bakterien) können erwähnt werden. Auch Teilchen mit nicht-kolloidalen Abmessungen, sondern mit Fokus auf nicht-sedimentierender Fähigkeit werden verwendet. Diese sind mehr oder weniger ungleichmäßig und mehr oder weniger polydispers (Kohlenstoffteilchen < 1 μm; Pharmacia AB, WO 96/22532).
Für Teilchen als Markierungssgruppe wird Bezug genommen auf Unilever WO 88/08534; Abbott US-Patent Nr. 5 120 643; Becton Dickinson EP-Nr. 284 232 unter anderen.
In Zusammenhang mit der Entwicklung, die zu der vorliegenden Erfindung geführt hat, wurde überraschenderweise festgestellt, dass gute Ergebnisse erzielt werden können, wenn man gleichzeitig folgendes verwendet:

(a) Reaktant* mit Markierungsteilchen gemäß der obigen Ausführung als eine Nachweisgruppe, und
(b) eine Nachweiszone, in welcher der Reaktant I mittels Teilchen mit der Matrix verankert wurde, die im Wesentlichen Abmessungen haben, welche den Transport der Teilchen als solche durch die Matrix zulassen würden.

Wir haben funktionierende Systeme erreicht, in denen markierte Teilchen und Verankerungsteilchen im Wesentlichen die gleichen Abmessungen haben. Dies bedeutet mit großer Wahrscheinlichkeit, dass die markierten Teilchen größer sein können als die Verankerungsteilchen und umgekehrt, so lange sie kleiner bleiben als die durch die Matrix festgelegten Strömungskanäle. Das System kann mit oder ohne vorherige Deponierung des Reaktanten* in der beabsichtigten Anwendungszone funktionieren. Diese Ausführungsform ist Teil einer Erfindung, beschrieben in Pharmacia Diagnostics AB, WO 99/36780.
Analyte
Die Erfindung ist primär angepasst für die Bestimmung von biospezifischen Affinitätsreaktanten der eingangs erwähnten Typen. Die Reaktanten können eine Zelle oder ein Virus oder ein Teil davon sein. Insbesondere kann Antigen, wie ein Immunglobulin oder ein Antikörper, erwähnt werden. Für Immunglobuline kann die Bestimmung mit einem bestimmten Ig und/oder einer bestimmten Ig-Unterklasse in Zusammenhang stehen. Für Antikörper kann die Bestimmung mit einer bestimmten Spezifizität in Verbindung stehen, wahlfrei auch die Ig-Klasse oder die Ig-Unterklasse des Antikörpers. Relevante Ig-Klassen sind IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Relevante Ig-Subklassen sind IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4.
In Sandwich-Varianten (gemäß der Protokolle A und B oben) kann der Analyt ein Antikörper sein, der auf ein Allergen/Antigen/Hapten gerichtet ist und von einer bestimmten Spezies, einer bestimmten Ig-Klasse oder einer bestimmten Ig-Subklasse hergeleitet ist. In diesem Fall kann der Reaktant* ein analytisch nachweisbarer Antikörper sein, der auf ein Epitop, spezifisch für diese Spezies, Ig-Klasse oder Ig-Subklasse, gerichtet ist, und mit dem Reaktanten I (Protokoll A) oder Reaktanten II (Protokoll B) als das Allergen/Antigen/Hapten. Alternativ kann das Umgekehrte gewählt sein, d. h. der Reaktant* ist das Allergen/Antigen/Hapten, und der Reaktant I bzw. Reaktant II ist der Antikörper, gerichtet auf den Analyten. Wenn der Analyt ein Antigen im allgemeinen ist, können sowohl der Reaktant I als auch der Reaktant* in Protokoll A Antikörper sein, die auf das Antigen gerichtet sind. Für Protokoll B ist es der Reaktant Π und der Reaktant*, die auf das Antigen gerichtete Antikörper sind.
Kompetitive Varianten sind für Niedrigmolekular-Analyten höchst interessant. Veranschaulichende Beispiele sind Antigen und Hapten. Für Protokoll C kann der Reaktant I das Antigen oder das Hapten sein, fest verankert in der Matrix, Reaktant III kann ein Antikörper sein, gerichtet auf das Antigen, und der Reaktant* kann ein Antikörper sein, gerichtet auf den Reaktanten III. Für Protokoll D kann der Reaktant I ein Antikörper sein, der auf den Analyten gerichtet ist, und Reaktant* kann der Analyt sein, der mit einer analytisch nachweisbaren Gruppe gekennzeichnet ist.
Das Verfahren der Erfindung kann als Teil der Diagnose einer Allergie oder Autoimmunerkrankung durchgeführt werden.
Für die Erfinder war es von speziellem Interesse, Antigen-Allergen-Antikörper der IgE- oder IgG-Klasse zu messen, bei der letzteren vorzugsweise mit Fokus auf eine der erwähnten Subklassen. Das Messen von Allergen-spezifischen Antikörpern kann bei der Diagnose einer durch IgE übertragenen Allergie verwendet werden.
Proben
Relevante Proben können biologischen Ursprungs sein, z. B. aus verschiedenen Körperflüssigkeiten (Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Tränenflüssigkeit, Cerebrospinal-Flüssigkeit etc.), aus Zellkulturmedien, Verarbeitungsverfahren in der Biotechnologie, aus Gewebeextrakten, aus Nahrungsmitteln, aus der Umwelt (Umweltanalyse-Proben) etc. stammen. Die Proben können vorbehandelt sein, um z. B. zu der Matrix, dem dazugehörigen Testprotokoll etc. zu passen.
Kalibratoren
Bestimmungsverfahren des Typs, mit dem die Erfindung in Zusammenhang steht, schließen ein, dass das nachweisbare Signal des analytisch nachweisbaren Reaktanten (Reaktant*) gemessen wird, und das gemessene Signal (Probenwert) wird als eine Messung der Menge an Analyt genommen, die in der Probe vorhanden ist. Um das Messsignal auf die tatsächlichen Mengen an Analyt zu übertragen, wird das Signal gewöhnlich mit dem entsprechenden Signal (Kalibratorwert) bekannter Standardmengen von Analyt (Kalibratoren) verglichen. In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist ein neues Kalibratorsystem entwickelt worden, das bei Anwendung auf die vorliegende Erfindung die beste Ausführungsform darstellt.
Diese separate Erfindung bedeutet, dass der verwendete Kalibrator im voraus mit einer Matrix verankert wurde (Matrixkalibrator), vorzugsweise des gleichen Typs wie der für den Probedurchlauf verwendete. Bei der Messung von Kalibratorwerten darf der Matrixkalibrator sich an den Reaktanten* binden, und dann wird das Messsignal von Reaktant* auf eine Weise gemessen, die an sich bekannt ist. Durch Verwenden unterschiedlicher Mengen an Matrixkalibrator kann eine Reihe von Kalibratorwerten erhalten werden, die verschiedenen vorbestimmten Mengen an Analyt in der Probe entsprechen (Standardmengen, Dosis-Wirkungs-Kurve, Kalibrationskurve).
Alternativ wird stattdessen ein Binder für den Kalibrator mit der Matrix verankert, und es wird Kalibrator bei der Bestimmung des Kalibratorwertes zugesetzt, der wahlfrei vorher in der Matrix stromaufwärts der Kalibratorzone(n) deponiert wurde, um bei der Bestimmung durch Auflösen der Probe oder Puffer aufgelöst zu werden. Wenn ein Kalibrator-Binder an die Matrix gebunden ist, kann der Kalibrator entweder beweglich (diffusionsfähig) vorab in der Matrix in einer Zone deponiert sein, die von der Nachweiszone abgetrennt ist, oder er kann zusammen mit oder getrennt von der Probe zugesetzt werden. Der Kalibrator-Binder ist gewöhnlich ein Glied eines spezifischen Bindungspaares (Reaktantenpaares), wobei das andere Glied des Bindungspaares mit der Kalibratorsubstanz gekoppelt oder konjugiert ist. Als Beispiele dieser spezifischen Bindungspaare können immunologische Bindungspaare, wie Antigen-Antikörper und Hapten-Antikörper, Biotin-Avidin oder -Streptavidin, Lectin-Zucker, Hormon-Hormon-Rezeptor und Nukleinsäureduplex angeführt werden.
Angewandt auf die vorliegende Erfindung schließt unser neues Kalibratorsystem primär ein, dass die Transportströmung eine oder mehrere Zonen mit einem Kalibrator passiert, der fest in der entsprechenden Kalibratorzone (CZ) mit der Matrix verankert ist.
Verankern eines Kalibrators mit der Matrix in einer Kalibratorzone kann gemäß der gleichen Prinzipien wie bei der Verankerung von Reaktant I mit einer Nachweiszone durchgeführt werden.
Kalibratorzonen sollten sich stromabwärts einer Anwendungszone für Flüssigkeit befinden, mit dem Zweck des Transports von Reaktant*. Im Verhältnis zu der Nachweiszone (DZ) befindet sich die Kalibratorzone vorzugsweise stromaufwärts.
Unsere Erfindung, die sich auf Kalibratoren bezieht, wird ausführlich in Pharmacia Diagnostics AB, WO 99/36777 beschrieben.
Ein zweiter Hauptaspekt der Erfindung
Die Durchflussmatrix gemäß der obigen Ausführungen, die zwei oder mehr Anwendungszonen für Flüssigkeit enthält, wahlfrei in der Form eines Kits, in dem die Durchflussmatrix zusammen mit dem analytisch indizierbaren Reaktanten eingeschlossen ist, stellt einen zweiten Hauptaspekt der Erfindung dar.
Die Erfindung wird veranschaulicht in dem anschließenden nicht-limitierenden experimentellen Teil.
BEISPIEL 1: SEQUENTIELLES VERFAHREN MIT DER ZONENABFOLGE: LZ₄B, LZ₃R*, LZ₂B, LZ₁S, DZ. NACHWEIS VON hIgE IN EINER TESTVARIANTE MIT KOHLENSTOFFTEILCHENKONJUGAT
Verfahren und Materialien
Phenyldextran (Substitutionsgrad: 1 Phenylgruppe auf jede fünfte Monosaccharid-Einheit = 20%, Mw Dextran 40.000, Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) wurde auf Polystyrol-Teilchen adsorbiert (0,49 um Bangs Laboratorien, USA) durch Inkubationen unter Rühren mit Phenyldextran, gelöst in entionisiertem Wasser auf 1) 5 mg/ml, 10% Teilchensuspension, RT 30– 60 Minuten; 2) 5 mg/ml, 5% Teilchensuspension, RT 1 Std.; 3) 20 mg/ml, 1–2% Teilchensuspension, RT 3 Std. oder über Nacht. Die Teilchen wurden anschließend zweimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die Teilchensuspensionen wurden zwischen jeder Inkubation und Wäsche zentrifugiert (12.100 × g, 25 min, Beckman, J-21, JA-20, 10.000 U/min). Die Teilchensuspension wurde schließlich beschallt (Ultrasonic-Bad, Branson 5210, 5 min).
Koppeln von anti-human-IgE-Antikörper (anti-hIgE) an Polystyrolteilchen:anti-hIgE wurde mit CDAP (1-Cyano-4-dimethylamino-pyridiumbromid (J. Kohn und M. Wilchek, FEBS-Letters 154(1) (1983) 209–210) an mit Phenyldextran beschichtete Polystyrolteilchen gekoppelt.
Das Entsalzen und der Wechsel des anti-hIgE-Puffers wurden durch Gelfiltration (PD-10, Pharmacia Biotech AB) in 0,1 M NaHCO₃, pH 8,5, durchgeführt. 2,3 g Polystyrolteilchen (beschichtet mit Phenyldextran gemäß obiger Ausführung) in 2%iger Lösung in 30% (bezogen auf Volumen) Aceton wurden mit 17 ml CDAP (0,44 M) und 14 ml TEA (0,2 M Triethylamin, Riedel-de Haën Deutschland) aktiviert. CDAP wurde 150 Sekunden unter Rühren und TEA 150 Sekunden lang zugesetzt. Die Teilchen wurden mit 30% (bezogen auf Volumen) Aceton gewaschen und bei 12.100 xg zentrifugiert (25 min, Beckman, J-21, JA-20, 10.000 U/min). 17 der hIgE wurden durch Inkubation unter Rühren über Nacht bei +4°C an die aktivierten Teilchen (2%, 0,15 g in 0,1 M NaHCO₃, pH 8,5) gekoppelt. Die Teilchen wurden zentrifugiert und abgegossen, bevor sie mit 0,05 M Glutaminsäure und 0,05 M Asparaginsäure in 0,1 M NaCHO₃, pH 8,5 durch Inkubation unter Rühren über Nacht bei +4°C deaktiviert wurden. Gekoppelte Teilchen wurden einmal mit 0,1 M NaHCO₃, 0,3 M NaCl, pH 8,5 gewaschen, einmal mit 0,1 M HAc, 0,3 M NaCl, pH 5, einmal mit 0,1 M NaHCO₃, pH 8,5 und einmal mit 20 mM Boratpuffer, pH 8,5.
Die Konzentration von Teilchen wurde spektrophotometrisch bei A₆₀₀ nm mit unbehandelten Teilchen als Vergleichsprobe bestimmt. Die Konzentration von gekoppeltem Protein wurde bestimmt, indem anti-hIgE während des Koppelns und der cpm-Messung vorhanden war.
Kohlenstoffteilchenkonjugat (Reaktant*): Dies wurde durch anti-hIgE, welches an Kohlenstoffteilchen (sp 100, < 1 μm, Degussa, Deutschland) gemäß WO96/22532 (Pharmacia AB) adsorbiert wurde, hergestellt. Die in der Durchflussmatrix verwendete endgültige Lösung enthielt 400 μg Kohlenstoffteilchen pro ml.
Deponieren von anti-hIgE-gekoppelten Teilchen auf Membran: Auf Nitrocellulosebögen (Whatman, 8 um, Länge 5 cm und Breite 25 cm mit Polyesterrückseite) wurden anti-hIgE-Teilchen (hergestellt gemäß obiger Ausführung) in einer Zone über die Breite des Bogens (zukünftige Nachweiszone) mit Linearem Abstreifer (IVEK Corporation) deponiert. Der Durchfluss betrug 1 μl/sec und 1 μl/cm. Die Teilchen wurden in Boratpuffer (20 mM, pH 8,5, Dextran T5000 4,2% w/w, Sorbitol 5,8% w/w) verdünnt. Die Menge an deponiertem anti-hIgE-Antikörper betrug etwa 1000 ng/cm. Die Bögen wurden 1 Stunde bei 30°C getrocknet.
Zonen für die Anwendung von Puffer Probe und Kohlenstoffteilchenkonjugat: 4 Inplastor-Streifen (Mylar mit Klebstoff auf einer Seite, Gelman) mit einer Breite von 1 mm, wurden, gut abgetrennt von der Zone, die deponiertes Material enthielt, parallel zu der Zone und parallel zueinander mit einem Abstand von 5 mm voneinander (Zonen-Spacer) gelegt. Die Inplastor-Streifen legten auf diese Weise vier Zonen mit einer Breite von 5 mm fest. Die Bögen wurden senkrecht im Verhältnis zu der Zone, die deponiertes Material enthielt, in Streifen mit einer Breite von 0,5 cm geschnitten (die Länge des Streifens betrug dann 5 cm) (Singulator: Matrix 1201 Membranschneider, Kinematic-Automation). Die endgültigen Streifen wiesen vier parallele Zonen (Anwendungszonen), die getrennt waren durch Inplastor-Streifen als Zonen-Spacer und eine separate Zone mit deponiertem anti-hIgE-Antikörper (Nachweiszone) auf. Zum Vergleich wurden Streifen ohne Zonen-Spacer, d. h. ohne abgetrennte Anwendungszonen, hergestellt.
Testmethodik: Es wurden Streifen mit abgetrennten Anwendungszonen auf einem Flächenhalter befestigt. An der Spitze (0,5 cm) des Streifens (und mit der Nachweiszone als der nächstgelegenen Zone) wurde eine Saugmembran (Whatman, 17 Chr, Breite 3 cm) plaziert. Der Halter übte auch einen konstanten Druck auf die Saugmembranen aus. Für die gleichzeitige Anwendung von Reagenzien auf die vier Unterzonen wurde eine 4-Kanal-Multipipette (Labsystems) verwendet. Die Multipipette wurde so befüllt, dass eine Serumprobe (30 μl) in der Anwendungszone, die der Nachweiszone am nächsten gelegen war, in der Reihenfolge Puffer (30 μl), Kohlenstoffteilchenkonjugat (30 μl) und Puffer (30 + 30 μl) in der entsprechenden stromaufwärts gelegenen Anwendungszone angewendet wurde. Für sequentielle Anwendung auf die Streifen ohne Zonen-Spacer wurden 30 μl Probe zuerst auf das untere Ende des Streifens aufgebracht. Nach Aufsaugen des Probenvolumens wurden Puffer (30 μl), Kohlenstoffteilchenkonjugat (30 μl) und Puffer (30 + 30 μl) nacheinander nach dem Aufsaugen zugesetzt. Das Kohlenstoffteilchenkonjugat wurde gemäß obiger Ausführung hergestellt und in Puffer suspendiert. Der Puffer war 0,1 M NaPO₄, 3% BSA, 0,05% NaN₃, 3% Sucrose, 0,2% Natriumchlorid, 0,05% Phenyldextran, 0,05% Rinder-Gammaglobulin, pH 7,5. Das Binden des Kohlenstoffteilchenkonjugats an die Nachweiszone wurde quantifiziert durch Messung von Absorption (Ultroscan XL, Enhanced Laser Densitometer, LKB). IgE-Standardkonzentrationen in Plasmaumgebung (0; 0,5; 2; 10; 50 und 200 KU/L) wurden als Proben verwendet.
Ergebnisse
Mit vier Anwendungszonen für Flüssigkeit und gleichzeitige Zugabe wanderten die Flüssigkeiten im Bereich der Anwendungszonen, d. h. die Probe in der Zone, die der Nachweiszone am nächsten gelegen war, wanderte zuerst, ohne mit der Waschlösung der folgenden Anwendungszone vermischt zu werden, deren Lösung wiederum die Migration auslöste, wenn die Probe aus der Anwendungszone für Proben heraus transportiert wurde. Entsprechend wanderten die Flüssigkeiten der übrigen Zonen nacheinander, ohne vermischt zu werden.
Tabelle 1: Analysenergebnisse aus Ansätzen mit sequentieller Zugabe in einer Zone und aus gleichzeitiger Zugabe in vier Unterzonen (Puffer, analytisch nachweisbarer Reaktant, Puffer, Probe).
In Tabelle 1 wird gezeigt, dass die Aufnahme leicht bei Streifen mit getrennten Anwendungszonen abnimmt, verglichen mit der Zugabe in ein und derselben Zone. Die Abnahme ist allerdings geringfügig. Deshalb zeigt der Versuch, dass im Allgemeinen das gleiche Ergebnis erzielt werden kann, wenn eine gleichzeitige Zugabe an die Zonenabfolge LZ₄B, LZ₃R*, LZ₂B, LZ₁S erfolgt, als wenn Probe, Reaktant* und Puffer nacheinander einer gemeinsamen Anwendungszone zugesetzt werden.
Wenn ein fest verankerter aanti-IgE-Antikörper (Reaktant I) durch ein Allergen ersetzt wird, erhält man eine Bestimmungsmethode für IgE-Antikörper, die auf das Allergen gerichtet sind. Analog können Testsysteme bestimmt werden, die sich auf Antikörper einer anderen Klasse/Subklasse beziehen und die eine andere Spezifität haben. Anwendungszonen nur für Puffer können ausgelassen werden. Für zusätzliche alternative Testprotokolle und Analyten siehe oben unter den Überschriften „Testprotokolle" und „Analyten".
BEISPIEL 2: SEQUENTIELLES VERFAHREN MIT DER ZONENABFOLGE: LZ₄B, LZ₃R*, LZ₂B, LZ₁S, DZ. NACHWEIS VON hIgE IN DER TESTVARIANTE MIT FLUORESZIERENDEM NACHWEISKONJUGAT
Verfahren und Materialien
Koppeln von anti-human-IgE-Antikörper (anti-hIgE) an ein Polystyrolteilchen: anti-hIgE wurde an Polystyrolteilchen gekoppelt, die mit Phenyldextran (hergestellt gemäß Beispiel 1), mit CDAP (1-Cyano-4-dimetylaminopyridiniumbromid) (J. Kohn und M. Wilchek, FEBS-Briefe 154(1) (1983) 209–210) beschichtet waren. Ein Entsalzen und Pufferwechsel von anti-hIgE wurde durch Gelfiltration (PD-10, Amersham Pharmacia Biotech AB) in 0,1 M NaCO₃, pH 8,5 durchgeführt.
0,35 g Polystyrolteilchen (2%ige Lösung) wurden mit 5,2 ml CDAP (0,44 M) und 4,2 ml TEA (0,2 M Triethylamin, Riedel-deHaën, Deutschland) aktiviert. CDAP wurde unter Rühren für 60 Sekunden und TEA für 120 Sekunden zugesetzt. Ein fünffacher Überschuss von eisgekühltem entionisiertem Wasser wurde zugesetzt. Die Teilchen wurden bei 12.100xg (25 min, Beckman, J-21, JA-20, 10.100 U/min) zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in eisgekühltem entionisierten Wasser gelöst und einmal mit eisgekühltem entionisierten Wasser gewaschen und dann bei 12.000 × g zentrifugiert. 50 mg anti-hIgE wurden an die aktivierten Teilchen gekoppelt (2%, 0,35 g in 0,1 M NaHCO₃, pH 8,5). Eine Inkubation unter Rühren wurde dann 1 Stunde lang bei +4°C durchgeführt. Nach dem Zentrifugieren wurden die Teilchen mit 0,05 M Glutaminsäure und 0,05 M Asparaginsäure in 0,1 M NaHCO₃, pH 8,5 deaktiviert. Dann wurden über Nacht bei +4°C Inkubation und Rühren durchgeführt. Gekoppelte Teilchen wurden zweimal mit 20 mM Boratpuffer gewaschen, woraufhin die Teilchenkonzentration spektrophotometrisch bei A_600nm mit unbehandelten Teilchen als Vergleichsprobe bestimmt wurde. Die Konzentration von gekop peltem Protein wurde bestimmt, indem radioaktives anti-hIgE während des Koppelns vorhanden war.
Koppeln von anti-hIgE-Antikörpern an Nachweispartikel: Mit Pepsin zu Fab'2-Fragmenten gespaltene Antikörper gegen hIgE wurden an fluoreszierende Polystyrolteilchen gekoppelt, welche Aldehydgruppen auf ihrer Oberfläche hatten (Molecular Probes C-17177 TransFluoSphere, Aldehyd-Sulfat-Mikrosphären, 0,1 um, 633/720, 2% Feststoffe). 23 mg Antikörper wurden dann an 66 mg Teilchen in 50 mM NaPO₄, pH 6,5 über Nacht bei Raumtemperatur gekoppelt, woraufhin 205 μL NaCNBH₄ (5 M) zugesetzt wurden, um das Koppeln für 3 Stunden bei Raumtemperatur zu verringern. Ein Zentrifugieren wurde bei 20.800 × g 50 Minuten lang (50 Minuten in einer Eppendorf 5417R, 14.000 U/min) durchgeführt, und dann wurde eine Deaktivierung in 0,05 M Glutaminsäure und 0,05 M Asparaginsäure über Nacht unter Rühren bei Raumtemperatur in entionisiertem Wasser durchgeführt. Nach Zentrifugieren bei wiederum 20.800 × g wurde ein Blockieren mit 0,2% BSA in 50 mM NaPO₄, pH 7,4 mit 0,05% NaN₃ durchgeführt, und es wurde über Nacht bei +4°C eine Inkubation durchgeführt.
Dann wurde wiederum bei 20.800 × g ein Zentrifugieren durchgeführt, und es wurde zweimal mit Blockierpuffer gewaschen, der dann auch für die Lagerung verwendet wurde. Die Teilchenkonzentration wurde in einem Fluorimeter (Perkin-Elmer LS50B) mit einer Standardkurve bestimmt, die mit dem Originalteilchen hergestellt wurde. Die Konzentration von gekoppeltem Protein wurde bestimmt, indem radioaktives hIgE während des Koppelns vorhanden war.
Deponieren von anti-hIgE-gekoppelten Teilchen auf Membran und Anwendungszonen: Wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Inplastor-Streifen durch Streifen aus Klebeband (2 Mil starkes durchsichtiges Polyester-Arcar mit Klebstoff auf einer Seite) ersetzt wurden.
Testmethodik: Streifen mit Anwendungszonen in Abständen wurden auf eine geneigte Ebene, etwa 16°, in einem Halter befestigt. An der Spitze (0,5 cm) des Streifens (und mit der Nachweiszone als der am nächsten gelegenen Zone) wurden zwei Saugmembranen (Whatman, 17 Chr, Breite 3,4 cm) übereinander angebracht. Der Halter übte auch einen konstanten Druck auf die Saugmembranen aus. Für die gleichzeitige Anwendung von Reagenzien auf die vier Unterzonen wurde eine Finn-Multikanal-Pipette (Labsystems) verwendet. Die Multipipette wurde so befällt, dass eine Serumprobe (30 μl) in der Reihenfolge Puffer (15 μl), Fluoreszenzteilchenkonjugat (30 μl) und Puffer (30 + 30 μl) auf die der Nachweiszone nächstgelegene Anwendungszone in der entsprechenden stromaufwärts gelegenen Anwendungszone angewendet wurde. Für eine sequentielle Anwendung auf die Streifen ohne Zonen-Spacer wurden 30 μl Probe zuerst auf das untere Ende des Streifens aufgebracht. Nach dem Aufsaugen des Probevolumens wurden Puffer (15 μl), Nachweisteilchenkonjugat (30 μl) und Puffer (30 + 30 μl) nacheinander nach dem Aufsaugen zugesetzt. Das Teilchenkonjugat wurde in Probepuffer suspendiert, der aus 0,1 M NaPO₄, 3% BSA, 0,05% NaN₃, 10% Sucrose, 0,15 M NaCl und 0,05% Rinder-Gammaglobulin, pH 7,5 bestand. Die Zeitmessung begann mit der Anwendung der Probe, und es wurde die Zeit notiert, bis der letzte Puffer von der Membran aufgesogen worden war. Das Binden des fluoreszierenden Teilchenkonjugats an die Nachweiszone wurde mengenmäßig durch Scannen mit einem roten Diodenlaser (635 ± nm) bestimmt. Als Probe wurden IgE-Standardkonzentrationen in Plasmaumgebung (0; 0,5; 2; 10; 50 und 200 KU/L) verwendet.
Ergebnisse:
Genau wie in Beispiel 1 wanderten die Flüssigkeiten in der bestehenden Reihenfolge aus der Anwendungszone. Die Zeit für einen ganzen Test mit gleichzeitiger Anwendung betrug etwa 20 Minuten, und die Zeit für einen Test mit sequentieller Anwendung betrug etwa 25 Minuten.
Tabelle 2: Analyseergebnisse aus Ansätzen mit sequentieller Anwendung in einer Zone und aus gleichzeitiger Anwendung in vier Unterzonen (Puffer, analytisch nachweisbarer Reaktant, Puffer, Probe).
Tabelle 2 zeigt, dass die Aufnahme vergleichbar ist mit Streifen mit abgetrennten Anwendungszonen, im Vergleich zur Zugabe zu einer einzelnen Zone. Der Versuch zeigt deshalb, dass das gleiche Ergebnis erzielt werden kann, wenn die Zugabe gleichzeitig an die Zonenabfolge LZ₄B, LZ₃R*, LZ₂B, LZ₁S erfolgt, wie wenn Probe, Reaktant* und Puffer nacheinander einer gemeinsamen Anwendungszone zugefügt werden.
BEISPIEL 3: SEQUENTIELLES VERFAHREN MIT DER ZONENABFOLGE: LZ₅B, LZ₄R*, LZ₃B, LZ₂S, LZ₁B, DZ. NACHWEIS VON BIRKEN-SPEZIFISCHEM hIgE IN TESTVARIANTE MIT FLUORESZIERENDEM NACHWEISKONJUGAT
Verfahren und Materialien
Extraktion von Birkenpollenallergen t3, Betula verucosa: 1 Teil (bezogen auf Gewicht) Birkenpollen (Allergon, Schweden) wurde mit 10 Teilen (bezogen auf Volumen) von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4 extrahiert. Das Extrahieren wurde 2 Stunden auf einem Schütteltisch bei +4°C fortgesetzt. Der Extrakt wurde bei 4000 U/min für 1,75 Std. zentrifugiert. Nach dem Filtrieren wurde die Lösung auf eine PD-10-Säule (Pharmacia Biotech AB) aufgetragen und in 0,1 M NaHCO₃, pH 8,5 eluiert. Das t3-Eluat (bezeichnet: t3-Extrakt 1/14) wurde einer Aminosäureanalyse zugeführt, um den gesamten Proteingehalt zu bestimmen.
Koppeln von Birkenpollenallergen an Polystyrolteilchen: t3-Extrakt wurde mit CDAP an mit Phenyldextran beschichtete Polystyrolteilchen (hergestellt gemäß Beispiel 1) gekoppelt. Das Koppeln wurde analog mit dem Koppeln von hIgE durchgeführt.
Mit Phenyldextran in 30% (bezogen auf Volumen) Aceton und 2% Teilchensuspension beschichtete Polystyrolteilchen (2128 mg) wurden mit 954 mg CDAP (100 mg/ml in 30% Aceton) und 7,63 ml von 0,2 M Triethylamin (TEA, Riedel-de Haen, Deutschland) aktiviert. CDAP wurde unter Rühren zugesetzt und TEA wurde tropfenweise für 90 Sekunden und unter Rühren für insgesamt 120 Sekunden zugesetzt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 30% Aceton (4faches Volumen) und Zentrifugieren bei 12.400 g für 35 Minuten gestoppt. Die Teilchen wurden einmal mit entionisiertem Wasser gewaschen.
640 ml t3-Extrakt 1/14 in 0,1 M NaHCO₃, pH 8,5 wurden den aktivierten Teilchen zugesetzt, und das Koppeln wurde für eine Stunde auf einem Rütteltisch fortgesetzt. Nach dem Zentrifugie ren wurden die Teilchen mit 0,05 M Asparaginsäure und 0,05 M Glutaminsäure in 0,1 M NaH-CO₃, pH 8,5, deaktiviert. Dann fand auf einem Rütteltisch über Nacht bei +4°C eine Inkubation statt. Die Teilchen wurden dann zweimal mit 50 mM NaPO₄, 0,05% NaN₃, pH 7,4 gewaschen. Die Teilchenkonzentration wurde spektrophotometrisch bei 600 nm mit unbeschichteten Polystyrolteilchen als Vergleichsprobe bestimmt. t3-gekoppelte Polystyrolteilchen wurden zu einer Aminosäureanalyse zur Bestimmung des gesamten Proteingehalts herangezogen.
Ablagerung von t3-gekoppelten Polystyrolteilchen auf einer Membran: Auf Nitrocellulosebögen mit Polyesterrückseite (Whatman, 8 um, 5 cm Breite) wurden Zonen von t3-gekoppelten Teilchen aufgetragen, die auf einen 4%igen Teilchengehalt in 50 mM NaPO₄, 10% Sucrose, 0,05 NaN₃, pH 7,4, verdünnt worden waren. Die Deponierungen wurden für 1 Stunde bei 30°C getrocknet.
Zonen für die Anwendung von Puffer, Probe und Nachweisteilchenkonjugat: Fünf 1 mm breite Streifen Klebeband (2 Mil transparenter Polyester, Arcare mit Klebstoff auf einer Seite) wurden in einem Abstand von 5 mm von einander und parallel zu der Zone angebracht, sorgfältig von der Zone getrennt, die das deponierte Material enthielt. Die Klebestreifen legten dadurch fünf verschiedene 5 mm breite Zonen fest. Die Bögen wurden senkrecht zu der Zone, die deponiertes Material enthält, in Streifen mit einer Breite von 0,5 cm geschnitten (die Länge der Streifen betrug dann 5 cm) (Singulator: Matrix 1201 Membranschneider, Kinematic Automation). Die endgültigen Streifen wiesen fünf Zonen auf (Anwendungszonen), getrennt durch Klebestreifen als Zonen-Spacer, und eine separate Zone mit deponierten Birkenpollen (Nachweiszone). Streifen ohne Zonen-Spacer, d. h. ohne getrennte Anwendungszonen, wurden als Vergleich hergestellt.
Testmethodik: Streifen mit getrennten Anwendungszonen wurden befestigt, und Reagenzien wurden wie in Beispiel 2 angewendet. Puffer (20 μl) wurde auf die der Anwendungszone nächstgelegenen Zone aufgebracht, und dann die Serumprobe (30 μl), Puffer (20 μl), Nachweisteilchenkonjugat (20 μl) und Puffer (30 + 30 μl) in der entsprechenden stromaufwärts gelegenen Anwendungszone. Für eine sequentielle Anwendung auf die Streifen ohne Zonen-Spacer wurden erst 20 μl Puffer auf das untere Ende des Streifens aufgebracht, und nachdem diese aufgesogen waren, wurden 30 μl Probe in der gleichen Position aufgebracht und dann Puffer (20 μl), Fluoreszenzteilchenkonjugat (20 μl) und Puffer (30 + 30 μl). Vor sämtlichen Anwendungen wurde die vorhergehende Anwendung von dem Streifen aufgesogen. Das Nachweisteilchenkonjugat und der Puffer waren gemäß Beispiel 2.
Ergebnisse:
Mit der aus fünf Unterzonen bestehenden Anwendungszone und der gleichzeitigen Zugabe dazu stellte sich heraus, dass die Flüssigkeiten, genau wie in den Beispielen oben, in der bestehenden Reihenfolge aus der Anwendungszone wanderten. Die für einen gesamten Test benötigte Zeit mit gleichzeitiger Zugabe betrug etwa 21 Minuten, und die für einen gesamten Test mit sequentieller Zugabe benötigte Zeit betrug etwa 27 Minuten.
Tabelle 3: Analysenergebnisse aus Ansätzen mit sequentieller Zugabe in einer Zone und aus gleichzeitiger Zugabe in 4 Unterzonen (Puffer, analytisch nachweisbarer Reaktant, Puffer, Probe).
Tabelle 3 zeigt, dass die Aufnahme in einem gewissen Maß bei Streifen abnimmt, die abgetrennte Anwendungszonen im Vergleich zur Zugabe zu einer einzigen Zone haben. Die Abnahme ist allerdings geringfügig und ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Durchflussrate bei gleichzeitiger Anwendung irgendwie verzögert war. Der Versuch zeigt deshalb, dass im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse erzielt werden können bei gleichzeitiger Anwendung auf die Zonenabfolge LZ₅B, LZ₄R*, LZ₃B, LZ₂S und LZ₁B, wie wenn Probe, Reaktant* und Puffer sequentiell auf eine gemeinsame Anwendungszone angewendet werden.

Claims

Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe in einer Durchflussmatrix unter Anwendung einer Transportströmung von einem oder mehreren biospezifischen Affinitätsreaktanten, von denen mindestens einer analytisch nachweisbar ist (Reaktant*) und einer fest in der Matrix verankert ist (Reaktant I), und wobei die Durchflussmatrix Folgendes umfasst: A) eine Anwendungszone für Flüssigkeit (LZ), enthaltend Puffer und Probe und wahlweise einen oder mehrere der Reaktanten, aber nicht den Reaktanten I, B) eine Nachweiszone (DZ), angeordnet stromabwärts der LZ mit dem fest verankerten Reaktanten (Reaktant I) und C) wahlweise eine oder mehrere Zonen, in welchen einer der Reaktanten zuvor abgeschieden wurde, wobei (i) die Strömung in Richtung der Nachweiszone durch die Zugabe der Flüssigkeit mit Probe zu der Anwendungszone LZS für den Transport von Analyt und Reaktanten in Richtung der Nachweiszone (DZ) initiiert wird und (ii) die Menge des an die DZ gebundenen Reaktanten* nachgewiesen wird, wobei die nachgewiesene Menge mit der Menge an Analyt in der Probe in Zusammenhang steht, dadurch gekennzeichnet, dass I. die Strömungsmatrix mindestens zwei Anwendungszonen für Flüssigkeit umfasst, die im Wesentlichen benachbart zueinander angeordnet sind:
worin a) LZ eine Anwendungszone für Flüssigkeit ist und n die Position der Anwendungszone LZ_n ist, b) m die Gesamtzahl an Anwendungszonen ist, in welchen die Strömung initiiert wird (m ≥ 2), c) eine LZ_n eine Anwendungszone für die Probe (LZ_n'S) ist und eine LZ_n für den Reaktanten* ist (LZ_n''R*), mit n'' ≥ n'; d) → die Strömungsrichtung ist, und e) DZ die Nachweiszone ist; und II. die Strömung durch Zusetzen von Flüssigkeit zu jeder Zone LZ_m .. LZ_n .. LZ₁ (m ≠ n) initiiert wird, in einer Weise, dass Flüssigkeit_n+1, welche der Anwendungszone LZ_n+1 hinzugefügt wird, mit der Strömungsmatrix praktisch gleichzeitig in Kontakt kommt und durch die Matrix hindurch befördert wird unmittelbar nach der Flüssigkeit_n, welche der nächsten stromabwärts gelegenen Anwendungszone LZ hinzugefügt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass n'' > n' ist (aufeinanderfolgende Varianten bezüglich Analyt und Reaktant*).
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass n" = n' (gleichzeitige Varianten bezüglich Analyt und Reaktant*).
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktant* in seiner Anwendungszone (LZ_n''R*) vorab abgeschieden wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, das LZ_n+1 endet, wo LZ_n beginnt (m ≠ n).
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–5, dadurch gekennzeichnet, dass die Anwendung von Flüssigkeit praktisch gleichzeitig in allen LZ_m .. LZ_n .. LZ₁ erfolgt.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass m ≤ 6 ist; n' 1, 2 oder 3 ist; n'' > n'; LZ_n'+1, LZ_n'+2; LZ_n'+3, LZ_n'-1 und LZ_n'-2 Anwendungszonen für Flüssigkeiten sind, die für den Transport des Reaktanten* oder eines anderen Reaktanten oder Puffers ohne Reaktant bestimmt sind, solange dies m, n'' und n' zulassen.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der Zonen LZ_m .. LZ_n .. LZ₁ ein Kissen oder eine Materialschicht, aufgebracht auf die Strömungsmatrix, umfasst.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zonen LZ_m .. LZ_n .. LZ₁ Zonen-Spacer zwischen diesen aufweisen.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–9, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung von transportierten Komponenten von einer Anwendungszone LZ nicht dieselbe ist wie von der nächstgelegenen Anwendungszone LZ, in welcher die Strömung initiiert wird (LZ_n+1 und LZ_n-1, mit der Ausnahme von n = m und n = 1, wobei den Zonen LZ_n+1 bzw. LZ_n-1 fehlen).
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–10, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein von dem Reaktanten* verschiedener Reaktant in einer Anwendungszone LZ_n'''R für Flüssigkeit, die für den Transport des Reaktanten bestimmt ist, vorab abgeschieden wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–11, dadurch gekennzeichnet, dass m ≤ 6 ist und dass n' für die Anwendungszone für die Probe (LZ_n'S) 1, 2 oder 3 ist.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–12, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktant* eine biospezifische Affinität zu dem Analyt besitzt, so dass der Reaktant* in einen Komplex Reaktant' ---Analyt---Reaktant* in der Nachweiszone in einer Menge in Verbindung mit der Menge an Analyt in der Probe eingebracht wird, in welcher der komplexe Reaktant' eine biospezifische Affinität zu dem Analyt besitzt und (a) der Reaktant I ist, oder (b) ein Reaktant, zu welchem der Reaktant I eine biospezifische Affinität besitzt und welcher von LZS oder von einer Anwendungszone stromabwärts von LZ_n'S transportiert wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–13, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix mindestens eine Kalibratorzone (CZ) umfasst, in welcher Kalibrator an die Matrix gebunden ist oder zuvor an diese gebunden wurde.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Kalibratorzone oder -zonen (CZ) ein Bindemittel für den fest in der Matrix verankerten Kalibrator aufweisen, wobei der Kalibrator wahlweise in der Matrix vorab stromaufwärts der Kalibratorzone oder -zonen abgeschieden wird.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–15, dadurch gekennzeichnet, dass a. der Analyt allgemein unter Antigenen gewählt ist, und b. das Verfahren als Teil der Diagnose einer Allergie oder einer Autoimmunerkrankung durchgeführt wird.