CN111406215B - 侧向流动测定装置 - Google Patents

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Abstract

提供了用于进行侧向流动测定的侧向流动装置、方法和试剂盒。

Description

侧向流动测定装置
本申请要求于2017年11月28日提交的美国临时申请第62/591,284号的权益，其全文以参见的方式纳入本文。
背景技术
在生物科学中通常采用检测固定化分析物的方法。例如，传统印迹法(例如，Southern、northern、western、far western、eastern、真空、middle eastern、eastern-western和far-eastern印迹法等)可以用于检测固定在基材或膜上或基质中(例如琼脂糖或丙烯酰胺中)的分析物。通常，这样的印迹技术涉及固定待检测的(一种或多种)分析物并使(一种或多种)分析物与结合剂(例如抗体)接触。印迹法通常还涉及固定与最终检测之间的多个洗涤步骤和/或封闭步骤。这样的洗涤和封闭步骤消耗了从业人员有限的时间和/或试剂，并且可能导致错误和不可重复性。
发明内容
本文提出了侧向流动测定装置以及使用和制造这种装置的方法。
在一实施例中，侧向流动装置包括由多孔材料组成的芯吸垫，该芯吸垫具有平面区域，该平面区域用于接触包括固定的分析物的基材；并且其中，芯吸垫具有第一端、第二端和两个侧向边缘；基部，该基部包括侧向壁和在空间上彼此分开的两个或更多个贮存部，其中，每个贮存部接纳芯吸垫的第一端并与芯吸垫的第一端流体连通；芯吸垫连续地遵循基部轮廓并且基本上完全粘结至基部；并且芯吸垫的侧向边缘以彼此无间隙的关系邻接基部的侧向壁；以及泵，该泵包括吸收垫，该吸收垫接触芯吸垫的第二端。
在一些实施例中，芯吸垫的每个侧向边缘的一部分包括锯齿形状。在一些实施例中，芯吸垫的每个侧向边缘的包括锯齿形状的部分位于芯吸垫的第一端附近，并且与基部中的贮存部对准。
在一些实施例中，基部的底表面与侧向壁之间的拔模角度为约90度或更大。在某些实施例中，基部的底表面与侧向壁之间的拔模角度为约95度。
在一些实施例中，一个或多个贮存部具有垂直于芯吸垫的侧向边缘的较长尺寸。在某些实施例中，一个或多个贮存部具有平行于芯吸垫的侧向边缘的较长尺寸。在一些实施例中，所有贮存部的最低点位于同一平面上。在一些实施例中，每个贮存部都是凹陷部。在一些实施例中，每个贮存部包括可变长度、可变宽度和深度。在某些实施例中，芯吸垫跨越贮存部的可变长度和可变宽度。在一些实施例中，每个贮存部的横截面具有从由v形、半圆形、椭圆形、u形、矩形、正方形和梯形组成的组中选择的形状。在一些实施例中，基部由模制塑料形成。在一些实施例中，塑料选自由聚对苯二甲酸乙二醇酯、二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚碳酸酯构成的组。在某些实施例中，贮存部包括在侧向流动装置的宽度轴上彼此在空间上分开且彼此相邻的两组或更多组贮存部。
在一些实施例中，芯吸垫和泵由选自以下组中的至少一种吸收性材料形成，所述组包括玻璃纤维、棉、纤维素、纤维素纤维衍生物、烧结玻璃、烧结聚合物、烧结金属以及合成聚合物。在一些实施例中，基材选自由膜、玻璃、塑料、硅、金属和金属氧化物构成的组。在一些实施例中，膜由选自硝化纤维素、聚偏氟乙烯、尼龙和聚砜构成的组中的至少一种材料形成。在一些实施例中，分析物是蛋白质。在一些实施例中，泵接触芯吸垫的第二端的上表面。在某些实施例中，该装置还包括覆盖件。
还提供了执行侧向流动测定的方法。在一些实施例中，该方法包括提供如上所述或本文中其它地方描述的侧向流动装置；可选地将侧向流动缓冲液施加至芯吸垫；将包括蛋白质的基材施加至芯吸垫的用于接触基材的平面区域；将不同的试剂溶液施加至每个贮存部；以及允许试剂溶液从贮存部侧向流动至泵，使得试剂溶液中的每种试剂在芯吸垫中被顺序地输送并与基材上的蛋白质接触，其中，每种试剂溶液作为一个均匀的流体前缘流过芯吸垫。
在一些实施例中，从最靠近用于施加基材的平面区域的贮存部开始将试剂溶液施加至每个贮存部。
在该装置具有覆盖件的一些实施例中，该方法还包括移除覆盖件并将运行缓冲液和基材施加至芯吸垫；将不同的试剂溶液施加至每个贮存部；以及将覆盖件放置在基部上，同时允许试剂溶液从贮存部侧向流动至泵。
在一些实施例中，允许侧向流动的步骤包括：如果存在目标蛋白，则允许来自第一贮存部中的第一试剂溶液的一抗在基材上结合它们的目标蛋白，然后，允许第二贮存部中的第二试剂溶液中的第一洗涤溶液从基材中移除未结合的一抗。在一些实施例中，允许侧向流动的步骤还包括：如果存在目标蛋白，则允许来自第三贮存部中的第三试剂溶液的二抗或二级检测试剂接触结合其目标蛋白的一抗。在一些实施例中，允许侧向流动的步骤还包括：允许来自第四贮存部中的第四试剂溶液的第二洗涤溶液从基材中移除未结合的二抗。在一些实施例中，第二洗涤溶液的体积是具有二抗的第三试剂溶液的体积的至少两倍。
在某些实施例中，这些方法还包括向泵施加基本上均匀的压力。
还提供了形成侧向流动装置的方法。在一实施例中，形成侧向流动装置的方法包括将由多孔材料组成的芯吸垫对准模具，其中，芯吸垫包括用于接触基材的平面区域，该基材包括固定化分析物、第一端、第二端和两个侧向边缘，并且其中，模具包括用于向模具施加真空的多个通孔；将芯吸垫顺序地压配到模具上，以形成成形的芯吸垫；向模具施加真空以将成形的芯吸垫拉紧至模具；将加热到模制和粘结温度的热塑性片材对准并施加至成形的芯吸垫；通过利用真空将经加热的热塑性片材拉紧至成形的芯吸垫以形成侧向流动装置的基部来形成侧向流动装置，其中，该基部包括侧向壁，并且芯吸垫的侧向边缘以彼此无间隙的关系邻接基部的侧向壁。在一些实施例中，芯吸垫被顺序地压配到模具中的多个凹陷部中。在一些实施例中，方法还包括在将芯吸垫顺序地压配到模具上之前将芯吸垫锚定到模具上。
在一些实施例中，一种形成侧向流动装置的方法包括将由多孔材料组成的芯吸垫对准模具，其中，芯吸垫包括用于接触基材的平面区域，该基材包括固定化分析物、第二端和两个侧向边缘，并且其中，模具包括用于向模具施加真空的多个通孔；顺序地向模具施加真空，以将芯吸垫顺序地拉紧至模具，从而形成成形的芯吸垫；将加热到模制和粘结温度的热塑性片材对准并施加至成形的芯吸垫；通过利用真空将经加热的热塑性片材拉紧至成形的芯吸垫以形成侧向流动装置的基部来形成侧向流动装置，其中，该基部包括侧向壁，并且芯吸垫的侧向边缘以彼此无间隙的关系邻接基部的侧向壁。在一些实施例中，向芯吸垫顺序地施加真空的步骤包括将芯吸垫顺序地拉入模具中的多个凹陷部中。在一些实施例中，通过顺序地揭开(露出)模具中的通孔来顺序地向芯吸垫施加真空。
在一些实施例中，将芯吸垫对准模具的步骤包括将芯吸垫的第一端或第二端分别对准模具的第一端或第二端。在某些实施例中，每个侧向边缘的在芯吸垫的第一端附近的一部分具有锯齿形状，并且每个侧向边缘的该部分与模具中的多个凹陷部对准。在一些实施例中，通过加热热塑性片材来增加热塑性片材的表面积。在一些实施例中，模制和粘结温度至少为玻璃化转变温度。在某些实施例中，施加第二片材和拉动经加热的第二片材的步骤是同时执行的。
还提供了一种用于执行侧向流动的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包括如上文和本文中其它地方所述的侧向流动装置。在一些实施例中，试剂盒包括用作泵的多个吸收垫，所有吸收垫在本文中都进行了描述。在一些实施例中，试剂盒包括试剂(例如，包括标记的一抗或者一抗和二抗的结合剂、洗涤溶液和/或运行缓冲液)，这些试剂作为溶液而由最终用户施加至贮存部。在某些实施例中，一些或所有试剂在芯吸垫的与装置的每个贮存部流体连通的部分中干燥到芯吸垫上。
在一些实施例中，试剂盒还包括用于进行侧向流动的运行缓冲液，并且可选地包括封闭剂(封滞剂)(例如牛血清白蛋白、脱脂奶粉或酪蛋白)、表面活性剂(例如吐温20或曲通X-100)、如本文所述的蛋白质聚集改性剂、大分子拥挤剂(例如，葡聚糖、聚乙二醇和/或Ficoll)、密度剂和/或促进试剂的均匀流动和/或促进与集采上的分子的反应并使基材上的背景最小化的试剂。可以在试剂盒中提供作为固体或液体形式的附加的试剂。在一些实施例中，试剂盒还包括用于实施本文所述方法的说明书。
附图说明
图1A–1C分别是根据一实施例的侧向流动装置的示意性立体图、俯视图和剖视侧视图。该装置示出为没有与芯吸垫接触的泵。
图2A和2B是根据一实施例的侧向流动装置的俯视图和立体图。该装置示出为具有与芯吸垫接触的泵。该泵具有覆盖件。
图3A和图3B是侧向流动装置的一部分的特写图像，这两张附图分别在芯吸垫的侧向边缘与基部的侧向壁之间具有和不具有间隙。
图4A和图4B是侧向流动装置的示意性局部立体图，这些附图示出了液体如何在侧向流动装置中迁移，在芯吸垫的侧向边缘与基部的侧向壁之间具有间隙。
图5A和图5B是侧向流动装置的示意性局部立体图，这些附图示出了液体如何在侧向流动装置中迁移，在芯吸垫的侧向边缘与基部的侧向壁之间没有间隙。
图6是芯吸垫的示意性俯视图，该芯吸垫在靠近芯吸垫的第一端的每个侧向边缘的一部分中具有锯齿形状。
图7A和7B是在侧向流动期间两个不同的侧向流动装置的图像。图7A中的装置在芯吸垫的侧向边缘与基部的侧向壁之间具有间隙。染料在不均匀的流体前端中流动。图7B中的装置在芯吸垫的侧向边缘与基部的侧向壁之间不具有任何间隙。染料在均匀的染料前端中流动。
具体实施方式
本文描述了侧向流动装置和使用这样的装置的方法，这些方法允许使用特异性结合剂(例如抗体)高效地侧向检测固定在基材(例如，western印迹膜)或芯吸垫(例如，诊断应用)上的分析物(例如，蛋白质、核酸)。本文所述的装置和方法还允许高效地侧向检测由固定在基材上的特异性结合剂捕获的分析物。侧向流动装置和使用这样的装置的方法将不同的溶液(例如，具有一种或多种分析物、特异性结合剂、运行缓冲液、洗涤溶液的样品)顺序地且免手接触地递送至芯吸垫，该芯吸垫与其上固定有分析物或结合剂的基材紧密接触。溶液从模制到侧向流动装置的基部中的至少两个贮存部被顺序地被递送至芯吸垫。已经发现了侧向流动装置以及使用这种装置的方法，这些方法从至少两个贮存部横跨芯吸垫的宽度均匀地递送溶液，并且在贮存部之间没有溶液混合。在一些实施例中，本文描述的装置能够以一次性使用的装置构造，从而允许可负担的且简单的测定形式。
I.定义
术语“分析物”是指生物分子，例如蛋白质、核酸、多糖、脂质、抗原、生长因子、半抗原等或其一部分。可以将分析物可逆地或不可逆地固定在诸如膜或芯吸垫之类的表面上，并如本文所述进行检测。
术语“固定的”或“嵌入的”可互换地指可逆或不可逆地固定的分子(例如，分析物或结合剂)。在一些实施例中，可逆地固定的分子以允许分子或其一部分(例如，至少25％、50％、60％、75％、80％或更多的分子)从其固定位置移除而不发生实质性变性或聚集的方式固定。例如，通过将含有分子的溶液与吸收性材料接触，分子能够可逆地固定在吸收性材料(例如吸收垫)中或其上，从而吸收(摄取)溶液并可逆地固定分子。然后，可以通过使溶液从吸收性材料芯吸出来或从吸收性材料的一个区域芯吸至另一个区域来移除可逆地固定的分子。在一些情况下，可以通过使含有分子的溶液与吸收性材料接触从而吸收(摄取)溶液，然后干燥含有溶液的吸收性材料，来使分子可逆地固定在吸收性材料上。然后，可以通过将吸收性材料与相同或不同组成的另一溶液接触，从而溶解可逆地固定的分子，然后将溶液从吸收性材料芯吸出来或从吸收性材料的一个区域芯吸至另一区域，来移除可逆地固定的分子。
不可逆地固定的分子(例如，结合剂或分析物)被固定，使得其在温和条件下(例如，pH值在4-9之间，温度在4-65℃之间)不被从其位置移除或基本上不被移除。示例性的不可逆地固定的分子包括通过标准印迹法(例如，电印迹法)结合硝化纤维素、聚偏氟乙烯、尼龙或聚砜膜的蛋白质分析物或结合剂。其它示例性的不可逆地固定的分子包括结合玻璃或塑料的蛋白质分析物或结合剂(例如，微阵列、微流控切片、玻璃组织载玻片或具有在其中结合蛋白质分析物的孔的塑料微量滴定板)。
术语“结合剂”是指与诸如分析物之类的分子特异性结合的试剂。尽管本文在许多内容中描述了抗体，但将理解的是，可以根据用户的偏好使用其它结合剂代替抗体。多种结合剂在本领域中是已知的，包括抗体、适体、亲和物、脂质运载蛋白(例如抗铁蛋白)、硫氧还蛋白A、联蛋白结合蛋白或者含有锚蛋白重复序列、葡萄球菌蛋白A的Z结构域或纤维结合蛋白III结构域的蛋白质。其它结合剂包括但不限于生物素/链霉亲和素、螯合剂、色谱树脂、亲和标签或者功能化珠、纳米颗粒和磁性颗粒。
术语“特异性结合”是指与目标结合的亲和力比非目标化合物高至少2倍的分子(例如，诸如抗体或抗体片段之类的结合剂)，例如高至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍或1000倍或更高的亲和力。
术语“抗体”是指包含免疫球蛋白基因或其片段的框架区域的多肽，其特异性结合并识别抗原、例如特定的分析物。典型地，“可变区域”包含抗体的抗原结合区(或其功能等同物)，并且在结合的特异性和亲和力方面是呃最关键。参见Paul的《基础免疫学》(Fundamental Immunology)(2003年)。抗体包括例如嵌合的抗体、人的抗体、人源化抗体或单链抗体。
示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一条“轻”链(约25千道尔顿(kD))和一条“重”链(约50-70千道尔顿)。每条链的N端限定了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区域。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。
抗体能够以完整的免疫球蛋白形式存在，还能够以任何数量的具有特定抗原结合活性的充分表征的片段形式存在。这些片段可以通过各种肽酶消化产生。胃蛋白酶消化铰链区中的二硫键下的抗体，以产生F(ab)’2、Fab的二聚体，它本身是通过二硫键与VH-CH1连结的轻链。在温和的条件下，F(ab)’2可被还原，以打破铰链区的二硫键，从而将F(ab)’2二聚体转化为Fab’单体。Fab’单体本质上是具有部分铰链区的Fab(参见《基础免疫学》(Paul编辑，第3版，1993)。虽然就完整抗体的消化而言定义了各种抗体片段，但是本领域技术人员将理解，可通过化学或通过使用重组DNA方法从头合成此类片段。因此，本文所用的术语抗体还包括通过改性完整抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的片段(参见例如McCafferty等人的《自然》(Nature)348：552-554(1990))。
除非内容另有明确说明，本说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数的指代。如在本文中使用的，术语“约”是指所记载的数字和在所记载的数字的10％内的任何值。因此，“约5”是指4.5至5.5之间的任何值，包括4.5和5.5。
II.装置
本文描述的是用于检测基材上的分析物、用于检测与基材上的结合剂结合的分析物或用于检测与芯吸垫上的结合剂结合的分析物的侧向流动装置的实施例。
参照图1A–2B，侧向流动装置100包括芯吸垫102，该芯吸垫102具有第一端104、第二端106、两个侧向边缘108以及用于接触包括待检测的固定的分析物或蛋白质(例如western印迹、斑点印迹)的基材(例如，膜)的平面区域110。侧向流动装置100还包括基部114，该基部包括侧向壁115和空间上彼此分开的两个或更多个贮存部116(例如凹陷部或槽)。贮存部116(例如，R1、R2、R3和R4)位于芯吸垫102的第一端104处或附近。每个贮存部116均接纳芯吸垫102的第一端104并与第一端104流体连通(即，当液体存在于贮存部116中时，液体可以从每个贮存部116流入芯吸垫102中)。贮存部116将液体(例如，缓冲液和检测试剂)顺序地供应至芯吸垫102并供应到用于施加基材的平面区域110中。芯吸垫102的平面区域110位于贮存部116下游且位于泵上游(例如，在贮存部116与泵120之间)。泵120位于芯吸垫102的第二端106上或附近，并与芯吸垫102紧密接触。干泵120通过从贮存部116芯吸液体穿过芯吸垫102来充当引流件。
在一些实施例中，每个贮存部具有垂直于芯吸垫102的侧向边缘108的较长尺寸。因此，每个贮存部的定向垂直于侧向流动的方向。在某些实施例中，一个或多个贮存部具有平行于芯吸垫102的侧向边缘的较长尺寸。每个贮存部由垂直于液体流定向的第一壁117和第二壁118界定。每个贮存部还由两个端壁119界定。在一些实施例中，第一贮存部R1的第二壁118的边缘附连于第二贮存部R2的第一壁117的边缘。
在一些实施例中，每个贮存部116跨越芯吸垫102的宽度。如图1A-2B所示，一个或多个贮存部116的最低点基本上位于芯吸垫102的平面区域110的平面中。在一些实施例中，一个或多个贮存部的最低点基本上位于芯吸垫102的平面区域110的平面下方。在一些实施例中，一个或多个贮存部116的最低点基本上位于平面区域110的平面上方。在某些实施例中，所有贮存部116的最低点位于同一平面上，该平面可以在平面区域110的平面上(中)、上方或下方。
贮存部116可以是任何尺寸和形状。在一些实施例中，每个贮存部116包括长度L1、宽度W1和深度D1。如图1A–2B所示，每个贮存部的长度L1和宽度W1是可变的(即，长度和宽度从每个贮存部的底部到顶部增加)。在一些实施例中，每个贮存部在至少一个维度上为至少约0.1、0.5、1.0、8.5、13.5、20cm或更大。在一些情况下，每个贮存部116的长度L1和宽度W1比深度D1大至少约2倍、3倍、5倍、10倍、100倍或更多。在一些实施例中，每个贮存部112尺寸设计为与芯吸垫102的宽度匹配，并且具有比长度L1大至少约3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、13倍、17倍、20倍、27倍或更多的长度L1。每个贮存部的示例性尺寸包括但不限于长度L1和宽度W1分别为约0.5cm×8.5cm、1×3cm、3cm×3cm、2.5cm×约8.5cm、1cm×10cm、3cm×10cm、2cm×13.5cm、3×13.5cm、1cm×15cm、3cm×15cm或3.5cm×20cm。如图1A–1C所示，“长度L1”基于流动方向并且是最短的尺寸。在一些实施例中，每个贮存部的长度L1为3cm，宽度W1为10cm。在一些情况下，每个试剂贮存部的长度L1为1±0.5、1、2或3cm，宽度W1为10±0.5cm或15±0.5cm。在一些情况下，长度L1是较长的尺寸，并且一个或多个贮存部的长度L1是约1cm至约5cm，宽度W1是约0.5cm至约5cm。在一些情况下，至少一个贮存部的深度D1为约0.5cm、约1cm、约2cm或约3cm。
在某些实施例中，每个贮存部116的横截面具有“V”形(图1A–2B)、半圆形、椭圆形、“U”形、矩形、正方形或梯形形状。在一些实施例中，每个贮存部116的第一壁117和第二壁118具有相对于水平面约30度至约90度的斜率。在某些实施例中，每个贮存部116的端壁119相对于水平面具有大约90度的斜率。可以选择贮存部116的深度D1以及第一壁和第二壁的斜率来控制离开贮存部116的试剂溶液的总流动速率，其中较深的凹陷部或较陡的壁减慢侧向流动速率，而较浅的倾斜壁导致较快的流动速率。每个贮存部116的体积由许多因素确定，包括但不限于贮存部116的尺寸和形状以及侧向流动装置100的构造。在一些实施例中，每个贮存部具有至少约0.1毫升至约30毫升的容量。
芯吸垫102连续地遵循基部114的轮廓并且基本上完全粘结至基部114。如图1A-5B所示，芯吸垫102基本上完全粘结至基部114的底表面122。将芯吸垫102粘结至基部114的底表面122可以防止流体在芯吸垫102的底侧上流动。在一些实施例中，芯吸垫102不粘结至贮存部的端壁119。在某些实施例中，芯吸垫跨越贮存部的可变长度和可变宽度。
如图3A所示，芯吸垫102的侧向边缘108以彼此无间隙的关系邻接基部114的侧向壁115(即，芯吸垫102的侧向边缘108与基部114的侧向壁115共享公共边界)。基部的侧向壁与基部的底表面之间的拔模角A1约为90度或更大(例如，约为95度或更大)。如果将矩形芯吸垫102粘结至基部114的底表面122，则芯吸垫102的侧向边缘108与基部114的侧向壁115之间可能存在间隙124(图3B–4B)。间隙124在芯吸垫102的外部形成流体通道，并且在试剂侧向流动期间试剂可以泄漏到间隙124中(图4A)。最初，试剂以横跨芯吸垫的均匀的流动路径(FF1(时间＝0))流动。随着侧向流动进行，在间隙124中流动的试剂在另一流动路径中沿间隙向下行进并在贮存部之间混合。这在芯吸垫102中产生了不均匀的流体流动(即，如图4B所示，产生了多个流体流动前缘FF1和FF2)，这最终可能导致分析物检测中的错误。因此，芯吸垫102的侧向边缘108以无间隙的关系与基部114的侧向壁115彼此邻抵(图3B)，消除了交替的流体流动路径，并导致流体跨芯吸垫102的宽度在一个均匀的流体前缘中流动(即，流体前缘FF1(时间＝0)是均匀的；图5A)。当流体前缘向侧向流动装置100的泵120行进时，流体前缘保持均匀(即，FF1(时间＝1)是均匀(一致)的；图5B)。在一些实施例中，芯吸垫102的每个侧向边缘108的一部分包括锯齿形状126。在某些实施例中，芯吸垫的每个侧向边缘的包括锯齿形状126的部分位于芯吸垫102的第一端104附近，并且与基部114的贮存部116对准(图6)，使得当粘结至基部114时，芯吸垫102的侧向边缘108以彼此无间隙的关系装配至基部114的侧向壁115。
芯吸垫102具有宽度、长度和高度(例如，厚度)。芯吸垫102可以是任何尺寸和形状的。在某些实施例中，芯吸垫102的至少一部分(例如，用于施加基材的平面区域110)是平坦的(平面的)。在一些情况下，芯吸垫102的长度和宽度比高度(即，厚度)大至少约2倍、5倍、10倍、100倍或更多。
芯吸垫的示例性的尺寸包括但不限于这样的芯吸垫：它们在至少一个维度上为至少约0.25cm、0.5cm、1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、10cm、12cm、15cm、20cm、25cm、30cm或更大。在一些情况下，芯吸垫102的长度为20±0.5、1、2、3、4、5、6、9或10cm，宽度为10±0.5、1、2、3、4、5、6、7、8或9cm。
芯吸垫102是吸收性材料。在一些实施例中，芯吸垫102构造成具有高溶液容量和侧向流动速率。在一些情况下，通过使芯吸垫102具有相当大的高度(例如，厚度)来提供所述高溶液容量和侧向流动速率。在一些情况下，芯吸垫102为约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或约0.2mm厚。在一些情况下，芯吸垫102厚度在约0.05mm至约0.5mm之间。
在一些实施例中，芯吸垫102在一个或多个区域中(例如，在贮存部116下游的一个或多个区域中或在每个贮存部116内部的区域中)具有固定或嵌入其中的一种或多种试剂。嵌入的试剂通常被嵌入或结合并干燥到芯吸垫中，以使得试剂在流体流动期间保持固定，或者使得试剂固定直到在侧向流动下与水性流体前缘接触并在用户定义的事件时被释放。这些区域可以是试剂的印刷线或点。
芯吸垫102的平面区域110可以包括用于用户应将基材放置在何处或结合剂在芯吸垫中/上固定在何处的图/标记或其它指示。或者，图形/标记可以在装置覆盖件或基部上。
由于存在多个孔，所以芯吸垫102通常具有大的表面积。大的表面积可以增加芯吸垫102对一种或多种试剂或含有试剂的一种或多种溶液的装载能力。在一些实施例中，芯吸垫102具有至少约0.001m2/g、0.02m2/g、0.1m2/g、0.5m2/g、1m2/g、10m2/g或更大的比表面积，如通过标准技术所测得的。
在一些实施例中，芯吸垫102可以具有特定的孔径、特定的平均孔径或特定的孔径范围。例如，芯吸垫102可以包含0.1μm的孔、0.2μm的孔、0.45μm的孔、或1、2、4、5、6、7、8、10、15、20μm的孔、或比约20μm更大的孔。作为另一示例，芯吸垫102可以包含孔径平均为0.1、0.2、0.45、1、2、4、5、6、7、8、10、15或20μm的孔。作为另一示例，芯吸垫102可以包含孔径范围在约0.1-8μm、0.2-8μm、0.45-8μm、1-8μm、0.1-4μm、0.1-2μm、0.1-1μm、0.1-0.45μm、0.2-8μm、0.2-4μm、0.2-2μm、0.2-1μm、0.2-0.45μm、0.45-8μm、0.45-4μm、0.45-2μm、0.45-1μm的孔。在一些情况下，芯吸垫102可包含孔径小于约20μm的孔。例如，芯吸垫102可由其中至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多的孔的孔径小于约20、15、10或5μm的材料构成。在某些情况下，芯吸垫102中的孔足够大以包含一种或多种平均大小(例如，约1nm)的蛋白质。例如，孔的孔径可以为至少1nm，至少5nm，至少10、100或500nm。替代地，至少50％、60％、70％、80％、90％或更多的孔的孔径可以大于1、5、10、50、100或500nm。如本文中所用的，孔径(孔尺寸)可以作为半径或直径测得。在一些情况下，芯吸垫102包含多孔聚乙烯，例如具有0.2微米至20微米之间或1微米至12微米之间的孔径的多孔聚乙烯。芯吸垫102在垫的不同区域中可以具有不同的孔径。例如，芯吸垫102可以具有侧向流动区域，该侧向流动区域具有不同的孔径或孔径范围。在一些实施例中，选择孔径以控制流动速率。例如，较大的孔径将允许较快的流动速率。
芯吸垫102可以被处理或功能化以使非特异性试剂结合最小化、增加侧向流动、增加芯吸或减少蛋白质聚集。例如，可以对芯吸垫102或其一部分进行处理，以改变经处理的区域的亲水性或疏水性。在一些情况下，改变芯吸垫102的亲水性或疏水性可以增加结合剂的负载，减少结合剂的聚集或变性，产生其中排除或未装载结合剂的遮罩区域或者在芯吸垫湿润时使结合剂直接流动。在一些情况下，芯吸垫包含如本文所述的蛋白质聚集改性剂。
芯吸垫102和泵120通常由吸水材料形成，并且可以由例如天然纤维、合成纤维、玻璃纤维或其混合物制成。非限制性示例包括棉、玻璃及其组合。存在许多来自供应商的可用于诊断用途的商业材料，包括但不限于奥斯龙(Ahlstrom)、通用电气(GE)、颇尔(PALL)、密理博(Millipore)、赛多利斯(Sartorius)和S&S。
泵120由液体吸收能力显著大于芯吸垫102的材料形成。在一些实施例中，泵120由一个或多个吸收垫形成。
吸水材料可以包括，但不限于，含聚合物的材料。聚合物可以呈聚合物珠、聚合物膜或聚合物单体的形式。在一些情形中，聚合物是纤维素。含纤维素的垫包括纸、布、织造或非织造纤维素基材。布垫包括含有诸如棉或羊毛之类的天然纤维素纤维的那些布垫。纸垫包括含有天然纤维素纤维(例如，纤维素或再生纤维素)的那些纸垫和含有纤维素纤维衍生物的那些纸垫，纤维素纤维衍生物包括但不限于纤维素酯(例如，硝化纤维素、乙酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、丙酸醋酸纤维素，丁酸醋酸纤维素和硫酸纤维素)以及纤维素醚(例如，甲基纤维素、乙基纤维素、乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素和羧甲基纤维素)。在一些情形中，纤维素垫包含人造丝。在一些情形中，垫是纸，例如各种纸。
吸水材料可以包括但不限于烧结材料。例如，吸水材料可包含烧结玻璃、烧结聚合物或烧结金属或其组合。在一些情形中，通过烧结粉末玻璃、粉末聚合物或粉末金属中的一种或多种来形成烧结材料。在其它情形中，通过烧结玻璃、金属或聚合物纤维中的一种或多种来形成烧结材料。在还有其它情形中，从对玻璃、聚合物或金属珠中的一种或多种的烧结来形成烧结材料。
吸水材料还可包含但不限于一种或多种非纤维素聚合物，例如，合成聚合物、天然聚合物或半合成聚合物。例如，材料可以包含聚酯、例如聚乙交酯、聚乳酸、聚己内酯、聚己二酸酯、聚羟基链烷酸酯、聚羟基丁酸酯、聚(3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基戊酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚对苯二甲酸丙二醇酯，聚萘二甲酸乙二醇酯、在一些情形中，聚合物是纺粘的、诸如纺粘的聚酯。
附加的合成聚合物包括但不限于尼龙、聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、二乙烯基苯、聚乙烯基、聚二氟乙烯、高密度聚二氟乙烯、聚丙烯酰胺、(C2-C6)单烯烃聚合物、乙烯基芳族聚合物、乙烯基氨基芳族聚合物、乙烯基卤化物聚合物、(甲基)丙烯酸(C1-C6)烷基酯聚合物、(甲基)丙烯酰胺聚合物、乙烯基吡咯烷酮聚合物、乙烯基吡啶聚合物、(甲基)丙烯酸(C1-C6)羟烷基酯聚合物、(甲基)丙烯酸聚合物、丙烯酰胺基甲基丙基磺酸聚合物、含N-羟基的(C1-C6)烷基(甲基)丙烯酰胺聚合物、丙烯腈或上述物质的任意的混合物。
基材通常是平面形状，并且可以是例如由硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙或聚砜形成的膜。可以形成基材的其它材料包括但不限于玻璃、塑料、硅、金属和/或裸的或经聚合物官能化的金属氧化物。可以形成基材的塑料材料包括但不限于聚对苯二甲酸乙二酯、聚丙烯、聚苯乙烯和/或聚碳酸酯。用于对由金属或金属氧化物形成的基材表面进行官能化的聚合物的示例包括环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷、聚-L-赖氨酸、聚凝胺、聚乙二醇聚合物、葡聚糖聚合物、氨基丙基硅烷、羧基硅烷(caroxysilane)、水凝胶和聚合物刷、和/或如官能化烷基硫醇、树枝状聚合物或寡核苷酸的自组装单层。
将芯吸垫的全部或部分粘结至装置的基部或覆盖件的示例性粘结方法包括但不限于用粘合剂粘结、热粘结以及在有或没有压力的情况下进行有机溶剂粘结。在使用粘合剂的实施例中，粘合剂的性质可影响测定性能(即，流动特性、试剂稳定性)，并且可以针对所期望的测定或应用进行优化。在一些实施例中，粘合剂可以是装置100的基部114的一部分。示例性的粘合剂包括但不限于喷雾粘合剂、紫外线可固化粘合剂或压敏粘合剂。
在一些实施例中，基部和/或覆盖件由包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚碳酸酯的塑料形成。基部和/或覆盖件可以例如是真空的或注射模制的或以其它方式构造的。在某些实施例中，覆盖件装配(例如，卡扣装配)至基部。在一些实施例中，覆盖件被模制成使得当覆盖件附连于基部时，覆盖件接触并在泵上施加均匀且向下的力。在某些实施例中，覆盖件在多于一个的部段中提供。例如，覆盖件可以包括可移除的第一部段、第二部段和第三部段。第一部段可以覆盖贮存部，第二部段可以覆盖基材区域，并且第三部段可以覆盖装置的泵。
A.示例性检测试剂
i.结合剂
本文描述了用于检测分析物的结合剂。在一些情况下，结合剂是抗体(例如，一抗或二抗)。一抗可以用于结合分析物。在一些情况下，一抗被标记，从而能够检测一抗并随后检测分析物。在一些情况下，通过结合标记的第二结合剂、比如标记的二抗来检测一抗。在一些情况下，第三结合剂用于检测含有分析物以及第一结合剂和第二结合剂的复合物。
可以在一种或多种试剂溶液中提供结合剂。试剂溶液可以包含本文所述的缓冲液、盐、密度剂或蛋白质聚集改性剂中的一种或多种。密度剂可以用于调制试剂溶液的粘度，这将调制溶液从贮存部中流出的速率。在每种试剂溶液中具有密度剂还可以增强例如固定在基材上的分析物与结合剂(例如抗体)之间的结合相互作用。密度剂的示例包括但不限于甘油、蔗糖、海藻糖、葡聚糖和聚乙二醇。(一种或多种)结合剂可以在溶液中储存至少约一天、三天、7-10天、至少约一个月、两个月、3个月、六个月、一年或更长时间。
还可以在芯吸垫上或芯吸垫中提供结合剂。例如，可以将结合剂的线或点固定在贮存部下游的芯吸垫中/上(例如，在平面区域110中)。在一些实施例中，第一结合剂是用于检测的可逆固定的、标记的第一一抗(例如，一抗偶联物)，第二结合剂是用于捕获的不可逆固定的、未标记的第二一抗(例如，“测试”一抗)，并且第三结合剂是与第一一抗结合的对照抗体。对照抗体可以用于评估测定的有效性。在某些实施例中，将标记的第一一抗与第二一抗配对，并且两种抗体以如下方式结合分析物上的不同表位：如果存在分析物，则在侧向流动测定期间将分析物夹在第一一抗与第二一抗之间。在一些实施例中，将多个配对的第一一抗和第二一抗固定在芯吸垫上，以允许对样品中的分析物进行多重检测。
在一些情况下，芯吸垫的与一个或多个贮存部中的流体连通的平面区域包含在其上干燥的一种或多种结合剂。(一种或多种)干燥的结合剂可以通过使芯吸垫的平面区域与水溶液接触来重建。在一些情况下，水性重建缓冲液可以包含一种或多种再润湿剂，包括本文所述的盐、缓冲液或蛋白质聚集改性剂。在一些情况下，(一种或多种)结合剂可以在芯吸垫中干燥或基本上干燥地存储至少约一天、三天、7-10天、至少约一个月、两个月、3个月、六个月、一年或更长时间。
ii.标记物
可以通过检测与结合剂相连的标记物来检测分析物。标记物可以直接连接于结合剂(例如，通过与一抗的共价键或其它键)，或者附连可以是间接连接的(例如，使用螯合剂或连接分子)。术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中同义使用。在一些实施例中，每个标记物(例如，连接于第一结合剂的第一标记物、连接于第二结合剂的第二标记物等)生成可检测的信号，并且所述信号(例如，由第一标记物生成的第一信号、由第二标记物生成的第二信号等)是可区分的。在一些实施例中，两个或更多个结合剂标记物包括相同类型的结合剂(例如，为第一荧光剂的第一标记物和为第二荧光剂的第二标记物)。在一些实施例中，两个或更多个结合剂标记物(例如，第一标记物、第二标记物等)组合以产生可检测的信号，该信号在缺少一个或多个标记物的情况下不生成。
可检测标记物的例子包括但不限于生物素/链霉亲和素标记物、核酸(例如寡核苷酸)标记物、化学反应标记物、荧光标记物、酶标记物、放射性标记物、量子点、聚合物点、质量标记物、胶体金、电化学标记物及其组合。在一些实施例中，标记物可以包括光学试剂，比如发色团、荧光剂、磷光剂、化学发光剂或电化学发光剂。许多试剂(例如染料、探针或指示剂)是本领域已知的，并且可以用于本发明中。(参见，例如，Invitrogen的手册《荧光探针和标记技术指南》(A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies)，第十版(2005))。发色团包括具有可检测的吸光度的辅酶或辅因子。在一些情况下，可以通过检测220nm处肽键的固有吸光度或280nm处复合氨基酸的吸光度来检测结合剂。
荧光剂可以包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于花青素、酞菁、卟啉、吲哚菁、若丹明、吩恶嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素(例如，FITC、5-羧基荧光素和6-羧基荧光素)、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明(如TAMRA、TMR和若丹明红)、吖啶、蒽醌、硫属吡喃鎓(chalcogenopyrylium)类似物、二氢卟酚、萘菁、次甲基染料、吲哚鎓染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷型染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青、BODIPYTM和BODIPYTM衍生物，及其类似物。在一些实施例中，荧光剂是Alexa Fluor染料，DyLight染料或IRDye。在一些实施例中，荧光剂是聚合物点或量子点。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自例如英杰/分子探针公司(Invitrogen/MolecularProbes)(俄勒冈州尤金市)，皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)，和Licor生物科学公司(Licor Biosciences)(内布拉斯加州林肯)的那些。在一些实施例中，该光学试剂是嵌入式染料。在一些实施例中，2、3、4、5或更多种结合剂各自标记有光学试剂如荧光剂(例如第一结合剂标记有第一荧光标记物，第二结合剂标记有第二荧光标记物等)，且通过检测该光学试剂生成的信号(例如荧光标记物生成的荧光信号)来检测标记有光学试剂的各结合试剂。在一些实施例中，该第二荧光标记物淬灭第一荧光标记物生成的荧光信号。在一些实施例中，第一和第二荧光标记物是荧光共振能量转移(FRET)对的成员。术语“荧光共振能量转移”或“FRET”是指在至少两个发色团，供体发色团和受体发色团之间的能量转移。通常在FRET中，如果供体和受体足够靠近，当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体将其能量转移到受体。受体能够以不同波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。合适的FRET对(供体/受体)包括但不限于EDANS/荧光素，IAEDANS/荧光素，荧光素/四甲基罗丹明，荧光素/LC Red 640，荧光素/Cy 5，荧光素/Cy 5.5，和荧光素/LC Red 705。
在一些实施例中，所有结合剂都标记有光学试剂，且带有光学试剂标记的各结合试剂都通过检测该光学试剂生成的信号来测得。
在一些实施例中，该标记物是放射性同位素。放射性同位素包括放射性核素，其发射γ射线、正电子、β和α粒子和X射线。合适的放射性核素包括但不限于：225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、166Ho、123I、124I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、47Sc、153Sm、89Sr、99mTc、88Y和90Y。在一些实施例中，2、3、4、5或更多种结合剂各自标记有放射性同位素(例如第一结合剂标记有第一放射性同位素，第二结合剂标记有第二放射性同位素等)，且标记有放射性同位素的各结合剂通过检测该放射性同位素生成的放射性来测得。例如，一种结合剂可标记有γ发射子，并且一种结合剂可标记有β发射子。或者，这些结合剂可标记有以不同的能量发射相同粒子(例如，α、β或γ)的放射性核素，其中不同的能量是可区分的。在一些实施例中，所有结合剂都标记有放射性同位素，且各标记的结合剂可通过检测该放射性同位素生成的放射性来测得。
在一些实施例中，标记物是酶，并通过检测该酶生成的产物来检测结合剂。合适的酶的示例包括但不限于：脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)氢过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。例如，辣根过氧化物酶检测系统可与生色底物四甲基联苯胺(TMB)联用，其在过氧化氢存在下产生在450nm处可检测的可溶产物，或者与化学发光底物(例如，来自生物辐射实验室(Bio-Rad Laboratories)的Clarity)联用，其产生可检测的光。碱性磷酸酶检测系统可与生色底物对硝基苯基磷酸酯联用，其产生在405nm处易测的可溶产物。β-半乳糖苷酶检测系统可与生色底物邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)联用，其产生在410nm可测的可溶产物。脲酶检测系统可与底物如脲溴甲酚紫(西格玛免疫化学品公司(Sigma Immunochemicals)，密苏里州圣路易斯)联用。在一些情况下，该酶作用于荧光底物上以生成可检测的荧光产物。在一些实施例中，2、3、4、5或更多种结合剂各自标记有酶(例如第一结合剂标记有第一酶，第二结合剂标记有第二酶等)，且标记有酶的各结合剂通过检测该酶生成的产物来测得。在一些实施例中，所有结合剂都标记有酶，且带有酶标记的各结合剂都通过检测该酶生成的产物来测得。
在一些实施例中，该标记物是亲和标签。合适的亲和标签的示例包括但不限于：生物素、肽标签(如FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Strep标签、eXact标签)和蛋白质标签(如GST标签、MBP标签、GFP标签)。
在一些实施例中，标记物是核酸标记物。合适的核酸标记物的示例包括但不限于：寡核苷酸序列、单链DNA、双链DNA、RNA(例如mRNA或miRNA)或DNA-RNA杂合体。在一些实施例中，该核酸标记物的长度是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。在一些情况下，核酸标记物是扩增的核酸(例如，通过PCR或通过等温聚合酶延伸)。在一些情况下，使用聚合酶、逆转录酶、连接酶或其它作用于核酸(例如，荧光改性的核苷酸、生物素核苷酸、洋地黄毒苷-核苷酸、半抗原核苷酸)的酶将一个或多个标记物纳入核酸标记物中。在一些实施例中，将核酸标记物与另一标记物(例如，核酸)连接以产生可检测的产物(例如，邻位连接技术)。
在一些实施例中，该标记物是核酸条码。如本文所用的“条码”是专一限定标记的分子或标记的结合剂上结合的第二分子的短核苷酸序列(例如，长至少约4、6、8、10或12个核苷酸)。条码序列的长度决定了可以对多少独特的样品进行区分。例如，4个核苷酸的条码能区分不多于44即256个样品；6个核苷酸的条码能区分不多于4096个不同样品；而8个核苷酸的条码能标引不多于65536个不同样品。本领域熟知条码技术的应用，参见例如Katsuyuki Shiroguchi等人的，“Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias and amplification noise with optimized single-moleculebarcodes(数字式RNA测序用优化的单分子条码最小化序列依赖性偏置和扩增噪音)”,PNAS2012年1月24日；109(4):1347-52；和Smith,AM等人的“Highly-multiplexed barcodesequencing:an efficient method for parallel analysis of pooled samples(高度多重条码测序：一种对合并的样品平行分析的高效方法)”，Nucleic Acids Research 2010年7月；38(13):e142。
在一些实施例中，该标记物是“点击”化学部分。点击化学使用简单稳健的反应(如铜催化的叠氮化物和炔的环加成)来建立分子间连接。对于点击化学的综述，参见Kolb等人的Agnew Chem 40:2004-2021(2001)。在一些实施例中，点击化学部分(如叠氮化物或炔部分)可使用另一种可检测标记物(例如带荧光标记、生物素化或放射性标记的炔或叠氮化物部分)来检测。
附接可检测标记物到结合剂，如蛋白质(例如，抗体)的技术是熟知的。例如，常见蛋白标记技术的综述可参见《生物化学技术：理论和实践(Biochemical Techniques:Theory and Practice)》，John F.Robyt和Bernard J.White，维弗兰德出版公司(WavelandPress,Inc.)(1987)。其它标记技术综述于，例如，R.Haugland的《生物聚合物的激发状态(Excited States of Biopolymers)》，Steiner编，普莱南出版社(Plenum Press)(1983)；《荧光探针设计与合成：技术指南(Fluorogenic Probe Design and Synthesis:ATechnical Guide)》，PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems)(1996)；以及G.T.Herman的《生物偶联技术(Bioconjugate Techniques)》，学术出版社(AcademicPress)(1996)。
在一些实施例中，两种或更多种标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号，该可检测信号在所述多种标记物缺失其中一个或多个时不会生成。例如，在一些实施例中，各标记物是酶，且这些酶的活性联合生成可检测信号来指示标记物(并因此指示各带标记的蛋白质)的存在。联合生成可检测信号的酶的示例包括成对的测定，例如使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的成对测定；以及针对与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-D-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶测定偶联的NAD(P)H的化学发光测定。参见例如，Maeda等人的生物发光与化学发光期刊(J Biolumin Chemilumin)1989,4:140-148。
B.蛋白质聚集改性剂
本文描述了蛋白质聚集改性剂。可采用蛋白质聚集改性剂来减少或消除在试剂溶液或芯吸垫102中储存或从中递送的结合剂如蛋白质(例如，抗体)的聚集或变性。例如，蛋白质聚集改性剂可用来减少或消除在试剂溶液或芯吸垫102中储存或从中递送的一抗的聚集或变性。在一些情况下，蛋白质聚集改性剂可用于促进结合剂在芯吸垫102的平面区域110中的侧向流动。
在一些情况下，起到使蛋白质从空气-水界面置换从而保护蛋白质免于变性和聚集的作用的蛋白质聚集改性剂在减少固定在芯吸垫102上的结合剂的聚集方面特别有效。在其它情况下，蛋白质聚集改性剂通过与结合剂结合和/或稳定结合剂而直接影响结合剂的稳定性。在其它情况下，蛋白聚集改性剂的作用为使平衡移离变性或解折叠状态并由此减少聚集。例如，在一些情况下，由于结合剂的酰胺主链和蛋白聚集改性剂之间的强烈排斥，热力学上不利于(disfavored)蛋白质聚集改性剂与结合剂之间的相互作用。因此，蛋白聚集改性剂存在时不利于结合剂的解折叠，因为解折叠将更多酰胺主链表面暴露于蛋白聚集改性剂。
蛋白质聚集改性剂可以是以下一种或多种：环糊精、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、两性离子表面活性剂、非去污剂磺基甜菜碱、简单糖、多糖、多元醇、有机溶剂、聚集改性蛋白质、无序肽序列、氨基酸、氧化还原剂、冻干保护剂、冷冻保护剂或离液剂。
环糊精可以是但不限于，α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、(2，3，6-三-O-甲基)-β-环糊精，(2，3，6-三-O-甲基)-β-环糊精、(2-羟基)丙基-β-环糊精、(2-羟基)丙基-γ-环糊精、无规甲基-β-环糊精、无规甲基-γ-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精、6-单去氧-6-单氨基-β-环糊精、磺丁基-β-环糊精、6-氨基-6-脱氧-β-环糊精、乙酰基β-环糊精、琥珀酰α-环糊精、琥珀酰β-环糊精、琥珀酰γ-环糊精、(2，3，6-三-O-苯甲酰基)-β-环糊精、琥珀酰基-(2-羟丙基)-β-环糊精或琥珀酰基-(2-羟丙基)-γ-环糊精。环糊精也可以是含有一种或多种前述环糊精分子的环糊精聚合物。其它环糊精是本领域已知的且包括例如万维网cyclodextrin.com上描述的那些。环糊精的示例性浓度是但不限于约1mM(毫摩尔)、2mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、50mM、75mM或100mM。
非离子型表面活性剂可以是聚乙烯-去水山梨糖醇-脂肪酸酯、聚乙二醇-聚丙二醇(polyethylene-polypropylene glycols)或聚氧乙烯-硬脂酸酯。聚乙烯-去水山梨糖醇-脂肪酸酯可以是聚乙烯(20)-去水山梨糖醇酯(Tween 20TM)或聚氧乙烯(20)-去水山梨糖醇单油酸酯(Tween 80TM)。聚乙二醇-聚丙二醇可以是聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如以商品名或PoloxamerTM售卖的那些。聚氧乙烯-硬脂酸酯可以是例如以商标MyrjTM售卖的那些。示例性的聚氧乙烯单月桂基醚包括以商标BrijTM售卖的那些，例如Brij-35。非离子型表面活性剂的示例性浓度是但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％或约10％w/w、w/v或v/v。
离子型表面活性剂可以是阴离子型表面活性剂或阳离子型表面活性剂。可用于本发明的阴离子型表面活性剂可以是但不限于皂，包括碱金属皂，比如脂族羧酸(通常是脂肪酸)的钠、钾或铵盐，比如硬脂酸钠。其它阴离子型表面活性剂包括有机胺皂，比如脂族羧酸(通常是脂肪酸)的有机胺盐，比如三乙醇胺硬脂酸盐。可用于本发明的阳离子型表面活性剂包括但不限于胺盐，比如十八烷基氯化铵或季铵化合物，比如苯扎氯铵。离子型表面活性剂可包括烷基硫酸的钠、钾或铵盐，比如十二烷基硫酸钠或辛基硫酸钠。离子型表面活性剂的示例性浓度是但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％或约10％w/w、w/v或v/v。
两性离子型表面活性剂具有与同一分子相连的阳离子和阴离子中心。例如，阳离子部分是基于伯胺、仲胺或叔胺或者季铵阳离子。阴离子部分可以是磺酸根，如CHAPS(3[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)中那样。其它阴离子基团是磺基甜菜碱类，其由椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱或甜菜碱类所示，例如椰油酰胺乙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱或月桂酰胺丙基甜菜碱。两性离子型表面活性剂的示例性浓度是但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。
非去污剂磺基甜菜碱(NDSB)具有无法聚集形成胶束的短疏水性基团和磺基甜菜碱亲水性基团，因此不认为NDSB是去污剂。示例性的NDSB包括但不限于NDSB 256、NDSB221、NDSB 211、NDSB 201、NDSB 195、3-(4-叔丁基-1-吡啶并)-1-丙磺酸盐、3-(1-吡啶并)-1-丙磺酸盐、3-(苄基二甲基铵基)丙磺酸盐或二甲基乙基丙磺酸铵。NDSB的示例性浓度包括但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。
多元醇是具有多个羟基官能团的化合物。在一些情况下，多元醇可通过多种机理改变蛋白质的聚集或变性行为。例如，在一些情况下，多元醇会通过给出热力学上不利的与蛋白主链的相互作用来使平衡移向折叠状态。或者，在一些情况下，多元醇可与蛋白质的折叠状态结合并使其稳定。
多元醇可以是简单糖，比如蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、赤藓糖醇、葡萄糖、半乳糖、棉籽糖或海藻糖。多元醇也可以是多糖，例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉或含有一种或多种本文所述简单糖的聚合物。甘油、乙二醇、聚乙二醇、季戊四醇丙氧基化物和季戊四醇丙氧基化物，以及它们的组合也是示例性多元醇。
有机溶剂可以是但不限于已知抑制一种或多种蛋白质的变性、解折叠或聚集的那些有机溶剂。本领域已知多种合适的有机溶剂。例如，有机溶剂可包括乙醇、丁醇、丙醇、苯酚、二甲基甲酰胺、2-甲基-2,4-戊二醇、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、1,6-己二醇或二甲基亚砜。
聚集改性蛋白质可以是本领域已知抑制一种或多种蛋白质变性、解折叠或聚集的蛋白质。示例性的聚集改性蛋白质包括但不限于白蛋白、蛋白质伴侣和热休克蛋白。白蛋白是水溶性、在浓盐溶液中中度可溶并经受热变性的蛋白。示例性白蛋白包括血清白蛋白(例如牛、马或人血清白蛋白)或卵白蛋白(例如，鸡蛋白蛋白)。其它示例性聚集改性蛋白质包括酪蛋白、明胶、泛素、溶菌酶或胚胎发生晚期丰富(LEA)蛋白。LEA蛋白包括LEA I、LEA II、LEA III、LEA IV、LEA V或非典型LEA蛋白。LEA蛋白是本领域已知的并描述于例如Goyal K.等人的《生物化学学报》(Biochemical Journal)288(第1部分)，151-57，(2005)。
蛋白质聚集改性剂也可以是氨基酸。在一些情况下，氨基酸可起氧化还原作用来为固定在基材上的蛋白质维持适当的氧化电位。合适的氧化还原氨基酸包括半胱氨酸和胱氨酸。其它氨基酸通过非氧化还原方法起到减少变性或聚集的作用。例如，精氨酸、甘氨酸、脯氨酸和牛磺酸已证明能减少蛋白质聚集。
可用其它氧化还原剂来减少蛋白质聚集。可用半胱氨酸和胱氨酸以外的氧化还原剂来优化蛋白质固定于其上的基材中的还原电位。示例性的氧化还原剂包括巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、三(2-羧基乙基)膦、谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物及其氧化衍生物，以及Cu2+。
蛋白质聚集改性剂还可以包括冻干保护剂、冷冻保护剂或离液剂。在一些情况下，蛋白质聚集改性剂是离液剂，例如脲、硫脲、胍盐、氰酸盐、硫氰酸盐、三甲基铵、四甲基铵、铯、铷、硝酸盐、乙酸盐、碘化物、溴化物、三氯乙酸盐或高氯酸盐。在某些条件下，如在低浓度下，离液剂可减少蛋白质聚集。其它蛋白质聚集改性剂包括三甲基胺N-氧化物。
蛋白质聚集改性剂可以是盐。示例性盐包括但不限于盐酸、硫酸或磷酸的钠盐、钾盐、镁盐或钙盐。蛋白质聚集改性剂也可以是缓冲剂。示例性缓冲剂包括但不限于三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、TAPSO、MES、HEPES、PIPES、CAPS、CAPSO、MOPS、MOPSO或磷酸钠或磷酸钾、碳酸钠或碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾、乙酸钠或乙酸钾、或硼酸钠或硼酸钾缓冲剂。
蛋白质聚集改性剂能够以任何合适浓度提供。在一些情况下，蛋白质以包含结合剂和蛋白质聚集改性剂的水溶液形式提供。在这种情况下，溶液可以与芯吸层接触，并可选地干燥。水性结合剂溶液中蛋白质聚集改性剂的示例性浓度包括但不限于溶液的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、4％、5％、10％、20％或约25％或更多w/v。其它的示例性浓度包括但不限于约1μM、5μM、10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、150μM、200μM、300μM、500μM、750μM、1mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM和1M。
在一些情况下，在试剂溶液中提供蛋白质聚集改性剂。包含蛋白质聚集改性剂的示例性组合物包含约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或约10％、20％、或约25％的重量的一种或多种蛋白质聚集改性剂。
蛋白质聚集改性剂能够以任何合适的组合提供。例如，在一些情况下，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的前述蛋白质聚集改性剂可用于减少可逆地固定在芯吸垫上的结合剂的聚集。在一些情况下，在使芯吸垫接触结合剂溶液之前，芯吸垫含有蛋白质聚集改性剂，并且结合剂溶液含有相同或不同的蛋白质聚集改性剂。在一些情况下，在使芯吸垫接触结合剂溶液之前，芯吸垫含有蛋白质聚集改性剂，并且结合剂溶液不含蛋白质聚集改性剂。在一些情况下，在使芯吸垫与结合剂溶液接触之前，结合剂溶液含有蛋白质聚集改性剂，而芯吸垫或待接触的区域不含蛋白质聚集改性剂。
III.方法
提供了使用本文描述的装置进行侧向流动测定的方法。在一实施例中，该方法包括使具有固定的分析物或(一种或多种)结合剂的基材(例如，Western印迹)与芯吸垫102接触，该基材可以预先润湿地提供或可以由用户利用例如侧向流动缓冲液预先润湿。在一些实施例中(图1A–2B)，基材在贮存部116下游且在泵120上游地面朝下放置在芯吸垫102上(例如，在贮存部116与泵120之间或在芯吸垫102的区域110中)。
接着，将不同的试剂溶液施加至每个贮存部。试剂溶液还能够以任何顺序施加至贮存部。在一些实施例中，将试剂溶液从最靠近用于接触基材的区域110的第一贮存部R1开始施加至每个各贮存部。试剂溶液可以顺序地或同时地施加至贮存部。在具有覆盖件的实施例中，可以在将覆盖件放置在装置上之前或之后将不同的试剂溶液施加至每个贮存部。在其中将覆盖件放置在装置上之后将试剂溶液施加至各贮存部的实施例中，可以通过装置中的一个或多个端口或孔来施加溶液。在一实施例中，将四种不同的试剂溶液(例如，一抗、第一洗涤溶液、二抗或二级检测试剂和第二洗涤溶液)施加至贮存部。
在一些实施例中，将具有标记的一抗的第一试剂溶液施加于第一贮存部R1，并将具有第一洗涤溶液的第二试剂溶液施加于第二贮存部R2。在某些实施例中，按以下顺序将四种不同的试剂溶液施加至贮存部：将具有一抗的第一试剂溶液施加至第一贮存部R1，将具有第一洗涤溶液的第二试剂溶液施加至第二贮存部R2，将具有二抗或二级检测试剂的第三试剂溶液施加至第三贮存部R3，并将具有第二洗涤溶液的第四试剂溶液施加至第四贮存部R4。在一些实施例中，按以下顺序将四种不同的试剂溶液施加至贮存部：将具有第二洗涤溶液的第四试剂溶液施加至第四贮存部R4，将具有第一洗涤溶液的第二试剂溶液施加至第二贮存部R2，将具有一抗的第一试剂溶液施加至第一贮存部R1，并将具有二抗或二级检测试剂的第三试剂溶液施加至第三贮存部R3。在某些实施例中，在将第四试剂溶液施加至第四贮存部R4之前，将第二试剂溶液施加至第二贮存部R2。在一些实施例中，施加至贮存部的试剂溶液具有另一种试剂溶液的至少两倍的体积。例如，第四贮存部R4中的第二洗涤溶液的体积可以是第三贮存部R3中的二抗的体积的至少两倍。在一些实施例中，省略具有第二洗涤溶液的第四试剂溶液以使第三贮存部R3中的二抗或二级检测试剂有更多时间结合一抗。
在其中基材上具有固定的结合剂的实施例中，将具有分析物的样品施加至第一贮存部R1，将第一洗涤溶液施加至第二贮存部R2，将二级检测试剂施加至第三贮存部R3，并且，如果需要，将第二洗涤溶液施加至第四贮存部R4。
在一些实施例中，样品是生物样品。生物样品可以获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、细菌或任何其它有机体。在一些实施例中，该生物样品来自动物，例如哺乳动物(例如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(例如鸡)、或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液、血液成分或血液制品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等)、痰液或唾液、组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物、外植体，转化的细胞、干细胞、粪便或尿液。在一些实施例中，样品包括阳性对照蛋白，用于评估测定有效性或用于使测试信号在多个不同抗体区域上标准化。
在其中没有基材并且其中结合剂固定在贮存部下游的芯吸垫102的平面区域100上的线或点中的一些实施例中，将不同溶液(例如，样品或试剂溶液)施加至至少两个贮存部。在其中一系列标记的、可逆固定的第一一抗(例如，第一结合剂或一抗偶联物)、一系列未标记的、不可逆固定的第二一抗(例如，第二结合剂或测试一抗)和一系列不可逆固定的、结合一抗的对照抗体(例如，第三结合剂)印刷到芯吸垫102的平面区域110上的一个实施例中，将具有一种或多种分析物和可选的对照蛋白质的样品施加至第一贮存部R1并将洗涤溶液(例如，侧向流动缓冲液)施加至第二贮存部R2。在其中未标记的第二一抗和对照抗体不可逆地固定在芯吸垫102的平面区域110上的一些实施例中，将检测试剂(例如，标记的一抗)施加至第三贮存部R3，并且如果需要，将第二洗涤溶液施加至第四贮存部R4。
在其中分析物固定在贮存部下游的芯吸垫102的平面区域110上的线或点中的实施例中，将标记的一抗施加至第一贮存部R1并将第一洗涤溶液施加至第二贮存部R2。如果需要，将二级检测试剂施加至第三贮存部R3，并将第二洗涤溶液施加至第四贮存部R4。
然后使试剂溶液和/或样品从各贮存部依次流到芯吸垫102的区域110上。试剂溶液和/或样品中的每一种均作为一个均匀的流体前缘流过芯吸垫102。在一些实施例中，试剂溶液和/或样品在贮存部之间不混合的情况下流动。在具有固定在一个或多个贮存部内部的芯吸垫102的区域中的试剂的实施例中，为了启动试剂从贮存部到芯吸垫102的顺序流动，将侧向流动(例如行经)缓冲液顺序地或同时施加至所有贮存部。在一些情况下，用在每个试剂溶液中的一种或多种染料或指示剂目视监测每个试剂溶液离开贮存部116和进入/通过芯吸垫102的侧向流动(例如，过程)。
在具有固定在基材上的分析物的实施例中，通过从贮存部芯吸进入芯吸垫中和到干泵来吸引(吸出)试剂溶液，从而将试剂溶液中的试剂(例如一抗、第一洗涤溶液，并且如果需要，二抗和第二洗涤溶液)顺序地携带成(承载成)通过侧向流动与其上固定有蛋白质或分析物的基材接触。每种试剂溶液均作为一个均匀的流体前缘流过芯吸垫102。第一试剂溶液中的一抗在芯吸垫102中输送，接触基材上的蛋白质或分析物，并且如果目标蛋白质或分析物存在，则与基材上的目标蛋白质或分析物结合。在一些实施例中，试剂溶液/侧向流动缓冲液从贮存部到泵的侧向流动还允许第二试剂溶液中的第一洗涤溶液在芯吸垫102中输送，使得未结合的一抗从基材移除。在某些实施例中，试剂溶液/侧向流动缓冲液从贮存部到泵的侧向流动还允许第三试剂溶液中的二抗或二级检测试剂在芯吸垫102中输送，并且如果存在它们的目标蛋白，则接触与基材上的目标蛋白结合的一抗。在一些实施例中，试剂溶液/侧向流动缓冲液从贮存部到泵的侧向流动还允许第四试剂溶液中的第二洗涤溶液在芯吸垫102中输送，使得未结合的二抗从基材中被移除。在一些实施例中，施加至芯吸垫102并在芯吸垫102中输送的第二洗涤溶液的体积是施加至芯吸垫102并在芯吸垫102中输送的二抗的体积的两倍。
在其中结合剂固定在基材上的实施例中，通过从贮存部芯吸到芯吸垫和干泵中来吸引样品和试剂溶液，从而将试剂溶液中的样品和试剂(例如，第一洗涤溶液、二级检测试剂以及如果需要的话，第二洗涤溶液)中的分析物(和可选的对照蛋白)携带成通过侧向流动顺序地与基材接触。样品和每种试剂溶液均作为一个均匀的流体前缘流过芯吸垫102。
在其中结合剂固定在贮存器下游的芯吸垫的区域110上的实施例中，通过从贮存部芯吸到芯吸垫和干泵来吸引样品和试剂溶液，从而将试剂溶液中的样品和试剂(例如，第一洗涤溶液，以及如果需要，二级检测试剂和第二洗涤溶液)中的分析物携带成通过侧向流动顺序地与区域110接触。样品和每种试剂溶液均作为一个均匀的流体前缘流过芯吸垫102。
在一些实施例中，在开始侧向流动之前或之后以及在侧向流动期间，向泵施加基本均匀的压力以改善泵与芯吸垫102的接触。例如，可以将重物放置在泵的顶部上，或者可以将覆盖件(或覆盖件的一部分)附连于基部，以将泵推向芯吸垫102。
在具有至少部分地粘结至基部的芯吸垫的实施例中，一旦试剂溶液已经被施加至贮存部，就可以将覆盖件放置到装置上，以使蒸发最小化并且向泵施加均匀的压力。可以将覆盖件卡配到基部上以施加均匀的压力，或者可以将覆盖件松散地放置在基部之上，然后将带有覆盖件的基部放入抽屉式的容器中，其然后滑入盒中。在将覆盖件附连之前或作为覆盖件的替代，可以将海绵放置在泵上以帮助向泵施加均匀的压力。该过程要求用户与耗材的交互最少。
在具有基材的一些实施例中，在侧向流动期间，通过目测或使用检测器跟踪一抗与目标蛋白的结合(以及可选地二抗或二级检测试剂与一抗接触)。在一些实施例中，从侧向流动装置100移除基材，并且如果存在，则检测一抗与目标蛋白的结合。在一些实施例中，通过使用文中所述的可检测的部分和/或标记物来目测和/或检测与目标蛋白结合的抗体。通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、同位素、电学、光学、化学或质谱技术来检测合适的标记物和/或部分。
在其中结合剂固定在芯吸垫的平面区域110上的实施例中，如果存在分析物，则通过目测或使用检测器来跟踪在侧向流动期间分析物与第一一抗和第二一抗的结合(例如，检测夹在第一一抗与第二一抗之间的分析物)。在一些实施例中，通过使用如本文所述的可检测部分和/或标记物来目测和/或检测分析物与第一一抗和第二一抗的结合。
本领域已知许多吸性收吸水垫材料、芯吸垫材料和抗体施用材料，可以从其中进行选择，以控制体积，控制系统的流动速率，保证均匀的流动，并且保证由贮存部完整地递送抗体/试剂。影响试剂/抗体递送时机的其它方法、比如在芯吸垫中使用曲折路径是可能的。控制侧向流动过程的另外的其它实施例可以工程设计到塑料外壳中，其中表面可以包含倾斜区域以使用重力来延缓或加速液体的流动。
图1A–2B中所示的是消耗型装置，该装置容纳单个微型凝胶尺寸的膜。通常用户使用被称为中型印迹的膜进行Western印迹，所述中型印迹通常是微型膜的宽度的2倍。在其它Western印迹应用中，用户可以将微型和/或中型膜切成更小的部分，其对应于用于蛋白质电泳和转移的原始凝胶的几条泳道。因此，在一些实施例中，消耗型侧向流动装置可以是适应(容纳)微型或中型膜的尺寸。在还有其它实施例中，可以将单独的脊部模制到或以其它方式存在于其中可以放置膜区段的耗材的基部中。
在侧向流动装置的其它实施例中，可以将多种抗体混合并且装载到一个或多个贮存部中以有助于在单一样品中目标的多重检测。
现在将描述根据本文的各实施例的形成侧向流动装置的方法。形成侧向流动装置的方法包括将由多孔材料构成的芯吸垫与模具对准，其中，芯吸垫包括平面区域、第一端、第二端和两个侧向边缘，该平面区域用于接触包括固定的分析物的基材，并且其中，模具包括用于向模具施加真空的多个通孔。在一些实施例中，通过将芯吸垫的第一端或第二端分别对准模具的第一端或第二端来将芯吸垫对准模具。在一些实施例中，在芯吸垫的第一端附近的侧向边缘的锯齿形部分与模具中的多个凹陷部对准。在最终组装的侧向流动装置中，多个凹陷部对应于基部中的贮存部。
在该方法的下一步骤中，将芯吸垫顺序地压配到模具上，以形成成形的芯吸垫。芯吸垫可通过如共同待决的美国专利申请第62/537,730号中所述的系统和工艺顺序地压配到模具中，其全文以参见的方式本文。在某些实施例中，在将芯吸垫顺序地压配至模具之前，芯吸垫被锚定至模具。在一些实施例中，芯吸垫102被顺序地压配到模具中的多个凹陷部中。
该方法的下一步骤包括向模具施加真空以将成形的芯吸垫拉紧至模具。在一些实施例中，在将芯吸垫对准模具之后，顺序地向模具施加真空，以将芯吸垫顺序地拉紧至模具以形成成形的芯吸垫(即，在向模具施加真空之前不会先将芯吸垫顺序地压配到模具上)。
接着，将加热到模制和粘结温度的热塑性片材与成形的芯吸垫对准并施加至该芯吸垫。在一些实施例中，通过加热热塑性片材来增加热塑性片材的表面积。在某些实施例中，模制和粘结温度至少为玻璃化转变温度。
在该方法的下一步骤中，通过借助真空将经加热的热塑性片材拉紧至成形的芯吸垫以形成侧向流动装置的基部来形成侧向流动装置。由此形成的基部包括侧向壁，并且芯吸垫的侧向边缘以彼此无间隙的关系邻接基部的侧向壁。在一些实施例中，在将经加热的热塑性片材拉紧至成形的芯吸垫的同时，将经加热的热塑性片材施加至成形的芯吸垫。
IV.试剂盒
提供了用于根据本文描述的方法进行侧向流动测定的试剂盒。还提供了包含如本文所述的侧向流动装置的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含液体形式的试剂(例如，试剂溶液)(例如，包括标记的一抗或一抗和二抗、洗涤溶液和/或侧向流动缓冲液的结合剂)，这些试剂通过终端用户施加至装置。在一些实施例中，溶液以浓缩形式提供(例如5x或10x)，这些溶液在使用之前稀释。在一些实施例中，试剂以固体形式提供，这些试剂在使用之前用液体、例如缓冲液进行重建。
在一些实施例中，试剂盒包含封闭剂(例如，牛血清白蛋白和/或脱脂奶粉)、表面活性剂(例如，Tween 20或Triton X-100)、如本文所述的蛋白质聚集改性剂、拥挤剂(例如，葡聚糖、聚乙二醇和/或Ficoll)、密度剂、和/或促进试剂均匀流动和/或促进对基材上的分子的反应并使基材上的背景最小化的试剂。附加的试剂可以作为固体(例如粉末)或以液体形式(例如作为溶液)提供在试剂盒中。在一些实施例中，试剂盒还包括用于进行本文所述方法的指示。
附加公开内容和可要求主题
第1项.一种侧向流动装置，包括：
由多孔材料组成的芯吸垫，所述芯吸垫具有用于接触包含固定的分析物的基材的平面区域；并且
其中，所述芯吸垫具有第一端、第二端和两个侧向边缘；
基部，所述基部包括侧向壁以及在空间上彼此分开的两个或更多个贮存部，
其中，每个所述贮存部接纳所述芯吸垫的所述第一端并与其流体连通；
所述芯吸垫连续地遵循所述基部的轮廓并且基本上完全粘结至所述基部；并且
所述芯吸垫的所述侧向边缘以彼此无间隙的关系邻接所述基部的所述侧向壁；以及
泵，所述泵包括与所述芯吸垫的所述第二端接触的吸收垫。
第2项.如第1项所述的装置，其中，所述芯吸垫的每个所述侧向边缘的一部分包括锯齿形状。
第3项.如第2项所述的装置，其中，所述芯吸垫的每个所述侧向边缘的包括所述锯齿形状的所述部分位于所述芯吸垫的所述第一端附近，并且与所述基部中的所述贮存部对准。
第4项.如第1-3项中任一项所述的装置，其中，所述基部的底表面与所述侧向壁之间的拔模角度为约90度或更大。
第5项.如第1-3项中任一项所述的装置，其中，所述基部的底表面与所述侧向壁之间的拔模角度为约95度。
第6项.如第1-5项中任一项所述的装置，其中，所述一个或多个贮存部具有垂直于所述芯吸垫的所述侧向边缘的较长尺寸。
第7项.如第1-5项中任一项所述的装置，其中，所述一个或多个贮存部具有平行于所述芯吸垫的所述侧向边缘的较长尺寸。
第8项.如第1-7项中任一项所述的装置，其中，所有所述贮存部的最低点位于同一平面上。
第9项.如第1-8项中任一项所述的装置，其中，每个所述贮存部是凹陷部。
第10项.如第1-9项中任一项所述的装置，其中，每个所述贮存部包括可变长度、可变宽度和深度。
第11项.如第10项所述的装置，其中，所述芯吸垫跨越所述贮存部的所述可变长度和所述可变宽度。
第12项.如第1-11项中任一项所述的装置，其中，每个所述贮存部的横截面具有从由v形、半圆形、椭圆形、u形、矩形、正方形和梯形组成的组中选择的形状。
第13项.如第1-12项中任一项所述的装置，其中，所述基部由模制塑料形成。
第14项.如第1-13项中任一项所述的装置，其中，所述贮存部包括在侧向流动装置的宽度轴上在空间上彼此分开并且彼此相邻的两组或更多组贮存部。
第15项.如第1项所述的装置，其中，所述芯吸垫和所述泵由选自以下组中的至少一种吸收性材料形成，所述组包括玻璃纤维、棉、纤维素、纤维素纤维衍生物、烧结玻璃、烧结聚合物、烧结金属和合成聚合物。
第16项.如第1项所述的装置，其中，所述基材选自由膜、玻璃、塑料、硅、金属和金属氧化物构成的组。
第17项.如第16项所述的装置，其中，膜由选自硝化纤维素、聚偏氟乙烯、尼龙和聚砜构成的组中的至少一种材料形成。
第18项.如第13或16项所述的装置，其中，所述塑料选自由聚对苯二甲酸乙二醇酯、二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚碳酸酯构成的组。
第19项.如第1-18项中任一项所述的装置，其中，所述分析物是蛋白质。
第20项.如第1-19项中任一项所述的装置，其中，所述泵接触所述芯吸垫的所述第二端的上表面。
第21项.如第1-20项中任一项所述的装置，其中，所述装置还包括覆盖件。
第22项.一种用于侧向流动的试剂盒，所述试剂盒包括：
如第1-20项中任一项所述的装置。
第23项.一种执行侧向流动测定的方法，所述方法包括：
提供如第1-21项中任一项所述的装置；
可选地将侧向流动缓冲液施加至所述芯吸垫；
将包含蛋白质的基材施加至所述芯吸垫的用于接触基材的所述平面区域；
将不同的试剂溶液施加至每个所述贮存部中；以及
允许所述试剂溶液从所述贮存部侧向流动至泵，使得所述试剂溶液中的每种试剂在所述芯吸垫中被顺序地输送并接触所述基材上的蛋白质，其中，所述每种试剂溶液都作为一个均匀的流体前缘流过所述芯吸垫。
第24项.如第23项所述的方法，其中，所述试剂溶液从最靠近用于施加所述基材的平面区域的贮存部开始施加至每个所述贮存部。
第25项.如第23项所述的方法，其中，允许侧向流动的所述步骤包括如果存在目标蛋白，则允许来自第一贮存部中的第一试剂溶液的一抗在所述基材上结合它们的目标蛋白，然后，允许第二贮存部中的第二试剂溶液中的第一洗涤溶液从所述基材中移除未结合的一抗。
第26项.如第25项所述的方法，其中，允许侧向流动的所述步骤还包括如果存在目标蛋白，则允许来自第三贮存部中的第三试剂溶液的二抗或二级检测试剂接触在所述基材上结合至其目标蛋白的一抗。
第27项.如第26项所述的方法，其中，允许侧向流动的所述步骤还包括允许来自第四贮存部中的第四试剂溶液的第二洗涤溶液从所述基材中移除未结合的二抗。
第28项.如第27项所述的方法，其中，所述第二洗涤溶液的体积是具有所述二抗的所述第三试剂溶液的体积的至少两倍。
第29项.如第23-28项中任一项所述的方法，还包括向所述泵施加基本上均匀的压力。
第30项.如第23-29项中任一项所述的方法，还包括如果存在目标蛋白，则在所述一抗与所述目标蛋白结合之后，可选地在所述二抗或二级检测试剂与所述一抗接触之后，可选地移除所述基材，并且如果存在目标蛋白，则检测所述一抗与所述目标蛋白的结合。
第31项.如第23项所述的方法，其中，将所述不同的试剂溶液顺序地或同时地施加至所述贮存部。
第32项.如第23项所述的方法，其中，所述装置包括附连于所述基部的覆盖件；以及
所述方法还包括：
移除所述覆盖件；
将侧向流动缓冲液和所述基材施加至所述芯吸垫；
将不同的试剂溶液施加至每个所述贮存部中；以及
将所述覆盖件放置在所述基部上，同时允许所述试剂溶液从所述贮存部侧向流动至所述泵。
第33项.一种形成侧向流动装置的方法，所述方法包括：
将由多孔材料构成的芯吸垫与模具对准，其中，所述芯吸垫包括平面区域、第一端、第二端和两个侧向边缘，所述平面区域用于接触包括固定的分析物的基材，并且其中，所述模具包括用于向所述模具施加真空的多个通孔；
将所述芯吸垫顺序地压配到所述模具上，以形成成形的芯吸垫；
向所述模具施加真空以将所述成形的芯吸垫拉紧至所述模具；
将加热到模制和粘结温度的热塑性片材对准并施加至所述成形的芯吸垫；
通过利用所述真空将所述加热的热塑性片材拉紧至所述成形的芯吸垫以形成所述侧向流动装置的基部，来形成所述侧向流动装置，其中，所述基部包括侧向壁，并且所述芯吸垫的所述侧向边缘以彼此无间隙的关系邻接所述基部的所述侧向壁。
第34项.如第33项所述的方法，其中，将所述芯吸垫对准所述模具包括将所述芯吸垫的第一端或第二端分别对准所述模具的第一端或第二端。
第35项.如第33或34项所述的方法，其中，所述芯吸垫被顺序地压配到所述模具中的所述多个凹陷部中。
第36项.如第33-35项中任一项所述的方法，其中，每个所述侧向边缘的在所述芯吸垫的所述第一端附近的一部分具有锯齿形状，并且每个所述侧向边缘的所述部分与所述模具中的所述多个凹陷部对准。
第37项.如第33-36项中任一项所述的方法，还包括在将所述芯吸垫顺序地压配到所述模具上之前将所述芯吸垫锚定到所述模具上。
第38项.如第33-37项中任一项所述的方法，其中，所述热塑性片材的表面积通过加热所述热塑性片材来增大。
第39项.如第33-38项中任一项所述的方法，其中，所述模制和粘结温度至少为玻璃化转变温度。
第40项.如第33-39项中任一项所述的方法，其中，施加所述热塑性片材和拉动所述加热的热塑性片材的步骤是同时执行的。
第41项.如第33-40项中任一项所述的方法，其中，所述成形的芯吸垫包括多个凹陷部。
第42项.如第41项所述的方法，其中，所述多个凹陷部在所述成形的芯吸垫的约第一半部上。
第43项.如第41或42项所述的方法，其中，每个所述凹陷部具有垂直于所述成形的芯吸垫的侧向边缘的较长尺寸。
第44项.如第41-43项中任一项所述的方法，其中，每个所述凹陷部的横截面具有从由v形、半圆形、椭圆形、u形、矩形、正方形和梯形组成的组中选择的形状。
第45项.如第41-44项中任一项所述的方法，其中，所述多个凹陷部是至少两个凹陷部。
第46项.如第33项所述的方法，其中，所述热塑性片材由选自构成以下组的至少一种材料形成：聚对苯二甲酸乙二醇酯、二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚碳酸酯。
第47项.一种形成侧向流动装置的方法，所述方法包括：
将由多孔材料构成的芯吸垫与模具对准，其中，所述芯吸垫包括平面区域、第二端和两个侧向边缘，所述平面区域用于接触包括固定的分析物的基材，并且其中，所述模具包括用于向所述模具施加真空的多个通孔；
顺序地向所述模具施加真空以将所述芯吸垫顺序地拉紧至所述模具，以形成成形的芯吸垫；
将加热到模制和粘结温度的热塑性片材对准并施加至所述成形的芯吸垫；
通过利用所述真空将所述经加热的热塑性片材拉紧至所述成形的芯吸垫以形成所述侧向流动装置的基部，来形成所述侧向流动装置，其中，所述基部包括侧向壁，并且所述芯吸垫的所述侧向边缘以彼此无间隙的关系邻接所述基部的所述侧向壁。
第48项.如第47项所述的方法，其中，将所述芯吸垫对准所述模具包括将所述芯吸垫的第一端或第二端分别与所述模具的第一端或第二端对准。
第49项.如第47或48项所述的方法，其中，顺序地向所述芯吸垫施加真空的步骤包括将所述芯吸垫顺序地拉入所述模具中的多个凹陷部中。
第50项.如第47-49项中任一项所述的方法，其中，每个所述侧向边缘的在所述芯吸垫的所述第一端附近的一部分具有锯齿形状，并且每个所述侧向边缘的所述部分与所述模具中的所述多个凹陷部对准。
第51项.如第47-50项中任一项所述的方法，其中，通过顺序地露出所述模具中的所述通孔来顺序地向所述芯吸垫施加真空。
第52项.如第47-51项中任一项所述的方法，其中，所述热塑性片材的表面积通过加热所述热塑性片材来增大。
第53项.如第47-52项中任一项所述的方法，其中，所述模制和粘结温度至少为玻璃化转变温度。
第54项.如第47-53项中任一项所述的方法，其中，施加第二片材和拉动经加热的第二片材的步骤是同时执行的。
第55项.如第47-54项中任一项所述的方法，其中，所述成形的芯吸垫包括多个凹陷部。
第56项.如第55项所述的方法，其中，所述多个凹陷部在所述成形的芯吸垫的约第一半部上。
第57项.如第55或56项所述的方法，其中，每个所述凹陷部具有垂直于所述成形的芯吸垫的侧向边缘的最长尺寸。
第58项.如第55-57项中任一项所述的方法，其中，每个所述凹陷部的横截面具有从由v形、半圆形、椭圆形、u形、矩形、正方形和梯形组成的组中选择的形状。
第59项.如第55-58项中任一项所述的方法，其中，所述多个凹陷部是至少两个凹陷部。
第60项.如第47项所述的方法，其中，所述热塑性片材由选自构成以下组的至少一种材料组成：聚对苯二甲酸乙二醇酯、二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚碳酸酯。
V.示例－在芯吸垫的侧向边缘与基部的侧向壁之间有间隙和没有间隙的情况下，装置中的侧向流动的比较
该示例示出了有色溶液从侧向流动装置中的贮存部的侧向流动，该侧向流动装置在芯吸垫的侧向边缘与基部的侧向壁之间有间隙(图7A)，与无间隙装置(图7B)。
对于图7A和7B所示的两个装置，首先用侧向流动缓冲液(1％酪蛋白、1X PBS缓冲液、0.1％吐温20)润湿芯吸垫(玻璃纤维)，然后将泵(未示出)放置成与芯吸垫的平面区域下游的芯吸垫接触。通过将二甲苯蓝(Bio-Rad)添加至侧向流动缓冲液来制备蓝色染料溶液。将蓝色染料溶液放入每个装置的贮存部R1中。随着溶液被吸入泵中，R1中的蓝色染料溶液流入芯吸垫。对于在芯吸垫的侧向边缘与基部的侧向壁之间具有间隙侧向流动装置，观察到不均匀的染料流动前端(图7A)，而对于无间隙的侧向流动装置，观察到均匀的染料流动前缘(图7B)。
结果表明，本文中所述的无间隙的侧向流动装置可以将溶液以均匀的流动前缘递送至芯吸垫。
在本说明书中引用的所有专利、专利申请以及其它已公开的参考材料以参见的方式、以它们的全文纳入本文。

Claims (26)

1.一种侧向流动装置，包括：
由多孔材料组成的芯吸垫，所述芯吸垫具有用于接触包含固定的分析物的基材的平面区域；并且
其中，所述芯吸垫具有第一端、第二端和两个侧向边缘；
基部，所述基部包括侧向壁以及在空间上彼此分开的两个或更多个贮存部，
其中，每个所述贮存部接纳所述芯吸垫的所述第一端并与其流体连通；
所述芯吸垫连续地遵循所述基部的轮廓并且完全粘结至所述基部；并且
所述芯吸垫的所述侧向边缘以彼此无间隙的关系邻接所述基部的所述侧向壁；以及
泵，所述泵包括与所述芯吸垫的所述第二端接触的吸收垫。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫的每个所述侧向边缘的一部分包括锯齿形状。
3.如权利要求2所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫的每个所述侧向边缘的包括所述锯齿形状的所述部分位于所述芯吸垫的所述第一端附近，并且与所述基部中的所述贮存部对准。
4.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，所述基部的底表面与所述侧向壁之间的拔模角度为90度或更大。
5.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，所述基部的底表面与所述侧向壁之间的拔模角度为95度。
6.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，一个或多个所述贮存部的长度的尺寸短于宽度。
7.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，一个或多个所述贮存部的长度的尺寸长于宽度。
8.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，所有所述贮存部的最低点位于同一平面上。
9.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，每个所述贮存部是凹陷部。
10.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，每个所述贮存部包括可变长度、可变宽度和深度。
11.如权利要求10所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫跨越所述贮存部的所述可变长度和所述可变宽度。
12.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，每个所述贮存部的横截面具有从由v形、半圆形、椭圆形、u形、矩形、正方形和梯形组成的组中选择的形状。
13.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，所述基部由模制塑料形成。
14.如权利要求1-3中任一项所述的装置，其特征在于，所述贮存部包括在侧向流动装置的宽度轴上在空间上彼此分开并且彼此相邻的两组或更多组贮存部。
15.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫和所述泵由至少一种吸收性材料形成，所述至少一种吸收性材料包括玻璃纤维。
16.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫和所述泵由至少一种吸收性材料形成，所述至少一种吸收性材料包括棉。
17.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫和所述泵由至少一种吸收性材料形成，所述至少一种吸收性材料包括纤维素。
18.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫和所述泵由至少一种吸收性材料形成，所述至少一种吸收性材料包括纤维素纤维衍生物。
19.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫和所述泵由至少一种吸收性材料形成，所述至少一种吸收性材料包括烧结玻璃。
20.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫和所述泵由至少一种吸收性材料形成，所述至少一种吸收性材料包括烧结聚合物。
21.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫和所述泵由至少一种吸收性材料形成，所述至少一种吸收性材料包括烧结金属。
22.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述芯吸垫和所述泵由至少一种吸收性材料形成，所述至少一种吸收性材料包括合成聚合物。
23.如权利要求13所述的装置，其特征在于，所述塑料选自由聚对苯二甲酸乙二醇酯、二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯和聚碳酸酯构成的组。
24.一种用于侧向流动的试剂盒，所述试剂盒包括：
如权利要求1–23中任一项所述的装置。
25.一种执行侧向流动测定的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1-23中任一项所述的装置；
将包含蛋白质的基材施加至所述芯吸垫的用于接触基材的所述平面区域；
将不同的试剂溶液施加至每个所述贮存部中；以及
允许所述试剂溶液从所述贮存部侧向流动至泵，使得所述试剂溶液中的每种试剂在所述芯吸垫中被顺序地输送并接触所述基材上的蛋白质，其中，每种所述试剂溶液都作为一个均匀的流体前缘流过所述芯吸垫。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，将侧向流动缓冲液施加至所述芯吸垫。
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