CN105339795A

CN105339795A - 横向流动印迹试验

Info

Publication number: CN105339795A
Application number: CN201580001151.1A
Authority: CN
Inventors: C·麦基
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2015-02-27
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2035-02-27
Also published as: EP3111215A1; CN105339795B; US20170299587A1; EP3111215B1; US10408830B2; WO2015131142A1; US9671402B2; EP3111215A4; US20150241425A1

Abstract

在横向流动试验中进行分析物检测的方法、组合物和试剂盒。

Description

横向流动印迹试验

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年2月27日提交的美国临时申请61/945,376号的优先权，该文通过引用全文纳入本文用于所有目的。

背景技术

生物科学中经常使用检测固定的分析物的方法。例如，常规印迹(例如，Southern、Northern、Western、FarWestern、Eastern、真空、MiddleEastern、Eastern-Western和Far-Eastern印迹等)可用于检测固定在基材或膜上或基质中的分析物(例如，在琼脂糖或丙烯酰胺中)。一般而言，这类印迹技术涉及固定待检测的分析物和使分析物接触结合试剂(例如，抗体)。印迹也通常在固定和最终检测之间包括多个洗涤步骤和/或封闭步骤。这类洗涤和封闭步骤消耗了实施者有限的时间和/或试剂并且是误差和不可再现性的常见来源。

发明内容

本发明提供了用于检测固定的分析物的改善的方法、组合物和试剂盒。

在一些实施方式中，本发明提供了具有一定长度和宽度并包含试剂储库区和横向流动区的多孔基材，所述试剂储库区包含或以不可透过或疏水性阻隔为边框，所述不可透过或疏水性阻隔基本上封闭了液体从试剂储库区向横向流动区的流动直至引发横向流动。在一些情况中，横向流动区设置成在将横向流动区与试剂储库区接触之后从试剂储库中并沿着横向流动区的长度芯吸一种或多种结合试剂。

在一些实施方式中，多孔基材还包括折叠区，其中定位折叠区使得通过在折叠区折叠多孔基材来引发横向流动，其中在折叠区折叠多孔基材使得至少一部分的试剂储库区接触至少一部分的横向流动区。

在一些方面中，所述试剂储库区包括至少第一试剂储库亚区和第二试剂储库亚区，其中第一和第二试剂储库亚区并不流体连通；并且所述横向流动区包括至少第一横向流动亚区和第二横向流动亚区，其中所述第一和第二横向流动亚区并不流体连通。

在一些情况中，第一试剂储库亚区通过疏水性或不可透过阻隔与第二试剂储库亚区分开。在一些情况中，第一横向流动亚区通过疏水性或不可透过阻隔与第二横向流动亚区分开。在一些情况中，设置各试剂储库亚区使得各亚区可分开接触相应的横向流动亚区。例如，一个或多个试剂储库亚区可在折叠区单独并独立地折叠以接触相应的横向流动亚区。

在一些实施方式中，横向流动亚区和/或试剂储库区包含毛细流动基质。在一些方面中，多孔基材的至少一部分(例如毛细流动基质的至少一部分)与不可透过或疏水性背衬偶联。毛细流动基质可包括纤维素或玻璃纤维。

在一些实施方式中，折叠区包括可见标记物、褶皱或折痕。在一些情况中，折叠区延伸通过多孔基材的宽度。在一些情况中，横向流动区设置成在折叠折叠区之后从试剂储库中并沿着横向流动区的长度芯吸一种或多种结合试剂。

在一些实施方式中，多孔基材的至少一部分是基本上可压缩的。例如，在一些情况中，横向流动区的至少一部分是基本上可压缩的。作为另一个示例，试剂储库区的至少一部分是基本上可压缩的。

在一些实施方式中，试剂储库区包括第一一级结合试剂。试剂储库区也可包括第二一级结合试剂。在一些方面中，试剂储库区的第一和第二一级结合试剂被不可透过或疏水性阻隔分开。

在任意前述的方面、实施方式或情况中，多孔基材的试剂储库区和/或横向流动区可含有蛋白质聚集改性剂。

在一些实施方式中，本发明提供递送蛋白质的方法，所述方法包括：提供包括横向流动区的多孔基材；将多孔基材与包含多种固定的分析物的膜密切接触；并将横向流动区与包含一级结合试剂的试剂储库区接触，从而至少一部分的一级结合试剂芯吸到横向流动区中，其中使得至少一部分的一级结合试剂芯吸到横向流动区引发一级结合试剂流过至少一部分的横向流动区，从而使至少一部分的一级结合试剂接触包含多种固定的分析物的膜。

在一些方面中，该方法还包括引发洗涤溶液通过横向流动区的至少一部分的横向流动。在一些方面中，该方法还包括引发含有二级结合试剂的溶液横向流过横向流动区的至少一部分。在一些情况中，可在引发含有二级结合试剂的溶液横向流过横向流动区的至少一部分的横向流动之后引发洗涤溶液。在一些情况中，可在一级结合试剂的横向流动之后引发洗涤溶液的横向流动。

在一些方面中，包含横向流动区的多孔基材还包含试剂储库区，并且该试剂储库区通过(i)不可透过或疏水性阻隔和(ii)折叠区与横向流动区分开。在一些情况中，其中折叠区延伸通过多孔基材的宽度。在一些情况中，将多孔基材与包含一级结合试剂的试剂储库区接触包括在折叠区处折叠多孔基材。在一些情况中，横向流动区设置成在折叠折叠区之后使一种或多种结合试剂离开试剂储库并沿着横向流动区的长度芯吸。该折叠区可包括可见标记物、褶皱或折痕。在一些情况中，横向流动区的至少一部分、试剂储库区的至少一部分或多孔基材的至少一部分是基本可压缩的。

在一些实施方式中，试剂储库区包括至少第一试剂储库亚区和第二试剂储库亚区，其中第一和第二试剂储库亚区并不流体连通；并且所述横向流动区包括至少第一横向流动亚区和第二横向流动亚区，其中所述第一和第二横向流动亚区并不流体连通。在一些方面中，第一和第二试剂储库亚区可分别与第一和第二横向流动亚区分开接触。例如，一个或多个试剂储库亚区可在折叠区独立地折叠以各自接触相应的横向流动亚区。

在一些情况中，第一试剂储库亚区通过疏水性或不可透过阻隔与第二试剂储库亚区分开，并且第一横向流动亚区通过疏水性或不可透过阻隔与第二横向流动亚区分开。

在一些实施方式中，第一试剂储库亚区包含第一一级结合试剂且第二试剂储库亚区包含第二一级结合试剂。在一些实施方式中，试剂储库区包含蛋白质聚集改性剂。

在该方法的一些实施方式中，多孔基材、多孔基材的至少一部分、试剂储库区、试剂储库区的至少一部分、横向流动区和/或横向流动区的至少一部分包括毛细流动基质。例如，毛细流动基质可包括纤维素或玻璃纤维。在该方法的一些实施方式中，多孔基材、多孔基材的至少一部分、试剂储库区、试剂储库区的至少一部分、横向流动区和/或横向流动区的至少一部分与不可透过或疏水性背衬偶联。

在一些实施方式中，本发明提供包含至少1种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)任意前述多孔基材的试剂盒。在一些情况中，该试剂盒还包含第一和第二一级结合试剂。在一些情况中，该试剂盒还包含具有蛋白质聚集改性剂的容器。在一些情况中，蛋白质聚集改性剂是环糊精。

附图简要说明

图1显示了具有3个分开的试剂储库亚区和3个分开的相应横向流动亚区的多孔基材。这些亚区全部通过疏水性阻隔分开，使得在亚区之间没有结合试剂流动。用不同的结合试剂加载试剂储库亚区以能够检测多种分析物。

图2显示了多孔基材在折叠区处的折叠，使得试剂储库区接触横向流动亚区，从而引发箭头所示方向上的试剂横向流动。这些疏水性阻隔封闭试剂在横向流动期间在横向流动亚区之间的流动。

图3显示了使用本文所述的多孔基材在Western印迹膜上进行分析物多重检测的方法。提供了多孔基材并与含结合的蛋白质(分析物)的Western印迹膜密切接触。在步骤1中，结合试剂(例如，抗体)加载到通过疏水性阻隔划分的自含式试剂储库亚区。在步骤2处，折叠多孔基材使试剂储库和横向流动区之间接触。芯吸使抗体横向流过多孔基材，从而使抗体接触与western印迹膜结合的蛋白质。通过其与结合试剂的结合来检测并鉴定用圆圈表示的固定的蛋0质。检测的分析物在膜上的位置可提供关于分析物种类的其它信息。

发明详述

I.定义

术语“分析物”是指生物分子，例如，蛋白质、核酸、多糖、脂质、抗原、生长因子、半抗原等或其部分。可在表面(如膜)上不可逆地固定分析物并检测，如本文所述。

本文所用的术语“固定”是指可逆或不可逆地固定的分子(例如，结合试剂或分析物)。可逆固定的分子以允许分子或其部分(例如，这些分子的至少25％、50％、60％、75％、80％或更多)从其固定的位置上移去而没有明显变性或聚集。例如，分子可通过将含该分子的溶液与多孔基材接触可逆地固定在多孔基材中或之上，从而吸掉溶液并可逆地固定分子。然后可通过从多孔基材中芯吸溶液，或将溶液从多孔基材的一个区芯吸到另一个区来移去可逆固定的分子。在一些情况中，分子可通过将含该分子的溶液与多孔基材接触可逆地固定在多孔基材上，从而吸掉溶液，然后干燥含溶液的多孔基材。然后可通过将多孔基材接触相同或不同组成的另一种溶液来移去可逆固定的分子，从而溶解可逆固定的分子，然后从多孔基材中芯吸溶液或将溶液从多孔基材的一个区芯吸到另一个区。

固定可逆固定的分子(例如，结合试剂或分析物)使得在温和条件(例如，约4-9的pH，约4-65℃的温度)下它们不被或基本不被从它们的位置上移去。示例性的可逆固定的分子包括通过标准印迹技术(例如，电印迹)与硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯膜结合的蛋白质分析物。

术语“结合试剂”是指特异性结合分子(如分析物)的试剂。本领域已知多种结合试剂，包括抗体、适体、粘合素(affimer)、脂质运载蛋白(如抗运载蛋白)、硫氧还蛋白A、胆汁三烯结合蛋白或含有锚蛋白重复、葡萄球菌蛋白A的Z结构域或纤连蛋白III型结构域的蛋白。

术语“特异性结合”是指分子(如结合试剂如抗体或抗体片段)与靶标结合的亲和性比非靶标化合物高至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍或1000倍或更高。

术语“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其片段，其特异性结合并识别抗原，例如，特定分析物。通常，“可变区”含有抗体的抗原结合区(或其功能性等价物)并且对于结合的特异性和亲和性是至关重要的。参见Paul，FundamentalImmunology(《基础免疫学》)(2003)。

示范性免疫球蛋白(抗体)的结构单元包含四聚体。各四聚体由相同的两对多肽链组成，每对包含一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)分别指这些轻链和重链。

“同种型”是由一类重链恒定区确定的抗体类别。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因。轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，这进而确定了同种型类别，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。

抗体可以完整的免疫球蛋白形式或任何包含特定抗原结合活性的多种已充分表征片段的形式存在。这样的片段可以通过用多种肽酶消化来产生。胃蛋白酶在铰链区中的二硫键以下消化抗体，产生Fab的二聚体F(ab)′₂，Fab本身是由二硫键连接到V_H-C_H1的轻链。可在温和条件下还原F(ab′)₂以打断铰链区中的二硫键，从而将F(ab′)₂二聚体转化为Fab′单体。Fab′单体本质上Fab附带有部分绞链区(参见《基础免疫学》(FundamentalImmunology)，Paul编，第3版，1993年)。虽然根据对完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员会理解，这类片段也可用化学方法或重组DNA方法从头合成。因此，本文中所用术语抗体，也包括通过修饰整个抗体而生成的抗体片段，或用重组DNA方法从头合成所产生(例如，单链Fv)，或使用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见如McCafferty等，Nature348：552-554(1990))。

“单克隆抗体”是指对于抗原上的给定表位具有单一的结合特异性和亲和性的抗体的克隆制备物。“多克隆抗体”是指针对单一抗原产生，具有不同的结合特异性和亲和性的抗体的制备物。

本文使用的“V-区”是指抗体可变区结构域，所述抗体可变区结构域包含构架1、CDR1、构架2、CDR2和构架3的区段，包括CDR3和构架4，其区段是由于B细胞分化中重链和轻链V-区基因的重排而被加入到所述V-区段中。

本文使用的“互补决定区(CDR)”是指在每条链上的三个高变区，其中断由轻链和重链可变区建立的4个“构架”区。CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR一般被称为CDR1、CDR2和CDR3，依次从N末端开始编号，并且也通常由特定CDR位于的链来鉴定。因此，V_HCDR3位于发现V_HCDR3的抗体的重链可变区上，而V_LCDR1是来自发现V_LCDR1的抗体的轻链可变区的CDR1。

不同的轻链或重链的构架区序列在物种内是相对保守的。抗体的构架区即组成轻链和重链的组合的构架区，其用作在三维空间中定位和对齐CDR。

CDR和框架区的氨基酸序列能够采用本领域中熟知的不同定义来确定，例如Kabat，Chothia，国际免疫遗传学数据库(IMGT)和AbM(参见，例如Johnson等，出处同上；Chothia和Lesk，1987，JMol.Biol.196，901-917；Chothia等，(1989)Nature342，877-883；Chothia等，(1992)J.Mol.Biol.227，799-817；Al-Lazikani等，J.Mol.Biol1997，273(4))。在以下文献中也描述了抗原结合位点的定义：Ruiz等，NucleicAcidsRes.，28，219-221(2000)；和LefrancNucleicAcidsRes.1月1日；29(1)：207-9(2001)；MacCallum等，JMol.Biol.，262：732-745(1996)；和Martin等，Proc.NatlAcad.Sci.USA，86，9268-9272(1989)；Martin等，MethodsEnzymol.，203：121-153，(1991)；Pedersen等，Immunomethods，1，126，(1992)；和Rees等，在(In)SternbergM.J.E.(编)，ProteinStructurePrediction(《蛋白结构预测》)，牛津的牛津大学出版社(OxfordUniversityPress，Oxford)，141-1721996)。

“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其部分被改变、替代或交换，从而使抗原结合位点(可变区，CDR或其部分)连接至类型、效应物功能和/或种类不同或变化的恒定区，或连接至赋予所述嵌合抗体新性质的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生长因子、药物等)；或(b)可变区或其部分被具有不同或变化的抗原特异性的可变区(例如，来自不同物种的CDR或框架区)改变、替代或交换。

抗体结合抗原上的“表位”。表位是抗原上的特异性抗体结合相互作用位点，并且可包括几个氨基酸或几个氨基酸的部分，例如，5或6个，或更多，例如20个或更多氨基酸，或这些氨基酸的部分。在一些情况中，表位包括非蛋白质组分，例如，来自糖、核酸或脂质。在一些情况中，表位是三维部分。因此，例如，在靶标是蛋白质的情况中，该表位可由连续氨基酸、或来自蛋白质的不同部分的氨基酸组成，这些部分部分通过蛋白质折叠靠近(例如，不连续或构象表位)。这对于形成三维结构的其它类型的目标分子也是一样的。

II.引言

本文所述的组合物、方法和试剂盒可用于检测与膜结合的分析物。例如，本文所述的是多孔基材。该多孔基材可放置密切接触含有结合的分析物的膜。一种或多种结合试剂横向流过与膜密切接触的多孔基材可使得一种或多种结合试剂结合并从而检测一种或多种膜结合的分析物。该多孔基材可通过不可透过或疏水性阻隔分成2个或更多个亚区，使得在一个亚区中一种或多种分析物的检测不会与另一个亚区中的检测混淆。因此，可使用本文所述的组合物、方法和试剂盒来进行多重检测。在一些情况中，设置多孔基材用于顺序横向流动装置。

III.组合物

A.多孔基材

多孔基材可用于储存一种或多种结合试剂。多孔基材也可用于检测一种或多种固定的分析物。多孔基材具有一定的宽度、长度和高度(例如，厚度)。基质可以是任意大小和形状。在某些实施方式中，多孔基材是平面的，例如，多孔基材可以是或近似矩形平面。在一些情况中，多孔基材的长度和宽度是高度(即厚度)的至少约2倍、5倍、10倍、100倍或更高。在一些实施方式中，多孔基材经剪裁用于印迹设备。例如，多孔基材可经剪裁以将试剂转移通过多孔基材的至少一部分，并从而使该试剂接触具有一种或多种可逆固定其上的分析物的印迹膜。在一些实施方式中，多孔基材具有不可透过或基本不可透过的背衬。

多孔基材的示例性尺寸包括，但不限于至少一个维度为至少约0.25cm、0.5cm、1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、10cm、12cm、15cm、20cm、30cm或更大的多孔基材。矩形平面多孔基材的示例性尺寸包括长度与宽度分别为约1cmx1cm、7x8.4cm、8.5x13.5cm、10cmx15cm或25x28cm的多孔基材。示例性大小还包括8.5cmx9cm、7cmx9cm、8cmx10.7cm、10cmx10cm、7cmx8.5cm、8.3cmx7.3cm、8cmx8cm、8.3cmx13cm、10.8cmx13.5cm。在一些实施方式中，多孔基材的长度为18cm，宽度为10cm。在一些情况中，多孔基材的长度为18±0.5、1、2或3cm，宽度为10±0.5、1、2或3cm。

在一些实施方式中，多孔基材设置成具有高溶液容量和横向流速。在一些情况中，通过使多孔基材具有明显高度(如厚度)来提供高溶液容量和横向流速。在一些情况中，多孔基材的厚度是约10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或约0.2mm。在一些情况中，多孔基材的厚度是约0.05mm至约0.5mm。

多孔基质通常由于存在很多孔而具有大表面积。大表面积可增加多孔基材对一种或多种试剂或者一种或多种含试剂的溶液的加载容量。在一些实施方式中，与相同材料和尺寸的非多孔基材相比，多孔基材或其部分，如横向流动区或试剂储库区具有大表面积。例如，与相同材料和大小的非多孔基材相比，多孔基材的表面积增至至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、100、200、300、500、1000倍或更多倍。在一些实施方式中，多孔基材或其部分，如横向流动区或试剂储库区具有大的比表面积。例如，按标准技术所测，多孔基材的比表面积可以是至少约0.1m²/g、0.5m²/g、1m²/g、10m²/g或更多。

在一些实施方式中，多孔基材或其部分，如横向流动区或试剂储库区具有对结合试剂(如抗体)的高特异性结合容量。例如，一些情况中，多孔基材能够每mg基质材料可逆固定至少约0.1mg、0.5mg、1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、40mg、60mg、100mg或更多结合试剂。

在一些实施方式中，多孔基材可具有特定孔径，特定平均孔径或特定孔径范围。例如，多孔基材可含有0.1μm孔、0.2μm孔、0.45μm孔或1、2、4、5、6、7、8、10、15、20μm孔或大于约20μm的孔。又例如，多孔基材可含有平均大小0.1、0.2、0.45、1、2、4、5、6、7、8、10、15或20μm或更大的孔。再例如，多孔基材可含有大小范围约0.1-8μm、0.2-8μm、0.45-8μm、1-8μm、0.1-4μm、0.1-2μm、0.1-1μm、0.1-0.45μm、0.2-8μm、0.2-4μm、0.2-2μm、0.2-1μm、0.2-0.45μm、0.45-8μm、0.45-4μm、0.45-2μm、0.45-1μm的孔。一些情况中，多孔基材可含有小于20μm的孔。例如，多孔基材可由其中至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多的孔小于约20、15、10、5μm的材料组成。一些情况中，孔足够大，能够容纳一般大小(例例，约1nm)的一或多个蛋白质。例如，孔的大小可以是至少1nm、至少5nm，至少10、100或500nm。或者，至少约50％、60％、70％、80％、90％或更多的孔可以大于1、5、10、50、100或500nm更大。如本文所用，孔径可按半径或直径测定。在一些情况中，多孔基材含有多孔聚乙烯，如孔径0.1至20微米，或1至12微米的多孔聚乙烯。多孔基材可在基材的不同区中有不同的孔径。例如，试剂储库区可具有一定的孔径或孔径范围，而横向流动区可具有不同的孔径或孔径范围。

可对基材进行处理或官能化以最小化非特异性试剂结合、增加横向流动、增加芯吸，或者减少蛋白质聚集。例如，基材或其部分可被处理以改变受处理区域的亲水性或疏水性。在一些情况中，改变多孔基材的亲水性或疏水性可在基材湿时增加结合试剂加载量、减少结合试剂聚集或变性、产生掩蔽区(其中排除或不加载结合试剂)，或引导结合试剂流动。在一些情况中，多孔基材含有本文所述的蛋白质聚集改性剂。

多孔基材可被标识或标注以记录可逆固定的结合试剂(如一抗)的来源、组成或位置。例如，一或多个含有可逆固定的结合试剂的区可以肉眼可见，使得本领域技术人员能确定可逆固定的结合试剂的位置。在一些情况中，多孔基材的一部分上可印刷、冲压或者显示结合试剂的名称(如抗-磷酸PIK3)、种类(如目录号)、量、货号等。在一些情况中，标记或标注基材使得可分辨用于印迹装置，例如顺序横向流动毛细装置的合适取向。

多孔基材可包括但不限于含聚合物的基材。聚合物可以是聚合物珠、聚合物膜或聚合物整料的形式。一些情况中，聚合物是纤维素。含纤维素的基质包括纸、布、织造或非织造纤维素基质。布料基质包括含有天然纤维素纤维如棉或羊毛的那些。纸基质包括含有天然纤维素纤维(例如，纤维素或再生纤维素)的那些以及含有纤维素纤维衍生物的那些，所述衍生物包括但不限于：纤维素酯(例如，硝酸纤维素，乙酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸-丙酸纤维素、乙酸-丁酸纤维素和硫酸纤维素)，和纤维素醚(例如，甲基纤维素、乙基纤维素、乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素和羧甲基纤维素)。一些情况中，纤维素基质含有人造丝。一些情况中，基质是纸，例如各种纸。

多孔基材也可包括，但不限于含有烧结材料的基材。例如，基材可含有烧结玻璃、烧结聚合物或烧结金属，或其组合。在一些情况中，通过烧结一种或多种粉状玻璃、粉状聚合物或粉状金属来形成烧结材料。其它情况中，通过烧结一种或多种玻璃、金属或聚合物纤维来形成烧结材料。其它情况中，由烧结一种或多种玻璃、聚合物或金属珠来形成烧结材料。

多孔基材还可含有但不限于一种或多种非纤维素聚合物，例如合成聚合物、天然聚合物或半合成聚合物。例如，基材可含有聚酯，例如聚乙交酯、聚乳酸、聚己内酯、聚己二酸乙二醇酯、聚羟基烷酸酯、聚羟基丁酸酯、3-羟基丁酸-共聚-3-羟基戊酸、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚对苯二甲酸1，3-丙二酯、萘二甲酸乙二醇酯、一些情况中，基材是纺粘的，例如纺粘聚酯。

其它合成聚合物包括但不限于：尼龙、聚丙烯、聚乙烯(polyethylene)、聚苯乙烯、二乙烯基苯、聚乙烯(polyvinyl)、聚二氟乙烯、高密度聚二氟乙烯、(C₂-C₆)单烯烃聚合物、乙烯基芳族聚合物、乙烯基氨基芳族聚合物、卤乙烯聚合物、(C₁-C₆)烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酰胺聚合物、乙烯基吡咯烷酮聚合物、乙烯基吡啶聚合物、(C₁-C₆)羟烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酸聚合物、丙烯酰胺基甲基丙磺酸聚合物、含N-羟基的(C₁-C₆)烷基(甲基)丙烯酰胺聚合物、丙烯腈或前述任意物质的混合物。

多孔基材也可含有，但不限于一种或多种多糖。示例性多糖包括含有纤维素、琼脂糖、直链淀粉、几丁质、壳聚糖、半乳糖胺、凝乳聚糖、右旋糖苷、木糖醇、菊糖及其衍生物如酯、苯基氨基甲酸酯、烷基氨基甲酸酯和苄基氨基甲酸酯的那些。一些情况中，多糖可以是交联的。例如，多孔基材可包括琼脂糖或交联的琼脂糖。一些情况中，基材可包括多糖与基质的其它组分之间的交联。

多孔基材也包括但不限于，本文所用的毛细芯吸床和材料。例如，基材可包括薄层色谱板或可由本领域已知的任意薄层色谱基质形成。本领域已知的薄层色谱基质包括但不限于：二氧化硅，使用C₄、C₈或C₁₈烷基基团衍生化的二氧化硅，以及氧化铝。多孔基材也可含有但不限于玻璃、玻璃纤维、纤维玻璃、天然或合成的海绵、二氧化硅、氧化铝或其衍生物。在一些情况中，玻璃纤维是玻璃纤维衍生物。在一些情况中，多孔基材含有玻璃纤维和另一种多孔材料，如纤维素、纤维素衍生物和/或聚酯。

在上述基质材料以外，基材还可含有前文所述的任意组合。一些情况中，基材可含有复合材料，其包括上述材料的组合。例如，基材可在合成聚合物基质中含有玻璃或二氧化硅纤维。作为另一个示例，多孔基材可含有塑料背衬的玻璃纤维或塑料背衬的硝酸纤维素。可含有多孔基材的其它合适的材料包括任意的Jallerat和Thom，FilterMembranesandBioseparationEquipmentandSupplies(滤膜和生物分离设备和供应)，IVDTechnology(2004年10月)中所述的材料或其组合，或者任意的美国专利号4,632,901，或美国专利申请号2010/0239459和2013/0164193中所述的材料。在一些实施方式中，多孔基材的一个或多个区或其部分是基本上可压缩的。如本文所用，基本上可压缩是指在施加的压缩材料的压力下保留结构刚性的材料。例如，基本上可压缩的多孔基材可沿着至少一条轴压缩，使得压缩的轴的长度减少至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、33％、40％、50％、60％、66％、75％、80％、90％或更多，而不损失结构完整性。

在一些实施方式中，多孔基材设置成能够通过横向流动装置(例如，顺序横向流动装置)中的横向流来检测一种或多种分析物。例如，多孔基材可用于通过在顺序横向流动装置中的横向流动来使一种或多种结合试剂接触一种或多种结合膜的分析物。在一些情况中，顺序横向流动装置是被动顺序横向流动装置。示例性的被动顺序横向流动装置描述于美国专利申请号2010/0239459和2013/0164193。

多孔基材可适于储存。例如，多孔基材可储存至少约1天、3天、7-10天、至少约1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长。在一些情况中，多孔基材可储存(例如，在约4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、22、25、30、35或37℃或更高温度下)至少约1天、3天、7-10天、至少约1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长。多孔基材可以干态、基本干态或湿态储存。在一些情况中，一部分的多孔基材以干态或基本干态储存，而一部分以湿态储存。在一些情况中，一部分的多孔基材以干态储存，而一部分以基本干态储存。多孔基材可储存，然后从储存中移去，任选地重建，然后如本文所述提供以检测一种或多种膜结合的分析物。

多孔基材可适于储存结合试剂。例如，一种或多种结合试剂可与多孔基材接触(例如，多孔基材的接触试剂储库区或亚区)并且然后储存多孔基材(例如，储存至少约1天、3天、7-10天、至少约1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长)。然后可使用储存的多孔基材和一种或多种结合试剂来检测与膜结合的一种或多种分析物。在一些情况中，在储存之前，结合试剂在多孔基材上经干燥或基本干燥。可在用于检测膜结合的分析物期间或之前通过接触水性溶液重建干燥或基本干燥的结合试剂。

i.试剂储库区和横向流动区

多孔基材可具有试剂储库区和横向流动区。在一些实施方式中，试剂储库区是一种或多种结合试剂(例如，一种或多种一抗和/或一种或多种二抗)的储库。在一些实施方式中，横向流动区是设置成从试剂储库区中并通过横向流动区或其部分芯吸一种或多种结合试剂或其部分的多孔基材。多孔基材的试剂储库区可通过阻隔与多孔基材的横向流动区分开，使得横向流动区直至引发横向流动时才从试剂储库区中芯吸溶液或试剂。这类阻隔包括本文另外所述的疏水性或不可透过阻隔。

在一些实施方式中，试剂储库区含有可逆固定的结合试剂，如抗体。在一些情况中，可逆固定的结合试剂以干态或基本干态存在于试剂储库区之上或其中。在其它实施方式中，可逆固定的结合试剂以溶液存在于试剂储库区之上或其中。在一些情况中，试剂储库区是海绵、吸附剂或可逆含有或可以可逆含有结合试剂(例如，在溶液中、干态或基本干态)的吸附剂。在一些实施方式中，试剂储库区设置成与含有结合试剂的溶液接触从而可逆固定结合试剂。在一些实施方式中，试剂储库区设置成与含有结合试剂的溶液接触然后干燥或基本干燥，从而可逆固定结合试剂。

在一些实施方式中，试剂储库区由与横向流动区相同的材料组成。在其它实施方式中，试剂储库区由与横向流动区不同的材料组成。例如，试剂储库区和横向流动区可具有不同的孔径、厚度、组成等。在一些情况中，试剂储库区与横向流动区的宽度相同或基本相同。在一些情况中，试剂储库区与横向流动区的高度相同或基本相同。在其他实施方式中，试剂储库区比横向流动区更厚，并因此有更大的高度(例如，非压缩状态下更大的高度)。例如，试剂储库区可以比横向流动区厚至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.7、2.0、2.2、2.5、3倍或更多。在一些实施方式中，试剂储库区比横向流动区薄。

在一些实施方式中，试剂储库区具有2个或更多个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个)试剂储库亚区。在一些情况中，2个或更多个试剂储库亚区能够检测多种分析物。例如，一个试剂储库亚区可用于可逆固定检测第一分析物的第一一级结合试剂，且第二试剂储库区可用于可逆固定检测第二分析物的第二一级结合试剂等。在一些实施方式中，试剂储库亚区的数量决定了可在单次印迹实验中检测到的不同分析物的数量。例如，特异性结合不同分析物的不同一级结合试剂可与各试剂储库亚区接触，或存在于各试剂储库亚区中。替代地，如果预期待检测的分析物可逆固定在膜的不同位置上，可在单个试剂储库区或亚区中使用多种一级结合试剂(例如，2、3、4或更多种)。可由疏水性或不可透过阻隔分隔试剂储库亚区，使得一个亚区中的检测试剂不从一个试剂储库亚区迁移、芯吸或流动到另一个吸收储库亚区。

在一些实施方式中，含有至少2个或更多个试剂储库亚区的多孔基材具有相应数量的横向流动亚区。在一些情况中，相应横向流动亚区直到引发横向流动时才流体连通。例如，试剂储库和横向流动亚区可通过疏水性或不可透过阻隔与它们的相应亚区分开。因此，在引发横向流动之后，各试剂储库亚区中的结合试剂或其部分流过相应横向流动亚区的至少一部分。可由疏水性或不可透过阻隔分隔横向流动亚区，使得一个亚区中的一级或二级结合试剂不从一个横向流动亚区迁移、芯吸或流动到另一个横向流动亚区。

图1是具有试剂储库区和横向流动区的多孔基材的一个示例性实施方式，各区由疏水性阻隔分隔成多个亚区。在图1中，用三种不同的结合试剂加载试剂储库区，其各自由疏水性阻隔互相分开。试剂储库区也各自由疏水性阻隔与它们相应的横向流动亚区分开。如图2所示，将试剂储库区与横向流动区接触(例如，通过折叠)引发横向流动。因此，如本文所示，可通过三种不同的结合试剂检测(例如，平行检测)至少三种不同的膜结合分析物。然而，应理解除3以外的数量(例如，2、4、5、6、7、8等)也可类似地平行运行。

在一些情况中，多孔基材含有液体槽。液体槽是具有明显大于横向流动区的液体吸附能力的多孔基材的组件。在一些实施方式中，液体槽经设置使得在引发横向流动之后，液体从试剂储库区流向横向流动区并流到液体槽中。在一些情况中，液体槽是多孔基材的整体组件。在一些情况中，液体槽是多孔基材的不同组件。在一些情况中，液体槽设置为或包含促进横向流动通过横向流动区的速率的材料。在一些实施方式中，与横向流动区相比，液体槽包含相同的材料。在一些实施方式中，与横向流动区相比，液体槽包含不同的材料。液体槽可由本文所述的任意多孔基材或其组合组成。在一些情况中，液体槽更厚(例如，比横向流动区厚至少约1.1、1.2、1.3、1.5、1.7、2.0、2.2、2.5、3倍或更多)。

ii.折叠区

在一些实施方式中，多孔基材含有折叠区。通常，折叠区位于或设置成使得试剂储库区或其部分接触横向流动区或其部分，从而引发横向流动。折叠区可延伸多孔基材或其部分的宽度。在一些情况中，折叠区位于试剂储库区内或与之相邻。在一些情况中，折叠区位于横向流动区内或与之相邻。在一些情况中，折叠区位于试剂储库区和横向流动区之间。在一些情况中，折叠区位于试剂储库区和横向流动物之间的不可透过或疏水性阻隔中或与之相邻。在一些情况中，折叠区经划分。在一些情况中，划分是视线或其它识别折叠区的位置或大概位置的标记物。在一些情况中，划分是多孔基材的折痕或褶皱。

iii.阻隔

多孔基材可含有一个或多个阻隔，如一个或多个疏水性阻隔或者一个或多个不可透过阻隔。在一些情况中，多孔基材在试剂储库区和横向流动区之间有一个或多个阻隔。在一些情况中，多孔基材在试剂储库亚区和另一个试剂储库亚区之间有一个或多个阻隔。在一些情况中，多孔基材在横向流动亚区和另一个横向流动亚区之间有一个或多个阻隔。在一些情况中，多孔基材在一个或多个试剂储库亚区和一个或多个横向流动亚区之间有一个或多个阻隔。在一些实施方式中，一个或多个多孔基材阻隔抑制、消除或基本消除相邻区或亚区之间的流体连通(例如，流动)。在一些情况中，一个或多个多孔基材阻隔抑制、消除或基本消除相邻区或亚区之间的流体连通(例如，流动)直至引发横向流动。

合适的阻隔包括疏水性阻隔(如蜡阻隔)或由多孔基材的气相或液相硅烷化形成的阻隔。合适的阻隔也包括不可透过阻隔，如包含塑料、聚合物或树脂的阻隔。在一些情况下，该不可透过阻隔是支持亲水性转移片材的框架，该转移片材悬浮于框架内。在一些情况下，该阻隔由疏水性(如蜡或硅烷化纤维素)和不可透过阻隔的组合构成。例如，在一些情况下，多孔基材被不可透过(如塑料或树脂)阻隔框架围绕并由蜡或硅烷化纤维素阻隔进一步细分。

用于形成蜡阻隔的蜡可以是在温度升高时可流动且在室温(例如，约20-25℃)下不可流动的任何蜡。示例是石蜡、微结晶蜡、热固性蜡、动物蜡(如蜂蜡、羊毛脂和牛油)、植物蜡(如大豆蜡、巴西棕榈蜡、坎台里蜡和棕榈蜡)、矿物蜡(如纯地蜡和褐煤蜡)、石油蜡和合成蜡(如烯键式聚合物、氯化萘和费-托蜡(Fischer-Tropschwax))。除了正链烷烃和异链烷烃以外，石蜡组合物可含有少量的环烷烃或烯烃，或同时含有少量的环烷烃和烯烃。可使用的蜡在约60℃至约150℃，或约75℃至约125℃的温度范围内变得可流动(即具有熔点)。表现出这种方式的蜡制剂和组合物是本领域技术人员已知的。

用于形成疏水性阻隔的硅烷化试剂可以是与多孔基材或其部分发生反应的任意硅烷化试剂。例如，如果多孔基材含有纤维素，可使用硅烷化纤维素骨架的羟基的硅烷化试剂。示例性的硅烷化试剂包括，但不限于，三甲基氯硅烷、三甲基硅烷或六甲基二硅氮烷。硅烷化试剂还包括三乙氧基硅烷(R-Si(C₂H₅O)₃)，其中R是例如乙烯基、甲基丙烯酰基、氨基丙基、氟烷基或硫代乙基。其它合适的硅烷化试剂对于本领域技术人员是显而易见的。

可向多孔基材的一侧或两侧施加蜡或其它阻隔形成试剂(例如，硅烷化试剂或不可透过阻隔)，虽然在大多数情况中，向一侧施加将足够使得多孔基材透过、或使透过(例如，通过施加后的熔化)，多孔基材在一定程度上足以用作液体流动的阻隔。可以液体施加阻隔形成试剂。可通过手动或其它设备施加液体。在一些情况下，将该液体喷涂或倒在多孔基材上。可用喷墨打印机或类似设备来完成喷涂。在一些情况下，该液体在施涂后硬化以形成不可透过和/或疏水性阻隔。替代地，可以气体施加阻隔形成试剂。例如，硅烷化试剂、蜡、塑料、树脂或聚合物可作为气体施涂，其在多孔基材上冷凝或与多孔基材发生反应。替代地，可以固体施加阻隔形成试剂。例如，可手动或自动化或机器化的方式作为固体施涂蜡。在一些情况中，掩蔽多孔基材以保护各区免于接触阻隔形成试剂，并且阻隔形成试剂与多孔基材接触。

蜡的施涂可通过手(使用常规的蜡笔(crayon)或蜡钢笔(waxpen))或通过蜡印刷机(waxprinter)实现。蜡钢笔是本领域已知的且通常包括具有含有热蜡的容器、喷嘴和把手的外壳。通过倾斜外壳使液化的蜡通过喷嘴来施加热蜡，并且外壳装配阀门以在印刷线末端处停止蜡的流动。蜡印刷机同样是本领域已知的且通常通过使用印刷头的热转移印刷来运行，该印刷头包括非常小的加热元件阵列，其受软件控制独立激活以对蜡进行局部加热至高于其熔点，从而将蜡释放至印刷介质。市售可得的蜡印刷机的示例包括Phaser8560DN(日本的富士施乐有限公司(FujiXerox，Ltd.))和CALCOMPCOLORMASTERPLUS热蜡转移印刷机(美国加利福尼亚州福特希尔兰奇的数控绘图有限公司(CalCompGraphics，LLC))。蜡印刷机及其用途的描述可参见Kroon(泰克公司(Tektronix，Inc.))的美国专利号5,957,593(1999年9月28日)；Lin(施乐公司(XeroxCorporation))的美国专利号8,206,664(2012年6月26日)；Lu，Y.，等，“Rapidprototypingofpaper-basedmicrofluidicswithwaxforlow-cost，portablebioassay(用于低成本便携式生物试验的使用蜡的纸基微流体快速原型制作)”Electrophoresis2009，30，1497-1500；以及Carrilho，E.，等，“UnderstandingWaxPrinting：ASimpleMicropatterningProcessforPaper-BasedMicrofluidics(理解蜡印刷机：用于纸基微流体的简单微成像过程)”Anal.Chem.，2009，81(16)，7091-7095。施涂的蜡线宽度(加热前)可变化并且在本发明中不重要，前提是该线中蜡的含量足以透过多孔基材并对多孔基材内流体的横向流动形成阻隔。

在一些实施方式中，一旦施涂，即可通过将蜡加热至其熔点以上来使蜡透过多孔基材的厚度以填充各孔并对水性流体流动形成侧向阻隔。在一些情况中，施涂的蜡的含量应完全透过片材的厚度，并且蜡熔化时熔化的蜡的侧向流动(即与片材的平坦表面平行的方向)是最小的或至少限于沿所施涂蜡线长度基本均匀的较小距离，使得形成的以蜡阻隔为边界的区域是已知且受控制的。也可通过加热程度，包括蜡加热的温度和加热持续的时间长度来控制以这种方式形成的阻隔。通过常规反复试验可容易地确定最佳温度和持续时间，但在大多数情况下可通过加热至高于蜡熔点至少5℃(且在许多情况下高于蜡熔点约5至约50℃或高于蜡熔点约10至约30℃)来获得有用的结果。最适当的加热时间取决于温度，温度越高所需时间越短。通常，约15秒至约20分钟(或在许多情况下为约30秒至约10分钟)的加热时间可提供有用的结果。可通过常规手段，包括辐射加热、导电加热、对流加热、脉冲加热和微波加热来实现加热。可用加热板或常规烘箱那么简单的设备来实现有效结果。

疏水性或不可透过阻隔的最佳宽度可根据以阻隔为边界的区域大小以及多孔基材的厚度变化，且可容易地通过常规测试确定。在大多数情况下，该宽度的范围将是约10微米至约5mm，约30微米至约3mm，约100微米至约1mm，或约200微米至约5mm，或10mm。

B.检测试剂

i.结合试剂

本文描述结合试剂用于检测分析物。在一些情况中，结合试剂是抗体(例如，一抗或二抗)。一抗可用于结合分析物。在一些情况中，一抗经标记使得能够检测一抗并因此检测分析物。在一些情况中，通过结合至标记的二级结合试剂，如标记的二抗来检测一抗。在一些情况中，使用三级结合试剂来检测含有分析物和一级结合试剂以及二级结合试剂的复合物。

在一些实施方式中，多孔基材含有多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个)试剂储库亚区，以及相应数量的结合试剂(例如，一级结合试剂如一抗)。在一些情况中，多孔基材含有多种一级结合试剂并且这些一级结合试剂的不同之处在于它们各自检测不同的分析物。在一些情况中，一种或多种一级结合试剂的相同之处在于它们检测相同的分析物。在一些情况中，多孔基材含有比试剂储库亚区少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个的结合试剂。在一些情况中，向消费者或终端用户提供含有多个试剂储库亚区的多孔基材并且消费者或终端用户使一种或多种结合试剂与试剂储库接触。

可在多孔基材之上或其中提供结合试剂，或可分开供应。在一些情况中，多孔基材含有一种或多种在其上干燥的结合试剂。可通过将试剂储库区与水溶液接触来重建干燥的结合试剂。在一些情况中，水性重建缓冲剂可含有一种或多种再润湿的试剂，如盐、缓冲剂或蛋白质聚集改性剂，如本文所述。替代地，结合试剂可以溶液形式存在于多孔基材中。在一些情况中，在多孔基材(例如，试剂储库区)中储存结合试剂。例如，结合试剂可以干态、基本干态或溶液在多孔基材中储存至少约1天、3天、7-10天、至少约1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长。在一些情况中，结合试剂和多孔基材适于储存(例如，在约4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、22、25、30、35或37℃或更高温度下)至少约1天、3天、7-10天、至少约1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长。

ii.标记物

可通过检测与结合试剂连接的标记物来检测分析物。该标记物可直接连接至结合试剂(例如通过共价键)或可以间接连接(例如使用螯合剂或接头分子)。术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中同义使用。在一些实施方式中，各标记物(如连接至第一结合试剂的第一标记物、连接至第二结合试剂的第二标记物等)生成可检测信号且这些信号(例如第一标记生成的第一信号、第二标记生成的第二信号等)是可区分的。在一些实施方式中，两种或更多种结合试剂标记物包含相同类型的试剂(例如作为第一标记物的第一荧光剂和作为第二标记物的第二荧光剂)。在一些实施方式中，两种或更多种结合试剂标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号，该可检测信号是在一种或多种标记物不存在时无法生成的。

可检测标记的示例包括但不限于：生物素/链霉亲和素标记、核酸(例如寡核苷酸)标记、化学反应性标记、荧光标记、酶标记、放射性标记、量子点、聚合物点、质量标记、胶体金及其组合。在一些实施方式中，标记可包括光学试剂，如生色团、荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。多种试剂(如染料、探针或指示剂)是本领域已知的并可用于本发明。(参见例如英杰公司(Invitrogen)，TheHandbook-AGuidetoFluorescentProbesandLabelingTechnologies(《手册——荧光探针和标记技术指导》)，第10版(2005))。生色团包括具有可测吸光的辅酶和辅因子。一些情况中，可通过检测肽键在例如220或280nm处的固有吸光来检测结合试剂。

荧光剂可包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于：花青、酞菁、卟啉、吲哚菁、若丹明、吩噁嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素(例如FITC、5-羧基荧光素和6-羧基荧光素)、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明(例如TAMRA、TMR和若丹明红)、吖啶、蒽醌、硫族吡喃鎓(chalcogenopyrylium)类似物、氯、萘菁、次甲基染料、方菁染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷型染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青、BODIPY^TM和BODIPY^TM衍生物，及其类似物。在一些实施方式中，荧光剂是AlexaFluor染料。在一些实施方式中，荧光剂是聚合物点或量子点。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自英杰/分子探针公司(Invitrogen/MolecularProbes)(俄勒冈州尤金市)和皮尔斯生物技术公司(PierceBiotechnology，Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)的那些。在一些实施方式中，该光学试剂是插入染料。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种结合试剂各自标记有光学试剂如荧光剂(例如第一结合试剂标记有第一荧光标记物，第二结合试剂标记有第二荧光标记物等)，且通过检测该光学试剂生成的信号(例如荧光标记物生成的荧光信号)来检测标记有光学试剂的各结合试剂。在一些实施方式中，所有结合试剂都标记有光学试剂，且带有光学试剂标记的各结合试剂都通过检测该光学试剂生成的信号来测得。

在一些实施方式中，该标记物是放射性同位素。放射性同位素包括放射性核素，其发射γ射线、正电子、β和α粒子和X射线。合适的放射性核素包括但不限于：²²⁵Ac、⁷²As、²¹¹At、¹¹B、¹²⁸Ba、²¹²Bi、⁷⁵Br、⁷⁷Br、¹⁴C、¹⁰⁹Cd、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、¹⁸F、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、³H、¹⁶⁶Ho、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³⁰I、¹³¹I、¹¹¹In、¹⁷⁷Lu、¹³N、¹⁵O、³²P、³³P、²¹²Pb、¹⁰³Pd、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁴⁷Sc、¹⁵³Sm、⁸⁹Sr、^99mTc、⁸⁸Y和⁹⁰Y。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种结合试剂各自标记有放射性同位素(例如第一结合试剂标记有第一放射性同位素标记，第二结合试剂标记有第二放射性同位素标记等)，且标记有放射性同位素的各结合试剂通过检测该放射性同位素生成的放射性来测得。例如，一种结合试剂可标记有γ发射子，而一种结合试剂可标记有β发射子。或者，这些结合试剂可标记有以可辨识性不同能级发射同一粒子(例如，α、β或γ)的放射性核素。在一些实施方式中，所有结合试剂都标记有放射性同位素，且各带标记结合试剂可通过检测该放射性同位素生成的放射性来测得。

在一些实施方式中，标记物是酶，并通过检测该酶生成的产物来检测结合试剂。合适的酶的示例包括但不限于：脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。例如，辣根过氧化物酶检测系统可与生色底物四甲基联苯胺(TMB)联用，其在过氧化氢存在下产生在450nm处可检测的可溶产物。碱性磷酸酶检测系统可与生色底物对硝基苯基磷酸盐联用，其产生405nm处易测的可溶性产物。β-半乳糖苷酶检测系统可与生色底物邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)联用，产生在410nm可测的可溶性产物。脲酶检测系统可与底物如脲溴甲酚紫(西格玛免疫化学品公司(SigmaImmunochemicals)，密苏里州圣路易斯)联用。在一些实施方式中，2、3、4、5或更多种结合试剂各自标记有酶(例如第一结合试剂标记有第一酶，第二结合试剂标记有第二酶等)，且标记有酶的各结合试剂通过检测该酶生成的产物来测得。在一些实施方式中，所有结合试剂都标记有酶，且带有酶标记的各结合试剂都通过检测该酶生成的产物来测得。

在一些实施方式中，该标记物是亲和标签。合适的亲和标签的示例包括但不限于：生物素、肽标签(如FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Strep标签、eXact标签)和蛋白质标签(如GST标签、MBP标签、GFP标签)。

在一些实施方式中，该标记物是核酸标记物。合适的核酸标记物的示例包括但不限于：寡核苷酸序列、单链DNA、双链DNA、RNA(如mRNA或miRNA)或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中，该核酸标记物的长度是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。

在一些实施方式中，该标记是核酸条码。如本文所用“条码”是专一限定带标记分子的或带标记结合试剂上结合的第二分子的短核苷酸序列(例如，长至少约4、6、8、10或12个核苷酸)。条码序列的长度决定能区分多少独特性样品。例如，4个核苷酸的条码能区分不多于4⁴即256个样品；6个核苷酸的条码能区分不多于4096个不同样品；而8个核苷酸的条码能标引不多于65,536个不同样品。本领域熟知条码技术的应用，参见例如KatsuyukiShiroguchi等DigitalRNAsequencingminimizessequence-dependentbiasandamplificationnoisewithoptimizedsingle-moleculebarcodes(数字式RNA测序用优化的单分子条码降低序列依赖性偏置和扩增噪音)，PNAS(2012)和Smith，AM等NucleicAcidsResearchCan11，(2010)。

在一些实施方式中，该标记物是“点击”化学部分。点击化学使用简单稳健的反应(如铜催化的炔和叠氮化物的环加成)来建立分子间连接。对于点击化学的综述，参见Kolb等，AgnewChem40：2004-2021(2001)。在一些实施方式中，点击化学部分(如叠氮化物或炔部分)可使用另一种可检测标记(例如带荧光标记、生物素化或放射性标记的炔或叠氮化物部分)来检测。

接合可检测标记物与结合试剂如蛋白质(例如，抗体)的技术是熟知的。例如，常见蛋白标记技术的综述可参见BiochemicalTechniques：TheoryandPractice(《生物化学技术：理论和实践》)，JohnF.Robyt和BernardJ.White，维弗兰德出版公司(WavelandPress，Inc.)(1987)。其他标记技术综述于，例如，R.Haugland，ExcitedStatesofBiopolymers(《生物聚合物的兴奋状态》)，Steiner编，普莱南出版社(PlenumPress)(1983)；FluorogenicProbeDesignandSynthesis：ATechnicalGuide(《荧光探针设计与合成：技术指南》)，PE应用生物系统公司(PEAppliedBiosystems)(1996)；以及G.T.Herman，BioconjugateTechniques(《生物偶联技术》)，学术出版社(AcademicPress)(1996)。

在一些实施方式中，两种或更多标记(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号，该可检测信号在所述多种标记物缺失其一或其中多个时不会生成。例如，在一些实施方式中，各标记物是酶，且这些酶的活性联合生成可检测信号来指示标记物(并因此指示各带标记的蛋白质)的存在。联合生成可检测信号的酶的示例包括成对的试验，例如使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的成对试验；以及针对与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-D-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶试验偶联的NAD(P)H的化学发光试验。参见例如，Maeda等，JBioluminChemilumin1989，4：140-148。

C.蛋白质聚集改性剂

本文所述的是蛋白质聚集改性剂。可采用蛋白质聚集改性剂来减少或消除在多孔基材上储存或从中递送的结合试剂如蛋白质(例如，抗体)的聚集或变性。例如，可采用蛋白质聚集改性剂来减少或消除多孔基材的试剂储库区中储存或从中递送的一抗的聚集或变性。在一些情况中，可采用蛋白质聚集改性剂来促进结合试剂在多孔基材的横向流动区中的横向流动。

在一些情况中，作用为将蛋白质置换出气水界面并由此保护蛋白质免于变性和聚集的那些蛋白质聚集改性剂对于减少固定在多孔基材上的结合试剂的聚集特别有效。在其它情况中，蛋白质聚集改性剂通过结合结合试剂和/或稳定结合试剂而直接影响结合试剂的稳定性。在其他情况中，蛋白质聚集改性剂的作用为使平衡移离变性或解折叠状态并由此减少聚集。例如，在一些情况中，由于结合试剂的酰胺主链与蛋白质聚集改性剂之间的强排斥，蛋白质聚集改性剂和结合试剂之间的相互作用是热力学上不利的。因此，蛋白质聚集改性剂存在时不利于结合试剂的解折叠，因为解折叠将更多的酰胺主链表面暴露于蛋白质聚集改性剂。

蛋白质聚集改性剂可以是以下一种或多种：环糊精、非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、两性离子表面活性剂、非去污剂磺基甜菜碱、简单糖、多糖、多元醇、有机溶剂、聚集改性蛋白质、无序肽序列、氨基酸、氧化还原剂、冻干保护剂、冷冻保护剂或离液剂。

环糊精可以是，但不限于α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、(2，3，6-三-O-甲基)-β-环糊精、(2，3，6-三-O-甲基)-β-环糊精、(2-羟基)丙基-β-环糊精、(2-羟基)丙基-γ-环糊精、无规甲基-β-环糊精、无规甲基-γ-环糊精、羧甲基-β-环糊精、羧甲基-γ-环糊精、6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精、磺基丁基-β-环糊精、6-氨基-6-脱氧-β-环糊精、乙酰β-环糊精、琥珀酰α-环糊精、琥珀酰β-环糊精、琥珀酰γ-环糊精、(2，3，6-是-O-苯甲酰)-β-环糊精、琥珀酰-(2-羟丙基)-β-环糊精或琥珀酰-(2-羟丙基)-γ-环糊精。环糊精也可以是含有前述环糊精分子中的一种或多种的环糊精聚合物。其他环糊精是本领域已知的且包括例如cyclodextrin.com上描述的那些。环糊精的示例性浓度是，但不限于约1mM、2mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、50mM、75mM或100mM。

非离子型表面活性剂可以是聚乙烯-去水山梨糖醇-脂肪酸酯、聚乙烯-聚丙二醇或聚氧乙烯-硬脂酸酯。聚乙烯-去水山梨糖醇-脂肪酸酯可以是聚乙烯(20)-去水山梨糖醇-酯(Tween20^TM)和聚氧乙烯(20)-去水山梨糖醇单油酸酯(Tween80^TM)。聚乙烯-聚丙二醇可以是聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，例如以商品名或Poloxamer^TM售卖的那些。聚氧乙烯-硬脂酸酯可以是，例如以商标Myrj^TM售卖的那些。例如，聚氧乙烯单月桂基醚包括以商标Brij^TM售卖的那些，如Brij-35。非离子型表面活性剂的示例性浓度是，但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％或约10％w/w、w/v或v/v。

离子型表面活性剂可以是阴离子型表面活性剂或阳离子型表面活性剂。本发明中使用的阴离子型表面活性剂可以是但不限于皂(包括碱金属皂，如脂族羧酸(通常是脂肪酸)的钠、钾或铵盐，如硬脂酸钠)。其他阴离子型表面活性剂包括有机胺皂，如脂族羧酸(通常是脂肪酸)的有机胺盐(如三乙醇胺硬脂酸酯)。本发明中使用的阳离子型表面活性剂包括但不限于铵盐，如十八烷基氯化铵或季铵化合物(如苯扎氯铵)。离子型表面活性剂可包括烷基硫酸酯的钠、钾或铵盐，如十二烷基硫酸钠或辛基硫酸钠。离子型表面活性剂的示例性浓度是，但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％或约10％w/w、w/v或v/v。

两性离子型表面活性剂包括与同一分子相连的阳离子和阴离子中心。例如，阳离子部分是基于伯胺、仲胺或叔胺或者季铵阳离子。阴离子部分可包括磺酸盐，如CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐)中那样。其它阴离子基团有磺基甜菜碱类示例如椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱，或甜菜碱类例如椰油酰胺乙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱或月桂酰胺丙基甜菜碱。两性离子型表面活性剂的示例性浓度是，但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。

非去污剂磺基甜菜碱(NDSB)具有无法聚集形成胶束的短疏水性基团和磺基甜菜碱亲水性基团，因此不认为NDSB是去污剂。示例性的NDSB包括但不限于NDSB256、NDSB221、NDSB211、NDSB201、NDSB195、3-(4-叔丁基-1-吡啶内鎓)-1-丙磺酸盐、3-(1-吡啶内鎓)-1-丙磺酸盐、3-(苯基二甲基铵)丙磺酸盐或二甲基乙基铵丙磺酸盐。NDSB的示例性浓度包括但不限于约0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、0.75％、1％、2％、2.5％、5％、7.5％和约10％w/w、w/v或v/v。

多元醇是具有多个羟基官能团的化合物。一些情况中，多元醇可通过多种机理改变蛋白质的聚集或变性行为。例如，一些情况中，多元醇会通过给出热力学上不利的与蛋白主链的相互作用来使平衡移向折叠状态。或者，一些情况中，多元醇可与蛋白质的折叠状态结合并使其稳定。

多元醇可以是简单糖，例如：蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、木糖醇、赤藓糖醇、葡萄糖、半乳糖、棉籽糖或海藻糖。多元醇也可以是多糖，例如右旋糖酐、淀粉、羟乙基淀粉以及含有一种或多种本文所述简单糖的聚合物。甘油、乙二醇、聚乙二醇、季戊四醇丙氧基化物和季戊四醇丙氧基化物及其组合也是示例性的多元醇。

有机溶剂可以是但不限于已知能抑制一或多种蛋白质变性、解折叠或聚集的那些有机溶剂。本领域已知多种合适的有机溶剂。例如，有机溶剂可包括乙醇、丁醇、丙醇、苯酚、二甲基甲酰胺、2-甲基-2，4-戊二醇、2，3-丁二醇、1，2-丙二醇、1，6-己二醇或二甲亚砜。

聚集改性蛋白可以是本领域已知能抑制一种或多种蛋白质变性、解折叠或聚集的蛋白质。示例性的聚集改性蛋白包括但不限于白蛋白。白蛋白是水溶性、在浓盐溶液中中度可溶并经受热变性的蛋白。白蛋白包括血清白蛋白(例如，牛、马或人的血清白蛋白)和卵白蛋白(例如，母鸡卵清白蛋白)。其它示例性的聚集改性蛋白包括酪蛋白、明胶、泛素、溶菌酶和胚胎发生晚期丰富(LEA)蛋白。LEA蛋白包括LEAI、LEAII、LEAIII、LEAIV、LEAV或非典型LEA蛋白。LEA蛋白是本领域已知的并描述于例如GoyalK.等，BiochemicalJournal288(pt.1)，151-57，(2005)。

蛋白质聚集改性剂也可以是氨基酸。在一些情况中，氨基酸可起氧化还原作用来为固定在基质上的蛋白质维持适当的氧化电位。合适的氧化还原氨基酸包括半胱氨酸和胱氨酸。其它氨基酸通过非氧化还原方法起到减少变性或聚集的作用。例如，精氨酸、甘氨酸、脯氨酸和牛磺酸已证明能减少蛋白质聚集。

可用其它氧化还原剂来减少蛋白质聚集。可用半胱氨酸和胱氨酸以外的氧化还原剂来优化蛋白质固定其上的基质中的还原电势。示例性氧化还原剂包括巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、三(2-羧基乙基)膦、谷胱甘肽、谷胱甘肽二硫化物及其氧化衍生物，以及Cu²⁺。

蛋白质聚集改性剂还可包括冻干保护剂、冷冻保护剂或离液剂。一些情况中，蛋白质聚集改性剂是离液剂，例如脲、硫脲、胍、氰酸盐/酯、硫氰酸盐/酯、三甲基铵、四甲基铵、铯、铷、硝酸盐、乙酸盐/酯、碘化物、溴化物、三氟乙酸盐/酯或高氯酸盐/酯。在某些条件下，如在低浓度下，离液剂可减少蛋白质聚集。其它蛋白质聚集改性剂包括三甲基胺N-氧化物。

蛋白质聚集改性剂可以是盐。示例性的盐包括但不限于盐酸、硫酸或磷酸的钠、钾、镁或钙盐。蛋白质聚集改性剂也可以是缓冲剂。示例性缓冲剂包括但不限于三(羟基甲基)甲胺(TRIS)、TAPSO、MES、HEPES、PIPES、CAPS、CAPSO、MOPS、MOPSO或磷酸钠或磷酸钾、碳酸钠或碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾、柠檬酸钠或柠檬酸钾、乙酸钠或乙酸钾、或硼酸钠或硼酸钾缓冲剂。

蛋白质聚集改性剂可以任何合适浓度提供。在一些情况中，以含有结合试剂和蛋白质聚集改性剂的水溶液形式提供蛋白质。此类情形中，溶液可接触多孔基材，并任选地干燥。蛋白质聚集改性剂在结合试剂水溶液中的示例性浓度包括但不限于该溶液的约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、4％、5％、10％、20％或约25％或更高的w/v。其他的示例性浓度包括但不限于约1μM、5μM、10μM、25μM、50μM、75μM、100μM、150μM、200μM、300μM、500μM、750μM、1mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM和1M。

在一些情况中，在多孔基材上提供蛋白质聚集改性剂。含有蛋白质聚集改性剂和多孔基材的示例性组合物包括：按重量含有约0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或约10％、20％或约25％蛋白质聚集改性剂的基材或其中的区(例如，试剂储库区)。

蛋白质聚集改性剂可以任何合适组合提供。例如，在一些情况中，可使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种前述蛋白质聚集改性剂来减少固定于多孔基材上的结合试剂的聚集。在一些情况中，在使多孔基材接触结合试剂溶液之前，多孔基材含有蛋白质聚集改性剂，并且结合试剂溶液含有相同或不同的蛋白质聚集改性剂。在一些情况中，在使基材接触结合试剂溶液之前，基材含有蛋白质聚集改性剂，并且结合试剂溶液不含蛋白质聚集改性剂。在一些情况中，在使基材接触结合试剂溶液之前，结合试剂溶液含有蛋白质聚集改性剂，并且基材或其区不含蛋白质聚集改性剂。

IV.方法

可采用本文所述的组合物和方法来检测一种或多种分析物。例如，可采用组合物和方法来检测可逆结合到膜上的一种或多种分析物。在一些情况中，可采用本文所述的组合物和方法来进行印迹实验。

示例性实施方式示于图3。图3显示了使用本文所述的组合物和方法进行三种不同分析物的多重检测。在图3的步骤1中，向多孔基材的3个不同试剂储库亚区上加载3种不同的结合试剂(例如，抗体)。试剂储库亚区由疏水性或不可透过阻隔互相分离并与横向流动区分离。在该加载步骤之前或之后，可使多孔基材与含结合(例如，可逆结合)的分析物的膜密切接触。在步骤2中，试剂储库区与横向流动区接触以通过例如折叠引发横向流动。其相应横向流动亚区中的结合试剂的横向流动因此允许结合试剂结合，从而检测膜结合的分析物。因此，在该实施方式中，可同时检测至少3种不同的膜结合的分析物。

可使含有一种或多种可逆结合的分析物的膜密切接触多孔基材，如具有横向流动区的多孔基材。随后，引发一种或多种结合试剂流动通过多孔基材然后可使结合试剂接触膜结合的分析物。在一些实施方式中，通过使多孔基材或多孔基材的横向流动区接触试剂储库区或其部分来引发结合试剂横向流动通过多孔基材。

在引发结合试剂的横向流动之前，可以用封闭剂来封闭膜和/或横向流动区。在一些情况中，在放置膜密切接触多孔基材之前进行封闭。替代地，在放置膜密切接触多孔基材之后进行封闭。封闭剂是本领域已知的并且可用于减少或消除一种或多种结合试剂(例如一级或二级结合试剂)的非特异性结合。示例性的封闭试剂包括，但不限于，牛血清白蛋白(BSA)、甲基化BSA、酪蛋白、脱脂奶粉、血清、明胶或无蛋白质封闭溶液。示例性的无蛋白质封闭溶液包括含有亲水性或两性合成聚合物的溶液。

多孔基材的横向流动区和试剂储库区可被折叠区分开。在一些情况中，通过在折叠区处折叠多孔基材来使试剂储库区接触横向流动区。在折叠区处折叠多孔基材可使试剂储库区的至少一部分与横向流动区的至少一部分接触，并因此引发一种或多种结合试剂流出试剂储库区并流过横向流动区。

试剂储库区对于多孔基材可以是整体的。替代地，试剂储库区可与多孔基材不同，但接合至多孔基材(例如，接合至多孔基材的横向流动区)。在其他情况中，试剂储库区可以是接触与膜密切接触的第一多孔基材的第二多孔基材。在一些实施方式中，试剂储库区含有多个试剂储库亚区。在一些情况中，试剂储库亚区可含有不同的结合试剂。

试剂储库可含有含结合试剂的水溶液。例如，可向多孔基材提供在其上干燥的结合试剂，用水性缓冲溶液重建该结合试剂，并且如本发明所述进行使用以检测一种或多种分析物。可在使多孔基材密切接触膜之前或之后进行重建。替代地，可向多孔基材提供含有结合试剂的水溶并如本发明所述进行使用。作为另一个替代，可由终端用户以溶液形式向试剂储库区施涂结合试剂，任选地干燥然后重建，并如本发明所述进行使用。

在一些实施方式中，在试剂储库区接触横向流动区之后，结合试剂或其部分(例如，含结合试剂的溶液或其部分)从试剂储库区中并通过横向流动区芯吸。在一些情况中，接触使得结合试剂或其部分从试剂储库区芯吸，通过横向流动区并进入液体槽。

该方法可包括一个或多个封闭、洗涤或二级检测步骤。在一些情况中，通过顺序横向流动来进行一个或多个封闭、洗涤或二级检测步骤。顺序横向流动是指在单个多孔基材中进行多个横向流动步骤。例如，可使多孔基材密切接触含一种或多种可逆结合的分析物的膜。任选地，然后可引发洗涤和/或封闭溶液横向流动通过多孔基材。替代地，或另外，在密切接触多孔基材之前，可洗涤和/或封闭膜。可引发一种或多种一级结合试剂横向流动通过多孔基材(例如，通过本文的横向流动区)，从而将结合试剂接触可逆结合的分析物。然后可引发洗涤和/或封闭溶液横向流动通过多孔基材。在一些情况中，洗涤溶液可去除过量或未结合的结合试剂。然后可引发一种或多种二级结合试剂的横向流动。可通过随后的封闭或洗涤步骤(例如，通过后续横向流动)来去除过量或未结合的二级结合试剂。

可用采用一个或多个泵、阀门或发动机的主动装置来进行后续横向流动。替代地，可用不采用泵、发明、发动机或不需要电源的被动装置来进行后续横向流动。示例性的被动顺序横向流动装置描述于美国专利申请号2010/0239459和2013/0164193。

在一些情况中，通过在多孔基材上倾倒、移液或喷涂封闭或洗涤溶液来进行一个或多个封闭或洗涤步骤。替代地，多孔基材可在封闭或洗涤溶液中浸泡。可手动或使用自动化装置来进行倾倒、移液、喷涂或浸泡。

在一些实施方式中，在由横向流过多孔基材使一种或多种一级结合试剂(例如，一种或多种一抗)接触膜之后，可去除多孔基材并且在膜上进行一个或多个或者全部的后续封闭、洗涤或二级检测步骤。

可通过检测结合的一级或二级结合试剂(例如，检测经标记的一抗或二抗)在膜上检测一种或多种可逆结合的分析物。检测与膜结合的分析物结合的一级或二级结合试剂的方法是本领域熟知的。

多孔基材可在使用前储存一段时间。例如，多孔基材可储存(例如，在约4、5、6、7、8、10、12、14、16、18、20、22、25、30、35或37℃或更高温度下)至少约1天、3天、7-10天、至少约1个月、2个月、3个月、6个月、1年或更长。在一些情况中，多孔基材含有一种或多种在其中/其上储存的结合试剂。结合试剂可以干态、基本干态或湿态储存在多孔基材之中或之上。在一些情况中，在使用前重建多孔基材或其部分(例如，试剂储库区)。

V.试剂盒

本文描述了用于进行任意前述方法的试剂盒。本文还描述了含有一种或多种前述组合物的试剂盒。在一些实施方式中，该试剂盒含有一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)多孔基材。在一些实施方式中，该试剂盒含有一种或多种结合试剂(例如，一种或多种一级和/或二级结合试剂)。在一些情况中，试剂盒含有带一种或多种可逆结合其中的结合试剂的一种或多种多孔基材。在一些情况中，结合试剂在多孔基材或其部分上干燥(例如，在储库区或亚区上干燥)。在一些情况中，在一种或多种蛋白质聚集改性剂存在下，结合试剂在多孔基材或其部分上干燥。在一些情况中，以待由终端用户施涂在多孔基材上的试剂提供结合试剂。

在一些实施方式中，该试剂盒含有环糊精或其它蛋白质聚集改性剂。在一些情况中，该试剂盒含有一种或多种浸渍蛋白质聚集改性剂的前述多孔基材。在一些实施方式中，该试剂盒含有可由终端用户施涂在多孔基材或其部分上的蛋白质聚集改性剂。该试剂盒的蛋白质聚集改性剂可以是，例如，以固体形式(例如，粉末)或液体形式(例如，溶液)提供。在一些情况中，该试剂盒含有可由终端用户在重建一种或多种可逆结合的结合试剂期间施涂于多孔基材(例如，作为水溶液的一部分)或其部分的蛋白质聚集改性剂。

VI.实施例

在多孔基材(例如，沃特曼色谱纸)上印刷疏水性阻隔(例如，蜡阻隔)。疏水性阻隔将结合试剂储库区与横向流动区分开。疏水性阻隔也分隔试剂储库亚区。类似地，疏水性组合分隔横向流动亚区。结合试剂(例如，抗体)加载在1个、2个或3个试剂储库亚区上。疏水性阻隔封闭试剂储库和横向流动区之间、试剂储库亚区之间和横向流动亚区之间的流动。参见图1。

使多孔基材与含结合的蛋白质的Western印迹膜密切接触。在折叠区折叠多孔基材以使试剂储库区接触横向流动区引发结合试剂横向流过横向流动亚区。由于疏水性阻隔，各横向流动亚区中的结合试剂并不在横向流动期间混合。参见图2。因此，各亚区可独立地检测一种或多种分析物，使得能够多重检测结合到膜上的分析物。参见图3。

应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和范围以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

Claims

1.一种具有一定长度和宽度并包含试剂储库区和横向流动区的多孔基材，所述试剂储库区包含或以不可透过或疏水性阻隔为边框，所述不可透过或疏水性阻隔基本上封闭了液体从所述试剂储库区向所述横向流动区的流动直至引发横向流动。

2.如权利要求1所述的多孔基材，其特征在于，所述多孔基材还包含折叠区，所述折叠区经定位使得通过在所述折叠区折叠所述多孔基材来引发横向流动，其中在所述折叠区折叠所述多孔基材使所述试剂储库区的至少一部分接触所述横向流动区的至少一部分。

3.如权利要求1或2所述的多孔基材，其特征在于：

所述试剂储库区包含至少第一试剂储库亚区和第二试剂储库亚区，其中所述第一和第二试剂储库亚区并不流体连通；并且

所述横向流动区包含至少第一横向流动亚区和第二横向流动亚区，其中所述第一和第二横向流动亚区并不流体连通。

4.如权利要求3所述的多孔基材，其特征在于，所述第一试剂储库亚区通过疏水性或不可透过阻隔与所述第二试剂储库亚区分开。

5.如权利要求3或4所述的多孔基材，其特征在于，所述第一横向流动亚区通过疏水性或不可透过阻隔与所述第二横向流动亚区分开。

6.如权利要求3-5中任一项所述的多孔基材，其特征在于，各试剂储库亚区设置成单独接触横向流动亚区。

7.如前述权利要求中任一项所述的多孔基材，其特征在于，所述横向流动区包含毛细流动基质。

8.如前述权利要求中任一项所述的多孔基材，其特征在于，所述试剂储库区包含毛细流动基质。

9.如权利要求7或8所述的多孔基材，其特征在于，所述毛细流动基质的至少一部分偶联不可透过或疏水性背衬。

10.如权利要求7或8所述的多孔基材，其特征在于，所述毛细流动基质包含纤维素或玻璃纤维。

11.如前述权利要求中任一项所述的多孔基材，其特征在于，所述折叠区包含可见标记物、褶皱或折痕。

12.如权利要求11所述的多孔基材，其特征在于，所述折叠区延伸通过所述多孔基材的宽度。

13.如权利要求2-12中任一项所述的多孔基材，其特征在于，所述横向流动区设置成在折叠所述折叠区之后从所述试剂储库中并沿着所述横向流动区的长度芯吸一种或多种结合试剂。

14.如前述权利要求中任一项所述的多孔基材，其特征在于，所述多孔基材的至少一部分是基本上可压缩的。

15.如权利要求14所述的多孔基材，其特征在于，所述横向流动区的至少一部分是基本上可压缩的。

16.如权利要求14或15所述的多孔基材，其特征在于，所述试剂储库区的至少一部分是基本上可压缩的。

17.如前述权利要求中任一项所述的多孔基材，其特征在于，所述试剂储库区包含第一一级结合试剂。

18.如权利要求17所述的多孔基材，其特征在于，所述试剂储库区还包含第二一级结合试剂。

19.如权利要求18所述的多孔基材，其特征在于，所述试剂储库区的第一和第二一级结合试剂被不可透过或疏水性阻隔分开。

20.如前述权利要求中任一项所述的多孔基材，其特征在于，所述试剂储库区或所述横向流动区包含蛋白质聚集改性剂。

21.一种进行横向流动试验的方法，所述方法包括：

-提供包含横向流动区的多孔基材；

-使所述多孔基材密切接触包含多种固定的分析物的膜；并且

-将所述横向流动区与包含一级结合试剂的试剂储库区接触，从而使所述一级结合试剂的至少一部分芯吸到横向流动区中，其中使一级结合试剂的至少一部分芯吸到所述横向流动区引发所述一级结合试剂横向流过所述横向流动区的至少一部分，从而使所述一级结合试剂的至少一部分接触包含多种固定的分析物的膜。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述方法还包括引发洗涤溶液横向流过所述横向流动区的至少一部分。

23.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述方法还包括引发含有二级结合试剂的溶液横向流过所述横向流动区的至少一部分。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在引发所述含有二级结合试剂的溶液横向流过所述横向流动区的至少一部分之后引发洗涤溶液的横向流动。

25.如权利要求21-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述包含横向流动区的多孔基材还包含所述试剂储库区，并且所述试剂储库区通过(i)不可透过或疏水性阻隔和(ii)折叠区与所述横向流动区分开。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述折叠区延伸通过所述多孔基材的宽度。

27.如权利要求25或26所述的方法，其特征在于，使所述多孔基材与包含所述一级结合试剂的试剂储库区接触包括在所述折叠区处折叠所述多孔基材。

28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述横向流动区设置成在折叠所述折叠区之后从所述试剂储库中并沿着所述横向流动区的长度芯吸一种或多种结合试剂。

29.如权利要求21-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述折叠区包含可见标记物、褶皱或折痕。

30.如权利要求21-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述横向流动区的至少一部分、所述试剂储库区的至少一部分或所述多孔基材的至少一部分是基本上可压缩的。

31.如权利要求21-30中任一项所述的方法，其特征在于，

32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述第一试剂储库亚区通过疏水性或不可透过阻隔与所述第二试剂储库亚区分开，并且所述第一横向流动亚区通过疏水性或不可透过阻隔与所述第二横向流动亚区分开。

33.如权利要求31-32中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一试剂储库亚区包含第一一级结合试剂而所述第二试剂储库亚区包含第二一级结合试剂。

34.如权利要求21-33中任一项所述的方法，其特征在于，所述试剂储库区包含蛋白质聚集改性剂。

35.如权利要求21-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述横向流动区包含含有纤维素或玻璃纤维的毛细流动基质。

36.如权利要求21-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述试剂储库区包含含有纤维素或玻璃纤维的毛细流动基质。

37.如权利要求35或36所述的方法，其特征在于，所述毛细流动基质的至少一部分偶联至不可透过或疏水性背衬。

38.如权利要求35-37中任一项所述的方法，其特征在于，所述毛细流动基质包含玻璃纤维。

39.一种包含至少1种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)权利要求1-20中任一项所述的多孔基材的试剂盒。

40.如权利要求39所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含第一和第二一级结合试剂。

41.如权利要求39或40所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含具有蛋白质聚集改性剂的容器。

42.如权利要求41所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白质聚集改性剂是环糊精。