CN111465855B - 在固定于用于侧流测定的条上捕集区中的无标记光学检测 - Google Patents

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Abstract

一种包含多孔基质的测试条，该测试条包含：样品施加区，其用于施加包含分析物的液体样品；报告物释放区，其包含传感材料，该传感材料适于通过释放光学报告物来与该分析物选择性相互作用，该报告物释放区布置在该样品施加区的下游；和检测区，其包含适于选择性结合该光学报告物的捕集材料并且布置在该报告物释放区的下游。

Description

在固定于用于侧流测定的条上捕集区中的无标记光学检测
领域和背景
本发明涉及用于快速且灵敏地检测分析物的方法，例如在医学诊断和环境监测中、在安保领域、职业健康和安全中以及在食品相关领域中。在分析物是某些核酸的情况下，它的检测在法医或在微生物学相关问题如细菌或其他微生物污染方面也是至关重要的。特别地，本发明涉及侧流测定形式。
在所有用于快速测试的方法中，侧流测定是最常用的，并且在市场上可以获得成百种基于该技术的测试套件。这种类型的测定通常包含往往是硝基纤维素或玻璃的纤维膜条，在其中样品-指示剂络合物可以通过条的多孔结构内液体的毛细管力来传输。该膜条通常包含样品施加区和检测区，在检测区中固定有针对分析物的捕集试剂(往往是抗体或抗体片段)。最后，在条端部处的吸收垫通常确保液体的连续毛细管流动。
然而，已知的侧流测定的一个主要缺点在于大部分捕集剂或是仅通过与标记的类似物竞争来间接指示分析物，或是依照传统的指示剂方案，即不得不同时实现选择性和灵敏地结合以及产生强信号。这往往是难以实现的，并且在大多数情况下，相当大地降低了灵敏度。已知的侧流测定的另一缺点在于每个测定仅可以测量几个分析物。此外，在大部分情况下，需要能够直接或间接结合到分析物上的第二结合剂，例如第二标记的抗体或抗体片段。
已知的方法主要基于传统的指示剂方案，在其中分析物和指示剂或免疫剂之间的相互作用必须依照规定的化学计量，并且结合和指示事件是固有耦合的。在许多情况下，检测仅是在使用第二结合剂之后完成，这不仅增加了成本，而且潜在引入了更多的误差。
简要概述
针对该背景，根据第一实施方案，提出了一种包含多孔基质的测试条。该测试条包含：
-样品施加区，其用于施加包含分析物的液体样品，其中该分析物典型地溶解或增溶在液体中；
-报告物释放区，其包含传感材料，该传感材料适于通过释放响应于该分析物存在的光学报告物来与该分析物选择性地相互作用，该报告物释放区布置在该样品施加区的下游；
-检测区，其包含适于选择性结合该光学报告物的捕集材料，并且布置在该报告物释放区的下游。
换言之，如果含有分析物的液体润湿了传感材料，则报告物从测试条上的传感材料中释放。由于测试条包含多孔基质，因此由毛细管力驱动的液体(例如溶剂)可以在多孔基质内流动并且随后润湿全部区。所释放的报告物通过液体流、典型地通过溶剂流(流)传输到检测区。相对于该液体流或流，报告物释放区位于与样品施加区相比的下游。此外，检测区相对于该液体流或流来说位于与报告物释放区相比的下游。关于不同区的顺序，以或在流动液体的连续或不连续流方向上，样品施加区是第一，报告物释放区是第二，和检测区是第三。报告物在至少一个检测区中的存在和/或量典型地通过检测手段来量化。然而，分析物的存在和表观量偶尔也可以在无需任何另外仪器的情形下通过使用检测区的合适的照明仅目视检查来评价。
根据另一实施方案，提出了一种检测分析物的方法。该方法包括：
-提供包含多孔基质的测试条，该测试条包含：至少一个样品施加区；报告物释放区，其包含传感材料，其中该传感材料适于在与该分析物接触之后，通过释放报告物来与该分析物选择性相互作用；和检测区，其包含捕集材料，其中该捕集材料适于选择性结合该报告物；
-将样品施加到该样品施加区；
-在至少一个检测区中检测该报告物的存在和/或量和/或浓度；
-确定样品中该分析物的存在和/或浓度。
根据一种实施方案，以上方法包括从样品施加区到报告物释放区和从报告物释放区到至少一个检测区的连续或不连续流体流。
附图说明
对本领域技术人员而言，本发明完整且可以实现的公开内容，包括其最佳模式，更具体地阐述在说明书的其余部分中，包括参照附图。
图1显示了适于检测单个分析物(图1A)和3种分析物(图1B)的侧流测定的测试条或浸量尺的工作原理。i)显示了流动前各自的条，ii)不存在(a)和存在(b-e)分析物的流动期间，和iii)流动之后。
图2a显示了适于侧流测定的测试条或浸量尺，其包含已经作为17％溶液施加到多孔基质上6mm宽度上以形成捕集区的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)＝PDDAC的线，并且含有1μL的磺化罗丹明B溶液(SURB；在水中10mgmL-1)以模拟距离底部2cm的报告物释放区。图2b显示了使用H2O作为溶剂流动之后(1和2)和磷酸盐缓冲盐水＝PBS(0.8mM；3和4)作为溶剂在流动5min(1和2)和1h(3和4)之后相应的测试条。图2c显示了在使用PBS作为溶剂(0.8mM，pH7.5)流动3min(1)和10min(2)后，含有PDDAC线(35％3mm)作为捕集区的测试条。图2d显示了在用PBS缓冲剂流动20min后，含有PDDAC线(35％，6mm)作为捕集区的测试条。
图3a显示了用疏水性蜡阻挡物改性的硝基纤维素条的照片，该硝基纤维素条含有样品施加区1)、报告物释放区2)(这里含有染料2,7-二氯荧光黄)，和检测区3)(含有APTES改性的介孔材料)。其中APTES表示(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷。图3b显示了在检测区3)中含有APTES-MCM的条上2,7-二氯荧光素(FLU)流动之后，在自制UV灯下的照片。MCM表示介孔二氧化硅材料MCM-41。流动后检测区3)中具有APTES-SBA的相应条显示在图3c中，和检测区3)中具有COOH-MCM的相应条显示在图3d中。其中SBA表示介孔二氧化硅材料SBA-15。COOH-MCM表示COOH-官能化MCM。所用缩写将在以下进一步解释。
图4a显示了在作为溶剂的PBS(80mM)流动之后，条在UV光下的照片，该条包含作为捕集区的APTES-MCM线，以及以浓度1mg mL-1施加到报告物释放区2中的染料SURB(左)和FLU(右)。图4b显示了在用作为溶剂的80mM PBS流动之后，条在UV光下的照片，该条含有作为检测区的COOH-MCM(L1)和APTES-MCM(L2)线，以及报告物释放区2中染料罗丹明6G(R6G)和FLU的混合物(1mg mL-1)。图4c显示了在用作为溶剂的80mM PBS流动之后，条在UV光下的相应照片，该条含有在L1处的PVP-APTES-MCM和在L2处的PA-COOH-MCM的线作为检测区，以及在报告物释放区2中染料R6G和FLU的混合物(1mg mL-1)。其中PVP-APTES-MCM表示聚(乙烯基吡咯烷酮)-(PVP)改性的APTES-MCM，和PA-COOH-MCM表示PDDAC-改性的COOH-MCM。注意与类似于SURB相比，R6G在颜色和荧光上更类似于FLU。
图5a显示了含有在检测区3中捕集材料处的一张APTES-C(1)和APTES-GF(2)纸和在报告物释放区2上的FLU染料点(10mg mL-1)的条的照片。其中APTES-C表示APTES改性的纤维素纸，和APTES-GF表示APTES-改性的玻璃纤维纸。图5b显示了在作为时间函数的流动期间相应的条在UV光下的照片，该条在检测区3处含有APTES-C(1)、APTES-GF(2)和COOH-GF(3)。图5c显示了对于捕集材料APTES-C(1)、APTES-GF(2)和COOH-GF(3)，使用ImageJ软件评价的作为时间函数的捕集区面积的积分的荧光。缩写将在以下进一步解释。
图6a显示了含有在捕集区处的一张FLU-M-GF纸和在报告物释放区(模拟的相互作用区)上的FLU染料点的条的照片。图6b显示了在某些时间间隔后相应的条在UV光下的照片，该条含有1)NIG-M-GF和2)FLU-M-GF(使用FLU作为染料)，和3)FLU-M-GF(使用SURB作为染料)。其中NIG-M-GF表示非印迹凝胶改性的甲基丙烯酸-3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯改性的玻璃纤维纸。FLU-M-GF表示FLU印迹的M-GF。图6c显示了对于捕集材料1)NIG-M-GF和2)FLU-M-GF(使用FLU作为染料)和3)FLU-M-GF(使用SURB作为染料)，使用ImageJ软件评价的作为时间函数的检测区面积的任意单位中相应积分的荧光强度的图。这些染料作为水溶液施加，以模拟从报告物释放区释放的报告物，如以下将进一步解释的。
图7a显示了含有作为检测区的一张SURB-M-GF(S)和FLU-M-GF(F)纸的玻璃纤维条的照片。图7b显示了在不存在(2)和存在(1)在含有作为检测区的一张SURB-M-GF(1-S和2-S)和FLU-M-GF(1-F和2-F)纸的条底部处的1μL的FLU和SURB的混合物(1mM)的情形下，流动之后相应条的照片。图7c显示了作为时间函数的条在荧光下相应的照片(λ激发470nm和λ激发505nm用于激发，532nm截止和550nm长通作为发射滤光片)。图7d显示了对于两种不同的捕集材料，使用ImageJ软件评价的作为时间函数的检测区面积的相应积分荧光强度。
图8a显示了在存在(1)和不存在(2)PETN(25ppm)，使用80mM的含有2.5％MeOH作为溶剂的PBS的流动之后，适于侧流测定的测试条，该测试条含有PDDAC线(17％，6mm)作为捕集材料和能够检测报告物释放区2)中的PETN的传感材料。其中PETN表示模拟分析物季戊四醇四硝酸酯。图8b包含相应的测定，但是使用PDDAC线(35％，3mm)代替(17％，6mm)作为捕集区，和图8c显示了使用PDDAC线(作为35％溶液以6mm线宽度施加)作为捕集区的相应测定。
图9显示了含有垂直堆叠的不同区的堆叠的侧流测定的工作原理。样品注入区1布置在顶部，和报告物释放区2位于纸的第二层中。作为第三层，含有检测区3的条布置在底部。在垂直流F期间，包封在报告物释放区2的传感材料中的报告物(例如光学报告物分子)仅当各自的分析物存在于样品b中时才释放，和然后通过毛细管力随流朝向捕集区3移动，在捕集区3中它被保留以用于检测。在样品中不存在分析物的情形下(如a中所示)，没有登记释放，而在情况(指定为b)中，在检测区中可以检测到来自样品的分析物。
图10示意性显示了针对检测多个分析物的情况下，堆叠的侧流测定的工作原理。彼此叠置的不同的多孔基质层包含样品注入区(1)，和报告物释放区，该报告物释放区含有例如两种传感颗粒的混合物，该两种传感颗粒含有适于与两种不同的分析物选择性相互作用的两种不同的报告物分子。该堆叠体还包含含结构化检测区3的多孔基质层。具有两个不同检测区的底层包含可以例如通过蜡印刷产生的通道图案。显示存在两种不同的检测区，其具有两种不同的对于相应的报告物分子是选择性的捕集材料。在流F期间，相应的报告物分子仅当各自的分析物存在于以上所施加的样品(b-c)中时才从报告物释放区释放，和然后通过毛细管力随流朝向捕集区3移动，在捕集区3中它们被保留用于检测。在该方案的样品中不存在分析物的情形下(如a部分所示)，没有登记释放，并且没有检测区产生信号。不同的报告物释放区也可以应用于堆叠在包含检测区的基质层顶上的不同的基质层中。在底层中形成的通道的端部，可以布置吸收垫。包含一个或多个检测区的层对于来自上方或来自下方的光学检测装置而言可以是可到达的。
在以下详细描述中，参照形成其一部分的附图，并且在其中以示例性的方式显示本发明的具体实施方案和特征。要理解的是在不脱离本发明的范围的情形下，可以使用其他实施方案，并且可以进行结构或逻辑变化。因此，以下的详细描述不采取限制性含义，并且本发明的范围通过附加的权利要求书来定义。
详细描述
当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含(包括)(comprising)”结合使用时，措词“(a)一个”或“(an)一种”的使用可以表示“一个(种)”，但是它也与“一个(种)或多个(种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)或大于一个(种)”的含义一致。
权利要求书中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指示仅指的是替代选项或该替代选项是互斥的，虽然本公开内容支持仅指的是替代选项和“和/或”的定义。
如本说明书(以上和以下)和权利要求书中所用，措词“包含(包括)(comprising)”(和任何形式的包含(包括)(comprising)，例如“包含(包括)(comprise)”和“包含(包括)(comprises”)，“具有(having)”(和任何形式的具有(having)，例如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(和任何形式的包括(including)，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和任何形式的含有(containing)，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放端的，并且不排除另外的、未表述的要素或方法步骤。
如本说明书(以上和以下)和权利要求书中所用，术语“多孔基质”被理解为典型地包含含开放多孔固体材料的不规则结构，该开放多孔固体材料在溶剂如缓冲剂溶液中典型地是惰性和稳定的。
如本说明书(以上和以下)和权利要求书中所用，术语“介孔无机材料”被理解为典型地涵盖含介孔的实心体。介孔具有在2nm-50nm之间的平均孔径。用于测量这些无机材料的平均孔径的公认方法是氮气吸附孔隙率法、电子显微镜法如扫描电镜或透射电镜。
如本说明书(以上和以下)和权利要求书中所用，术语“介孔传感材料”包含无机介孔材料，其是可商购的或实验室制造的，并且选自例如称作MCM-41、HMS、MSU-n、MSU-V、FSM-16、KSW-2、SBA-n(n＝1、2、3、8、11-16)、FDU-n(12、14、15、16)、UVM-7、UVM-8、M-UVM-7或M-UVM-8、Al2O3-型MCM-41的材料。典型地，无机介孔材料包含二氧化硅即SiO2，或氧化铝即Al2O3。介孔无机材料还可以包含TiO2、碳、碳氮化物、碳化硅、碳氧化硅、碳氮化硅、氮化硅、氮氧化硅、氮化硅铝、或碳氮化硅硼。所述无机材料的介孔含有报告物。所述报告物从所述介孔的释放通过孔封闭材料来阻止。该孔封闭材料可以是化学官能化的，即具有官能团如氨基或羧基。通过带有这样的官能团的小有机分子改性无机材料是公知的，和因此无需进一步规定。
如本说明书(以上和以下)和权利要求书中所用，术语“样品”被理解为是含有未知浓度的分析物的液体。典型地，该分析物以溶解形式存在于样品中。在这样的情况下，样品还包含溶质。样品中所包含的溶质可以用作在样品施加区和报告物释放区之间产生流体连接的液体相。除了样品中所含的溶质之外，在已经施加样品后，可以将纯溶剂施加到样品施加区。该溶剂可以用于产生或保持报告物释放区和检测区之间的流体连接。然而，样品也可以在样品施加区处干燥。在这样的情况下，可以将相同类型或另一类型的纯溶剂施加到样品施加区以便产生与报告物释放区的流体连接。最后，流体连接是在报告物释放区和检测区之间产生。
如本说明书(以上和以下)和权利要求书中所用，术语“报告物”与术语“指示剂”同义使用。它包含可以夹裹在介孔材料的孔中以产生传感材料的实体，如以上和以下所解释的。报告物可以直接地(例如通过它的颜色)或间接地如在它的荧光、磷光或发光激发后检测。
如本说明书(以上和以下)和权利要求书中所用，术语“荧光测量”、“荧光染料”和任何与之相关的术语被理解为包含光学性能或它的检测，例如激发波长、发射波长、荧光强度、荧光量子产率、荧光寿命或衰减、和/或荧光比等或它的检测。
传感材料的孔封闭材料是可释放的。特别地，孔封闭材料典型地是有机的，并且可分离地结合(即非共价)至无机介孔材料。特别地，孔封闭材料通过锚定到多孔材料上的化合物来非共价结合至介孔材料。选择孔封闭材料以特异性结合分析物。报告物物质在孔封闭材料结合分析物时从该孔释放。分析物典型地包含(或不包含)在润湿了报告物储器(即报告物释放区)的液体样品中。换言之，在介孔材料表面处的全部孔被孔封闭材料封端和因此封闭。因此，只要分析物没有被孔封闭材料特异性结合并且孔封闭材料从多孔无机材料中释放，存储在孔内的报告物就不能释放到周围液体中。如果含有分析物液体与报告物储器在报告物释放区接触，这允许非共价键被分离并且使得在孔封闭材料和分析物之间形成特定键和因此防止孔封闭材料和介孔材料或锚定到其上的任何化合物之间的非共价键重新形成。如果润湿液体不含有分析物，则封端材料到无机多孔材料的非共价键将足够强，以将孔封闭材料保持在该孔附近。因此，介孔被堵塞并且因此基本上防止了该报告物脱离介孔和因此没有信号可以产生。
换言之，无机多孔材料的孔被这样的实体封闭，该实体包含与孔封闭材料缔合的有机分子如半抗原类物质。孔封闭材料非共价结合至紧紧固定在介孔材料的表面处的有机分子(在此处称作化合物)。初始布置在孔内的报告物是通过当孔封闭材料结合存在于液体样品中的特定分析物(即指定给具体报告物的分析物)时孔封闭材料从孔开口分离，而从孔释放的。在结合到分析物之后，孔封闭材料被阻止重新结合至固定到紧邻孔的介孔材料上的化合物(其例如是半抗原类物质)，和因此分离了孔封闭材料。
该孔封闭材料选自抗体、抗体片段、受体蛋白、寡核苷酸和适配体。该适配体可以选自寡适配体和肽适配体。该抗体、受体蛋白、寡核苷酸和适配体能够特异性结合分析物。此外，孔封闭材料可以包含无机纳米颗粒，其包含例如金、银或铁氧化物；金属簇，其包含例如金或银；纳米晶体，其包含例如硫化镉或另一半导体材料；或碳纳米点或纳米金刚石。所提及的无机纳米颗粒、金属簇或纳米晶体具有至多50nm、典型地至多30nm的尺寸。根据典型的实施方案，孔封闭材料的表面通过有机分子或通过抗体或通过抗体片段来改性。
例如如果孔封闭材料包含抗体或抗体片段，则可以给出所建议的报告物储器(即传感材料)和相应的报告物释放系统的基本机理的以下简要说明。
抗体和半抗原之间的一个或多个化学键或抗体和化合物(例如类似于半抗原衍生物的有机分子)之间的一个或多个化学键是非共价的。因此，孔封闭帽(例如抗体)在适当的溶剂中始终缔合和解离。所得的系统是动态地。由于在这样的动态系统中，缔合发生地非常快，而解离相当慢，因此仅发生报告物从报告物储器(即从报告物释放区)的孔中不显著地浸出。如果该报告物储器(即报告物释放区)是干燥地且没有被溶剂润湿，则根本不发生浸出。
此外，分析物对于抗体的亲和性与半抗原(化合物)对抗体的亲和性相比是高得多的。因此，抗体(帽)的结合位点在分析物存在下被有效堵塞。因此防止了抗体到半抗原(化合物)的任何快速地重新结合。因此，抗体可以足够远地离开该孔开口，而它的结合位点被堵塞。
因此，甚至在分析物和抗体(其也包含动态系统)之间的络合解离的情况下，也不会发生孔的重新密封。
关于上述亲和性，该抗体对于分析物的亲和性与抗体对于半抗原相比也是高得多的。
所描述的实施方案的技术目标是为了在侧流装置或测试条上产生无标记和潜在地多重检测，使用固定在侧流装置的检测区中的几种大分子或材料。这些固定的大分子或捕集材料经调适(即经选择)以与报告物分子(即报告物，其是从位于样品注入区之上或之中的介孔传感材料释放的)进行选择性相互作用，其中该传感材料负责与待检测的分析物特异性相互作用。
所提出的实施方案的优点在于从传感材料的孔中释放的报告物仅在该条上明确规定的位置处(即在检测区中或在检测区的至少一个中)专门捕集。
特别地，图1A显示了根据第一实施方案所提出的测试条的工作原理。该测试条i)包含样品注入区(称作样品施加区1)、报告物释放区2和检测区3(其包含能够与从区2中释放的光学报告物分子相互作用的捕集材料)。在溶剂沿着条流动ii)期间，该光学报告物分子(即报告物，其初始包封在沉积于报告物释放区2中的传感材料中)仅当各自的分析物存在于样品中时才释放(条b)，并且然后通过毛细管力随流朝向检测区3移动。在该检测区中，报告物被保留以用于检测。在样品中不存在分析物时(条a)，没有登记释放，和因此在检测区中不会检测出报告物。该报告物释放区典型地可以包含填充有报告物分子的介孔材料的颗粒，其中该介孔材料能够通过立即释放报告物来与分析物相互作用。
图1B显示了适于检测多个分析物的根据第一实施方案的测试条的工作原理。该测试条包含样品注入区1、报告物释放区2和检测区3。有三种不同类型的传感材料已经沉积到基质上以形成报告物释放区2。所述三种类型的传感材料的区别在于被夹裹在该介孔材料内的报告物(报告物分子)以及相应的孔封闭帽的分析物特异性二者。因此，孔封闭帽的特异性适于特异性识别给定的分析物并且一旦分析物和帽彼此结合则从介孔中释放报告物。由于不同的报告物被指定给帽不同的特异性(即不同的分析物)，因此一旦报告物在其特定的检测区中积聚，则可以容易地检测相应的分析物的存在。
换言之，例如每个含有不同的报告物分子和每个能够与三种分析物中不同的一个相互作用的三种杂合传感颗粒的混合物包含报告物释放区2。与之组合，提供了结构化检测区3。换言之，提供了三个不同的检测区。三个不同检测区中的每一个包含选择性捕集材料，该材料适于特定识别三种分析物中之一，甚至在它们的混合物中。在流动ii)期间，包封在传感材料中的相应的光学报告物分子仅当各自的分析物存在于样品中时才释放(参见条b)-e))和随后通过分析物敏感性帽“识别”。由毛细管力驱动的被释放的光学报告物被多孔基质中的溶剂流携带朝向捕集区3。在液相流(例如溶剂)朝向条端部移动时，报告物特异性保留在指定区域中，在这里它可以被检测。在样品中不存在分析物的情况下(参见条a))，没有注册报告物的释放。例如通过在测试条与样品注入(施加)区相对的端部处提供吸收垫，可以支持流动的液体相的连续流。
根据一种实施方案，建议一种测试条，其中光学报告物包含在传感材料的孔中，其中该传感材料的孔被孔封闭材料封闭，其中孔封闭材料经选择以特异性结合分析物，当分析物特异性结合到孔封闭材料时，从孔中释放光学报告物。
有利地，A)：杂合的纳米颗粒材料，其可以释放初始在样品施加区中门控的报告物分子；和B)：固定在检测区中的特异性捕集材料，该捕集材料适于与从门控的杂合纳米颗粒中释放的报告物分子选择性相互作用，A)和B)的组合是用于设计新的侧流装置的有力工具：一方面，仅在分析物已经在独立的、分开的步骤中在孔开口处发生了特异性识别之后，该门控的传感器材料能够通过释放报告物分子而产生大量信号放大。另一方面，采用为了与所释放的报告物分子选择性相互作用的定制的捕集材料允许浓缩即聚焦所释放的报告物分子以用于更有效的检测和产生选择性多点检测区。这使得在多重检测各种分析物中同时进行几个报告物分子的同时检测成为可能。虽然理论上可能，但是同时地多重复用尚未实际实现，这是因为在测试条上或在侧流装置中分开不同的分析物和/或指示剂分子的难度。根据典型的实施方案，该报告物包含染料、荧光物质、荧光离子、稀土元素的离子或其任意组合，仅例举几个。将报告物选择成至少在被捕集材料捕获后可直接或间接地光学检测。
根据一种实施方案，建议了一种测试条，其中孔封闭材料非共价结合到传感材料，并且如果被分析物结合，则从传感材料上分离。
有利地，孔封闭材料到介孔无机材料的非共价结合促进了报告物从孔内部到溶剂流中的无阻碍扩散。另一方面，孔封闭材料(即“门”)本身可以容易地扩散而无任何位阻，并且促进了分析物的特异性结合。与共价连接的门相比，分析物结合的过程更快并且保留了其特异性。
根据一种实施方案，建议了一种测试条，其中光学报告物包含荧光染料、着色染料或稀土元素的发光无机荧光离子如铕离子，其典型地呈与有机感光剂配体的络合物形式。
有利地，荧光染料允许精致的灵敏和选择性光学检测。如果以与有机配体的络合物形式使用，则稀土元素如仅例举几个的铕、铽、镱、钇或钆的离子表现出特有的和窄的原子发射的发射线，并且也可以相当大的选择性和以高灵敏度检测出来。
根据一种实施方案，建议了一种测试条，其中该报告物包含罗丹明、荧光素、苯乙烯基、花青和多次甲基、吡啶吡喃/>硫代吡喃/>钌、锇或铱络合物、稀土元素(例如铕或铽)的发光络合物和方酸菁衍生物。此外，香豆素、二吡咯亚甲基或BODIPY、吡咯亚甲基、苯并呋喃、吡啶、萘酰亚胺、苯并/>唑、苯并/>二唑、苯并吲哚、DAPI、茋、/>嗪、苝、薁、苯乙烯基碱、藻红蛋白、方酸、紫菜碱和酞菁染料的所有中性、阳离子和阴离子衍生物。
有利地，大部分的这些荧光和发光材料和化合物是可商购的，和因此用于它们的检测的合适的光学和分光光度仪器也是可商购的。
根据一种实施方案，建议了一种测试条，其中捕集材料选自分子印迹聚合物、聚离子液体、聚电解质或在表面处包含选自以下官能团的化学官能化介孔材料：硫醇、异氰酸酯、氨基、羟基、环氧基或羧酸基。
有利地，该捕集材料适于特异性结合报告物。捕集材料对于报告物的亲和性可以例如归因于静电相互作用、选择性亲和结合、疏水性相互作用、非特异性理化吸附或混合模式机理。用于改性介孔材料的官能团可以选自例如羟基基团、羧基基团、环氧基基团、氨基基团、巯基基团或带电官能团如季铵基团。
根据一种实施方案，建议一种测试条，其中该捕集材料选自分子印迹聚合物，并且该分子印迹聚合物通过与交联剂交联而聚合一种或多种类型的单体来产生，该单体选自：丙烯酰胺、乙烯基吡啶、N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸苄酯、甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、N,N'-二甲基甲基丙烯酰胺、乙烯醇、乙烯基咪唑；该交联剂选自：二甲基丙烯酸乙烯酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、聚(丙烯酸)、双(β-羟乙基)砜、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯或例如季戊四醇三丙烯酸酯。
有利地，这些聚合物可以是例如用染料如罗丹明或荧光素印迹的，并且相当强地结合这样的报告物，而不引起任何显著的背景信号。带正电的染料也可以用于印迹。
根据一种实施方案，建议一种测试条，其中该捕集材料选自聚离子液体(PIL)或聚电解质，其中该聚电解质典型地包含聚阳离子或聚阴离子如聚(二烯丙基二甲基氯化铵)、聚(烯丙基胺)盐酸盐、聚丙烯酸、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(苯乙烯磺酸钠)(PSS)、环葡聚糖或聚葡聚糖。
有利地，这些聚电解质确保报告物的强结合，甚至在缓冲溶液(使用高浓度的聚电解质)中。可以容易地将聚阳离子或聚阴离子大分子施加至基质以制作检测区。另一优点在于聚电解质可以与阴离子或阳离子染料选择性相互作用。
根据一种实施方案，建议一种测试条，其中该测试条进一步包含吸收区，该吸收区布置在检测区下游和适于吸收溶剂。
有利地，可以获得流动溶剂的稳态流。已经在报告物释放区释放的报告物可以到达检测区，或可替代地，到达每个检测区。
根据一种实施方案，建议一种测试条，其中该测试条包含至少一个或多个检测区的区域被阻挡物包围。该阻挡物局部封闭该多孔基质的孔和/或局部改变多孔基质的溶剂润湿性。该阻挡物因此形成多孔基质中的通道。根据该实施方案的一种改变，所制作的通道可以连接样品施加区、报告物释放区和检测区。样品施加区、报告物释放区和一个或多个检测区可以在溶剂流动方向上彼此前后布置。
有利地，在多孔基质内形成的通道促进了液体相或溶剂的定向流动。这样的通道的标准化形状允许标准化用于用作移动相的溶剂的流动条件，并且允许比较不同的侧流条和因此标准化的测定。
根据一种实施方案，建议一种测试条，其中该阻挡物包含蜡。可替代地，例如通过结合至多孔基质的硅烷提供的官能团可以改变或限制基质的润湿性和因此在多孔基质内形成通道状结构或图案。
有利地，所提及的材料可以用于在纤维素和玻璃纤维纸之上/之中，以及在其他多孔基质材料中有效制作通道。
根据一种实施方案，建议一种测试条，其中该传感材料包含介孔无机材料。
有利地，许多的介孔无机材料是可获得的和甚至可商购的。所述介孔材料可以容易地用报告物物质如荧光染料或离子填充。
根据一种实施方案，建议一种测试条，其中该介孔无机材料包含二氧化硅、氧化铝、TiO2、碳、碳氮化物、碳化硅、碳氧化硅、碳氮化硅、氮化硅、氮氧化硅、氮化硅铝、或碳氮化硅硼。
有利地，这些材料是化学惰性的，其可以容易地用报告物分子如染料负载，并且可以容易地用合适的封闭材料改性以产生适于分析物的传感材料。
根据一种实施方案，建议一种测试条，其中该多孔基质选自纸、毡、非织造物、纤维、压缩或烧结的粉末、布或薄纱，其中该纸、毡、非织造物、纤维、压缩或烧结的粉末、布和薄纱包含以下各项中的至少之一：聚合物如棉花或纤维素、玻璃、陶瓷、碳、石墨烯、矿物或金属。
有利地，合适的材料可以选择成被待分析的样品的实际溶剂或液体相可润湿的。
根据一种实施方案，建议一种测试条，其中该测试条包含一个报告物释放区和在2-7个之间的检测区。本文中这样的多个检测区也可以描述为结构化检测区。
有利地，多个检测区允许应用图案识别原理，和因此自动化样品分析和多重复用。多重测定是分析化学、临床化学和生物化学中用于在单次运行/循环的测定中同时测量多个分析物的一种测定类型。它区别于一次测量一种分析物的程序。使用多个检测区的优点在于可以在单一通道中进行多重测定。在不存在这些检测区的情形下，需要不同的通道来产生多重复用。
根据一种实施方案，建议一种测试条，其中该测试条至少在报告物释放区和/或在检测区包含至少两个基质层。
有利地，测试条可以容易地制备，例如通过将包含指定区域(例如检测区)的基质层夹入两个覆盖并封闭该指定区域的未改性基质层之间来进行。条也可以通过层合，使用毛细管力以使得报告物流动和扩散通过不同的区域来制备。
根据一种实施方案，该测试条的形状偏离非正方形矩形，并且包含正方形矩形或任何其他形状。例如该测试条可以包含圆形或三角形的至少一部分。
虽然长方形形状的测试条可以优选作为侧流测定中最常用的形式，但是其他形状的多孔基底可以用于产生流动液体相的定向流，其将所用的一个或多个报告物带到一个或多个检测区。多个图案的组合可以用于产生条中合适的溶剂流动。
根据一种实施方案，样品施加区布置在报告物释放区的顶部。样品施加区可以直接布置在报告物释放区的顶部或与中间基质层一起形成堆叠体。
有利地，不同的多孔基质材料可以经选择以用于不同区域。根据该改变，所示的区(即样品施加区、报告物释放区和至少一个检测区)沿着溶剂流布置，该溶剂将一个或多个报告物带到一个或多个检测区。
根据一种实施方案，提出了一种检测分析物的方法，该方法包括：
-提供根据上述实施方案中任一个的测试条；
-将样品施加到该测试条的样品施加区；
-在至少一个检测区中检测光学报告物的存在和/或量和/或浓度；
-确定该样品中分析物的存在和/或浓度。
有利地，该方法适合于多重测定形式。
根据一种实施方案，所提出的方法进一步包括提供用于产生从样品施加区到报告物释放区和从报告物释放区到至少一个检测区的连续或不连续流体流的液体。该液体可以选自用于分析物的溶剂。
该液体可以通过样品的液体相如溶剂来提供。可替代地，该液体如用于分析物的溶剂可以在分开的步骤中、在该样品已经施加后加入。典型地，该液体产生了流(液体流)，其将分析物从样品施加区至少带到报告物释放区。此外，产生了从报告物释放区导向检测区的流(液体流)。取决于液体的量，可以存在从样品施加区通过报告物释放区到检测区的连续液体流。然而，还可以具有第一流和第二流，该第一流从样品施加区导向报告物释放区并且可以通过重力和/或通过毛细管力驱动。该第二流典型地通过毛细管力驱动并且从报告物释放区朝向检测区导向和甚至可以到达检测区下游的吸收垫。有利地，不同溶剂的组合可以使得能够检测分析物悬浮液。
根据一种实施方案，提出一种检测分析物的方法，其中该光学报告物是荧光染料和该检测使用手持装置(即便携式装置)通过荧光测量来完成。
有利地，所述检测方法可以在现场当场使用，而无需复杂的仪器，甚至在没有或具有最小基础结构的设备中。
根据另一实施方案，便携式装置如智能手机、平板电脑或移动通信和计算装置可以用于收集光学信号如光致发光，并且确定所选择的检测区中光致发光是否是某些分析物存在的指示。
一些智能手机模块可以装备有允许用户和/或程序员访问或控制照相机的曝光和快门速度的装置。可以有利地从照相机采集中获得合适的原始图像，例如没有遭受自动曝光补偿算法的图像。这样的可以整合到智能手机硬件或软件中的算法对于作为业余摄影师的终端用户而言可以是方便的，但是当使用智能手机来进行化学分析和化学计量技术时会产生问题。例如由照相机检测器如CMOS或CCD接收的勒克斯(Lux)量可能会自动调节以匹配某些预定的勒克斯(Lux)标准。使用这样的值代替正确地校正和校准的值可导致易误解和错误的结果。
因此，根据另一实施方案，所提出的方法可以包括将检测区中的光致发光与校正值比较；例如将信号如发光与参照物比较。该参照物可以例如是存储数据或测试条上的参照点。
此外，在检测区产生的信号强度与在报告物释放区产生的信号强度的比率可以用于分析物的半定量检测。特别地，在检测区的荧光强度除以在检测区的荧光强度加上在报告物释放区的荧光强度之和的商，即等价于所释放的报告物除以报告物总量的比率，可以用于分析物的半定量检测。同样可以使用在不同的激发或发射波长下获得的荧光值的比率。根据典型的实施方案，条或至少该检测区的数字图像可以用数码相机来获得。该数字图像或其部分可以使用开放源图像处理程序ImageJ(https://imagej.net/)来处理。这样的处理可以用于内部参照和半定量检测二者。
上述每个实施方案可以与任何其他实施方案相组合，除非有明确地相反指示。
所提出的实施方案包含适于侧流测定的测试条或浸量尺的设计(参见图1)并且包含：第一，用于样品引入的部分(即样品施加区)；第二，含有能够与分析物特异性相互作用的介孔杂合传感材料的部分或段(即报告物释放区)；和第三，含有能够与从传感材料中释放的光学报告物分子特异性相互作用的捕集材料的部分或段(即检测区)。该部分可以含有大于一种捕集材料，并且目的是当使用传感材料的混合物时保留不同的报告物(例如染料、荧光物质、荧光离子、稀土元素的离子或它们的组合，仅例举几个)作为报告物分子。
对于侧流或浸量尺测定形式来说一旦开始流动，则溶剂可以将分析物从区1传输到区2，在区2中沉积了传感材料并且在区2中报告物分子从传感材料的释放将仅在相应的分析物存在下发生。然后报告物将从区2朝向各自的检测区3迁移。在那里一个或多个报告物将根据它(它们的)具体化学性质，使用各种选择成与报告物互补的大分子或捕集材料得以保留。归因于报告物与捕集材料的相互作用，报告物将典型地固定在该检测区中。
该实施方案的技术目标是为了在侧流装置上提供无标记的、潜在的多重检测，使用固定在测试条的检测区中的多个捕集材料。这些固定的大分子或捕集材料将能够与光学报告物选择性相互作用。该光学报告物已经通过从样品注入区(即样品施加区)朝向一个或多个检测区移动的分析物而从传感材料中选择性释放。这种方法的优点在于在成功的检测事件过程中从门控材料的孔释放的报告物仅在条上明确规定的位置处(即在检测区或在各种检测区之一中)被专门捕集。其不仅改进了选择性，而且改进了灵敏度，这归因于报告物在明确规定和限定的区域中的聚焦。
该多孔基质材料可以包含：
a)纤维素、棉、布、石墨烯、碳纳米管(CNT)；玻璃纤维纸、玻璃或聚合物，它们用能够与光学报告物特异性相互作用的某些有机基团改性。
b)用于光学报告物的特异性检测的某些分子印迹聚合物(MIP)或印迹凝胶，阳离子或阴离子聚电解质，二氧化硅或氧化铝介孔材料(例如SiO2-型MCM-41、HMS、MSU-n、MSU-V、FSM-16、KSW-2、SBA-n(n＝1、2、3、8、11-16)、FDU-n(12、14、15、16)、UVM-7、UVM-8、M-UVM-7或M-UVM-8、Al2O3-型MCM-41)，该介孔材料利用某些有机基团使用多个有机硅烷(例如使用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的氨基，或通过氨基与琥珀酸酐的开环连接子延伸反应的羧酸基团)改性。
所描述的实施方案对于在医用、环境、安保和食品诊断工业中检测小分子具有通用应用领域。为了证实所建议的实施方案的可行性，以下给出了描述所使用的实验室方法和材料的实施例。
实施例
MCM-41和SBA-15型介孔材料的合成依照以前报告的程序来进行。对于MCM-41，首先将正十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，1.00g，2.74mmol)溶解在480mL的milliQ水中。然后，将3.5mL的NaOH(在milliQ水中2.00M)加入至CTAB溶液，随后将溶液温度调节到80℃。然后将TEOS(5.00mL，2.57·10–2mol)逐滴加入至表面活性剂溶液中。将混合物搅拌2h以得到白色沉淀物。最后，将固体产物离心，用milliQ水和乙醇洗涤，并且在60℃下干燥。为了除去表面活性剂，将样品在560℃下煅烧8h。
SBA-15用三嵌段聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)(EO20–PO70–EO20，P123)共聚物作为结构导向剂和正硅酸四乙酯(TEOS)作为二氧化硅源来合成。在一种典型的合成中，将4.0g(0.69mmol)的P123溶解在120mL水和19.41mL的HCl中，然后在35℃下搅拌1小时以便溶解聚合物。然后将9.15mL的TEOS(41mmol)逐滴加入到均匀溶液中，并且在35℃下搅拌24h。将获得的凝胶在100℃下在特氟隆(Teflon)烧瓶中在不搅拌的情形下老化另外24h。将所获得的白色固体过滤，用蒸馏水洗涤和在70℃下在真空中空气干燥12h。最后，通过在560℃下8h期间的煅烧来除去模板剂。
以下中描述了用于检测染料(报告物)的材料，尤其是合成APTES-MCM和APTES-SBA材料。材料根据所报告的程序来改性。将100mg的MCM-41或SBA-15在2.5mL乙腈(MeCN)和过量3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES；186.3μL，8mmolg–1SiO2)中的悬浮液在氩气氛中在5.5h期间在室温下搅拌。然后，将材料在约10000rpm下离心5min并且用1.5mL的MeCN洗涤两次。最后，将材料在真空中在40℃下干燥2h，这产生了所得的材料APTES-MCM和APTES-SBA。
以下中描述了COOH-MCM的合成。为了用羧酸基团改性MCM-41，将50mg APTES-MCM材料悬浮在1.5mL的EtOH中，依照所报告的程序进行。将250μL的琥珀酸酐溶液(100mg mL-1)加入至所制备的每个悬浮液中，并且使得悬浮液在40℃下搅拌过夜。然后将材料在约10000rpm下离心5min并且用1.5mL的EtOH洗涤两次。最后，将材料在真空中在40℃下干燥2h，这产生了所得的材料COOH-MCM。
以下中描述了PA-COOH-MCM和PVP-APTES-MCM的合成。将聚(乙烯基吡咯烷酮)40(PVP-40)和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDDAC)分别化学吸附到APTES-MCM和COOH-MCM的表面上。为了合成PVP-APTES-MCM，将20mg的APTES-MCM在25mg mL-1的处于H2O(1mL)中的PVP-40溶液中悬浮2h。将20mg的COOH-MCM在1mL的H2O(其含有50μL的35％的PDDAC在水中的溶液)中悬浮2h而制备了PA-COOH-MCM。2h后，将两种悬浮液在约10000rpm下离心5min并且用1.5mL的H2O洗涤两次。最后，将材料在真空中在40℃下干燥2h，这产生了所得的材料PVP-APTES-MCM和PA-COOH-MCM。
以下中描述了APTES-纤维素纸(APTES-C)和APTES-玻璃纤维纸(APTES-GF)的合成。纤维素纸和玻璃纤维纸利用氨基使用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)来改性。为此目的，将20张相应的纸(2×0.5cm)悬浮在7mL甲苯和100μL的APTES中。将样品在80℃下在16h期间搅拌。收集所得的经氨基改性的纸，和然后用甲苯洗涤2次并且用EtOH洗涤1次，并且在真空下干燥3h，获得相应的APTES-C和APTES-GF纸。
以下中描述了COOH-纤维素纸(COOH-C)和COOH-玻璃纤维纸(COOH-GF)的合成。为了用羧酸基团改性APTES-C和APTES-GF纸，将5张每个纸与1.5mL的EtOH混合，依照所报告的程序。将250μL琥珀酸酐溶液(100mg mL-1)加入至每个所制备的混合物中，并且将其在40℃下搅拌过夜。然后将纸移出并且用1.5mL的EtOH洗涤两次。最后将纸在真空中在40℃下干燥2h，这产生了所得的纸COOH-MCM和COOH-SBA。
以下中描述了甲基丙烯酸酯-玻璃纤维纸(M-GF)的合成。玻璃纤维纸用甲基丙烯酸酯基团，依照用于APTES-GF所述相同的程序但是使用甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯代替APTES来改性，获得了纸M-GF。
以下中描述了用于检测染料的在纸上的选择性聚合物凝胶和聚合物凝胶的合成。特别地，描述了FLU-M-GF、SURB-M-GF、SURG-M-GF、R6G-M-GF和RuBipy-M-GF的合成。纸上的印迹纸凝胶使用含水沉淀聚合法，依照文献程序来制备。典型地，将10张M-GF(2×0.5cm)与含有丙烯酰胺(AAm；29.1mg，0.41mmol)和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm；46.4mg，0.41mmol)的6mL的PBS溶液(20mM；pH7.2)混合。将150μL的5mM的相应模板剂分子2,7-二氯荧光黄(FLU)、磺化罗丹明B(SURB)、磺化罗丹明G(SURG)、罗丹明6G(R6G)或双吡啶钌(RuBipy)的溶液加入至该溶液中，和将混合物在25℃下在缓慢搅拌下温育30min以形成络合物。其后，加入交联剂N,N'-乙烯双(丙烯酰胺)(EBAAm；25.2mg；0.15mmol)。在将混合物用N2吹扫1h后，通过加入过硫酸铵(APS；6mg)和N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED；3μL)开始聚合。反应在25℃下在N2气氛下持续1h，在10min后观察凝胶的形成。在1h的反应后，通过从凝胶中移出它们，随后用NaCl溶液(1M)彻底洗涤，直到完全除去未反应的单体和模板剂，来收集所得的印迹纸凝胶。最后，将相应的纸在真空中干燥2h，这产生相应的FLU-M-GF、SURB-M-GF、SURG-M-GF、R6G-M-GF和RuBipy-M-GF纸凝胶。并行地，将凝胶FLU-MIG、SURB-MIG、SURG-MIG、R6G-MIG和RuBipy-MIG在真空中干燥过夜。非印迹凝胶和纸凝胶(NIG和NIG-M-GF)以相同方式制备，除了在聚合期间没有加入模板剂之外。
以下将进一步描述仅采用在相互作用区上沉积染料的研究结果。
在第一尝试中，为了初始检查作为一个或多个检测区3制备的材料的效力，仅将各种染料溶液点到条的相互作用区2上，不包括更复杂的介孔杂合传感材料。这里，示例性研究采用玻璃纤维和硝基纤维素膜二者，用在区3上制备的所选择的聚电解质和介孔捕集材料来进行。
以下将描述作为捕集材料(即用于形成检测区)施加的聚电解质的研究。采用PDDAC溶液(17％)在距离膜底部4cm的玻璃纤维膜上产生厚度0.5cm(1μL的3个点)的线，其类似于第一检测区(图2a)。将1μL的磺化罗丹明B溶液(SURB；在H2O中10mg mL-1)点到距离底部2cm处的相互作用区上，并且将条放入LF盒(侧流盒)中，使用棉纸作为样品和吸收垫。通过移液100μL的H2O(图2b)和PBS缓冲剂(图1c；0.8mM，pH7.5)产生流。通过在UV光(λ激发254nm)下照相来监控该流。仅在H2O的情况下，该检测区能够将染料有效保留在该区中，甚至1h后(图2b/1和3)。然而，当使用缓冲剂时，我们观察到染料的保留仅在第一个5min期间是有效的(图2b/2)；其后含有染料的聚电解质线也开始随着该流向条的端部移动，拖尾了染料(图2b/4)。
在另一实验中，使用更浓的PDDAC溶液(35％)来尝试改进针对PBS(0.8mM，pH7.5)的“免疫性”；PBS缓冲剂是一种非常频繁的溶剂，并且往往对于成功进行生物大分子测定是必要的。为此目的，将较细的3mm聚合物线点到纸上和使用1μL的SURB(在H2O中10mgmL-1)。在那种情况下，我们观察到染料是流动的，并且保留在小区域中。然而，同样地，保留仅在3min是有效的(图2c/1)。其后，染料随着流动持续迁移(图2c/2)。
在另一实验中，我们制备了35％的PDDAC溶液(35％)的较粗的线(约6mm)。此处，我们观察到一旦它到达了聚合物线的区域，则流动停止，在线开始处预浓缩SURB(图2d)。通过所进行的实验，我们可以得出结论，采用聚电解质作为捕集材料对于非缓冲的溶剂或在小于5min内进行测定的测定中使用缓冲剂是有效的。这意味着使用缓冲剂的情形下，保留仅在第一分钟期间是有效的，其后保留不再有效。在所有情况下，流动真的很快，在约1分钟内条完全润湿，并且染料开始聚集在聚合物线上。
以下将描述利用介孔材料作为捕集材料的研究。在第一实验中，测试了用于制备捕集材料的介孔骨架的作用。对于该尝试，使用2,7-二氯荧光黄作为报告物染料。制备了含有疏水性蜡图案的多个硝基纤维素条，其定义了在条上的多个区。将4.5×0.5cm的硝基纤维素条印迹化，并且在105℃下在烘箱中加热1min以确保蜡渗透到纸中，这导致在膜中纸厚度的阻挡物(图3a)。将1μL的2,7-二氯荧光黄溶液(FLU；10mgmL-1)沉积到报告物释放区2)上，而将2.5μL的10mgmL-1的相应APTES-MCM和APTES-SBA材料的含水悬浮液悬浮到检测区3)上。测试了沉积在区3)中的捕集材料的效力，在样品施加区1)上加入了15μL的PBS溶液(80mM；pH7.5)。
在染料溶液沿着条流动期间，预期捕集FLU(一种带负电的染料)在检测区3)中在经氨基改性的材料中发生，因为这些基团在中性pH下大大地质子化，并且由于静电力而应当能够捕集负电物类。在2min后，将条置于自制的装备有两个LED(λ激发470nm和505nm)作为激发源和滤光片(532nm截止和550nm长通)的3D打印灯下，并且拍摄一些照片以观察检测区3)中材料的捕集效力。图3b显示了区3中含有APTES-MCM的条，而图3c显示了含有APTES-SBA的条。可以看出，与SBA-15相比，MCM-41骨架能够保持明显更多的染料。
考虑到MCM-41是明显更有效的，用COOH-MCM代替APTES-MCM在检测区3)中进行类似的实验。在相应的流动之后，没有FLU保留在检测区3中，这最有可能是因为带负电的材料和所用的阴离子染料之间的静电斥力(图3d)。
为了避免当使用阳离子染料时染料保留在硝基纤维素膜上，还测试了玻璃纤维膜。归因于纸较高的亲水性，材料的点是更浓缩的，并且必需将10μL的10mg mL-1的APTES-MCM悬浮液点两次以产生正确的线。图4a显示了在条的流动后APTES-MCM线的效力，该条在报告物释放区2中含有1μL的SURB或FLU。该染料的保留是有效的，甚至在几个小时后。
考虑到所发现的结果，在第二实验中我们使用了COOH-MCM和APTES-MCM，目的是在检测区上产生2个线，即制作两个分开的检测区，并且将一种阴离子染料与一种阳离子染料分开。将两种不同染料带负电的染料(FLU)和带正电的染料(R6G；1μL，1ppm)的混合物点到相互作用区上。将COOH-MCM点到距离底部约3cm距离的线上(L1)，而将APTES-MCM点在距离底部4cm处(L2)。在流动后，观察到仅对应于L1中的R6G和L2中的FLU的选择性荧光(图4b)。
最后，我们以类似方式测试了材料PVP-APTES-MCM和PA-COOH-MCM对于染料罗丹明6G和2,7-二氯荧光黄的保留性，以完成用COOH-MCM和APTES-MCM进行的研究。为此目的，使用PVP-APTES-MCM来产生L1，而使用PA-COOH-MCM来产生L2。如在图4c上可见，发现与在先实验类似的结果。
以下将描述利用改性的纤维素和玻璃纤维纸作为多孔基质的研究。在第一实验中，测试了所用纸的性质的影响。对于这些实验，使用FLU作为模型染料。因此，将几张0.5×0.5cm的APTES-C和APTES-GF纸(其代表检测区3)固定到两个GF纸的膜之间，等于总的条长度是3.5cm。将1μL的FLU溶液(10mgmL-1)点在距离底部约1cm处(图5a)，其模拟了报告物释放区2。将条置于LF盒中。在加入了100μL的PBS(80mM，pH7.5)之后，在UV光下通过与前述类似程序来监测沿着条的流动。在两种情况下，观察FLU随时间的保留性(图5b和5c/1和5c/2)，与APTES-GF相比，在APTES-C上的保留得更长。为了研究纸的选择性，用一张COOH-GF进行相同的实验(图5b和5c/3)，在那种情况下，观察到FLU沿着膜的快速流动；不存在保留。
为了量化所保留的荧光染料的量，使用ImageJ软件评价了作为时间函数的检测区面积的积分荧光。结果在图5c中描绘。
以下将描述利用在纸上的聚合物凝胶的研究。从用印迹凝胶所制备的纸中，我们选择了FLU-M-GF来进行试验，还使用了NIG-M-GF作为参照物。将一张0.5×0.5cm的NIG-M-GF或FLU-M-GF作为捕集区固定在两个GF纸膜之间，这产生总长3.5cm的条。将1μL的FLU溶液(10mgmL-1)点在距离底部约1cm处(相互作用区；图6a)。为了检查FLU-M-GF相比于其他染料的选择性，制备了在检测区含有FLU-M-GF的另一个条，并且将1μL的SURB溶液(10mgmL-1)代替FLU点到报告物释放区上。
将条置于LF盒中，并且在加入100μL的PBS之后，在UV光下通过如前所述的类似程序监测沿着条的流动的发展。图6b显示了对于1)NIG-M-GF和2)FLU-M-GF(使用FLU作为染料)和3)FLU-M-GF(使用SURB作为染料)，所制备的三种条作为时间函数的相应的流动。如可以看出的，FLU的保留仅使用FLU-M-GF是有效的，而SURB没有被FLU-M-GF保留。还使用ImageJ软件来量化作为时间函数的保留在NIG-M-GF和FLU-M-GF上的荧光量。结果是与在UV灯下所观察的荧光一致(图6c)。
在第二实验中，我们制备了含有两个检测区的条，第一区具有SURB-M-GF和第二区具有FLU-M-GF印迹凝胶，如图7a中所示。在一个条上，将1μL的含有1mM(总计)的FLU和SURB的混合物的溶液点在距离底部约1cm处，而仅将溶剂点到另一个条上，以评价溶剂单独对于荧光的影响。将条放在侧流盒中，并且在开始时和在结束时加入一张玻璃纤维纸来具有样品垫和吸收垫。将200μL的PBS引入样品垫上，并且使用如前所述的荧光自制灯监测流动。图7b)和7c)显示了在作为时间函数(6c)和在实验结束时(6b)的相应区所观察到的颜色和荧光。如可以看出的，SURB仅保留在SURB-M-GF区(S)中，而FLU仅保留在FLU-M-GF区(F)中。图7d显示了通过ImageJ来量化的，作为时间函数的在条上保留的荧光量。如可以看出的，在不存在染料的情形下，对于FLU-M-GF条没有观察到背景变化(2F)，而对于SURB-M-GF观察到背景小的下降，这归因于凝胶从干燥态向润湿态的转变(2S)。在染料混合物的存在下，首先在第一区上观察到荧光的增加，这归因于SURB-M-GF(1S)，而在2min后，在第二FLU-M-GF区中也观察到荧光的增加，这归因于FLU的保留(2S)。
以下将描述在相互作用区(即在传感区中)采用门控的传感材料的研究。受到模型研究中用荧光染料所发现的结果的鼓励，我们决定还在条上使用门控的传感材料。为此原因，将玻璃纤维纸用作多孔基质。我们点了2μL的5mgmL-1传感材料的悬浮液，该传感材料能够特异性检测季戊四醇四硝酸酯(PETN)并且其在孔内部含有SURB。
在第一实验中，使用17％和35％的PDDAC溶液制备了不同的条。我们制备了含有6mm的PDDAC(17％)线作为检测区的多个条，以及含有3或6mm的35％溶液的线作为检测区的其他条。条用流动的160μL的PBS(80mM，含有2.5％的MeOH)来发展，该PBS具有25ppm PETN的尖峰或不含分析物。图8显示了仅在PETN存在下，相当大量的染料可以在捕集区中检测出(线1，图8)。此外，与使用35％PDDAC的线(图8b的3mm带，和图8c的6mm带)相比，使用稀释的聚合物线(17％，图8a)的染料不太浓。虽然有发现的结果，但是染料在情况a)和b)中的保留性仅在第一个4min过去之前有效，在该时间之后染料不再被保留。停止染料流动穿过聚合物线的有效保留仅通过35％溶液和6mm的宽带而观察到。这种设置将染料保留大于30min。
与所提出的实施例和实施方案相反，已知的侧流测定基于传统的报告物方案并且没有产生信号的放大。传统侧流测试在“测试线”和“对照线”上的信号是由于分析物(其在之前的步骤中能够与偶联到着色或荧光颗粒上的相应抗体反应)与共价结合到条上的相应抗体的直接反应而产生的，具有1：1的化学计量。根据本文所述的实施方案，有利地，可以通过如下来获得大量的信号放大：首先，通过施加存在于报告物释放区中的敏感材料，和其次，通过在检测区中捕集和聚焦选择性释放的报告物。
而在大部分之前已知的侧流测定中，分析物的检测需要存在第二结合剂作为报告物，本文所述的实施方案是无标记的。有利地，根据一个或多个所述实施方案，每个通道可以检测并量化大于一种分析物。之前尚未证实在特定捕集区中释放的报告物分子的受控的聚焦或浓缩。
根据本文提出的实施方案，侧流条的多孔基质可以包含：
a)纤维素、棉、布、石墨烯、碳纳米管(CNT)；玻璃纤维纸、玻璃或聚合物，它们用能够与光学报告物特异性相互作用的某些有机基团改性。
b)用于光学报告物的特异性检测的某些分子印迹聚合物(MIP)或印迹凝胶，阳离子或阴离子聚电解质，二氧化硅或氧化铝介孔材料(例如SiO2型MCM-41、HMS、MSU-n、M5U-V、F5M-16、KSW-2、SBA-n(n＝1、2、3、8、11-16)、FDU-n(12、14、15、16)、UVM-7、UVM-8、M-UVM-7或M-UVM-8、Al2O3型MCM-41)，该介孔材料用某些有机基团使用多个有机硅烷(例如使用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的氨基，或通过氨基与琥珀酸酐的开环连接子延伸反应的羧酸基团)改性。
通过采用能够与不同的光学报告物分子选择性相互作用的材料，可以在检测区中产生多个区域，这允许报告物分子的空间聚集以改进灵敏度并且允许在一个单一条上同时检测多个物质的可能性。
所报告的信号在空间上与传感材料和分析物的相互作用分开的区域中产生。所报告的信号因此仅基于在传感材料与分析物相互作用之后释放的光学报告物分子的捕集。不需要标记或使用第二结合剂来在规定区域中产生信号。
由于光学报告物分子不包含在样品中并且捕集区的官能团总是相对于报告物分子高度过量的，因此可以用相当简单的力如静电、氢键、共价键(例如用硼酸检测糖)、配位键、π-π堆叠或疏水性相互作用来容易地完成报告物分子在捕集区中的完全保留。
此外，可以在检测区中使用捕集材料的图案以用于引入不同光学报告物分子的门控材料的混合物，这允许用一个测试条或尺同时检测多个分析物。
典型的实施方案包括在指定区域使用捕集材料，其不与分析物或标记的竞争剂相互作用，但是其可以以比分析物高得多的浓度吸收并保留化学上完整的不同光学报告物分子。这允许聚焦分析物的放大的检测和它的半定量分析。
有利地，可以产生在侧流条、平坦基底或尺上的多个或结构化检测区，以用于多重光学检测。
有利地，根据一种或组合的所述实施方案的分析物检测是无标记的。
此外，实现了灵敏度的增加，这不仅由于通过所用传感材料而产生的所述信号放大，而且由于所释放的报告物分子的专门捕集和浓缩。
本文所述实施方案的一些方面可以汇总如下。
1.所提出的是适于侧流测定的测试条或浸量尺的设计(参见图1)，并且其包含：
a)用于样品引入的部分或段；b)含有能够与分析物特异性相互作用的介孔杂合传感材料的部分或段；和c)含有捕集材料的部分或段，该捕集材料能够与一个或多个光学报告物分子相互作用，该一个或多个报告物分子是从该介孔杂合传感材料释放的。
2.如方面1中所述的测试条，其中该传感材料包含具有孔的多孔载体材料和包含在该多孔载体材料的孔中的光学报告物分子，其中该多孔载体材料的孔被孔封闭材料封闭，这形成与该多孔载体材料的非共价结合，其中该孔封闭材料经选择以特异性结合液体样品中的分析物，和其中当该分析物特异性结合到孔封闭材料上时，该光学报告物分子从未封闭的孔中释放。
3.如方面1中所述的测试条，其中该能够与光学报告物分子相互作用的材料是用某些能够与所述报告物相互作用的有机基团改性的纤维素或玻璃纤维纸。该有机基团例如选自氨基或羧酸基团。
4.如方面1中所述的测试条，其中该能够与光学报告物分子相互作用的材料是用某些能够与所述报告物相互作用的有机基团改性的介孔材料。该有机基团能够吸附或共价结合到该表面上。
5.如方面1中所述的测试条，其中该能够与光学报告物分子相互作用的材料是针对所述报告物产生并且能够与之特异性相互作用的分子印迹聚合物。
6.如方面1中所述的测试条，其中该能够与光学报告物分子相互作用的材料是能够与所述报告物特异性相互作用的印迹凝胶。
7.如方面1中所述的测试条，其中该能够与光学报告物分子相互作用的材料是硝基纤维素或玻璃纤维纸，其含有能够与所述报告物特异性相互作用的直接接枝的分子印迹聚合物或印迹凝胶。
8.如方面1中所述的测试条，其中该含有介孔传感材料的部分或段包含不同的介孔传感材料的图案(参见图4)。
9.如方面1中所述的测试条，其中为了同时检测大于一种分析物的存在，该含有方面3-7中所述材料的部分含有在权利要求3-7中所述材料的有序图案或阵列(参见图4)。
10.如方面2中所述的传感材料，其中该光学报告物描述在下表1中。
11.如方面1中所述的测试条，其中捕集材料和光学报告物分子的组合描述在下表2中。
表1.光学报告物分子的种类。
表2.表1的捕集材料和光学报告物分子的组合。
缩写
MCM-41、HMS、MSU-n、MSU-V、FSM-16、KSW-2、SBA-n(n＝1、2、3、8、11-16)、UVM-7、FDU-n(12、14、15、16)、UVM-8、M-UVM-7或M-UVM-8、Al2O3型MCM-41
＝介孔材料
AAm＝丙烯酰胺
APS＝过硫酸铵
APTES＝3-氨丙基三乙氧基硅烷
APTES-C＝APTES改性的纤维素纸
APTES-GF＝APTES改性的玻璃纤维纸
APTES-MCM＝APTES改性的MCM-41
APTES-SBA＝APTES改性的SBA-15
CTAB＝正十六烷基三甲基溴化铵
COOH-MCM＝COOH改性的MCM-41
COOH-C＝COOH改性的纤维素纸
COOH-GF＝COOH改性的玻璃纤维纸
COOH-SBA＝COOH改性的SBA-15
EBAAm＝N,N'-乙烯双(丙烯酰胺)
FLU＝2,7-二氯荧光黄
FLU-M-GF＝2,7-二氯荧光黄改性的M-GF
FLU-MIG＝2,7-二氯荧光素改性的分子印迹凝胶
M＝甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯
M-GF＝甲基丙烯酸3-(三甲氧基甲硅烷基)丙酯改性的玻璃纤维纸
＝甲基丙烯酸酯-玻璃纤维纸
MCM＝介孔材料，MCM-41
MeCN＝乙腈
MeOH＝甲醇
MIG＝分子印迹凝胶
NIG＝非印迹凝胶
NIG-M-GF＝非印迹凝胶改性的M-GF
NIPAAm＝N-异丙基丙烯酰胺
P123＝EO20-PO70-EO20＝三嵌段聚(环氧乙烷)-聚(环氧丙烷)-聚(环氧乙烷)
PA-COOH-MCM＝PDDAC改性的COOH-MCM-41
PBS＝磷酸盐缓冲的盐水
PDDAC＝聚(二烯丙基二甲基氯化铵)
PETN＝季戊四醇四硝酸酯
PVP＝聚(乙烯基吡咯烷酮)
PVP-APTES-MCM＝PVP改性的APTES-MCM-41
R6G＝罗丹明6G
R6G-M-GF＝玻璃纤维纸上的罗丹明6G印迹聚合物
R6G-MIG＝罗丹明6G分子印迹凝胶
RuBipy＝双吡啶钌
RuBipy-M-GF＝玻璃纤维纸上的双吡啶钌印迹凝胶
RuBipy-MIG＝双吡啶钌印迹凝胶
SBA-15＝介孔二氧化硅材料(Santa Barbara Amorphous)，
SURB＝磺化罗丹明B
SURB-M-GF＝磺化罗丹明B改性的M-GF
SURB-MIG＝磺化罗丹明B改性的分子印迹凝胶
SURG＝磺化罗丹明G
SURG-M-GF＝磺化罗丹明G改性的M-GF
SURG-MIG＝磺化罗丹明G改性的MIG
TEMED＝N,N,N',N'-四甲基乙二胺
TEOS＝正硅酸四乙酯；
已经参照各种示例性实施方案和实施例解释了本发明。这些实施方案和实施例并非意图限制通过权利要求及其等价物来定义的本发明的范围。对于本领域技术人员来说显而易见的是，本文所述实施方案可以以各种方式实施，而不脱离发明的范围。实施方案中所述的各种特征、方面和功能可以与其他实施方案组合。

Claims (15)

1.一种包含多孔基质的测试条，该测试条包含：
-样品施加区，其用于施加包含分析物的液体样品；
-报告物释放区，其包含传感材料，该传感材料适于响应于分析物的存在而释放光学报告物，该报告物释放区布置在该样品施加区的下游；
-检测区，其包含适于选择性结合该光学报告物的捕集材料，并且布置在该报告物释放区的下游，
其中该光学报告物包含在该传感材料的孔中，其中该传感材料的孔被孔封闭材料封闭，其中选择该孔封闭材料以特异性结合该分析物，当该分析物特异性结合到该孔封闭材料上时从该孔中释放该光学报告物，
其中该捕集材料选自分子印迹聚合物、聚电解质或包含以下各项中的至少之一的官能化介孔材料：硫醇、异氰酸酯、氨基、羟基、环氧基、羧基或带电官能团；并且
其中该测试条被配置为允许聚焦的分析物的放大检测。
2.根据权利要求1所述的测试条，其中该带电官能团为季铵基团。
3.根据权利要求1的测试条，其中该孔封闭材料非共价结合到该传感材料上，并且如果被分析物结合则从该传感材料上分离，并且该光学报告物包含荧光染料、着色染料或稀土元素的发光无机荧光离子。
4.根据权利要求3的测试条，其中该荧光染料包含以下各项中的至少之一：罗丹明；荧光素；苯乙烯基；花青或多次甲基；吡啶吡喃/>硫代吡喃/>钌络合物；锇络合物，铱络合物；稀土元素的发光络合物；方酸菁衍生物；以下各项的中性、阳离子或阴离子衍生物：香豆素、二吡咯亚甲基或BODIPY、吡咯亚甲基、苯并呋喃、吡啶、萘酰亚胺、苯并/>唑、苯并二唑、苯并吲哚、DAPI、茋、/>嗪、苝、薁、苯乙烯基碱、藻红蛋白、方酸、紫菜碱或酞菁染料。
5.根据权利要求1或2的测试条，其中该测试条包含至少一个或多个检测区的区域被阻挡物包围，该阻挡物封闭该多孔基质的孔和/或改变该多孔基质的溶剂润湿性并且在该多孔基质中形成通道。
6.根据权利要求5的测试条，其中该阻挡物由蜡形成。
7.根据权利要求1或2的测试条，其中该传感材料包含介孔无机材料，其中该介孔无机材料包含二氧化硅、氧化铝、TiO2、碳、碳氮化物、碳化硅、碳氧化硅、碳氮化硅、氮化硅、氮氧化硅、氮化硅铝、或碳氮化硅硼。
8.根据权利要求1或2的测试条，其中该多孔基质选自纸、毡、非织造物、纤维、压缩或烧结的粉末、布或薄纱，其中该纸、毡、非织造物、纤维、压缩或烧结的粉末、布和薄纱包含以下各项中的至少之一：聚合物、玻璃、陶瓷、碳、石墨烯、矿物或金属。
9.根据权利要求1或2的测试条，其中该测试条包含一个报告物释放区和在2-7个之间的检测区。
10.根据权利要求1或2的测试条，其中该测试条至少在该报告物释放区和/或在该检测区包含至少两个基质层。
11.根据权利要求1或2的测试条，其中该条的形状偏离非正方形矩形，并且包含圆形或三角形的至少一部分。
12.根据权利要求1或2的测试条，其中该样品施加区布置在该报告物释放区的顶部上。
13.一种检测分析物的方法，该方法包括：
-提供根据权利要求1-12中任一项的测试条；
-将样品施加到该测试条的该样品施加区；
-在至少一个检测区中检测该光学报告物的存在和/或量和/或浓度；
-确定该样品中该分析物的存在和/或浓度。
14.根据权利要求13的方法，其进一步包括提供用于产生从该样品施加区到该报告物释放区和/或从该报告物释放区到至少一个检测区的连续或不连续的流体流的液体。
15.根据权利要求14的方法，其中该光学报告物是荧光染料，和该检测通过用手持式装置进行荧光测量来完成。
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Selective, Sensitive, and Rapid Analysis with Lateral-Flow Assays Based on Antibody-Gated Dye-Delivery Systems: The Example of Triacetone Triperoxide;Estela Climent 等;《Chem. Eur. J.》 *

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