DE102017129476B4

DE102017129476B4 - Markierungsfreie optische Detektion in Fängerzonen, die auf Streifen immobilisiert sind, für Lateral-Flow-Assays

Info

Publication number: DE102017129476B4
Application number: DE102017129476.7A
Authority: DE
Inventors: Knut Rurack; Estela Climent; Wei Wan
Original assignee: Bundesministerium fuer Wirtschaft und Energie
Current assignee: Bundesministerium fuer Wirtschaft und Energie
Priority date: 2017-12-11
Filing date: 2017-12-11
Publication date: 2024-04-18
Anticipated expiration: 2037-12-12
Also published as: CN111465855B; DE102017129476A1; CN111465855A; KR20200097776A; US20200340989A1; KR102413619B1; AU2018382349B2; AU2018382349A1; WO2019115273A1

Abstract

Teststreifen umfassend ein poröses Material, wobei der Teststreifen Folgendes umfasst:- eine Probeauftragszone zum Auftragen einer flüssigen Probe, die einen Analyten umfasst;- eine Reporterfreisetzungszone, die ein Sensormaterial umfasst, wobei das Sensormaterial geeignet ist, selektiv mit dem Analyten durch Freisetzen eines optischen Reporters zu interagieren, wobei die Reporterfreisetzungszone stromabwärts von der Probeauftragszone angeordnet ist;- eine Detektionszone, die ein Fängermaterial umfasst, wobei das Fängermaterial geeignet ist, den optischen Reporter selektiv zu binden und stromabwärts von der Reporterfreisetzungszone angeordnet ist; wobei der optische Reporter in Poren des Sensormaterials enthalten ist, wobei die Poren des Sensormaterials durch ein Porenschließmaterial geschlossen sind, wobei das Porenschließmaterial so ausgewählt ist, dass es den Analyten spezifisch bindet, und wobei der optische Reporter aus den Poren freigesetzt wird, wenn der Analyt spezifisch an das Porenschließmaterial bindet.

Description

GEBIET UND STAND DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für die schnelle und empfindliche Detektion von Analyten, z.B. bei der medizinischen Diagnostik und Umweltüberwachung, im Sicherheitsbereich, im Bereich des Arbeits- und Gesundheitsschutzes sowie in mit Nahrungsmitteln verbundenen Zweigen. In dem Fall, in dem der Analyt eine gewisse Nucleinsäure ist, ist seine Detektion auch für die Forensik oder bei mit der Mikrobiologie verbundenen Problemen wie bakterieller oder anderer mikrobieller Verunreinigung kritisch. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Lateral-Flow-Assayformate.
Unter allen Verfahren, die für schnelle Tests angewendet werden, sind Lateral-Flow-Assays die am häufigsten verwendeten und hunderte von Testkits, die auf dieser Technik basieren, sind auf dem Markt erhältlich. Dieser Typ Assay umfasst für gewöhnlich einen Membranstreifen, der oft aus Nitrocellulose oder Glasfasern besteht, in dem der Probe-Indikator-Komplex durch die Kapillarkraft der Flüssigkeit innerhalb der porösen Struktur des Streifens transportiert werden kann. Dieser Membranstreifen umfasst für gewöhnlich eine Probeauftragszone und eine Detektionszone, in der ein Fängerreagenz (oft ein Antikörper oder ein Antikörperfragment) für den Analyten immobilisiert ist. Abschließend stellt ein Absorptionskissen am Ende des Streifens gewöhnlich eine kontinuierliche Kapillarströmung der Flüssigkeit sicher.
Jedoch besteht ein Hauptnachteil bekannter Lateral-Flow-Assays darin, dass die meisten der Fängermittel den Analyten entweder nur indirekt durch Konkurrenz mit einem markierten Analogon oder dem herkömmlichen Indikatoransatz folgend anzeigen, d.h. eine selektive und empfindliche Bindung erreichen sowie rechtzeitig ein intensives Signal erzeugen müssen. Dies ist oft schwierig zu erreichen und reduziert die Empfindlichkeit in vielen Fällen beträchtlich. Ein anderer Nachteil bekannter Lateral-Flow-Assays besteht darin, dass nur einige wenige Analyte pro Assay gemessen werden können. Ferner ist in den meisten Fällen ein zweites Bindungsmittel, das in der Lage ist, sich direkt oder indirekt an den Analyten zu binden, z.B. ein sekundärer markierter Antikörper oder ein Antikörperfragment, erforderlich.
Bekannte Verfahren basieren hauptsächlich auf dem herkömmlichen Indikatoransatz, wobei die Wechselwirkung zwischen dem Analyten und dem Indikator oder dem Immunreagenz definierten Stöchiometrien folgen muss und das Bindungs- und Indikationsereignis intrinsisch gekoppelt sind. In vielen Fällen wird die Detektion nur nach Verwenden eines zweiten Bindungsmittels erreicht, was nicht nur die Kosten erhöht, sondern auch potentiell mehr Fehler einbringt.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG
Vor diesem Hintergrund wird einer ersten Ausführungsform entsprechend ein Teststreifen vorgeschlagen, der eine poröse Matrix umfasst. Der Teststreifen umfasst:

- eine Probeauftragszone zum Auftragen einer flüssigen Probe, die einen Analyten umfasst, wobei der Analyt typischerweise in einer Flüssigkeit gelöst oder solubilisiert ist;
- eine Reporterfreisetzungszone umfassend ein Sensormaterial, wobei das Sensormaterial geeignet ist, selektiv mit dem Analyten durch Freisetzen eines optischen Reporters als Antwort auf das Vorliegen des Analyten zu interagieren, wobei die Reporterfreisetzungszone stromabwärts von der Probeauftragszone angeordnet ist;
- eine Detektionszone umfassend ein Fängermaterial, wobei das Fängermaterial geeignet ist, selektiv den optischen Reporter zu binden und stromabwärts von der Reporterfreisetzungszone angeordnet zu sein.

Anders ausgedrückt wird der Reporter von dem Sensormaterial auf dem Teststreifen freigesetzt, wenn eine Flüssigkeit, die den Analyten enthält, das Sensormaterial benetzt. Da der Teststreifen eine poröse Matrix umfasst, kann eine Flüssigkeit (z.B. ein Lösungsmittel), die durch Kapillarkräfte getrieben wird, innerhalb der porösen Matrix fließen und daraufhin alle Zonen benetzen. Der freigesetzte Reporter wird durch einen Flüssigkeitsstrom, typischerweise durch einen Lösungsmittelfluss (-strom) zu der Detektionszone transportiert. Mit Bezug auf den Flüssigkeitsfluss oder -strom befindet sich die Reporterfreisetzungszone stromabwärts im Vergleich mit der Probeauftragszone. Ferner befindet sich die Detektionszone in Bezug auf den Flüssigkeitsfluss oder -strom stromabwärts im Vergleich mit der Reporterfreisetzungszone. Was die Folge der verschiedenen Zonen anbetrifft, ist die Probeauftragszone die erste, die Reporterfreisetzungszone ist die zweite und die Detektionszone ist die dritte Zone mit oder in der Richtung eines kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Stroms der strömenden Flüssigkeit. Das Vorliegen und/oder die Menge des Reporters in mindestens einer Detektionszone wird/werden typischerweise durch Detektionsmittel quantifiziert. Jedoch können das Vorliegen und die scheinbare Menge des Analyten auch gelegentlich durch bloße visuelle Kontrolle durch Verwenden einer geeigneten Beleuchtung der Detektionszone ohne irgendwelche andere Ausrüstung beurteilt werden.
Einer anderen Ausführungsform entsprechend wird ein Verfahren zum Detektieren eines Analyten vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst:

- das Bereitstellen eines Teststreifens, der eine poröse Matrix aufweist, wobei der Teststreifen mindestens eine Probeauftragszone; eine Reporterfreisetzungszone, die ein Sensormaterial aufweist, wobei das Sensormaterial geeignet ist, selektiv mit dem Analyten durch Freisetzen eines Reporters zu interagieren, nachdem es mit dem Analyten in Kontakt steht; und eine Detektionszone aufweist, die ein Fängermaterial aufweist, wobei das Fängermaterial geeignet ist, den Reporter selektiv zu binden;
- das Auftragen einer Probe auf die Probeauftragszone;
- das Detektieren eines Vorliegens und/oder einer Menge und/oder einer Konzentration des Reporters in der mindestens einen Detektionszone;
- das Bestimmen eines Vorliegens und/oder einer Konzentration des Analyten in der Probe.

Gemäß einer Ausführungsform umfasst das obige Verfahren einen kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Fluidstrom von der Probeauftragszone zu der Reporterfreisetzungszone und von der Reporterfreisetzungszone zu mindestens einer Detektionszone.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Eine volle und ermöglichende Offenbarung der vorliegenden Erfindung, einschließlich des besten Modus davon, für jemand mit gewöhnlichem Fachwissen auf dem Gebiet der Technik, ist noch spezifischer im Rest der Beschreibung, einschließlich der Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren, aufgeführt.

Die 1 zeigt das Arbeitsprinzip des Teststreifens oder Messstabs, der für einen Lateral-Flow-Assay zum Detektieren eines einzelnen Analyten (1A) und von 3 Analyten (1B) geeignet ist. i) zeigt den jeweiligen Streifen vor dem Fließen ii) während des Flusses in Abwesenheit (a) und in Gegenwart (b-e) der Analyte und iii) nach dem Fluss.
Die 2a zeigt einen Teststreifen oder Messstab, der für einen Lateral-Flow-Assay geeignet ist, umfassend eine Linie Poly(diallyldimethylammoniumchlorid) = PDDAC, die als 17 %-ige Lösung über eine Breite von 6 mm auf der porösen Matrix aufgebracht ist, um eine Fängerzone zu bilden, und 1 µl einer Sulforhodamin B-Lösung (SURB; 10 mg ml^-1 in H₂O) enthält, um eine Reporterfreisetzungszone 2 cm vom unteren Rand zu simulieren. Die 2b zeigt einen entsprechenden Teststreifen nach dem Fluss unter Anwendung von H₂O als Lösungsmittel (1 und 2) und phosphatgepufferte Kochsalzlösung = PBS (0,8 mM; 3 und 4) als Lösungsmittel nach 5 min (1 und 2) und 1 h (3 und 4) des Flusses. Die 2c zeigt einen Teststreifen, der einen PDDAC-Strich (35 % 3 mm) enthält, als Fängerzone nach 3 min (1) und 10 min (2) des Flusses unter Anwendung von PBS als Lösungsmittel (0,8 mM, pH-Wert 7,5). Die 2d zeigt einen Teststreifen, der eine PDDAC-Linie (35 %, 6 mm) enthält, als Fängerzone nach 20 min des Flusses mit PBS-Puffer.
Die 3a zeigt eine Photographie von Nitrocellulosestreifen, die mit wasserabweisenden Wachsbarrieren modifiziert sind, die die Probeauftragszone 1), die Reporterfreisetzungszone 2), die hier den Farbstoff 2,7-Dichlorfluorescein enthält, und die Detektionszone 3), die APTES-modifizierte mesoporöse Materialien enthält, enthalten. Darin steht APTES für (3-Aminopropyl)triethoxysilan. Die 3b zeigt Photographien unter einer selbstgemachten UV-Lampe nach dem Fluss von 2,7-Dichlorfluorescein (FLU) auf Streifen, die APTES-MCM enthalten, in der Detektionszone 3). MCM steht für mesoporöses Siliciumdioxidmaterial MCM-41. Entsprechende Streifen mit APTES-SBA in der Detektionszone 3) sind in 3c und mit COOH-MCM in der Detektionszone 3) in 3d nach dem Fluss gezeigt. Hierbei steht SBA für mesoporöses Siliciumdioxidmaterial SBA-15. COOH-MCM steht für COOH-funktionalisiertes MCM. Die verwendeten Abkürzungen werden weiter unten erklärt.
Die 4a zeigt eine Photographie von Streifen unter UV-Licht, umfassend eine Linie von APTES-MCM als Fängerzone und die Farbstoffe SURB (links) und FLU (rechts) in einer Konzentration von 1 mg ml^-1, wie in der Reporterfreisetzungszone 2 nach dem Fließen mit PBS (80 mM) als Lösungsmittel aufgebracht. Die 4b zeigt eine Photographie des Streifens unter UV-Licht, der eine Linie von COOH-MCM (L1) und APTES-MCM (L2) als Detektionszonen und eine Mischung der Farbstoffe Rhodamin 6G (R6G) und FLU (1 mg ml^-1) in der Reporterfreisetzungszone 2 nach Fließen mit 80 mM PBS als Lösungsmittel enthält. Die 4c zeigt entsprechende Photographien des Streifens unter UV-Licht, der eine Linie von PVP-APTES-MCM bei L1 und PA-COOH-MCM bei L2 als Detektionszonen und eine Mischung der Farbstoffe R6G und FLU (1 mg ml^-1) in der Reporterfreisetzungszone 2 nach dem Fließen mit 80 mM PBS als Lösungsmittel enthält. Darin steht PVP-APTES-MCM für durch Poly(vinylpyrrolidon) (PVP-) modifiziertes APTES-MCM und PA-COOH-MCM steht für durch PDDAC modifiziertes COOH-MCM. Man beachte, dass R6G farblich und bezüglich der Fluoreszenz FLU ähnlicher ist als SURB.
Die 5a zeigt eine Photographie der Streifen, die ein Stück APTES-C- (1) und APTES-GF- (2) Papier als Fängermaterial in der Detektionszone 3 und einen Fleck FLU-Farbstoff (10 mg ml^-1) auf der Reporterfreisetzungszone 2 enthalten. Darin steht APTES-C für durch APTES modifiziertes Cellulosepapier und APTES-GF steht für durch APTES modifiziertes Glasfaserpapier. Die 5b zeigt eine Photographie der entsprechenden Streifen unter UV-Licht, die APTES-C (1), APTES-GF (2) und COOH-GF (3) an der Detektionszone 3 enthalten, während des Flusses in Abhängigkeit von der Zeit. Die 5c zeigt die integrierte Fluoreszenz des Bereichs der Fängerzonen in Abhängigkeit von der Zeit, unter Anwendung der ImageJ-Software, für die Fängermaterialien APTES-C (1), APTES-GF (2) und COOH-GF (3) beurteilt. Die Abkürzungen werden weiter unten erklärt.
Die 6a zeigt eine Photographie eines Streifens, der ein Stück FLU-M-GF-Papier an der Fängerzone und einen Fleck FLU-Farbstoff an der Reporterfreisetzungszone (simulierte Wechselwirkungszone) enthält. Die 6b zeigt eine Photographie der entsprechenden Streifen unter UV-Licht nach bestimmten Zeitspannen, enthaltend 1) NIG-M-GF und 2) FLU-M-GF unter Anwendung von FLU als Farbstoff und 3) FLU-M-GF unter Anwendung von SURB als Farbstoff. Darin steht NIG-M-GF für nicht geprägtes, gelmodifiziertes, durch 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat modifiziertes Glasfaserpapier. FLU-M-GF steht für mit FLU geprägtes M-GF. Die 6c zeigt eine grafische Darstellung entsprechender integrierter Fluoreszenzintensitäten in willkürlichen Einheiten des Bereichs der Detektionszonen in Abhängigkeit von der Zeit, unter Anwendung der ImageJ-Software für die Fängermaterialien 1) NIG-M-GF und 2) FLU-M-GF unter Anwendung von FLU als Farbstoff und 3) FLU-M-GF unter Anwendung von SURB als Farbstoff beurteilt. Diese Farbstoffe wurden als wässrige Lösungen zum Simulieren des aus der Reporterfreisetzungszone freigesetzten Reporters aufgebracht, wie weiter unten erklärt werden wird.
Die 7a zeigt eine Photographie des Glasfaserstreifens, der ein Stück SURB-M-GF- (S) und FLU-M-GF- (F) Papier als Detektionszone enthält. 7b zeigt eine Photographie entsprechender Streifen nach dem Fluss in Abwesenheit (2) und in Gegenwart (1) einer Mischung von 1 µl FLU und SURB (1 mM) unten an den Streifen, die ein Stück SURB-M-GF- (1-S und 2-S) und FLU-M-GF- (1-F und 2-F) Papier als Detektionszone enthalten. 7c zeigt eine entsprechende Photographie der Streifen unter fluoreszierendem Licht (λ_exc 470 nm und λ_exc 505 nm zur Anregung, Cut-off 532 nm und Langpass von 550 nm als Filter bei der Emission) in Abhängigkeit von der Zeit. Die 7d zeigt entsprechende integrierte Fluoreszenzintensitäten des Bereichs der Detektionszonen in Abhängigkeit von der Zeit, unter Anwendung der ImageJ-Software für zwei verschiedene Fängermaterialien beurteilt.
Die 8a zeigt einen Teststreifen, der für einen Lateral-Flow-Assay geeignet ist und eine PDDAC-Linie (17 %, 6 mm) als Fängermaterial und ein Sensormaterial umfasst, das in der Lage ist, PETN in der Reporterfreisetzungszone 2) nach dem Fließen in Gegenwart (1) und in Abwesenheit (2) von PETN (25 ppm) unter Anwendung von 80 mM PBS, das 2,5 % MeOH als Lösungsmittel enthält, zu detektieren. Darin steht PETN für den Modellanalyten Pentaerythrittetranitrat. Die 8b umfasst den entsprechenden Assay, jedoch unter Anwendung einer PDDAC-Linie (35 %, 3 mm) statt von (17 %, 6 mm) als Fängerzone und die 8c zeigt den entsprechenden Assay unter Anwendung einer Linie von PDDAC (als 35 %-ige Lösung in einer Linienbreite von 6 mm aufgebracht) als Fängerzone.
Die 9 zeigt das Arbeitsprinzip eines gestapelten Lateral-Flow-Assays mit verschiedenen senkrecht gestapelten Zonen. Die Probeinjektionszone 1 ist darüber angeordnet und die Reporterfreisetzungszone 2 befindet sich in einer zweiten Schicht Papier. Als dritte Schicht ist ein Streifen, der die Detektionszone 3 enthält, unten angeordnet. Während des senkrechten Fließens F wird der Reporter (z.B. das optische Reportermolekül), der im Sensormaterial der Reporterfreisetzungszone 2 eingekapselt ist, nur dann freigesetzt, wenn der entsprechende Analyt in einer Probe b vorliegt und sich dann mit dem Fluss durch Kapillarkräfte auf die Fängerzone 3 zu bewegt, wo er zur Detektion zurückgehalten wird. In Abwesenheit von Analyt in einer Probe (wie unter a gezeigt) wird keine Freisetzung verzeichnet, während in dem Fall, der als b angegeben ist, der Analyt aus der Probe in der Detektionszone detektiert werden kann.
Die 10 veranschaulicht schematisch das Arbeitsprinzip eines gestapelten Lateral-Flow-Assays für den Fall der Detektion multipler Analyte. Verschiedene poröse Matrixschichten, die aufeinander positioniert sind, umfassen die Probeinjektionszone (1) und eine Reporterfreisetzungszone, die eine Mischung von z.B. zwei Sensorteilchen enthält, die zwei verschiedene Reportermoleküle enthalten, die geeignet sind, selektiv mit zwei verschiedenen Analyten zu interagieren. Der Stapel umfasst auch eine Schicht poröser Matrix, die eine strukturierte Detektionszone 3 umfasst. Die untere Schicht mit den zwei verschiedenen Detektionszonen umfasst ein Kanalmuster, das z.B. durch einen Wachsdruck erzeugt werden kann. Dort sind zwei verschiedene Detektionszonen mit zwei verschiedenen Fängermaterialien, die für die entsprechenden Reportermoleküle selektiv sind, gezeigt. Während des Fließens F werden die entsprechenden Reportermoleküle aus der Reporterfreisetzungszone nur dann freigesetzt, wenn der entsprechende Analyst in der aufgebrachten obigen Probe (b-c) vorliegt und sich dann mit dem Fluss durch Kapillarkräfte auf die Fängerzonen 3 zu bewegt, wo sie zur Detektion zurückgehalten werden. In Abwesenheit von Analyt in einer Probe (wie in Teil a gezeigt) dieses Schemas wird keine Freisetzung registriert und keine der Detektionszonen erzeugt ein Signal. Verschiedene Reporterfreisetzungszonen können ebenfalls in verschiedenen Matrixschichten, die über der Matrixschicht gestapelt sind, die die Detektionszonen umfasst, aufgebracht werden. Am Ende des Kanals, der in der unteren Schicht gebildet ist, kann ein absorptionsfähiges Kissen (Engl.-pad) angeordnet sein. Die Schicht, die die Detektionszone(n) umfasst, kann für optische Detektionsmittel von oben oder von unten zugänglich sein.

In der folgenden genauen Beschreibung wird Bezug genommen auf die beiliegenden Figuren, die einen Teil davon bilden und die zur Veranschaulichung spezifischer Ausführungsformen und Merkmale der Erfindung gezeigt sind. Man sollte sich im Klaren darüber sein, dass andere Ausführungsformen benutzt werden können und strukturelle oder logische Änderungen gemacht werden können, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Die folgende genaue Beschreibung darf deshalb nicht in einem einschränkenden Sinn aufgefasst werden und der Umfang der vorliegenden Erfindung ist durch die anhängenden Ansprüche definiert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die Verwendung des Worts „ein“ oder „eine“ wird es in Verbindung mit dem Ausdruck „umfassend“ in den Ansprüchen und/oder der Beschreibung verwendet, kann „eines“ bedeuten, stimmt jedoch auch mit der Bedeutung von „einem oder mehreren“, „mindestens einem“ und „einem oder mehr als einem“ überein.
Die Verwendung des Ausdrucks „oder“ in den Ansprüchen wird benutzt, um „und/oder“ zu bedeuten, es sei denn es wird ausdrücklich angegeben, dass er sich nur auf Alternativen bezieht oder die Alternativen gegenseitig ausschließlich sind, obwohl die Offenbarung eine Definition unterstützt, die sich nur auf Alternativen und „und/oder“ bezieht.
Wie in dieser Beschreibung (oben und unten) und den Ansprüchen verwendet, sind die Wörter „umfassend“ (und irgend eine Form von umfassend, wie „umfasst“), „aufweisend“ (und irgendeine Form von aufweisend, wie „aufweisen“ und „weist auf“), „einschließend“ (und irgend einer Form von einschließend, wie „schließt ein“) oder „enthaltend“ (und irgend eine Form von enthaltend wie „enthält“) inklusive oder offen und schließen zusätzliche, nicht angegebene Elemente oder Verfahrensschritte nicht aus.
Wie in dieser Beschreibung (oben und unten) und den Ansprüchen verwendet, soll der Ausdruck „poröse Matrix“ so verstanden werden, dass er typischerweise eine unregelmäßige Struktur umfasst, die ein offen-poröses, festes Material umfasst, das typischerweise in Lösungsmitteln, z.B. Pufferlösungen inert und stabil ist.
Wie in dieser Beschreibung (oben und unten) und den Ansprüchen verwendet, soll der Ausdruck „mesoporöses anorganisches Material“ so verstanden werden, dass es typischerweise einen festen Körper umfasst, der Mesoporen aufweist. Mesoporen haben einen durchschnittlichen Porendurchmesser zwischen 2 nm und 50 nm. Ein gut eingeführtes Verfahren zum Messen des durchschnittlichen Porendurchmessers dieses anorganischen Materials ist die Stickstoffsorptionporosimetrie, Elektronenmikroskopie, z.B. Rasterelektronenmikroskopie oder Transmissionselektronenmikroskopie.
Wie in dieser Beschreibung (oben und unten) und den Ansprüchen verwendet, umfasst der Ausdruck „mesoporöses Sensormaterial“ ein anorganisches mesoporöses Material, das im Handel erhältlich ist oder im Labor hergestellt wird und z.B. unter Materialien ausgewählt wird, die als MCM-41, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8, 11-16), FTU-n (12, 14, 15, 16), UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 oder M-UVM-8, MCM-41 vom Typ Al₂O₃ bekannt sind. Typischerweise umfasst das anorganische mesoporöse Material Siliciumdioxid, d.h. SiO₂ oder Aluminiumoxid, d.h. Al₂O₃. Mesoporöse organische Materialien können auch TiO₂, Kohlenstoff, Carbonitrid, Siliciumcarbid, Siliciumoxycarbid, Siliciumcarbonitrid, Siliciumnitrid, Siliciumoxynitrid, Siliciumaluminiumnitrid, oder Silicoborcarbonitrid umfassen. Die Mesoporen des anorganischen Materials enthalten einen Reporter. Die Freisetzung des Reporters aus den Mesoporen wird durch ein Porenschließmaterial blockiert. Das Porenschließmaterial kann chemisch funktionalisiert, d.h. mit funktionellen Gruppen, wie beispielsweise z.B. Aminogruppen oder Carboxylgruppen, versehen sein. Die Modifikation anorganischer Materialien durch kleine organische Moleküle, die derartige funktionelle Gruppen tragen, ist allgemein bekannt und braucht deshalb hier nicht weiter spezifiziert zu werden.
Wie in dieser Beschreibung (oben und unten) und den Ansprüchen verwendet, soll der Ausdruck „Probe“ als eine Flüssigkeit verstanden werden, die den Analyten in einer unbekannten Konzentration enthält. Typischerweise liegt der Analyt in der Probe in gelöster Form vor. In einem derartigen Fall umfasst die Probe auch eine gelöste Substanz. Die gelöste Substanz, die in der Probe enthalten ist, kann als flüssige Phase verwendet werden, die eine fluide Verbindung zwischen der Probeauftragszone und der Reporterfreisetzungszone erzeugt. Zusätzlich zu der gelösten Substanz, die in der Probe enthalten ist, kann reines Lösungsmittel auf die Probeauftragszone aufgebracht werden, nachdem die Probe aufgebracht worden ist. Dieses Lösungsmittel kann zum Erzeugen oder Aufrechterhalten einer fluiden Verbindung zwischen der Reporterfreisetzungszone und der Detektionszone verwendet werden. Jedoch kann die Probe auch in der Probeauftragszone getrocknet werden. In einem derartigen Fall kann ein reines Lösungsmittel desselben Typs oder eines anderen Typs auf die Probeauftragszone aufgebracht werden, um eine fluide Verbindung mit der Reporterfreisetzungszone zu erzeugen. Schließlich wird eine fluide Verbindung zwischen der Reporterfreisetzungszone und der Detektionszone erzeugt.
Wie in dieser Beschreibung (oben und unten) und den Ansprüchen verwendet, wird der Ausdruck „Reporter“ synonym mit dem Ausdruck „Indikator“ verwendet. Er umfasst eine Einheit, die innerhalb der Poren eines mesoporösen Materials eingeschlossen werden kann, um ein Sensormaterial, wie oben und unten erläutert, herzustellen. Der Reporter kann entweder direkt (z.B. durch seine Farbe) oder indirekt, z.B. nach der Anregung durch seine Fluoreszenz, Phosphoreszenz oder Lumineszenz, detektiert werden.
Wie in dieser Beschreibung (oben und unten) und den Ansprüchen verwendet, sollen die Ausdrücke „Fluoreszenzmessung“, „fluoreszierender Farbstoff“ und irgendein damit in Bezug stehender Ausdruck so verstanden werden, dass er eine optische Eigenschaft oder ihre Detektion, z.B. eine Anregungswellenlänge, eine Emissionswellenlänge, eine Fluoreszenzintensität, eine Fluoreszenzquantenausbeute, eine Fluoreszenzlebensdauer oder -zerfall und/oder ein Fluoreszenzverhältnis oder dergleichen oder seine Detektion umfasst.
Das Porenschließmaterial des Sensormaterials ist freisetzbar. Insbesondere ist das Porenschließmaterial typischerweise organisch und loslösbar (d.h. nichtkovalent) an das anorganische mesoporöse Material gebunden. Insbesondere ist das Porenschließmaterial nichtkovalent an das mesoporöse Material durch eine Verbindung gebunden, die an dem porösen Material verankert ist. Das Porenschließmaterial wird so ausgewählt, dass es den Analyten spezifisch bindet. Die Reportersubstanz wird aus den Poren freigesetzt, wenn das Porenschließmaterial den Analyten bindet. Der Analyt ist typischerweise in einer Flüssigkeitsprobe enthalten (oder nicht enthalten), die das Reporterreservoir, d.h. die Reporterfreisetzungszone, benetzt. Anders ausgedrückt, sind alle Poren an der Oberfläche des mesoporösen Materials durch das Porenschließmaterial gedeckelt und so geschlossen. Deshalb kann der Reporter, der innerhalb der Poren gespeichert ist, nicht in die umgebende Flüssigkeit freigesetzt werden, solange der Analyt nicht spezifisch durch das Porenschließmaterial gebunden ist und das Porenschließmaterial aus dem porösen anorganischen Material freigesetzt wird. Wenn eine Flüssigkeit, die den Analyten enthält, in Kontakt mit dem Reporterreservoir an der Reporterfreisetzungszone kommt, so erlaubt das, dass die nichtkovalenten Bindungen gelöst werden und ermöglicht, dass eine spezifische Bindung/spezifische Bindungen zwischen dem Porenschließmaterial und dem Analyt gebildet wird/werden und so die erneute Bildung der nichtkovalenten Bindung zwischen dem Porenschließmaterial und dem mesoporösen Material oder irgendeiner daran verankerten Verbindung verhindert wird. Enthält die Benetzungsflüssigkeit den Analyten nicht, ist die nichtkovalenten Bindung des Verschlussmaterials an das anorganische poröse Material ausreichend stark, um das Porenschließmaterial in der Nähe der Pore zu halten. Deshalb werden die Mesoporen blockiert und der Reporter wird so im Wesentlichen daran gehindert, aus den Mesoporen zu entweichen und deshalb kann kein Signal erzeugt werden.
Anders ausgedrückt werden die Poren des anorganischen porösen Materials durch eine Einheit geschlossen, die ein organisches Molekül, z.B. eine haptenähnliche Substanz umfasst, die mit einem Porenschließmaterial verbunden ist. Das Porenschließmaterial ist nichtkovalent an ein organisches Molekül (hier als Verbindung bezeichnet) gebunden, das fest an der Oberfläche des mesoporösen Materials fixiert ist. Der Reporter - der anfänglich innerhalb der Poren angeordnet ist - ist aus den Poren durch Lösen des Porenschließmaterials von den Porenöffnungen freisetzbar, wenn das Porenschließmaterial einen spezifischen Analyten - d.h. einen, der dem spezifischen Reporter zugeteilt ist - bindet, der in einer flüssigen Probe vorliegt. Nach dem Binden an den Analyten wird das Porenschließmaterial daran gehindert, die Verbindung (die z.B. eine haptenähnliche Substanz ist) erneut zu binden, die an dem mesoporösen Material in nächster Nähe zu den Poren fixiert ist, und das Porenschließmaterial wird so losgelöst.
Das Porenschließmaterial ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend einen Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Rezeptorprotein, ein Oligonucleotid und ein Aptamer. Das Aptamer kann unter einem Oligoaptamer und einem Peptidaptamer ausgewählt sein. Der Antikörper, das Rezeptorprotein, das Oligonucleotid und das Aptamer sind in der Lage, den Analyten spezifisch zu binden. Zusätzlich kann das Porenschließmaterial ein anorganisches Nanoteilchen, das z.B. Gold, Silber oder Eisenoxid umfasst, einen Metallcluster, der z.B. Gold oder Silber umfasst, ein Nanokristall, das z.B. Cadmiumsulfid oder ein anderes Halbleitermaterial umfasst, oder einen Kohlenstoffnanopunkt oder einen Nanodiamanten umfassen. Das erwähnte anorganische Nanoteilchen, der erwähnte Nanocluster oder das erwähnte Nanokristall weisen eine Größe von bis zu 50 nm, typischerweise bis zu 30 nm, auf. Typischen Ausführungsformen entsprechend ist seine Oberfläche durch ein organisches Molekül oder durch einen Antikörper oder durch ein Antikörperfragment modifiziert.
Die folgende kurze Beschreibung des grundsätzlichen Mechanismus des vorgeschlagenen Reporterreservoirs, d.h. des Sensormaterials, oder des entsprechenden Reporterfreisetzungssystems kann beispielsweise bereitgestellt werden, wenn das Porenschließmaterial einen Antikörper oder ein Antikörperfragment umfasst.
Die Bindung(en) zwischen einem Antikörper und einem Hapten oder die Bindung(en) zwischen einem Antikörper und einer Verbindung (z.B. einem organischen Molekül, das einem Haptenderivat gleicht) ist (sind) nichtkovalent. Deshalb assoziiert oder dissoziiert der Porenverschluss (z.B. der Antikörper) in einem geeigneten Lösungsmittel ständig. Das resultierende System ist dynamisch. Da die Assoziation in einem derartigen dynamischen System sehr schnell erfolgt, während die Dissoziation ziemlich langsam vorgeht, erfolgt nur ein unbedeutendes Herauslösen des Reporters aus den Poren des Reporterreservoirs, d.h. der Reporterfreisetzungszone. Wenn das Reporterreservoir, d.h. die Reporterfreisetzungszone, trocken und nicht durch ein Lösungsmittel benetzt ist, erfolgt überhaupt kein Herauslösen.
Ferner ist die Affinität des Analyten zum Antikörper viel höher im Vergleich mit der Affinität des Haptens (Verbindung) zum Antikörper. Deshalb wird die Bindungsstelle des Antikörpers (des Verschlusses) in Gegenwart des Analyten wirksam blockiert. Deshalb wird irgendein schnelles erneutes Binden des Antikörpers an das Hapten (die Verbindung) verhindert. Aus diesem Grund kann der Antikörper sich ausreichend weit von der Porenöffnung entfernen, während seine Bindungsstelle blockiert ist.
Aus diesem Grund kann kein erneutes Versiegeln der Poren(n) selbst in dem Fall einer Dissoziation des Komplexes zwischen dem Analyten und dem Antikörper - der auch ein dynamisches System umfasst - erfolgen.
Bezüglich der erwähnten Affinitäten ist die Affinität des Antikörpers zum Analyten viel stärker im Vergleich mit der Affinität des Antikörpers zum Hapten.
Die technische Aufgabe der beschriebenen Ausführungsformen besteht darin, mehrere Makromoleküle oder Materialien, die in der Detektionszone einer Lateral-Flow-Vorrichtung immobilisiert sind, mit dem Ziel zu verwenden, eine markierungsfreie und potentiell multiplexierte Detektion an Lateral-Flow-Vorrichtungen oder Teststreifen zu erzeugen. Diese immobilisierten Makromoleküle oder Fängermaterialien sind geeignet, d.h. ausgewählt, um selektiv mit dem Reportermolekül, d.h. dem Reporter, der aus dem mesoporösen Sensormaterial freigesetzt wird, das auf oder in der Probeinjektionszone angeordnet ist, zu interagieren, während das Sensormaterial für die spezifische Wechselwirkung mit dem zu detektierenden Analyten verantwortlich ist.
Der Vorteil der vorgeschlagenen Ausführungsformen besteht darin, dass der Reporter, der aus den Poren des Sensormaterials freigesetzt wird, zweckbestimmt nur an einer gut definierten Stelle auf dem Streifen, d.h. der Detektionszone oder in mindestens einer der Detektionszonen gefangen wird.
Insbesondere zeigt die 1A das Arbeitsprinzip eines Teststreifens, wie es der ersten Ausführungsformen entsprechend vorgeschlagen ist. Der Teststreifen i) umfasst eine Probeinjektionszone, die als Probeauftragszone 1 bezeichnet ist, eine Reporterfreisetzungszone 2 und eine Detektionszone 3, die ein Fängermaterial umfasst, das in der Lage ist, mit dem aus der Zone 2 freigesetzten optischen Reportermolekül zu interagieren. Während des Fließens ii) eines Lösungsmittels den Streifen entlang, werden die optischen Reportermoleküle, d.h. der Reporter, der anfänglich in dem Sensormaterial eingekapselt ist, das in der Reporterfreisetzungszone 2 abgesetzt ist, nur dann freigesetzt, wenn der jeweilige Analyt in der Probe (dem Streifen b) vorliegt und sich dann mit dem Fluss durch Kapillarkräfte auf die Detektionszone 3 zu bewegt. In der Detektionszone wird der Reporter zur Detektion zurückgehalten. In Abwesenheit von Analyt in der Probe (dem Streifen a) wird keine Freisetzung verzeichnet und deshalb kann kein Reporter in der Detektionszone detektiert werden. Die Reporterfreisetzungszone kann typischerweise Teilchen eines mesoporösen Materials umfassen, das mit Reportermolekülen gefüllt ist, wobei das mesoporöse Material in der Lage ist, mit dem Analyten durch sofortiges Freisetzen des Reporters zu interagieren.
Die 1B zeigt das Arbeitsprinzip der Teststreifen der ersten Ausführungsformen entsprechend, die zum Detektieren multipler Analyte geeignet sind. Die Teststreifen umfassen eine Probeinjektionszone 1, eine Reporterfreisetzungszone 2 und eine Detektionszone 3. Dort sind drei verschiedene Typen Sensormaterial auf der Matrix abgesetzt worden, um die Reporterfreisetzungszone 2 zu bilden. Die drei Typen Sensormaterial unterscheiden sich sowohl durch den Reporter (Reportermoleküle), der innerhalb des mesoporösen Materials aufgefangen ist, als auch durch die Analytspezifizität des entsprechenden Porenverschlusses. So ist die Spezifizität des Porenverschlusses geeignet, einen vorgegebenen Analyten spezifisch zu erkennen und den Reporter aus den Mesoporen freizusetzen, wenn der Analyt und der Verschluss aneinander gebunden sind. Da verschiedene Reporter verschiedenen Spezifitäten des Verschlusses, d.h. verschiedenen Analyten, zugeordnet sind, kann das Vorliegen des entsprechenden Analyten ohne weiteres detektiert werden, wenn der Reporter einmal in seiner spezifischen Detektionszone angesammelt ist.
Anders ausgedrückt umfasst eine Mischung von z.B. drei hybriden Sensorteilchen, von denen jedes verschiedene Reportermolekül enthält und jedes in der Lage ist, mit einem anderen von drei Analyten zu interagieren, die Reporterfreisetzungszone 2. In Kombination damit wird eine strukturierte Detektionszone 3 bereitgestellt. Anders ausgedrückt werden drei verschiedene Detektionszonen bereitgestellt. Jede der drei verschiedenen Detektionszonen umfasst ein selektives Fängermaterial, das für die spezifische Erkennung eines der drei Analyten, selbst in ihrer Mischung, geeignet ist. Während des Fließens ii) werden die entsprechenden optischen Reportermoleküle, die in den Sensormaterialien eingekapselt sind, nur dann freigesetzt, wenn der entsprechende Analyt in der Probe (siehe Streifen b) bis e)) vorliegt und daraufhin durch die analytempfindliche Verschlusskappe „erkannt“ worden ist. Der freigesetzte optische Reporter, der durch Kapillarkräfte getrieben wird, wird durch den Lösungsmittelfluss in der porösen Matrix zur Fängerzone 3 hin getragen. Während der Strom der flüssigen Phase (z.B. eines Lösungsmittels) sich auf das Ende des Streifens zu bewegt, wird der Reporter spezifisch in der vorgesehenen Zone zurückgehalten, wo er detektiert werden kann. In Abwesenheit eines Analyten in einer Probe (siehe Streifen a)) wird keine Freisetzung von Reporter verzeichnet. Ein kontinuierlicher Strom strömender flüssiger Phase kann, z. B. durch Bereitstellen eines absorbierenden Kissens am Ende des Teststreifens der Probeinjektions- (Auftrags-) Zone entgegengesetzt, unterstützt werden.
Einer Ausführungsformen entsprechend wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei der optische Reporter in Poren des Sensormaterials enthalten ist, wobei die Poren des Sensormaterials durch ein Porenschließmaterial geschlossen sind, wobei das Porenschließmaterial so ausgewählt ist, dass es den Analyten spezifisch bindet, wobei der optische Reporter aus den Poren freigesetzt wird, wenn der Analyt sich spezifisch an das Porenschließmaterial bindet.
Vorteilhafterweise ist die Kombination von A): einem hybriden Nanoteilchenmaterial, das Reportermoleküle, anfänglich in der Probeauftragszone abgesperrt, freisetzen kann; und B): einem spezifischen Fängermaterial, das in der Detektionszone immobilisiert ist, wobei das Fängermaterial geeignet ist, selektiv mit den Reportermolekülen zu interagieren, die aus den abgesperrten hybriden Nanoteilchen freigesetzt werden, ein leistungsstarkes Werkzeug zum Konzipieren neuartiger Lateral-Flow-Vorrichtungen: einerseits ist das abgesperrte Sensormaterial in der Lage, eine massive Signalverstärkung durch Freisetzen von Reportermolekülen nur herzustellen, nachdem eine spezifische Erkennung des Analyten in einem unabhängigen, separaten Schritt an den Porenöffnungen stattgefunden hat. Andererseits gestattet das Verwenden von maßgeschneiderten Fängermaterialien für die selektive Wechselwirkung mit den freigesetzten Reportermolekülen das Konzentrieren, d.h. Fokussieren, der Letzteren für eine effizientere Detektion und um selektive Multipunktdetektionszonen zu schaffen. Dies ermöglicht die simultane Detektion mehrerer Reportermoleküle gleichzeitig bei der multiplexierten Detektion verschiedener Analyte. Obwohl das gleichzeitige Multiplexieren theoretisch möglich ist, ist es wegen der Schwierigkeit, verschiedene Analyte und/oder Indikatormoleküle auf einem Teststreifen oder in einer Lateral-Flow-Vorrichtung zu trennen, noch nicht praktisch realisiert worden. Gemäß typischen Ausführungsformen umfasst der Reporter einen Farbstoff, eine fluoreszierende Substanz, ein fluoreszierendes Ion, ein Ion eines Seltenerdelements oder irgendeine Kombination davon, um nur einige wenige zu nennen. Der Reporter wird so ausgewählt, dass er direkt oder indirekt, zumindest nach dem Fangen durch das Fängermaterial optisch detektierbar ist.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei das Porenschließmaterial nichtkovalent an das Sensormaterial gebunden ist und sich von dem Sensormaterial löst, wenn es durch den Analyten gebunden wird.
Vorteilhafterweise ermöglicht eine nichtkovalente Bindung des Porenschließmaterials an dem mesoporösen anorganischen Material die ungehinderte Diffusion des Reporters von innerhalb der Poren in den Lösungsmittelstrom. Andererseits kann das Porenschließmaterial, d.h. das „Gate“, selbst ohne weiteres ohne sterische Hinderung diffundieren und die spezifische Bindung des Analyten wird erleichtert. Im Vergleich mit einem kovalent verknüpften Gate ist der Vorgang der Analytbindung schneller und seine Spezifizität wird beibehalten.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei der optische Reporter einen fluoreszierenden Farbstoff, einen farbigen Farbstoff oder ein lumineszierendes anorganisches Fluoreszenzion eines Seltenerdelements, d.h. eines Europiumions, typischerweise in Form eines Komplexes mit organischem Sensibilisisatorliganden umfasst.
Vorteilhafterweise gestatten fluoreszierende Farbstoffe eine äußerst empfindliche und selektive optische Detektion. Werden sie in Form von Komplexen mit organischen Liganden verwendet, so weisen Ionen von Seltenerdelementen, z.B. Europium, Terbium, Ytterbium, Yttrium oder Gadolinium, um nur einige wenige zu nennen, charakteristische und schmale Emissionslinien einer Atomemission auf und sind dann auch ziemlich selektiv und mit hoher Empfindlichkeit detektierbar.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei der Reporter ein Rhodamin-, ein Fluorescein-, ein Styryl-, ein Cyanin- und Polymethin-, ein Pyridinium-, ein Pyrylium- oder ein Thiopyryliumderivat, ein Ruthenium-, ein Osmium- oder ein Iridiumkomplex, lumineszierende Komplexe von Seltenerdelementen (wie Europium oder Terbium) und ein Squaryliumderivat umfasst. Zusätzlich alle neutralen, kationischen und anionischen Derivate von Cumarin, Dipyrromethen oder BODIPY, Pyrromethen-, Benzofuran-, Pyridin-, Naphthalimid-, Benzoxazol-, Benzoxadiazol-, Benzindol-, DAPI, Stilben-, Oxazin-, Perylen-, Azulen-, Styrylbase-, Phycoerythrin-, Squarain-, Porphyrin- und PhthalocyaninFarbstoffe.
Vorteilhafterweise sind die meisten dieser fluoreszierenden und lumineszierenden Materialien und Verbindungen im Handel erhältlich und deshalb ist eine geeignete optische und spektrophotometrische Ausrüstung für ihre Detektion ebenfalls erhältlich.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei das Fängermaterial unter einem molekular geprägten Polymer, einer polyionischen Flüssigkeit, einem Polyelektrolyten oder einem chemisch funktionalisierten mesoporösen Material ausgewählt wird, das eine funktionelle Gruppe ausgewählt unter einem Thiol, einem Isocyanat, einer Aminogruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Epoxygruppe oder einer Carbonsäuregruppe an der Oberfläche umfasst.
Vorteilhafterweise ist das Fängermaterial geeignet, den Reporter spezifisch zu binden. Die Affinität des Fängermaterial für den Reporter kann z.B. elektrostatischer Wechselwirkung, selektiver Affinitätsbindung, hydrophober Wechselwirkung, nichtspezifischer physikalisch-chemischer Absorption oder einem Mischmodusmechanismus zugeschrieben werden. Funktionelle Gruppen zum Modifizieren eines mesoporösen Materials können z.B. unter Hydroxyl-, Carboxyl-, Epoxy-, Amino-, Sulfhydrylgruppen oder geladenen funktionellen Gruppen, wie quartären Ammoniumgruppen, ausgewählt werden.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei das Fängermaterial aus einem molekular geprägten Polymer ausgewählt ist und das molekular geprägte Polymer durch Polymerisation eines oder mehrerer Typen Monomere ausgewählt unter: Acrylamid, Vinylpyridin, N-Isopropylacrylamid, 2-Hydroxyethylmethacrylat, Methylmethacrylat, Benzylmethacrylat, Methacrylat, Methacrylamid, N,N'-Dimethylmethacrylamid, Vinylalkohol, Vinylimidazol; durch Vernetzen mit einem Vernetzungsmittel ausgewählt unter: Ethylendimethacrylat, Ethylenglycoldimethacrylat, Poly(acrylsäure), einem Bis(β-hydroxyethyl)sulfon, Trimethylolpropantrimethacrylat oder z.B. Pentaerythrittriacrylat erzeugt wird.
Vorteilhafterweise können diese Polymere z.B. mit Farbstoffen wie Rhodamin oder Fluorescein geprägt werden und binden derartige Reporter ziemlich stark, ohne irgendein signifikantes Hintergrundsignal zu verursachen. Positiv geladene Farbstoffe können ebenfalls zum Prägen verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei das Fängermaterial unter einer polyionischen Flüssigkeit (PIL) oder einem Polyelektrolyten ausgewählt ist, wobei der Polyelektrolyt Polykationen oder Polyanionen umfasst wie beispielsweise Poly(diallyldimethylammoniumchlorid), Poly(allylamin)hydrochlorid, Polyacrylsäure, Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(natriumstyrolsulfonat) (PSS), Cyclodextran oder Polydextran.
Vorteilhafterweise stellen diese Polyelektrolyte eine starke Bindung des Reporters selbst in gepufferten Lösungen (unter Anwendung hoher Konzentrationen des Polyelektrolyts) sicher. Polykationische oder polyanionische Makromoleküle können auf die Matrix zum Fertigen der Detektionszone ohne weiteres aufgebracht werden. Ein anderer Vorteil besteht darin, dass die Polyelektrolyte selektiv mit anionischen oder kationischen Farbstoffen interagieren können.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei der Teststreifen ferner eine Absorptionszone umfasst, wobei die Absorptionszone stromabwärts von der Detektionszone angeordnet und geeignet ist, das Lösungsmittel zu absorbieren.
Vorteilhafterweise kann ein gleichbleibender Strom von fließendem Lösungsmittel erhalten werden. Reporter, die auf der Reporterfreisetzungszone freigesetzt worden sind, können die Detektionszone oder alternativ jede der Detektionszonen erreichen.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei ein Bereich des Teststreifens mindestens eine oder mehrere Detektionszonen aufweist, die durch eine Barriere umgeben sind. Die Barriere schließt entweder örtlich die Poren der porösen Matrix oder modifiziert örtlich eine Benetzbarkeit der porösen Matrix für das Lösungsmittel. Die Barriere bildet so einen Kanal in der porösen Matrix. Gemäß einer Modifikation dieser Ausführungsformen kann der gefertigte Kanal die Probeauftragszone, die Reporterfreisetzungszone und die Detektionszone verbinden. Die Probeauftragszone, die Reporterfreisetzungszone und die Detektionszone(n) können hintereinander in der Fließrichtung des Lösungsmittels angeordnet sein.
Vorteilhafterweise ermöglicht ein Kanal, der innerhalb der porösen Matrix gebildet ist, einen geleiteten Strom der flüssigen Phase oder des Lösungsmittels. Eine standardisierte Gestalt derartiger Kanäle gestattet standardisierte Strömungsbedingungen für das Lösungsmittel, das als mobile Phase verwendet wird, und gestattet das Vergleichen verschiedener Lateral-Flow-Streifen und deshalb standardisierte Assays.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei die Barriere ein Wachs umfasst. Alternativ kann eine funktionelle Gruppe, die z.B. durch ein Silan bereitgestellt ist, das an die poröse Matrix gebunden ist, die Benetzbarkeit der Matrix ändern oder einschränken und so eine kanalähnliche Struktur oder ein kanalähnliches Muster innerhalb der porösen Matrix gestalten.
Vorteilhafterweise können die erwähnten Materialien zum wirksamen Fertigen von Kanälen an/in Cellulose- und Glasfaserpapier sowie in anderen porösen Matrixmaterialien verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei das Sensormaterial ein mesoporöses anorganisches Material umfasst.
Vorteilhafterweise sind eine Vielzahl mesoporöser anorganische Materialien zugänglich und sogar im Handel erhältlich. Die mesoporösen Materialien können ohne weiteres mit einer Reportersubstanz, z.B. einem fluoreszierenden Farbstoff oder Ion, gefüllt werden.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei das mesoporöse anorganische Material Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, TiO₂, Kohlenstoff, Carbonitrid, Siliciumcarbid, Siliciumoxycarbid, Siliciumcarbonitrid, Siliciumnitrid, Siliciumoxynitrid, Siliciumaluminiumnitrid oder Silicoborcarbonitrid umfasst.
Vorteilhafterweise sind diese Materialien chemisch inert, können ohne weiteres mit Reportermolekülen, z.B. Farbstoffen, beladen werden und ohne weiteres mit geeigneten Verschlussmaterialien modifiziert werden, um für Analyt geeignete Sensormaterialien zu erzeugen.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei die poröse Matrix unter einem Papier, einem Filz, einem Vlies, einer Faser, einem gepressten oder gesinterten Pulver, einem Tuch oder einem Gewebe ausgewählt wird, wobei das Papier, der Filz, das Vlies, die Faser, das gepresste oder gesinterte Pulver, das Tuch oder das Gewebe mindestens eines von einem Polymer, z.B. einer Baumwolle oder einer Cellulose, einem Glas, einem Keramikmaterial, einem Kohlenstoff, einem Graphen, einem Mineral oder einem Metall umfassen.
Vorteilhafterweise kann ein geeignetes Material so ausgewählt werden, dass es durch das tatsächliche Lösungsmittel oder die flüssige Phase der Probe, die analysiert werden soll, benetzbar ist.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei der Teststreifen eine Reporterfreisetzungszone und 2 bis 7 Detektionszonen umfasst. Derartige multiple Detektionszonen können hierin auch als strukturierte Detektionszone beschrieben werden.
Vorteilhafterweise gestatten mehrere Detektionszonen das Anwenden der Prinzipien der Mustererkennung und so die automatisierte Probenanalyse und das Multiplexieren. Ein Multiplexassay ist ein Typ Assay, der in der analytischen Chemie, klinischen Chemie und Biochemie zum gleichzeitigen Messen multipler Analyte in einem einzigen Lauf/Zyklus des Assays verwendet wird. Er unterscheidet sich von Vorgehensweisen, bei denen ein Analyt einzeln gemessen wird. Der Vorteil des Verwendens mehrerer Detektionszonen besteht darin, dass es mit einem Multiplexassay möglich ist, in einem einzigen Kanal zu arbeiten. In Abwesenheit dieser Detektionszonen sind verschiedene Kanäle zum Multiplexieren erforderlich.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Teststreifen vorgeschlagen, wobei der Teststreifen zumindest in der Reporterfreisetzungszone und/oder der Detektionszone mindestens zwei Matrixschichten umfasst.
Vorteilhafterweise können die Teststreifen ohne weiteres z.B. durch Einschieben von Matrixschichten, die die spezifizierten Zonen (z.B. eine Detektionszone) umfassen, zwischen zwei unmodifizierten Matrixschichten, die die spezifizierten Zonen bedecken und umschließen, hergestellt werden. Streifen können auch durch Laminieren unter Anwendung von Kapillarkräften, um das Fließen und die Diffusion von Reporter durch verschiedene Zonen zu gestatten, hergestellt werden.
Gemäß einer Ausführungsform weicht eine Gestalt des Teststreifens von einem nichtquadratischen Rechteck ab und umfasst ein quadratisches Rechteck oder irgendeine andere Gestalt. Beispielsweise kann der Teststreifen mindestens einen Abschnitt eines Kreises oder eines Dreiecks umfassen.
Obwohl eine längliche Gestalt des Teststreifens als üblichstes Format bei Lateral-Flow-Assays bevorzugt sein kann, können andere Gestalten des porösen Substrats zum Erzeugen eines gerichteten Stroms der strömenden flüssigen Phase verwendet werden, die den/die verwendeten Reporter zu der/den Detektionszone(n) trägt. Eine Kombination mehrerer Muster kann zum Erzeugen eines richtigen Flusses des Lösungsmittels in dem Streifen verwendet werden.
Gemäß einer Ausführungsform ist die Probeauftragszone auf der Reporterfreisetzungszone angeordnet. Sie kann direkt auf der Reporterfreisetzungszone angeordnet sein oder zusammen mit einer Zwischenmatrixschicht einen Stapel bilden.
Vorteilhafterweise können verschiedene poröse Matrixmaterialien für die verschiedenen Zonen ausgewählt werden. Dieser Modifikation entsprechend sind die angegebenen Zonen, d.h. die Probeauftragszone, die Reporterfreisetzungszone und die mindestens eine Detektionszone entlang einem Strom des Lösungsmittels angeordnet, wobei das Lösungsmittel den/die Reporter zu der/den Detektionszone(n) trägt.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Detektieren eines Analyten vorgeschlagen, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:

- das Bereitstellen eines Teststreifens irgendeiner der oben beschriebenen Ausführungsformen entsprechend;
- das Auftragen einer Probe auf die Probeauftragszone des Teststreifens;
- das Detektieren eines Vorliegens und/oder einer Menge und/oder einer Konzentration des optischen Reporters in der mindestens einen Detektionszone;
- das Bestimmen eines Vorliegens und/oder einer Konzentration des Analyten in der Probe.

Vorteilhafterweise ist das Verfahren für Multiplexassayformate geeignet.
Gemäß einer Ausführungsform umfasst das vorgeschlagene Verfahren ferner das Bereitstellen einer Flüssigkeit zum Erzeugen eines kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Fluidstroms von der Probeauftragszone zu der Reporterfreisetzungszone und von der Reporterfreisetzungszone zu mindestens einer Detektionszone. Die Flüssigkeit kann aus einem Lösungsmittel für den Analyten ausgewählt werden.
Die Flüssigkeit kann durch die Flüssigphase der Probe, z.B. ein Lösungsmittel bereitgestellt werden. Alternativ kann die Flüssigkeit, z.B. ein Lösungsmittel für den Analyten, in einem getrennten Schritt zugegeben werden, nachdem die Probe aufgebracht worden ist. Typischerweise erzeugt die Flüssigkeit einen Strom (Flüssigkeitsstrom), der den Analyten von der Probeauftragszone mindestens zu der Reporterfreisetzungszone trägt. Ferner wird ein Strom (Flüssigkeitsstrom) erzeugt, der von der Reporterfreisetzungszone zu der Detektionszone geleitet wird. Je nach der Menge Flüssigkeit, kann ein kontinuierlicher Flüssigkeitsstrom von der Probeauftragszone durch die Reporterfreisetzungszone zu der Detektionszone vorliegen. Jedoch ist es auch möglich, einen ersten Strom, der von der Probeauftragszone zu der Reporterfreisetzungszone geleitet wird und der durch Schwerkräfte und/oder Kapillarkräfte getrieben werden kann, und einen zweiten Strom vorliegen zu haben. Der zweite Strom wird typischerweise durch Kapillarkräfte getrieben und von der Reporterfreisetzungszone zur Detektionszone hin geleitet und kann sogar ein Absorptionskissen stromabwärts davon erreichen. Vorteilhafterweise kann die Kombination verschiedener Lösungsmittel die Detektion von Analytsuspensionen ermöglichen.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Detektieren eines Analyten vorgeschlagen, wobei der optische Reporter ein fluoreszierender Farbstoff ist und das Detektieren durch eine Fluoreszenzmessbestimmung mit einem Handgerät, d.h. einer tragbaren Vorrichtung erreicht wird.
Vorteilhafterweise kann das Detektionsverfahren im Feld, an Ort und Stelle, ohne anspruchsvolle Ausrüstung, selbst in Umgebungen ohne oder mit minimaler Infrastruktur angewendet werden.
Weiteren Ausführungsformen entsprechend kann eine tragbare Vorrichtung wie beispielsweise ein Smartphone, ein Tablet oder eine Mobilkommunikations- und Computervorrichtung zum Auffangen eines optischen Signals, z.B. einer Photolumineszenz, und Bestimmen, ob die Photolumineszenz in einer ausgewählten Detektionszone auf das Vorliegen eines gewissen Analyten hinweist, verwendet werden.
Einige Smartphone-Modelle können mit Mitteln ausgestattet sein, die dem Benutzer und/oder Programmierer gestatten, sich zu der Belichtung und Blendengeschwindigkeit der Kamera Zugang zu verschaffen oder diese zu regulieren. Es kann vorteilhaft sein, geeignete rohe Bilder aus der Kameraaufnahme, z.B. Bilder, die nicht unter Selbstbelichtungs-Kompensationsalgorithmen leiden, zu erhalten. Derartige Algorithmen, die in eine Smartphone-Hardware oder -Software integriert werden können, können für einen Endbenutzer wie einen Hobbyfotografen, zweckdienlich sein, können jedoch bei Verwendung des Smartphons für die chemische Analyse und für chemometrische Techniken Probleme verursachen. Beispielsweise kann die Luxmenge, die vom Detektor der Kamera, wie beispielsweise CMOS oder CCD aufgenommen wird, möglicherweise automatisch abgestimmt werden, um mit vorbestimmten Luxkriterien übereinzustimmen. Das Verwenden derartiger Werte statt richtig kalibrierter und korrigierter kann zu irreführenden und falschen Ergebnissen führen.
Deshalb kann das vorgeschlagene Verfahren einer weiteren Ausführungsform entsprechend das Vergleichen der Photolumineszenz in einer Detektionszone mit einem Kalibrierungswert, wie beispielsweise das Vergleichen eines Signals, wie der Lumineszenz, mit einem Bezugswert umfassen. Der Bezugswert kann aus gespeicherten Daten oder beispielsweise einem Bezugspunkt auf dem Teststreifen bestehen.
Ferner kann ein Verhältnis der Signalintensität, die in der Detektionszone erzeugt wird, zu der Signalintensität, die in der Reporterfreisetzungszone erzeugt wird, zur halbquantitativen Detektion eines Analyten verwendet werden. Insbesondere kann der Quotient der Fluoreszenzintensität an der Detektionszone, durch die Summe der Fluoreszenzintensität an der Detektionszone plus der Fluoreszenzintensität an der Reporterfreisetzungszone geteilt, d.h. das Äquivalent zu dem Verhältnis von freigesetztem Reporter, durch die Gesamtmenge des Reporters geteilt, für die halbquantitative Detektion eines Analyten verwendet werden. Auch kann ein Verhältnis von Fluoreszenzwerten, die bei verschiedenen Anregungs- oder Emissionswellenlängen erhalten werden, verwendet werden. Typischen Ausführungsformen entsprechend können digitale Bilder der Streifen oder mindestens der Detektionszone mit einer Digitalkamera erhalten werden. Die digitalen Bilder oder Abschnitte davon können unter Anwendung des Open Source Image Processing-Programms ImageJ (https://imagej.net) bearbeitet werden. Ein derartiges Bearbeiten kann sowohl für interne Referenzierung als auch halbquantitative Detektion verwendet werden.
Jede oben beschriebene Ausführungsform kann mit irgendeiner anderen Ausführungsform oder anderen Ausführungsformen kombiniert werden, es sei denn, es ist eindeutig das Gegenteil angegeben.
Die vorgeschlagenen Ausführungsformen umfassend die Konstruktion eines Teststreifens oder Messstabs, der für einen Lateral-Flow-Assay (siehe 1) geeignet ist und Folgendes umfasst: erstens einen Abschnitt für eine Probeeinführung (d.h. die Probeauftragszone); zweitens einen Abschnitt oder ein Segment, der/das mesoporöse hybride Sensormaterial enthält, das in der Lage ist, spezifisch mit dem Analyten (d.h. der Reporterfreisetzungszone) zu interagieren; und drittens einen Abschnitt oder ein Segment, der/das ein Fängermaterial enthält, das in der Lage ist, spezifisch mit dem optischen Reportermolekül, das aus dem Sensormaterial (d.h. der Detektionszone) freigesetzt worden ist, zu interagieren. Dieser Abschnitt kann mehr als ein Fängermaterial mit dem Ziel enthalten, verschiedene Reporter (z.B. Farbstoffe, fluoreszierende Substanzen, fluoreszierende Ionen, Ionen eines Seltenerdelements oder ihre Kombination, um nur einige wenige zu nennen) als Reportermoleküle zurückzuhalten, wenn eine Mischung von Sensormaterialien verwendet wird.
Ist das Fließen eines Lateral-Flow- oder Messstab-Assayformats einmal ausgelöst, so kann das Lösungsmittel den Analyten aus der Zone 1 zu der Zone 2 transportieren, in der das Sensormaterial abgesetzt worden ist und in der die Freisetzung des Reportermoleküls aus dem Sensormaterial nur in Gegenwart des entsprechenden Analyten erfolgt. Der Reporter wird dann aus der Zone 2 auf die / zu der jeweiligen Detektionszone 3 migrieren. Dort wird/werden der/die Reporter je nach seiner (ihrer) spezifischen chemischen Natur unter Anwendung verschiedener Makromoleküle oder Fängermaterialien, die komplementär zum Reporter ausgewählt worden sind, zurückgehalten. Aufgrund der Wechselwirkung des Reporters mit dem Fängermaterial wird der Reporter typischerweise in dieser Detektionszone immobilisiert.
Die technische Aufgabe der Ausführungsformen besteht darin, mehrere Fängermaterialen, die in der Detektionszone der Teststreifen immobilisiert sind, mit dem Ziel zu verwenden, eine markierungsfreie, potenziell multiplexierte Detektion mit Lateral-Flow-Geräten bereitzustellen. Diese immobilisierten Makromoleküle oder Fängermaterialien werden in der Lage sein, selektiv mit dem optischen Reporter zu interagieren. Der optische Reporter ist schon selektiv aus dem Sensormaterial durch den Analyten freigesetzt worden, der sich von der Probeinjektionszone (d.h. der Probeauftragszone) auf die Detektionszone(n) zu bewegt. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass der Reporter, der aus den Poren des abgesperrten Materials im Laufe eines erfolgreichen Detektionsereignisses freigesetzt wird, zweckbestimmt nur an einem gut definierten Ort auf dem Streifen, d.h. in der Detektionszone oder in einer von verschiedenen Detektionszonen, gefangen wird. Dies verbessert nicht nur die Selektivität, sondern auch die Empfindlichkeit aufgrund des Fokussierens des Reporters in einem gut definierten und eingeschränkten Bereich.
Die porösen Matrixmaterialien können Folgendes umfassen:

a) Cellulose, Baumwolle, Tuch, Graphen, Kohlenstoffnanoröhren (CNT); Glasfaserpapier, Glas oder Polymere, die mit gewissen organischen Gruppen modifiziert sind, die spezifisch mit dem optischen Reporter interagieren können.
b) gewisse molekular geprägte Polymere (MIP) oder geprägte Gele für die spezifische Detektion des optischen Reporters, kationische oder anionische Polyelektrolyte, mesoporöse Siliciumdioxid-oder Aluminiumoxidmaterialien (z.B. MCM-41 vom SiO₂-Typ, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8, 11-16), FDU-n (12, 14, 15, 16), UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 oder M-UVM-8, MCM-41 vom Al₂O₃-Typ), mit gewissen organischen Gruppen unter Anwendung verschiedener Organosilane (z.B. Aminogruppen unter Anwendung von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) oder Carbonsäuregruppe durch eine Ringöffnung-Linker- Verlängerungsreaktion der Aminogruppen mit Bernsteinsäureanhydrid) modifiziert.

Für die beschriebenen Ausführungsformen gibt es vielseitige Anwendungsbereiche für die Detektion kleiner Moleküle in den medizinischen, Umwelt-, Sicherheit- und Lebensmitteldiagnostischen Industrien. Mit dem Ziel, die Machbarkeit vorgeschlagener Ausführungsformen aufzuweisen, sind einige Beispiele, die die verwendeten Laborverfahren und -materialien beschreiben, unten aufgeführt.
BEISPIELE
Die Synthese von mesoporösen Materialien vom MCM-41-und SBA-15-Typ wurde den vorher berichteten Vorgehensweisen entsprechend ausgeführt. Für MCM-41 wurde n-Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB, 1,00 g, 2,74 mMol) zuerst in 480 ml MilliQ-Wasser gelöst. Dann wurden 3,5 ml NaOH (2,00 M in MilliQ-Wasser) der CTAB-Lösung zugegeben, gefolgt vom Einstellen der Lösungstemperatur auf 80 °C. TEOS (5,00 ml, 2,57·10^-2 Mol) wurde dann der Tensidlösung tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde 2 h lang gerührt, um ein weißes Präzipitat zu ergeben. Schließlich wurde das feste Produkt zentrifugiert, mit MilliQ-Wasser und Ethanol gewaschen und bei 60 °C getrocknet. Mit dem Ziel, das Tensid zu entfernen wurde die Probe 8 h lang bei
560 °C calciniert.
SBA-15 wurde mit Dreiblock-Poly(ethylenoxid)-Poly(propylenoxid)-Poly(ethylenoxid) (EO 20 -PO 70 -EO 20, P123) Copolymer als strukturregelndem Mittel und Tetraethylorthosilicat (TEOS) als Siliciumdioxidquelle synthetisiert. Bei einer typischen Synthese wurden 4,0 g (0,69 mMol) P123 in 120 ml Wasser und 19,41 ml HCl gelöst und dann bei 35 °C eine Stunde lang gerührt, um das Polymer zu lösen. Dann wurden 9,15 ml TEOS (41 mMol) tropfenweise in die homogene Lösung unter Rühren bei
35 °C über 24 h eingegeben. Das erhaltene Gel wurde bei 100 °C in einem Teflonkolben ohne Rühren weitere 24 h lang gealtert. Der erhaltene weiße Feststoff wurde filtriert, mit destilliertem Wasser gewaschen und bei 70 °C unter Vakuum 12 h lang luftgetrocknet. Schließlich wurde das Templat durch Calcinieren während 8 h bei 560°C entfernt.
Im Folgenden werden Materialien für die Detektion von Farbstoffen (Reportern), insbesondere die Synthese von APTES-MCM- und APTES-SBA-Materialien beschrieben. Die Materialien wurden den berichteten Vorgehensweisen entsprechend modifiziert. Eine Suspension von 100 mg MCM-41 oder SBA-15 in 2,5 ml Acetonitril (MeCN) und einem Überschuss von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES; 186,3 µl, 8 mMol g^-1 SiO₂) wurde bei Raumtemperatur während 5,5 h in einer Argonatmosphäre gerührt. Dann wurde das Material 5 min lang mit etwa 10.000 UpM zentrifugiert und zweimal mit 1,5 ml MeCN gewaschen. Schließlich wurde das Material unter Vakuum bei 40 °C 2 h lang getrocknet, was die resultierenden Materialien APTES-MCM und APTES-SBA ergab.
Im Folgenden wird die Synthese von COOH-MCM beschrieben. Für die Modifikation von MCM-41 mit Carbonsäuregruppen wurden 50 mg APTES-MCM-Materialien in 1,5 ml EtOH suspendiert, gefolgt von den berichteten Vorgehensweisen. 250 µl einer Lösung von Bernsteinsäureanhydrid (100 mg ml^-1) wurden jeder der hergestellten Suspension zugegeben und die Suspensionen wurden über Nacht bei 40 °C gerührt. Dann wurde das Material 5 min lang mit etwa 10.000 UpM zentrifugiert und zweimal mit 1,5 ml EtOH gewaschen. Schließlich wurde das Material unter Vakuum bei 40 °C 2 h lang getrocknet, was das resultierende Material COOH-MCM ergab.
Im Folgenden wird die Synthese von PA-COOH-MCM und PVP-APTES-MCM beschrieben. Poly(vinylpyrrolidon) 40 (PVP-40) und Poly(diallyldimethylammoniumchlorid) (PDDAC) wurden chemisch an die Oberflächen von APTES-MCM bzw. COOH-MCM adsorbiert. Für die Synthese von PVP-APTES-MCM wurden 20 mg APTES-MCM 2 h lang in einer Lösung von 25 mg ml^-1 PVP-40 in H₂O (1 ml) suspendiert. PA-COOH-MCM wurde durch Suspendieren von 20 mg COOH-MCM 2 h lang in 1 ml H₂O, das 50 µl einer Lösung von 35 % PDDAC in Wasser enthielt, hergestellt. Nach 2 h wurden beide Suspension 5 min lang mit etwa 10.000 UpM zentrifugiert und zweimal mit 1,5 ml H₂O gewaschen. Schließlich wurde das Material unter Vakuum bei 40 °C 2 h lang getrocknet, was die resultierenden Materialien PVP-APTES-MCM und PA- COOH-MCM ergab.
Im Folgenden wird die Synthese von APTES-Cellulosepapier (APTES-C) und APTES-Glasfaserpapier (APTES-GF) beschrieben. Cellulosepapier und Glasfaserpapier wurden mit Aminogruppen unter Anwendung von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) modifiziert. Zu diesem Zweck wurden 20 Stücke des entsprechenden Papiers (2 × 0,5 cm) in 7 ml Toluol und 100 µl APTES suspendiert. Die Proben wurden während 16 h bei 80 °C gerührt. Die resultierenden aminomodifizierten Papiere wurden aufgesammelt und dann zweimal mit Toluol und einmal mit EtOH gewaschen und sie wurden 3 h lang unter Vakuum getrocknet, wodurch die entsprechenden APTES-C- und APTES-GF-Papiere erhalten wurden.
Im Folgenden wird die Synthese von COOH-Cellulosepapier (COOH-C) und COOH-Glasfaserpapier (COOH-GF) beschrieben. Für die Modifikation von APTES-C- und APTES-GF-Papier mit Carbonsäuregruppen wurden 5 Stücke jedes Papiers mit 1,5 ml EtOH gemischt, gefolgt von den berichteten Vorgehensweisen. 250 µl einer Lösung von Bernsteinsäureanhydrid (100 mg ml^-1) wurden jeder der hergestellten Mischungen zugegeben und über Nacht bei 40 °C gerührt. Dann wurden die Papiere entfernt und zweimal mit 1,5 ml EtOH gewaschen. Schließlich wurden die Papiere unter Vakuum 2 h lang bei 40 °C getrocknet, was die resultierenden Papiere COOH-MCM und COOH-SBA ergab.
Im Folgenden wird die Synthese von Methacrylat-Glasfaserpapier (M-GF) beschrieben. Glasfaserpapier wurde mit Methacrylatgruppen derselben Vorgehensweise entsprechend, die für APTES-GF beschrieben worden ist, jedoch unter Anwendung von 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat statt APTES modifiziert, wodurch die Papiere M-GF erhalten wurden.
Im Folgenden wird die Synthese von selektiven Polymergelen und Polymergelen auf Papier für die Detektion von Farbstoffen beschrieben. Insbesondere wird die Synthese von FLU-M-GF, SURB- M-GF, SURG-M-GF, R6G-M-GF und RuBipy-M-GF beschrieben. Die geprägten Papiergele wurden unter Anwendung des wässrigen Ausfällungspolymerisationsverfahrens den Vorgehensweisen in der Literatur entsprechend hergestellt. Typischerweise wurden 10 Stücke M-GF (2 × 0,5 cm) mit 6 ml einer PBS-Lösung (20 mM; pH-Wert 7,2), die Acrylamid (AAm; 29,1 mg, 0,41 mMol) und N-Isopropylacrylamid (NIPAAm; 46,4 mg, 0,41 mMol) enthielt, gemischt. 150 µl einer Lösung von 5 mM des entsprechenden Template-Moleküls 2,7-Dichlorfluorescein (FLU), von Sulforhodamin B (SURB), Sulforhodamin G (SURG), Rhodamin 6G (R6G) oder Rutheniumtrisbipyridin (RuBipy) der Lösung zugegeben und die Mischung wurde 30 min unter langsamem Rühren bei 25 °C inkubiert, um Komplexe zu bilden. Daraufhin wurde der Vernetzer N,N'-Ethylenbis(acrylamid) (EBAAm; 25,2 mg; 0,15 mMol) zugegeben. Nach Spülen der Mischung mit N₂ 1 h lang, wurde die Polymerisation durch Zugeben von Ammoniumpersulfat (APS; 6 mg) und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED; 3 µl) ausgelöst. Die Reaktion wurde 1 h lang bei 25 °C unter einer N₂-Atmosphäre fortgesetzt, wobei die Bildung des Gels nach 10 min beobachtet wurde. Nach 1 h langer Reaktion wurden die geprägten Papiergele durch Entfernen derselben von dem Gel aufgesammelt, gefolgt von ausgiebigem Waschen mit NaCl-Lösung (1 M), bis zum vollständigen Entfernen der unreagierten Monomere und Template. Schließlich wurden die entsprechenden Papiere 2 h lang unter Vakuum getrocknet, was die entsprechenden FLU-M-GF-, SURB-M-GF-, SURG-M-GF-, R6G-M-GF- und RuBipy-M-GF-Papiergele ergab. Parallel dazu wurden die Gele FLU-MIG, SURB-MIG, SURG-MIG, R6G- MIG und RuBipy-MIG über Nacht unter Vakuum getrocknet. Die nicht geprägten Gele und Papiergele (NIG und NIG-M-GF) wurden auf dieselbe Weise hergestellt, mit der Ausnahme, dass kein Templat während der Polymerisation zugegeben wurde.
Weiter unten werden die Ergebnisse von Studien beschrieben, bei denen nur das Absetzen von Farbstoffen auf die Wechselwirkungszone vorgenommen wurde.
Bei einem ersten Versuch, die Effizienz der Materialien, die als Detektionszone(n) 3 hergestellt wurden, anfänglich zu kontrollieren, wurden nur verschiedene Farbstofflösungen auf die Wechselwirkungszone 2 der Streifen getüpfelt, wobei die komplexeren, mesoporösen, hybriden Sensormaterialien nicht involviert wurden. Hier wurden beispielhafte Studien mit ausgewählten Polyelektrolyten und mesoporösen Fängermaterialien, die auf der Zone 3 hergestellt wurden, ausgeführt, wobei sowohl Glasfaser- als auch Nitrocellulosemembranen verwendet wurden.
Im Folgenden werden Studien mit Polyelektrolyten, die als Fängermaterialen, z.B. für die Bildung einer Detektionszone, aufgebracht wurden, beschrieben. Eine PDDAC-Lösung (17 %) wurde zum Erzeugen einer Linie mit einer Dicke von 0,5 cm (3 Tupfen von 1 µl) auf einer Glasfasermembran, 4 cm vom unteren Rand der Membran, die einer ersten Detektionszone glich (2a), verwendet. 1 µl einer Sulforhodamin B-Lösung (SURB; 10 mg ml^-1 in H₂O) wurde auf die Wechselwirkungszone 2 cm vom unteren Rand aufgetüpfelt und der Streifen wurde in eine LF-Kassette (Lateral-Flow-Kassette) unter Verwendung eines Baumwollpapiers als Probe und absorptionsfähiges Kissens eingelegt. Das Fließen wurde durch Pipettieren von 100 µl H₂O (2b) und von PBS-Puffer (1c; 0,8 mM, pH-Wert 7,5) hergestellt. Das Fließen wurde durch Aufnehmen von Fotografien unter UV-Licht (λ_ex 254 nm) überwacht. Nur im Falle von H₂O war die Detektionszone in der Lage, den Farbstoff in der Zone selbst nach 1 h effizient zurückzuhalten (2b/1 and 3). Jedoch beobachteten wir, dass, wenn Puffer verwendet wurde, die Retention des Farbstoffs nur während der ersten 5 min effizient war (2b/2); nachher begann die Polyelektrolytlinie, die den Farbstoff enthielt, sich ebenfalls mit dem Fluss zum Ende des Streifens hin zu bewegen, wobei der Farbstoff verwischt wurde (2b/4).
Bei einem weiteren Versuch wurde eine konzentriertere Lösung von PDDAC (35 %) verwendet, um zu versuchen, die „Immunität“ gegen PBS (0,8 mM, pH-Wert 7,5) zu verbessern; PBS-Puffer ist ein sehr häufig verwendetes Lösungsmittel und oft für die erfolgreiche Arbeitsleistung von Biomakromolekülen bei Assays erforderlich. Zu diesem Zweck wurde eine dünnere Linie von 3 mm Polymer auf das Papier getüpfelt und 1 µl SURB (10 mg ml^-1 in H₂O) wurde verwendet. In diesem Fall beobachteten wir, dass der Farbstoff floss und in einem kleinen Bereich zurückgehalten wurde. Jedoch war die Retention wiederum nur 3 min lang wirksam (2c/1). Daraufhin fuhr der Farbstoff fort, mit dem Fluss zu migrieren (2c/2).
Bei einem weiteren Versuch stellten wir eine dickere Linie (etwa 6 mm) einer Lösung von 35 % PDDAC (35 %) her. Hier beobachteten wir, dass das Fließen aufhörte, wenn es die Region der Polymerlinie erreichte, wobei SURB sich zu Beginn der Linie vorkonzentrierte (2d). Bei den ausgeführten Versuchen können wir den Schluss ziehen, dass das Verwenden von Polyelektrolyten als Fängermaterial für ungepufferte Lösungsmittel oder Verwenden von Puffern bei einem Assay effizient ist, wobei der Assay in weniger als 5 min durchgeführt wird. Das bedeutet, dass bei Puffer die Retention nur während der ersten Minuten wirksam ist, daraufhin die Retention nicht mehr wirksam ist. In allen Fällen erfolgt das Fließen wirklich schnell, innerhalb etwa 1 Minute ist der Streifen vollständig nass und der Farbstoff beginnt sich auf der Polymerlinie anzusammeln.
Im Folgenden werden Studien mit mesoporösen Materialien als Fängermaterial beschrieben. Bei einem ersten Versuch wurde die Wirkung des mesoporösen Gerüsts, das für die Herstellung der Fängermaterialien verwendet wurde, getestet. Bei diesem Versuch wurde 2,7-Dichlorfluorescein als Reporterfarbstoff verwendet. Mehrere Nitrocellulosestreifen, die hydrophobe Wachsmuster enthielten, wurden hergestellt, wodurch mehrere Zonen auf dem Streifen definiert wurden. Nitrocellulosestreifen von 4,5 × 0,5 cm wurden bedruckt und 1 min lang bei 105 °C in einem Ofen erhitzt, um die Penetration des Wachses in das Papier zu garantieren, was zu papierdicken Barrieren in der Membran führte (3a). 1 µl einer Lösung von 2,7-Dichlorfluorescein (FLU; 10 mg ml^-1) wurde in der Reporterfreisetzungszone 2) abgesetzt, während 2,5 µl einer wässrigen Suspension von 10 mg ml^-1 der entsprechenden APTES-MCM- und APTES-SBA-Materialien in der Detektionszone 3) suspendiert wurden. Die Effizienz der Fängermaterialien, die in der Zone 3) abgesetzt wurden, wurde durch Aufgeben auf die Probeauftragszone 1) von 15 µl PBS-Lösung (80 mM; pH-Wert 7,5) getestet.
Während des Fließens der Farbstofflösung den Streifen entlang wurde erwartet, dass das Fangen von FLU, einem negativ geladenen Farbstoff, in den aminomodifizierten Materialien in der Detektionszone 3) erfolgt, weil diese Gruppen bei einem neutralen pH-Wert weitgehend protoniert sind und in der Lage sein sollten, negative Spezies aufgrund elektrostatischer Kräfte zu fangen. Nach 2 min wurden die Streifen unter eine selbsthergestellte 3D-gedruckte Lampe, die mit zwei LED (λ_exc 470 nm und 505 nm) als Anregungsquelle und Filtern ausgestattet war (Cut-off 532 nm und Langpass von 550 nm) positioniert und einige Fotografien wurden gemacht, um die Fängereffizienz von Materialien in der Detektionszone 3) zu beobachten. Die 3b zeigt Streifen, die APTES-MCM in Zone 3 enthalten, während die 3c Streifen zeigt, die APTES-SBA enthalten. Wie zu sehen ist, ist das MCM-41-Gerüst in der Lage, viel mehr Farbstoff im Vergleich mit SBA-15 zurückzuhalten.
In Anbetracht der Tatsache, dass MCM-41 viel effizienter war, wurde ein ähnlicher Versuch mit COOH-MCM statt APTES-MCM in der Detektionszone 3) durchgeführt. Nach dem entsprechenden Fließen wurde kein FLU in der Detektionszone 3 am wahrscheinlichsten wegen elektrostatischer Abstoßung zwischen dem negativ geladenen Material und dem verwendeten anionischen Farbstoff zurückgehalten (3d).
Um die Retention des Farbstoffs auf Nitrocellulosemembranen bei Verwendung kationischer Farbstoffe zu vermeiden, wurde ebenfalls eine Glasfasermembran getestet. Aufgrund der höheren Hydrophilizität des Papiers waren die Flecken der Materialien konzentrierter und es war notwendig, 10 µl einer Suspension von 10 mg ml^-1 APTES-MCM zweimal aufzutüpfeln, um eine richtige Linie zu erzeugen. Die 4a zeigt die Effizienz der APTES-MCM-Linie nach dem Fließen der Streifen, die 1 µl SURB oder FLU in der Reporterfreisetzungszone 2 enthielten. Die Retention des Farbstoffs war selbst nach ein paar Stunden effektiv.
In Anbetracht der festgestellten Ergebnisse, verwendeten wir bei einem zweiten Versuch COOH-MCM und APTES-MCM mit dem Ziel, 2 Linien in den Detektionszonen zu schaffen, d.h. zwei getrennte Detektionszonen und eine getrennte anionische aus einem kationischen Farbstoff zu fertigen. Eine Mischung von zwei verschiedenen Farbstoffen, einem negativ geladenen Farbstoff (FLU) und einem positiv geladenen Farbstoff (R6G; 1 µl 1 ppm) wurde auf die Wechselwirkungszone aufgetüpfelt. COOH-MCM wurde auf eine Linie in einer Entfernung von etwa 3 cm vom unteren Rand (L1) aufgetüpfelt, während APTES-MCM 4 cm vom unteren Rand (L2) aufgetüpfelt wurde. Nach dem Fließen wurde eine selektive Fluoreszenz, die nur R6G in L1 entsprach, und FLU in L2 beobachtet (4b).
Schließlich prüften wir die Materialien PVP-APTES-MCM und PA-COOH-MCM bezüglich der Retention der Farbstoffe Rhodamin 6G und 2,7-Dichlorfluorescein auf ähnliche Weise wie bei den Studien, die mit COOH-MCM und APTES-MCM ausgeführt worden sind. Zu diesem Zweck wurde PVP-APTES-MCM zum Erzeugen der L1 verwendet, während PA-COOH-MCM zum Erzeugen von L2 verwendet wurde. Wie in der 4c zu sehen ist, wurden ähnliche Ergebnisse wie bei dem vorhergehenden Versuch festgestellt.
Im Folgenden werden Studien mit modifizierten Cellulose- und Glasfaserpapieren als poröser Matrix beschrieben. Bei einem ersten Versuch wurde der Einfluss der Natur des verwendeten Papiers getestet. Bei diesen Versuchen wurde FLU als Modellfarbstoff verwendet. So wurden Stücke von 0,5 × 0,5 cm APTES-C- und APTES-GF-Papieren zwischen zwei Membranen von GF-Papier befestigt, die die Detektionszone 3 darstellten, was einer Gesamtstreifenlänge von 3,5 cm gleichkommt. 1 µl einer FLU-Lösung (10 mg ml^-1) wurde etwa 1 cm vom unteren Rand aufgetüpfelt (5a), was die Reporterfreisetzungszone 2 simulierte. Streifen wurden in einer LF-Kassette gelassen. Nach Zugabe von 100 µl PBS (80 mM, pH-Wert 7,5) wurde das Fließen dem Streifen entlang unter UV-Licht durch eine ähnliche Vorgehensweise, wie vorher beschrieben, überwacht. In beiden Fällen wurde eine Retention von FLU mit der Zeit beobachtet (5b und 5c/1 and 5c/2), der auf APTES-C länger im Vergleich mit APTES-GF zurückgehalten wurde. Um die Selektivität der Papiere zu studieren, wurde derselbe Versuch mit einem Stück COOH-GF (5b and 5c/3) ausgeführt. In diesem Fall wurde ein schnelles Fließen von FLU den Membranen entlang beobachtet; eine Retention fehlte.
Um die Menge an zurückgehaltenem fluoreszierendem Farbstoff zu quantifizieren wurde die integrierte Fluoreszenz des Bereichs der Detektionszonen in Abhängigkeit von der Zeit unter Anwendung der ImageJ-Software beurteilt. Die Ergebnisse sind in der 5d dargestellt.
Im Folgenden werden Studien mit Polymergelen auf Papier beschrieben. Unter den mit geprägten Gelen hergestellten Papieren wählten wir FLU-M-GF zum Ausführen der Versuche aus, wobei auch NIG-M-GF als Bezugssubstanz verwendet wurde. Ein Stück von 0,5 × 0,5 cm NIG-M-GF oder FLU-M-GF wurde als Fängerzone zwischen zwei Membranen von GF-Papier befestigt, was zu einem Streifen einer Gesamtlänge von 3,5 cm führte. 1 µl einer FLU-Lösung (10 mg ml^-1) wurde etwa 1 cm vom unteren Rand (der Wechselwirkungszone; 6a) aufgetüpfelt. Um die Selektivität des FLU-M-GF gegen andere Farbstoffe zu kontrollieren, wurde ein anderer Streifen, der FLU-M-GF enthielt, an der Detektionszone hergestellt und 1 µl einer SURB-Lösung (10 mg ml^-1) wurde statt FLU auf die Reporterfreisetzungszone getüpfelt.
Die Streifen wurden in einer LF-Kassette gelassen und nach Zugabe von 100 µl PBS wurde die Entwicklung des Fließens im Streifen entlang unter UV-Licht durch eine ähnliche Vorgehensweise wie zuvor beschrieben überwacht. Die 6b zeigt das entsprechende Fließen der drei Streifen, die in Abhängigkeit von der Zeit für 1) NIG-M-GF und 2) FLU-M-GF unter Anwendung von FLU als Farbstoff und 3) FLU-M-GF unter Anwendung von SURB als Farbstoff hergestellt wurden. Wie zu sehen ist, war die Retention von FLU nur unter Anwendung von FLU-M-GF wirksam, während SURB durch FLU-M-GF nicht zurückgehalten wurde. Die Menge an Fluoreszenz, die auf NIG-M-GF und FLU-M-GF in Abhängigkeit von der Zeit zurückgehalten wurde, wurde ebenfalls unter Anwendung der ImageJ-Software quantifiziert. Die Ergebnisse stimmen mit der unter der UV-Lampe beobachteten Fluoreszenz überein (6c).
Bei einem zweiten Versuch stellten wir Streifen her, die zwei Detektionszonen, eine erste Zone mit SURB-M-GF und eine zweite mit FLU-M-GF geprägten Gelen, wie in 7a gezeigt, enthielten. Auf einen der Streifen wurde 1 µl einer Lösung, die eine Mischung (insgesamt) von 1 mM FLU und SURB enthielt, etwa 1 cm vom unteren Rand aufgetüpfelt, während nur Lösungsmittel auf den anderen Streifen aufgetüpfelt wurde, um den Einfluss des Lösungsmittels als solchem auf die Fluoreszenz zu beurteilen. Die Streifen wurden in einer Lateral-Flow-Kassette gelassen und ein Stück Glasfaserpapier wurde zu Beginn und am Ende zugegeben, um eine Probe und ein absorptionsfähiges Kissen zu erhalten. 200 µl PBS wurden auf das Probekissen aufgegeben und das Fließen wurde unter Anwendungen einer selbstgefertigten Fluoreszenzlampe, wie oben beschrieben, überwacht. Die 7b) und 7c) zeigen die Farbe und Fluoreszenz, die in den entsprechenden Zonen beobachtet wurden, in Abhängigkeit von der Zeit (6c) und am Ende des Versuchs (6b). Wie zu sehen ist, wurde SURB nur in der SURB-M-GF-Zone (S) zurückgehalten, während FLU nur in der FLU-M-GF-Zone (F) zurückgehalten wurde. Die 7d zeigt die Menge an Fluoreszenz, die in Abhängigkeit von der Zeit auf den Streifen, wie durch ImageJ quantifiziert, zurückgehalten wird. Wie zu sehen ist, wurde in Abwesenheit der Farbstoffe keine Änderungen des Hintergrunds bei den FLU-M-GF-Streifen (2F) beobachtet, während eine geringe Abnahme des Hintergrunds bei SURB-M-GF beobachtet wurde, was dem Übergang vom trockenem zu nassem Zustand des Gels (2S) zuzuschreiben war. In Gegenwart der Mischung von Farbstoffen wurde eine Zunahme der Fluoreszenz zuerst in der ersten Zone beobachtet, die SURB-M-GF (1S) zugeschrieben wurde, während nach 2 min eine Zunahme der Fluoreszenz auch in der zweiten FLU-M-GF-Zone aufgrund der Retention von FLU (2S) beobachtet wurde.
Im Folgenden werden Studien, bei denen abgesperrte Sensormaterialien in der Wechselwirkungszone, d.h. in der Sensorzone verwendet wurden, beschrieben. Durch die Ergebnisse, die wir mit den fluoreszierenden Farbstoffen in den Modellstudien festgestellt haben, ermutigt, beschlossen wir, die abgesperrten Sensormaterialien auch auf Streifen zu verwenden. Zu diesem Zweck wurde Glasfaserpapier als poröse Matrix verwendet. Wir tüpfelten 2 µl einer Suspension von 5 mg ml^-1 eines Sensormaterials, das in der Lage ist, Pentaerythrittetranitrat (PETN) spezifisch zu detektieren und das SURB innerhalb der Poren enthält.
Bei einem ersten Versuch wurden verschiedene Streifen unter Anwendung von PDDAC-Lösungen von 17 und 35 % hergestellt. Wir stellten mehrere Streifen, die eine Linie von 6 mm PDDAC (17 %) als Detektionszone enthielten und andere, die Linien von 3 oder 6 mm einer 35 %-igen Lösung als Detektionszonen enthielten, her. Die Streifen wurden mit 160 µl fließender PBS (80 mM, die 2,5 % MeOH enthielt), die entweder mit 25 ppm PETN versetzt war oder keinen Analyten enthielt, entwickelt. Die 8 zeigt, dass nur in Gegenwart von PETN eine beträchtliche Menge Farbstoff in der Fängerzone (Linie 1, 8) detektiert werden konnte. Ferner war bei einer verdünnten Polymerlinie (17 %, 8a) der Farbstoff im Vergleich mit der Linie mit 35 % PDDAC (8b für eine Bande von 3 mm und 8c für eine Bande von 6 mm) weniger konzentriert. Trotz der festgestellten Ergebnisse war die Retention des Farbstoffs in den Fällen a) und b) nur bis zum Ende der ersten 4 min wirksam, wobei der Farbstoff nach dieser Zeit nicht mehr zurückgehalten wurde. Eine effektive Retention wurde nur bei der Lösung von 35 % und einer breiten Bande von 6 mm beobachtet, die das Fließen des Farbstoffs über die Polymerlinie aufhielten. Diese Anordnung hielt den Farbstoff länger als 30 min lang zurück.
Im Gegensatz zu den vorgelegten Beispielen und Ausführungsformen, basieren bekannte Lateral-Flow-Assays auf dem herkömmlichen Reporteransatz und es wird keine Amplifikation des Signals erzeugt. Das Signal auf der „Testlinie“ und der „Kontrolllinie“ der herkömmlichen Lateral-Flow-Tests wird aufgrund der direkten Reaktion des Analyten (der in einem vorhergehenden Schritt in der Lage ist, mit dem entsprechenden Antikörper, der an farbige oder fluoreszierende Teilchen gekoppelt ist, zu reagieren) mit dem entsprechenden Antikörper, der kovalent an den Streifen gebunden ist, und eine Stöchiometrie von 1:1 aufweist, erzeugt. Den hier beschriebenen Ausführungsformen entsprechend kann vorteilhafterweise eine massive Signalamplifikation erstens durch Auftragen des empfindlichen Materials, das in der Reporterfreisetzungszone vorliegt, und zweitens durch das Fangen und Fokussieren des selektiv freigesetzten Reporters in der Detektionszone erhalten werden.
Während bei den meisten der bisher bekannten Lateral-Flow-Assays die Detektion des Analyten das Vorliegen eines zweiten Bindungsmittels als Reporter erfordert, sind die hier beschriebenen Ausführungsformen markierungsfrei. Vorteilhafterweise kann einer oder mehreren der beschriebenen Ausführungsformen entsprechend mehr als ein Analyt pro Kanal detektiert und quantifiziert werden. Das kontrollierte Fokussieren und Konzentrieren bezüglich freigesetzter Reportermoleküle in spezifischen Fängerzonen ist bisher nicht aufgezeigt worden.
Hier aufgeführten Ausführungsformen entsprechend kann die poröse Matrix der Lateral-Flow-Streifen Folgendes umfassen:

a) Cellulose, Baumwolle, Tuch, Graphen, Kohlenstoffnanoröhren (CNT); Glasfaserpapier, Glas oder Polymere, die mit gewissen organischen Gruppen modifiziert sind, die in der Lage sind, spezifisch mit dem optischen Reporter zu interagieren.
b) Gewisse molekular geprägte Polymere (MIP) oder geprägte Gele für die spezifische Detektion des optischen Reporters, kationische oder anionische Polyelektrolyte, mesoporöse Siliciumdioxid- oder Aluminiumoxidmaterialien (beispielsweise MCM-41 vom SiO₂-Typ, HMS, MSU-n, MSU-V, F5M-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8,11-16), FDU-n (12, 14, 15, 16), UVM-7, UVM-8, M-UVM-7 oder M-UVM-8, MCM-41 vom Al₂O₃-Typ), die mit gewissen organischen Gruppen unter Anwendung mehrerer Organosilane (beispielsweise Aminogruppen unter Anwendung von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) oder Carbonsäuregruppen durch eine Ringöffnungs-Linkerverlängerungsreaktion der Aminogruppen mit Bernsteinsäureanhydrid modifiziert sind.

Durch Verwenden von Materialien, die in der Lage sind, selektiv mit verschiedenen optischen Reportermolekülen zu interagieren, ist es möglich, mehrere Bereiche in der Detektionszone zu schaffen, die das räumliche Konzentrieren der Reportermoleküle, um die Empfindlichkeit zu verbessern, und die Möglichkeit, mehrere Substanzen gleichzeitig auf einem einzigen Streifen zu detektieren, gestatten.
Das Reportersignal wird in einem Bereich erzeugt, der räumlich von der Wechselwirkung des Sensormaterials mit dem Analyten getrennt ist. Das gemeldete Signal basiert so nur auf dem Fangen des optischen Reportermoleküls, das nach der Wechselwirkung des Sensormaterials mit dem Analyten freigesetzt wird. Kein Markieren oder Verwenden von sekundären Bindungsmitteln ist zum Erzeugen eines Signals in einem definierten Bereich notwendig
Weil die optischen Reportermoleküle nicht in den Proben enthalten sind und die funktionellen Gruppen der Fängerzone immer in einem hohen Überschuss mit Bezug auf die Reportermoleküle vorliegen, kann die vollständige Zurückhaltung des Reportermoleküls in der Fängerzone ohne weiteres mit ziemlich einfachen Kräften wie Elektrostatik, H-Bindung, kovalenter Bindung (beispielsweise zum Detektieren von Zuckern mit Borsäuren), koordinativer, π-π-Stapel- oder hydrophober Wechselwirkung erreicht werden.
Ferner ist es möglich, ein Muster von Fängermaterialien in der Detektionszone für eine Mischung von abgesperrten Materialien zu verwenden, in die verschiedene optische Reportermoleküle integriert sind, was die gleichzeitige Detektion mehrerer Analyte mit einem Teststreifen oder Stab gestattet.
Typische Ausführungsformen umfassen die Verwendung eines Fängermaterials in einer festgelegten Zone, die nicht mit dem Analyten oder einem markierten Konkurrenten interagiert, sondern chemisch vollständig andere optische Reportermoleküle in viel höherer Konzentration aufnehmen und zurückhalten kann als der Analyt. Dies gestattet eine fokussierte amplifizierte Detektion eines Analyten und seine halbquantitative Analyse.
Vorteilhafterweise können multiple oder strukturierte Detektionszonen auf Lateral-Flow-Streifen, planaren Substraten oder Stäben für die multiplexierte optische Detektion erzeugt werden.
Vorteilhafterweise ist die Detektion von Analyten einer oder einer Kombination der beschriebenen Ausführungsformen entsprechend markierungsfrei.
Ferner wird eine Erhöhung der Empfindlichkeit nicht nur wegen der beschriebenen Signalamplifikation, die durch das verwendete Sensormaterial erzeugt wird, sondern wegen des zweckbestimmten Fangens und Konzentrierens der freigesetzten Reportermoleküle erreicht.
Einige Ausgestaltungen der hier beschriebenen Ausführungsformen können wie folgt zusammengefasst werden.

1. Vorgeschlagen wird die Konstruktion eines Teststreifens oder Messstabs, der für einen Lateral-Flow-Assay (siehe 1) geeignet ist und der Folgendes umfasst:
1. a) einen Abschnitt oder ein Segment für die Probeeinführung; b) (einen Abschnitt oder ein Segment, der/das ein mesoporöses hybrides Sensormaterial enthält, das in der Lage ist, spezifisch mit dem Analyten zu interagieren; und c) einen Abschnitt oder ein Segment, der/das das Fängermaterial enthält, wobei das Fängermaterial in der Lage ist, mit dem/den Reportermoleküle(en) zu interagieren, wobei das/die Reportermolekül(e) aus dem mesoporösen hybriden Sensormaterial freigesetzt wird/werden.
2. Einen Teststreifen, wie unter der Ausgestaltung 1 beschrieben, wobei das Sensormaterial ein poröses Trägermaterial umfasst, das Poren und ein optisches Reportermolekül aufweist, das in den Poren des porösen Trägermaterials enthalten ist, wobei die Poren des porösen Trägermaterials durch ein Porenschließmaterial geschlossen sind, das nichtkovalente Bindungen mit dem porösen Trägermaterial bildet, wobei das Porenschließmaterial so ausgewählt wird, dass es einen Analyten in einer flüssigen Probe spezifisch bindet und wobei das optische Reportermolekül aus ungeschlossenen Poren freigesetzt wird, wenn der Analyt sich spezifisch an das Porenschließmaterial bindet.
3. Einen Teststreifen wie unter der Ausgestaltung 1 beschrieben, wobei das Material, das in der Lage ist, mit dem optischen Reportermolekül zu interagieren, ein Papier aus modifizierter Cellulose oder Glasfaser mit gewissen organischen Gruppen ist, die in der Lage sind, mit dem Reporter zu interagieren. Die organischen Gruppen wurden z.B. unter Aminogruppen oder Carbonsäuregruppen ausgewählt.
4. Einen Teststreifen wie unter der Ausgestaltung 1 beschrieben, wobei das Material, das in der Lage ist, mit dem optischen Reportermolekül zu interagieren, ein modifiziertes mesoporöses Material mit gewissen organischen Gruppen ist, die in der Lage sind, mit dem Reporter zu interagieren. Die organischen Gruppen sind in der Lage, an die Oberfläche adsorbiert oder kovalent gebunden zu werden.
5. Einen Teststreifen wie unter der Ausgestaltung 1 beschrieben, wobei das Material, das in der Lage ist, mit dem optischen Reportermolekül zu interagieren, ein molekular geprägtes Polymer ist, das gegen den Reporter erzeugt und in der Lage ist, spezifisch damit zu interagieren.
6. Einen Teststreifen wie unter der Ausgestaltung 1 beschrieben, wobei das Material, das in der Lage ist, mit dem optischen Reportermolekül zu interagieren, ein geprägtes Gel ist, das in der Lage ist, spezifisch mit dem Reporter zu interagieren.
7. Einen Teststreifen wie unter der Ausgestaltung 1 beschrieben, wobei das Material, das in der Lage ist, mit dem optischen Reportermolekül zu interagieren, ein Nitrocellulose- oder Glasfaserpapier ist, das direkt gepfropft ein molekulargeprägtes Polymer oder ein geprägtes Gel enthält, das in der Lage ist, spezifisch mit dem Reporter zu interagieren.
8. Einen Teststreifen wie unter der Ausgestaltung 1 beschrieben, wobei der Abschnitt oder das Segment, der/das mesoporöse Sensormaterial enthält, ein Muster verschiedener mesoporöser Sensormaterialien umfasst (siehe 4).
9. Einen Teststreifen wie unter der Ausgestaltung 1 beschrieben, wobei der Abschnitt, der das unter den Ausgestaltungen 3-7 beschriebene Material enthält, ein geordnetes Muster oder eine geordnete Anordnung von Materialien, die in den Ansprüchen 3-7 beschrieben sind, enthält, mit dem Ziel, das Vorliegen von mehr als einem Analyten gleichzeitig zu detektieren (siehe 4).
10. Sensormaterial wie unter Ausgestaltung 2 beschrieben, wobei der optische Reporter in der folgenden Tabelle 1 beschrieben ist.
11. Einen Teststreifen wie unter der Ausgestaltung 1 beschrieben, wobei die Kombinationen von Fängermaterialien und optischen Reportermolekülen in der folgenden Tabelle 2 beschrieben sind.

Klasse	Optische Reportermoleküle
#1	Rhodamin und Derivate
	Fluorescein und Derivate
	Styrylderivate
	Cyanin- und Polymethinderivate
	Pyridiniumderivate
	Pyrylium- und Thiopyryliumderivate
	Ruthenium-, Osmium- oder Iridiumkomplexe und -derivate
	Lumineszierende Komplexe von Seltenerdelementen (wie Europium oder Terbium)
	Squarylium und Derivate
#2	Cumarin und Derivate
	Dipyrromethen oder BODIPY und Derivate
	Pyrromethan und Derivate
	Benzofuran und Derivate
	Pyridinderivate
	Naphthalimide und Derivate
	Benzoxazol und Derivate
	Benzoxadiazol und Derivate
	Benzindol und Derivate
	DAPI und Derivate
	Stilben und Derivate
	Oxazin und Derivate
	Perylen und Derivate
	Azulen und Derivate
	Styrylbasen-Derivate
	Phycoerythrin und Derivate
	Squarain und Derivate
	Porphyrin und Derivate
	Phthalocyanin und Derivate
#3	Kationische und anionische Derivate aller Farbstoff in #2.

Fängermaterialien	Optische Reportermoleküle
Cellulosepapier, Glasfaserpapier, Baumwollpapier, Glas, mesoporöse Siliciumdioxid- oder Aluminiumoxidmaterialien (z.B. MCM-41 vom SiO₂-Typ, HMS, MSU-n-, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8, 11-16), UVM-7, UVM-8, M- UVM-7 oder M-UVM-8, MCM-41 vom Al₂O₃-Typ), die Amino- oder Carbonsäuregruppen enthalten, die kovalent an die Oberfläche gebunden sind.	Klasse #1 und #3 der Tabelle 1
Cellulosepapier, Glasfaserpapier, Baumwollpapier, Glas, mesoporöse Siliciumdioxid- oder Aluminiumoxidmaterialien (z.B. MCM-41 vom SiO₂-Typ, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8, 11-16), UVM-7, UVM-8, M- UVM-7 oder M-UVM-8, MCM-41 vom Al₂O₃-Typ), die Amino- oder Carbonsäuregruppen, die kovalent an die Oberfläche gebunden sind und Polyelektrolyte enthalten, die an der Oberfläche adsorbiert sind.	Klasse #1 und #3 der Tabelle 1
Molekular geprägte Gele (MIG)	Klasse #1, #2 und #3 der Tabelle 1
Molekular geprägte Polymere (MIP) unter Anwendung optischer Reportermoleküle der Spalte 2	Klasse #1, #2 und #3 der Tabelle 1
Kern-MIP-Mantelteilchen (Kern = Siliciumdioxid oder Polymer)	Klasse #1, #2 und #3 der Tabelle 1
Cellulosepapier, Glasfaserpapier, Baumwollpapier, Glas, das molekular geprägte Gele oder Kern-MIP-Mantelteilchen enthält	Klasse #1, #2 und #3 der Tabelle 1

Abkürzungen

MCM-41, HMS, MSU-n, MSU-V, FSM-16, KSW-2, SBA-n (n = 1, 2, 3, 8, 11-16), UVM-7,FDU-n (12, 14, 15, 16), UVM-8, M-UVM-7 oder M-UVM-8, MCM-41 vom Al2O3-Typ: = mesoporöse Materialien
AAm: = Acrylamid
APS: = Ammoniumpersulfat
APTES: = 3-Aminopropyltriethoxysilan APTES-C = APTES-modifiziertes Cellulosepapier
APTES-GF: = APTES-modifiziertes Glasfaserpapier
APTES-MCM: = APTES-modifiziertes MCM-41 APTES-SBA = APTES-modifiziertes SBA-15
CTAB: = n-Cetyltrimethylammoniumbromid COOH-MCM = COOH-modifiziertes MCM-41
COOH-C: = COOH-modifiziertes Cellulosepapier
COOH-GF: = COOH-modifiziertes Glasfaserpapier
COOH-SBA: = COOH-modifiziertes SBA-15
EBAAm: = N,N'-Ethylenbis(acrylamid) FLU = 2,7-Dichlorfluorescein
FLU-M-GF: = 2,7-Dichlorfluorescein-modifiziertes M-GF
FLU-MIG: = 2,7-Dichlorfluorescein-modifiziertes, molekular geprägtes Gel
M: = 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat
M-GF: = 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat-modifiziertes Glasfaserpapier = Methacrylat-Glasfaserpapier MCM = mesoporöses Material, MCM-4 MeCN = Acetonitril
MeOH: = Methanol
MIG: = molekular geprägtes Gel
NIG: = nichtgeprägtes Gel
NIG-M-GF: = nichtgeprägtes Gel - modifiziertes M-GF
NIPAAm: = N-Isopropylacrylamid
P123: = EO₂₀-PO₇₀-EO₂₀ = Dreiblockpoly(ethylenoxid)-Poly(propylenoxid)-Poly(ethylenoxid)
PA-COOH-MCM: = PDDAC-modifiziertes COOH-MCM-41
PBS: = phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung
PDDAC: = Poly(diallyldimethylammoniumchlorid)
PETN: = Pentaerythrittetranitrat PVP = Poly(vinylpyrrolidon)
PVP-APTES-MCM: = PVP-modifiziertes APTES-MCM-41
R6G: = Rhodamin 6G
R6G-M-GF: = mit Rhodamin 6G geprägtes Polymer auf Glasfaserpapier
R6G-MIG: = mit Rhodamin 6G molekular geprägtes Gel
RuBipy: = Rutheniumtrisbipyridin
RuBipy-M-GF: = mit Rubidiumtrisbipyridin geprägtes Gel auf Glasfaserpapier
RuBipy-MIG: = mit Rubidiumtrisbipyridin geprägtes Gel
SBA-15: = mesoporöses Siliciumdioxidmaterial (amorphes Santa Barbara),
SURB: = Sulforhodamin B
SURB-M-GF: = mit Sulforhodamin B modifiziertes M-GF
SURB-MIG: = mit Sulforhodamin B modifiziertes, molekular geprägtes Gel
SURG: = Sulforhodamin G
SURG-M-GF: = mit Sulforhodamin G modifiziertes M-GF
SURG-MIG: = mit Sulforhodamin G modifiziertes MIG
TEMED: = N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin TEOS = Tetraethylorthosilicat.

Die vorliegende Erfindung ist unter Bezugnahme auf verschiedene veranschaulichende Ausführungsformen und Beispiele erklärt worden. Diese Ausführungsformen und Beispiele sollen den Umfang der Erfindung, die durch die Ansprüche und ihre Äquivalente definiert ist, nicht einschränken. Wie einem Fachmann auf dem Gebiet der Technik offensichtlich sein wird, können die hier beschriebenen Ausführungsformen auf verschiedene Arten und Weisen ausgeführt werden, ohne vom Umfang dessen, das erfunden worden ist, abzuweichen. Verschiedene Merkmale, Ausgestaltungen und Funktionen, die in den Ausführungsformen beschrieben sind, können mit anderen Ausführungsformen kombiniert werden.

Claims

Teststreifen umfassend ein poröses Material, wobei der Teststreifen Folgendes umfasst: - eine Probeauftragszone zum Auftragen einer flüssigen Probe, die einen Analyten umfasst; - eine Reporterfreisetzungszone, die ein Sensormaterial umfasst, wobei das Sensormaterial geeignet ist, selektiv mit dem Analyten durch Freisetzen eines optischen Reporters zu interagieren, wobei die Reporterfreisetzungszone stromabwärts von der Probeauftragszone angeordnet ist; - eine Detektionszone, die ein Fängermaterial umfasst, wobei das Fängermaterial geeignet ist, den optischen Reporter selektiv zu binden und stromabwärts von der Reporterfreisetzungszone angeordnet ist; wobei der optische Reporter in Poren des Sensormaterials enthalten ist, wobei die Poren des Sensormaterials durch ein Porenschließmaterial geschlossen sind, wobei das Porenschließmaterial so ausgewählt ist, dass es den Analyten spezifisch bindet, und wobei der optische Reporter aus den Poren freigesetzt wird, wenn der Analyt spezifisch an das Porenschließmaterial bindet.
Teststreifen nach Anspruch 1, wobei das Porenschließmaterial nichtkovalent an das Sensormaterial gebunden ist und sich von dem Sensormaterial löst, wenn es durch den Analyten gebunden wird.
Teststreifen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 2, wobei der optische Reporter einen fluoreszierenden Farbstoff, einen farbigen Farbstoff oder ein lumineszierendes, anorganisches fluoreszierendes Ion eines Seltenerdelements umfasst.
Teststreifen nach Anspruch 3, wobei der fluoreszierende Farbstoff mindestens eines umfasst von einem Rhodamin; einem Fluorescein; einem Styryl; einem Cyanin oder Polymethin; einem Pyridinium; einem Pyrylium; einem Thiopyrylium; einem Rutheniumkomplex; einem Osmiumkomplex; einem Iridiumkomplex; einem lumineszierenden Komplex eines Seltenerdelements; einem Squaryliumderivat; einem neutralen, einem kationischen oder einem anionischen Derivat von Cumarin, Dipyrromethen oder BODIPY, von Pyrromethen, von Benzofuran, von Pyridin, von Naphthalimid, von Benzoxazol, von Benzoxadiazol, von Benzindol, von DAPI, von Stilben, von Oxazin, von Perylen, von Azulen, von einer Styrylbase, von Phycoerythrin, von Squarain, von Porphyrin oder von einem Phthalocyanin-Farbstoff.
Teststreifen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Fängermaterial unter einem molekulargeprägten Polymer, einem Polyelektrolyt oder einem funktionalisierten mesoporösen Material ausgewählt ist umfassend mindestens eines von: einem Thiol, einem Isocyanat, einer Aminogruppe, einer Hydroxygruppe, einer Epoxygruppe, einer Carbonsäuregruppe oder einer geladenen funktionellen Gruppe wie einer quartären Ammoniumgruppe.
Teststreifen nach Anspruch 5, wobei das Fängermaterial aus einem molekular geprägten Polymer ausgewählt wird, wobei das molekulargeprägte Polymer durch Polymerisation von mindestens einem oder mehreren Typen eines Monomers, das ausgewählt ist unter: Acrylamid, Vinylpyridin, N-Isopropylacrylamid,2-hydroxyethylmethacrylat, Methylmethacrylat, Benzylmethacrylat, Methacrylat, Methacrylamid, N,N'-Dimethylmethacrylamid, Vinylalkohol, Vinylimidazol; mit einem Vernetzungsmittel erzeugt wird, das ausgewählt ist unter: Ethylendimethacrylat, Ethylenglycoldimethacrylat, Poly(acrylsäure), einem Bis(-hydroxyethyl)sulfon, Trimethylolpropantrimethacrylat oder Pentaerythrittriacrylat.
Teststreifen nach Anspruch 5, wobei das Fängermaterial aus einem Polyelektrolyt ausgewählt ist, wobei der Polyelektrolyt typischerweise Polykationen oder Polyanionen wie beispielsweise Poly(diallyldimethylammoniumchlorid), Poly(allylamin)hydrochlorid, Poly(ethylenimin) (PEI), Poly(acrylsäure), Poly(vinylpyrrolidon) (PVP), Poly(natriumstyrolsulfonat) (PSS), ein Cyclodextran oder Polydextan umfasst.
Teststreifen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, ferner eine Absorptionszone umfassend, wobei die Absorptionszone stromabwärts von der Detektionszone angeordnet und geeignet ist, das Lösungsmittel zu absorbieren.
Teststreifen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei ein Bereich des Teststreifens, der mindestens eine oder mehrere Detektionszonen umfasst, durch eine Barriere umgeben ist, wobei die Barriere entweder die Poren der porösen Matrix schließt und/oder eine Benetzbarkeit der porösen Matrix für das Lösungsmittel modifiziert und einen Kanal in der porösen Matrix bildet.
Teststreifen nach Anspruch 9, wobei die Barriere durch ein Wachs gebildet ist.
Teststreifen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Sensormaterial ein mesoporöses anorganisches Material umfasst.
Teststreifen nach Anspruch 11, wobei das mesoporöse anorganische Material Siliciumdioxid, Aluminiumoxid, TiO₂, Kohlenstoff, Carbonitrid, Siliciumcarbid, Siliciumoxycarbid, Siliciumcarbonitrid, Siliciumnitrid, Siliciumoxynitrid, Siliciumaluminiumnitrid oder Silicoborcarbonitrid umfasst.
Teststreifen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die poröse Matrix unter einem Papier, einem Filz, einem Vlies, einer Faser, einem gepressten oder gesinterten Pulver, einem Tuch oder einem Gewebe ausgewählt ist, wobei das Papier, der Filz, das Vlies, die Faser, das gepresste oder gesinterte Pulver, das Tuch und das Gewebe mindestens eines umfassen von einem Polymer, einem Glas, einem Keramikmaterial, einem Kohlenstoff, einem Graphen, einem Mineral oder einem Metall.
Teststreifen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 13, wobei der Teststreifen eine Reporterfreisetzungszone und 2 bis 7 Detektionszonen umfasst.
Teststreifen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der Teststreifen zumindest in der Reporterfreisetzungszone und/oder in der Detektionszone mindestens zwei Matrixschichten umfasst.
Teststreifen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Gestalt des Streifens von einem nichtquadratischen Rechteck abweicht und mindestens einen Abschnitt eines Kreises oder eines Dreiecks umfasst.
Teststreifen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 16, wobei die Probeauftragszone auf der Reporterfreisetzungszone angeordnet ist.
Verfahren zum Detektieren eines Analyten, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: - das Bereitstellen eines Teststreifens nach irgendeinem der Ansprüche1 bis 17; - das Auftragen einer Probe auf die Probeauftragszone des Teststreifens; - das Detektieren eines Vorliegens und/oder einer Menge und/oder einer Konzentration des optischen Reporters in der mindestens einen Detektionszone; - das Bestimmen des Vorliegens und/oder einer Konzentration des Analyten in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 18, ferner umfassend das Bereitstellen einer Flüssigkeit zum Erzeugen eines kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Fluidstroms von der Probeauftragszone zu der Reporterfreisetzungszone und/oder von der Reporterfreisetzungszone zu mindestens einer Detektionszone.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der optische Reporter ein fluoreszierender Farbstoff ist und das Detektieren durch eine Fluoreszenzmessbestimmung mit einem Handgerät erreicht wird.