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Die Erfindung betrifft eine Messeinrichtung zur Bestimmung der Konzentration von Halogeniden und Pseudohalogeniden in einer Probe, mit einem mit der Probe in Kontakt bringbaren fluoreszenzop- tischen Indikator, der nach Anregung über eine Anregungslichtquelle in Abhängigkeit von der vorliegenden Halogenidkonzentration fluoresziert und mit einer Anordnung zur Messung und Auswer- tung des Fluoreszenzlichtes, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines Sensorelementes zur Verwen- dung in einer derartigen Einrichtung.
Zur Bestimmung von Halogenidionen sind zur Zeit drei wesentliche Verfahren bzw. Methoden von Bedeutung, nämlich die titrimetrischen (z. B. mit Silbernitrat nach Fajans), die photometrischen (beschrieben z. B. in : Lange-Vejdelek, Photometrische Analyse, Verlag Chemie, 1980, S. 331-343 und 355-359) sowie die potentiometrischen Verfahren mit Hilfe ionenselektiver Elektroden (beschrieben z. B. in : Cammann, Das Arbeiten mit ionenselektiven Elektroden, Springer Verlag, 1977, S. 72ff).
In der klinischen Analytik, wo Chlorid das am häufigsten zu bestimmende Halogenid ist, sind im wesentlichen nur die photometrischen und-besonders in letzter Zeit - die potentiometri- schen Verfahren gebräuchlich. Die titrimetrischen und photometrischen Verfahren sind sehr genau, aber eher arbeitsaufwendig und nicht zur kontinuierlichen Messung geeignet. Die Verfahren mit Hilfe ionenselektiver Membranen sind zur kontinuierlichen Messung geeignet, nachteilig sind ihre geringe Spezifität und ihre zum Teil geringe Langzeitstabilität. Ausserdem wird bei jeder potentiometrischen Messung eine zweite Elektrode als Referenzelektrode benötigt.
Davon ausgehend stellt sich die Erfindung im wesentlichen die Aufgabe, die genannten Nachteile der bekannten Verfahren bzw. Einrichtungen zur Durchführung dieser Verfahren zu vermeiden, und insbesonders eine Messeinrichtung anzugeben, welche in einfacher Weise zur Bestimmung der Konzentration von Halogeniden und Pseudohalogeniden in einer Probe sowohl in kontinuierlicher wie auch in diskontinuierlicher Weise geeignet ist.
Es ist bekannt, dass die Fluoreszenzintensität gewisser Fluoreszenzfarbstoffe durch die Gegenwart gewisser anorganischer Ionen vermindert wird. Diesen Vorgang bezeichnet man als Fluoreszenzlöschung. Er ist reversibel, d. h., die Fluoreszenzintensität wird wieder maximal, wenn alle Löscherionen aus der Lösung wieder entfernt worden sind.
Weiters ist z. B. aus der Z. Anal. Chem. 314,577 [1983] bekannt, dass die Halogenide Chlorid, Bromid und Jodid relativ spezifisch die Fluoreszenz von Chinin, 6-Methoxychinolin, Acridin und andern derartigen heterocyclischen Indikatoren löschen. Diese Beobachtung ist die Grundlage des dort beschriebenen fluorimetrischen Bestimmungsverfahrens für Halogenide in organischen Materialien nach Verbrennung.
Ein Nachteil des dort beschriebenen Verfahrens ist die notwendige Zugabe einer genau gemessenen Indikatorlösung zur Probe. Ein weiterer erheblicher Nachteil ist der Umstand, dass stark gefärbte Lösungen wie z. B. Serum oder Vollblut auf diese Weise nicht vermessen werden können, da sie erhebliche Teile des Anregungs- bzw. Fluoreszenzlichtes absorbieren.
Bei der erfindungsgemässen Messeinrichtung werden diese Probleme dadurch gelöst, dass in einem oberflächlich mit der Probe in Kontakt bringbaren Sensorelement ein Indikator aus
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gebunden vorliegt und dass zwischen dem Träger und den Indikatormolekülen Spacergruppen angeordnet sind. Auf diese Weise ist erstmals und auf sehr einfache Weise eine kontinuierliche fluoreszenzoptische Messung der Konzentration von Halogeniden bzw. Pseudohalogeniden in einer Probe ermöglicht, wobei abhängig vom Material bzw. der Lichtdurchlässigkeit des Trägers sowie von den optischen Eigenschaften der Probe entweder im Durchlicht- oder im Remissionsverfahren gemessen werden kann.
Bei der folgenden näheren Erklärung der Erfindung ist teilweise Bezug genommen auf die Zeichnungen, welche in den Fig. l und 2 Formelschemata von verwendbaren Indikatoren, in Fig. 3 bis 5 schematische Darstellungen von Sensorelementen bzw. Messeinrichtungen nach der Erfindung, in Fig. 6 bis 11 weitere Formelschemata zur Erläuterung der Ausführungsbeispiele und in Fig. 12 und 13 Fluoreszenzsignal-Diagramme zeigen.
Im Zusammenhang mit einer Messeinrichtung nach der Erfindung wurden beste Erfahrungen
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mit heterocyclischen aromatischen Stickstoffverbindungen gemacht (typische chemische Strukturen sind beispielsweise in Fig. l angegeben) ; daneben sind aber auch Polyenfarbstoffe (z. B. aus der Reihe der Cyanine) in diesem Sinn geeignet. Diese Indikatoren werden vorzugsweise in kationischer Form eingesetzt, da sie dann durch die Halogenidanionen auf Grund bevorzugter elektrostatischer Wechselwirkung besonders leicht angezogen werden und dadurch eine besonders effiziente Loschung eintritt. Prinzipiell möglich sind auch aromatische Kohlenwasserstoffe, doch werden diese nur mehr durch das stark depolarisierbare Jodid-Ion einigermassen gut gelöscht.
Ein weiterer Nachteil der aromatischen Kohlenwasserstoffe ist der, dass sie die Oberfläche polymerer Träger hydrophobisieren und schliesslich auch nicht quarterniert werden können.
Als Spacergruppen kommen prinzipiell alle Molekülgruppierungen in Frage, welche den Abstand zwischen dem festen Träger und dem Indikatormolekül um mindestens die Länge einer CH,,-Einheit oder eines Phenylkernes erweitern.
Diese Spacergruppen können gemäss drei bevorzugten Verfahren nach der Erfindung auf verschiedene Weise eingeführt werden : a) Die Spacergruppe ist bereits in dem Reagens vorhanden, mit welchem ein polymerer
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material immobilisiert wird. Als Beispiel kann man die quarternierte Acridin-9-propionsäure, sowie die beiden weiteren Indikatoren mit mindestens zwei CHL-Gruppen im Formelschema in
Fig. 2 anführen.
Diese besitzen bereits Spacergruppen aus mindestens zwei CH -Gruppen. Werden diese Indikatoren an eine Glasoberfläche gebunden, welche bereits einen Spacer nach der in
Absatz a) geschilderten Art besitzt, ergibt sich eine Spacergruppe der Länge von mindestens fünf CH-Gruppen (Beispiele 1 und 2). c) Schliesslich kann die Spacergruppe auch noch in einem zusätzlichen chemischen Schritt eingeführt werden, indem man die chemische Funktion an der Oberfläche des polymeren Trägers zuerst mit einem Spacermolekül (z. B. Hexamethylendiamin, 1, 6-Diisocyanatohexan, Phenylendiiso- cyanat und deren Homologe) verlängert und erst an diese verlängerte Kette den Indikator anknüpft.
Wie bereits erwähnt, kommen als Indikatoren im Rahmen der Erfindung vorzugsweise heterocyclische Stickstoffverbindungen wie z. B. Chinin, 6-Methoxychinolin, Acridin, Chinazolin, Acridizin, Harman u. ähnl in Frage. (Typische chemische Strukturen s. Fig. 1.) Gegebenenfalls können diese Indikatoren auch noch weitere funktionelle Gruppen (z. B. Amino, Hydroxy, Carboxy, Carboxyalkyl, Sulfonsäure oder Sulfonatoalkyl) tragen, welche zur Verbesserung der Stabilität, der spektralen Eigenschaften oder zur Erleichterung der kovalenten Bindung dienen können. Auch die Löschkonstanten, d. h. die Fähigkeit, durch Halogenid gelöscht zu werden, lässt sich durch Substituenten in gewissem Mass steuern.
Auch die Fluoreszenz sauerstoffheterocyclischer Indikatoren (z. B. der Rhodamine) sowie polycyclischer aromatischer Kohlenwasserstoffe (z. B. Pyren, Anthracen usw.) und anderer heteroaromatischer Fluoreszenzfarbstoffe kann durch Halogenidionen gelöscht werden. Mit Ausnahme der kationischen Indikatoren ist aber die Wasserlöslichkeit bzw. Hydrophilie dieser Verbindungen üblicherweise zu gering, um sie in wässerigen Systemen anwenden zu können.
Neben den Halogeniden wirken auch die klinisch allerdings weniger bedeutsamen sogenannten Pseudohalogenide als Löscher und können somit mit Hilfe der vorgestellten Erfindung quantitativ bestimmt werden. Besonders Rhodanidion wirkt als sehr wirksamer Löscher, aber auch Cyanid und Cyanat löschen, etwa so effizient wie Chlorid.
Die Fluoreszenz der genannten heterocyclischen Indikatoren wird im allgemeinen nur in saurer Lösung genügend effizient gelöscht. In saurer Lösung liegen sie in protonierter (kationischer) Form vor und sind dadurch dem Angriff des anionischen Löscherions besonders gut zugänglich. Es hat sich nun herausgestellt, dass die Fluoreszenz dieser Indikatoren auch dann gut gelöscht wird, wenn sie gemäss einem weiteren Vorschlag der Erfindung in quarternierter Form vorliegen. Wieder liegen die Indikatoren als Kationen vor, aber im Gegensatz zur Protonierung ist die Quarternierung ein irreversibler Prozess. Diese bewirkt, dass die Indikatoren nicht nur
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in saurer Lösung, sondern auch unter physiologischen PH-Bedingungen gut gelöscht werden. Dadurch wird der Einfluss des PH-Wertes auf das Löschverhalten ausgeschaltet.
Das Formelschema in Fig. 2 gibt einige Beispiele solcher quarternierter Indikatoren. Ihre spektralen Eigenschaften sind praktisch identisch mit denen der nicht quarternierten Indikatoren in saurer Lösung.
Als Quarternierung bezeichnet man dabei ganz allgemein die Überführung eines tertiären Amins bzw. eines Stickstoffheteroaromaten in eine quarternäre Ammoniumverbindung mit Hilfe eines Reagenzes, welches elektrophile Reaktivität aufweist, z. B. mit Hilfe von Alkyljodiden, Sulfonsäureestern, Sultonen und andern Alkylierungsmitteln. Allgemeine Arbeitsvorschriften für die Quarternierung von Aminen sind in Lehrbüchern der organischen Chemie, z. B. in Gattermann- - Wieland. Die Praxis des organischen Chemikers, 43. Auflage, Verlag De Gruyter, Berlin-New York, [1982] sowie in Organikum, VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin-Ost, [1981] genauer beschrieben.
Bevorzugte Verfahrensschritte sind dabei gemäss der Erfindung solche, bei denen die Quarternierung gleichzeitig zu einer Einführung der Spacergruppen führt, z. B. mit Hilfe von Sultonen (s. auch Beispiel 2).
Die Quarternierung am fertigen Sensorelement kann objektiv durch Spektroskopie festgestellt werden, da sich die spektralen Eigenschaften der quarternierten Indikatoren deutlich von denen der nichtquarternierten Indikatoren unterscheiden. Als Beispiel sei das 6-Methoxychinolin angeführt, welches in nichtquarternierter Form bei 325 nm absorbiert und bei 382 nm fluoresziert.
Wird das Molekül hingegen quarterniert, so liegen die entsprechenden Maxima bei 345 und 450 nm.
Als Trägermaterialien zur kovalenten Immobilisierung der Indikatoren kommen einerseits organische Polymeren wie z. B. Poly (meth) acrylate, Poly (meth) acrylamide, Polyacrylnitrile, Polystyrol oder Cellulose sowie auch Copolymeren der entsprechenden Monomeren bzw. mit andern Monomeren in Frage. Anderseits hat sich unter den anorganischen Trägermaterialien Glas wegen seiner optischen Transparenz und mechanischen Stabilität besonders gut bewährt.
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sehr hohe spezifische Oberfläche ; gleichzeitig bleibt die mechanische Festigkeit des Trägers erhalten. Die hohe spezifische Oberfläche erlaubt eine dichte Belegung mit Indikator, somit eine Erhöhung der Signalintensität des Sensors.
Um die Indikatoren auf dem festen Träger zu immobilisieren sind insbesonders jene Verfahren besonders vorteilhaft, bei denen bei der Oberflächenmodifizierung des Trägermaterials bereits eine Spacergruppe miteingeführt wird, und bei denen der zu immobilisierende Indikator ebenfalls eine Spacergruppe mit einer zur Immobilisierung geeigneten Funktion besitzt.
Dies schliesst aber nicht die Anwendung anderer Verfahrensschritte aus. So kann man z. B. ein mit Aminogruppen modifiziertes Trägermaterial auch mit Indikatoren über COOH-, COCI- oder SO, Cl-Gruppen verknüpfen. Über Glycidyloxy-Endgruppen am Träger gelingt die Immobilisie-
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eine Endgruppe des Trägers noch über ein Diisocyanat um eine beliebige Anzahl von CH2-Gruppen oder Phenylkerne verlängert werden, wobei die zweite Isocyanat-Gruppe zur Immobilisierung des Indikators über Amino- oder Hydroxygruppen dienen kann.
Eine andere bereits kurz erwähnte Möglichkeit besteht darin, dass man den Indikator zuerst mit Hilfe eines Silylreagenzes umsetzt und dieses Reagens dann zur Immobilisierung verwendet (s. z. B. das Schema in Fig. 6, wo IND den Indikator und DCC Dicyclohexylcarbodiimid bedeutet). Diese Reaktion kann auch noch mit der Einführung einer zusätzlichen Spacerfunktion gekoppelt werden, wie dies z. B. im Schema der Fig. 7 dargestellt ist.
Der Vollständigkeit halber sei hier auch erwähnt, dass sich durch die angeführte Möglichkeit gemäss der Erfindung als Trägermaterial für den Indikator auch Copolymeren der entsprechenden Monomeren bzw. mit andern Monomeren zu verwenden in vorteilhafter Weise ein verbesserter Lösch-
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Ber. C 55, 50% H 5, 37% N 4, 98%
Gef. C 55, 42% H 5, 34% N 4, 88%
Sulfochloriddarstellung und Immobilisierung
100 mg der oben erhaltenen Verbindung werden 30 min in 1 ml Thionylchlorid in Anwesenheit eines Tropfens Dimethylformamid unter Rückfluss erhitzt.
Nach Abdampfen des überschüssigen
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Thionylchlorids löst man den Rückstand, der aus dem Sulfochlorid besteht, welches aber nicht isoliert zu werden braucht, in 10 ml trockenem Dimethylformamid, dem 1 Tropfen trockenes Pyridin zugesetzt worden war.
In diese Lösung taucht man ein wie unter Beispiel 1 hergestelltes Glasplättchen mit oberfläch- lichen Aminopropylgruppen. Man lässt 5 h stehen. Anschliessend wird mit Wasser und Aceton gewaschen. Die entstehenden Sensoren sind gebrauchsfertig.
Die auf die beschriebene Weise erhaltenen Sensorelemente sind sowohl zur kontinuierlichen wie zur diskontinuierlichen Messung des Halogenid- bzw. Pseudohalogenidgehaltes von flüssigen Proben geeignet. Fig. 3 zeigt einen Schnitt durch ein typisches Glassensorelement. Auf einem festen Träger --1--, beispielsweise aus Glas, ist an der Oberfläche --2-- vorerst sogenanntes CPG-Glas in Form von Kügelchen --3-- aufgesintert, welches eine stark vergrösserte Oberfläche für die schematisch angedeutete Anbindung der Indikatormoleküle I über Spacergruppen --4--
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Einflüsse des Probenmediums zu verringern bzw. auszuschalten.
Die Fig. 4 und 5 zeigen schematisch einfache Messeinrichtungen nach der Erfindung. Aus einer Lichtquelle L fällt Anregungslicht nach dem Passieren eines Primärfilters F 1 auf das Sensorelement S, dessen Indikatorschicht dem Probenraum --5-- zugewendet ist. Das entstehende Fluoreszenzlicht, welches der Halogenidkonzentration der Probe proportional ist, fällt nach dem Passieren eines Sekundärfilters F2, welches die Aufgabe hat, das Anregungs- licht wegzufiltern, auf einen Lichtdetektor D. Das damit erhaltene elektrische Signal wird im Verstärker V verstärkt, gegebenenfalls einer Rechnereinheit R zugeführt und dann einer analogen oder digitalen Auswertung oder Anzeige zugeführt.
Die Probenräume können z. B. als Einmalmesskammer oder als Durchflusszellen ausgeführt sein. Als Lichtquellen können z. B. thermoelektrische, elektronische Laser oder LED-artige Anordnungen dienen, die kontinuierlich oder gepulst Licht liefern. Als Filter können Absorptionsfilter oder Interferenzfilter eingesetzt werden. Als Lichtmesseinrichtungen können lichtelektrische Photozellen, Photoverstärker oder Photodioden eingesetzt werden. In der Rechnereinheit wird die Konzentration des zu bestimmenden Stoffes bestimmt, wobei es in der Praxis oft notwendig werden kann, vom anliegenden Messsignal bzw. der gemessenen Fluoreszenzintensität eine konstante Grösse abzuziehen, um auf das eigentliche Messsignal zu kommen.
Die Konstante berücksichtigt das störende Fluoreszenzlicht, welches durch Lichtstreuung in das Lichtdetektorsystem gelangt.
Die in Fig. 5 gezeigte Anordnung arbeitet im Prinzip wie die in Fig. 4 angegebene, nur dass das Fluoreszenzlicht nicht in Remission, sondern nach Passieren des Probenraumes --5-gemessen wird. Dadurch wird das Fluoreszenzlicht des Sensorelementes S besser genutzt, anderseits kann man diese Anordnung aber nur beim Vorliegen optisch transparenter und nicht selbst fluoreszierender Lösungen anwenden.
Im Bedarfsfall kann es weiters nach Massgabe der Erfordernisse zu verschiedenartigen Anordnungen und zur Verwendung anderer Bauteile kommen. So kann es z. B. notwendig werden, die Lichtzufuhr von der Lichtquelle zu den Sensorelementen sowie die Lichtableitung von den Indikatoren zu den Detektoren mit Hilfe von Lichtleitern vorzunehmen. Es ist weiters möglich, den Indikatorschichten ionenselektive Membranen vorzuschalten, um die Diffusion der Löscher an die Indikatorschichten selektiver zu gestalten. Zur Trennung des Fluoreszenzsignals des Sensors von der Störfluoreszenz des Probenmaterials kann es notwendig werden, optisch undurchlässige Trennschichten zwischen Probe und Sensor einzubauen, welche natürlich löscherdurchlässig sein müssen.
Fig. 12 zeigt schliesslich das Signal (relative Intensität J über der Zeit t) eines fluoreszenzoptischen Sensorelementes, bestehend aus glasimmobilisiertem Acridin, in einer Messeinrichtung wie sie in Fig. 4 angegeben ist. Man erhält das Signal A in Gegenwart von reinem Wasser bzw. auch mit 0, 1 M Natriumsulfatlösung, da weder Natrium- noch Sulfationen als Löscher wirken.
Beim Übergang zu 0, 1 M Lösungen von Natriumjodid (Signal B), Natriumbromid (Signal C) und Natriumchlorid (Signal D) tritt eine Signalminderung ein. Man erkannt, dass die Messung beim Gang von Chlorid zu Bromid zu Jodid zunehmend empfindlich wird.
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Zwischen der relativen Fluoreszenzintensität J und der Konzentration c des Halogenids besteht die in Fig. 13 dargestellte Beziehung, welche im wesentlichen der aus der Literatur bekannten folgenden Gleichung ("Stern-Volmer-Gleichung") gehorcht : I/I = l-k [L] (l)
Hier bedeuten :
Io die Fluoreszenzintensität in Abwesenheit von Löschern
I die Fluoreszenzintensität in Gegenwart von Löschern k die Löschkonstante [L] die Löschkonzentration lu und k sind in der Praxis konstante Grössen, welche im Fall von k einmal bestimmt werden müssen.
Die Beziehung zwischen I und [L) wird durch Justierungsmessungen ermittelt (Fig. 13). Man erkennt insbesonders aus Fig. 13, dass durch die Verwendung unterschiedlicher immobilisierter Indikatoren eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber den einzelnen Halogeniden erzielt werden kann ; der obere Teil von Fig. 13 betrifft ein Sensorelement mit Acridin als Indikator ; der untere Teil basiert auf einem solchen mit 6-Methoxyquinoliniúm.
Gegebenenfalls müssen störende Anteile am gemessenen Signal, welche durch Streulicht oder durch Untergrundfluoreszenzen des Probenmaterials zustande kommen, berücksichtigt werden.
Diese Beiträge sind üblicherweise konstant, so dass Gleichung (1) zu folgender Gleichung (2) erweitert werden kann : (I,-Ik)/ (I- Ik) = 1 -k [L] (2)
I, Io'kund [L) haben hier die vorhin angegebene Bedeutung, Ik ist der konstante Störlichtanteil. Störende Fluoreszenzen sind in der klinischen Chemie besonders die des Bilirubins im Serum (Maximum bei zirka 520 nm), die des NAD (P) H im Serum (Maximum bei zirka 465 nm) und die besonders starke Fluoreszenz der Tryptophan- und Vitamin Bg-Metaboliten im Urin (Maximum bei 420 nm).
Zur Ausschaltung von Intensitätsschwankungen der Lichtquelle, wobei Io nicht mehr konstant wäre, sowie auch zur Berücksichtigung eines geringen Ausbleicheffektes des Indikators kann dem Halogenidsensor weiters auch ein Referenzsensor zugeordnet werden, wie dies bei derartigen Messeinrichtungen an sich durchaus üblich ist.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Messeinrichtung zur Bestimmung der Konzentration von Halogeniden und Pseudohalogeniden in einer Probe, mit einem mit der Probe in Kontakt bringbaren fluoreszenzoptischen Indikator, der nach Anregung über eine Anregungslichtquelle in Abhängigkeit von der vorliegenden Halogenidkonzentration fluoresziert und mit einer Anordnung zur Messung und Auswertung des Fluoreszenzlichtes, dadurch gekennzeichnet, dass der in einem oberflächlich mit der Probe in Kontakt bringbaren Sensorelement befindliche Indikator aus der Gruppe der (hetero) aromatischen, polycyclischen Verbindungen sowie Polyenfarbstoffe, vorzugsweise in kationischer Form, in dünner Schicht kovalent an der Oberfläche eines festen Trägers gebunden vorliegt und dass zwischen dem Träger und den Indikatormolekülen Spacergruppen angeordnet sind.