DE69213826T2 - Teststreifen mit Merocyanin und Nitro- oder Nitroso-substituierten polyhalogenierten Phenolsulfonphthaleinen als Protein-Indikatoren - Google Patents

Teststreifen mit Merocyanin und Nitro- oder Nitroso-substituierten polyhalogenierten Phenolsulfonphthaleinen als Protein-Indikatoren

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein den Nachweis von Protein, insbesondere betrifft sie ein neues Verfahren zur Bestimmung von Protein in einer biologischen Probe unter Anwendung neuer Protein(Eiweiß)- Fehler indikatoren.
  • Die Bestimmung von in einer biologischen Probe vorhandenem Protein ist von größter Bedeutung bei der Diagnose verschiedener Krankheitszustände im Zusammenhang mit der Niere, dem Kreislauf- und Zentralnervensystem. Häufig ist es erforderlich, Protein (Albumin) in Urin qualitativ und quantitativ zu messen. Dies ist besonders wichtig bei der Diagnose von Diabetes und Nierenkrankheiten. Das vorherrschende Protein bei Diabetes ist Albumin; daher stellt Albumin das Modellsystem fur einen Protein-Test in Urin dar.
  • Verfahren zur Bestimmung von in Urin vorliegendem Albumin sind gut bekannt. Das am meisten preiswerte und einfache Verfahren zur Albumin- Bestimmung beinhaltet, daß man einen Papier-Teststreifen mit einer kleinen Menge Urin benetzt. Der Teststreifen wird mit einem Protein-Fehlerindikator imprägniert. Bei Vorliegen von Albumin in der Probe zeigt der Teststreifen dies durch eine einfache Farbänderung an. Die beobachtete Farbe kann in Abhängigkeit von der in der Probe vorliegenden Albumin-Konzentration schwanken. Diese variable Farbänderung wird dazu herangezogen, das Albumin der Probe quantitativ zu ermitteln. Testpapiere des obigen Typs erfordern ein Minimum an Geübtheit, um diese korrekt zu benutzen. Diese Teststreifen stellen ein genaues, einfaches und rasches Mittel zur punktuellen Bestimmung von Protein dar. Testpapiere wie diese werden in großem Umfang von Technikern in klinischen Laboratorien sowie von Ärzten in ihren Praxisräumen verwendet.
  • Genauer gesagt, umfassen diese Teststreifen einen absorbierenden Trägerstreifen, d.h. Papier, das mit einem Puffer, einem Polymer/oberflächenaktiven Mittel (erforderlich für Stabilität, Benetzbarkeit oder zur Verhinderung der Auslaugung des Puffers) sowie mit einem Protein-Fehlerindikator imprägniert ist. Im Grunde genommen, sind alle Protein-Fehlerindikatoren, die in handelsüblichen Trockenphasen-Tests verwendet werden, Phenolsulfonphthalein-Derivate, denen die folgenden Grundstrukturen gemeinsam sind:
  • Struktur A stellt die allgemeine Struktur von Phenolsulfonphthalein- Derivaten in protischen Lösungsmitteln (Wasser, Alkoholen usw.) dar, wogegen Struktur B die Form darstellt, die im trockenen Zustand oder in aprotischen Lösungsmitteln (Ethern, Acetonitril usw.) hauptsächlich vorliegt. Im allgemeinen sind aus Phenolsulfonphthalein abgeleitete Protein- Fehlerindikatoren als Struktur B dargestellt. Aus Gründen der Übereinstimmung bzw. Einheitlichkeit sind die Protein-Fehlerindikatoren der vorliegenden Erfindung, die Phenolsulfonphthalein-Derivate sind, als Struktur B dargestellt. Es sollte allerdings klar sein, daß die Protein- Fehlerindikatoren der vorliegenden Erfindung, die Phenolsulfonphthalein- Derivate sind, auch als Struktur A vorliegen können.
  • Protein-Fehlerindikatoren sind pH-Indikatoren mit einer ionisierbaren Gruppe, die einen pKa-Wert aufweist, der durch das Vorhandensein von Protein verschoben wird. Im Falle von Phenolsulfonphthaleinen ist die ionisierbare Gruppe die phenolische Hydroxyl-Gruppe am Ring C. Der pKA-Wert eines Phenolsulfonphthalein-Indikators ist derjenige pH-Wert, bei dem die Hälfte der Anzahl an Indikator-Molekülen entprotonierte phenolische Hydroxyl-Gruppen am Ring C aufweist.
  • Bezüglich der oben dargestellten Phenolsulfonphthalein-Protein Fehlerindikatoren laufen zwei Entprotonierungsvorgange ab, um eine erkennbare Farbänderung hervorzurufen. Durch die erste Entprotonierung wird das Proton aus der Arylsulfonsäure entfernt, um die folgende Verbindung zu ergeben:
  • Der pKa-Wert dieses Protons beträgt weniger als 1. Somit liegt dieser Rest bei allen gebräuchlichen pH-Werten ionisiert vor. Diese ionisierte Gruppe ist auch für die Wasserlöslichkeit dieser Verbindungen verantwortlich.
  • Die zweite Entprotonierung beruht darauf, daß ein Proton von der phenolischen Hydroxyl-Gruppe des Rings C abgespalten wird, um das folgende Dianion zu ergeben:
  • In Protein-Fehlerindikatoren ruft diese zweite Entprotonierung die erkennbare Farbänderung hervor, die das Vorliegen von Protein in der getesteten Probe anzeigt.
  • Der mitverwendete Puffer ergibt für den Indikator zu dessen besserer Funktionsweise eine Umgebung mit konstantem pH-Wert. Somit wird, bei Eintauchen des Teststreifens in eine biologische Flüssigkeit, die häufig einen deutlich anderen pH-Wert als die gepufferte Umgebung aufweist, der Indikator nicht durch den pH-Wert der biologischen Flüssigkeit beeinflußt. Dies gewährleistet, daß jegliche anschließende Farbänderung im Indikator das Ergebnis einer Verschiebung beim pKa-Wert des Indikators und nicht das Ergebnis einer pH-Verschiebung der getesteten Probe sind.
  • Teststreifen, die ganz allgemein als geeignet für die analytische Bestimmung von Protein in einer biologischen Probe angesehen werden, sind in US 4 013 416 beschrieben. Die dort beschriebenen Teststreifen umfassen einen absorbierenden Träger, der mit einem mit Wasser unmischbaren Polypropylenglykol, einem Puffer und einem Protein-Fehlerindikator der Octahalosulfophthalein-Gruppe imprägniert ist. Die Octahalosulfophthalein- Indikatoren sind Phenolsulfonphthalein-Derivate, die an den Positionen 3', 3", 5', 5", 3, 4, 5 und 6 halogeniert sind. Gemäß dem Patent werden Teststreifen, die Octahalosulfophthalein und mit Wasser unmischbare Polypropylenglykole enthalten, durch Interferenz mit in der Testprobe vorhandenen Stickstoff-haltigen Verbindungen weniger gestört, als dies bei Teststreifen der Fall ist, die andere Phenolsulfonphthalein-Indikatoren und Netzmittel enthalten.
  • Obwohl die oben beschriebenen Teststreifen durch in der Probe vorliegende Stickstoff-haltige Verbindungen weniger gestört werden, beinhalten diese und weitere derzeit im Handel erhältliche Teststreifen verschiedene allgemeine ernstere Nachteile. Gegenwärtig erhältliche Teststreifen ergeben Hintergrund-Negativfärbung, die zu Fehldiagnosen fuhren können. Beispielsweise sind die Indikatoren der Gruppe der Octahalosulfophthalein-Verbindungen bei Abwesenheit von Albumin gelb gefärbt. Bei Zugabe von Albumin zur Probe verändert sich die Farbe sodann von gelb nach gelbgrün bis grün, und zwar in Abhängigkeit von der Konzentration von Albumin in der Probe. Diese Hintergrundfärbung ist besonders problematisch, wenn man bedenkt, daß eine sehr häufig getestete biologische Flüssigkeit Urin ist, der normalerweise gelb bis gelbgrün gefärbt ist. Somit kann eine kleine Anderung bei der Farbe des Teststreifens, die durch Spurenmengen von Albumin, d.h. von ca. 10 bis 30 mgldl (Milligramrn/Deziliter), in Urin hervorgerufen wird, leicht durch die Farbe der Probe selbst maskiert werden und unnachgewiesen bleiben. Dieses Problem wird noch dadurch weiter verstärkt, daß diese Teststreifen von wenig geübten Technikern angewandt werden, die größere Schwierigkeiten bei der Interpretation der beobachteten Ergebnisse haben dürften. Da eine medizinische Behandlung häufig auf der Grundlage der Ergebnisse dieser Testverfahren erfolgt, ist die genaue Interpretation der Ergebnisse unbedingt erforderlich. Außerdem sind derzeit erhältliche Teststreifen nicht empfindlich genug, um sehr niedrige Gehaltsmengen von Protein nachzuweisen. Urinäre Albumin-Gehaltsmengen von ca. 3 bis ca. 10 mg/dl sind signifikant, um verschiedene lebensbedrohende Krankheitszustände, wie Diabetes und Nierenkrankheiten, zu diagnostizieren. Gleichwohl ist es mit gegenwärtig erhältlichen Teststreifen nicht möglich, Albumin in Mengen von weniger als ca. 10 bis 15 mg/dl genau nachzuweisen.
  • Demnach wäre es zur Überwindung der oben diskutierten Mängel äußerst vorteilhaft, einen Protein-Fehlerindikator bereitzustellen, der eine Farbe aufweist, die sich bei Abwesenheit von Protein von gelb unterscheidet. Es wäre des weiteren von Vorteil, wenn ein Protein-Fehlerindikator bereitgestellt würde, der 1 Farbe, die sich von gelb bei Abwesenheit von Protein unterscheidet, sowie eine 2. Farbe ergibt, die sich von der ersten Farbe bei Anwesenheit von Protein klar unterscheidet. Noch vorteilhafter wäre es, wenn der Protein-Fehlerindikator genau und klar anzeigen würde, ob Albumin bei Konzentrationen von weniger als den gegenwärtig nachweisbaren vorhanden ist oder nicht. Schließlich wäre es ein weiterer Vorteil, wenn ein Teststreifen bereitgestellt werden könnte, der einen derartigen Protein- Fehler indikator enthält.
  • Durch die vorliegende Erfindung wird ein analytischer Teststreifen zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe bereitgestellt, welcher einen absorbierenden Träger umfaßt, der mit der folgenden Phenolsul fonphthalein-Protein-Fehlerindikator-Verbindung:
  • worin gilt:
  • X sind -Cl, -Br oder -J,
  • Y -NO&sub2; oder -NO und
  • Z -Cl, -Hr oder -J,
  • sowie mit der folgenden Merocyanin-Protein-Fehlerindikator-Verbindung imprägniert ist:
  • worin gilt:
  • Q sind -Cl, -Br oder -J,
  • m eine ganze Zahl von 1 bis 6,
  • R S, Se, O oder C(CnH2n+1)&sub2;, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, und T -SO&sub3;&supmin; oder -H. Gemäß 1 Ausgestaltung der Erfindung sind X -J oder -Br, Y -NO&sub2;, Z -Hr oder -Cl, m 3 oder 4, R c(cH&sub3;)&sub2; und T -SO&sub3;-.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein analytischer Teststreifen zum Nachweis von in einer biologischen Probe vorliegendem Protein bereitgestellt, welcher einen absorbierenden Träger umfaßt, der mit der Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator Verbindung:
  • worin gilt:
  • X sind -Cl, -Br oder -J,
  • Y' -NO&sub2; oder -NO,
  • Y" -Cl, -Br, -J und
  • Z -Cl, -Br oder -J, sowie mit der Merocyanin-Proteinindikator-Verbindung imprägniert ist:
  • worin gilt:
  • Q sind Cl, Br oder J,
  • m eine ganze Zahl von 1 bis 6,
  • R S, Se, O oder C(CnH&sub2;n+1)&sub2;, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, und T -SO&sub3; oder -H. Gemäß 1 Ausgestaltung der Erfindung sind X -J oder -Br, Y -NO&sub2;, Z -Br oder -Cl, Q -Br oder -J, m 3 oder 4, R C(CH&sub3;)&sub2; und T -SO&sub3;&supmin;.
  • Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe. Bei dem Verfahren wird ein analytischer Teststreifen mit der biologischen Probe benetzt. Der Teststreifen umfaßt einen absorbierenden Träger, der mit den oben beschriebenen Protein-Fehlerindikator-Verbindungen imprägniert ist. Der Teststreifen wird dann in Augenschein genommen, um eine Farbänderung festzustellen bzw. nachzuweisen. Eine Farbänderung zeigt Protein in der biologischen Probe an.
  • Gemäß 1 Ausgestaltung der Erfindung wird der Teststreifen gegen Hitzebelastung stabilisiert. Das Protein-Assayverfahren (die Teststreifen) enthalten, Z.B., Glycerin oder Sorbit zusätzlich zum farbverstärkenden Polymer, wie einem Polypropylenglykol, um die erforderliche Hitzestabilität zu ergeben. Ebenfalls ist herausgefunden worden, daß bei Ersatz der bei Protein-Assayverfahren verwendeten Standard-Zitratpuffer durch Glycin die thermische Beständigkeit verbessert wird.
  • Figur 1 ist eine schematische Darstellung von Verfahren zur Synthese von Nitroso-substituierten Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikatoren;
  • Figur 2 ist eine schematische Darstellung von Verfahren zur Synthese von Nitro-substituierten Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikatoren;
  • Figur 3 ist eine schematische Darstellung von Verfahren zur Synthese von Nerocyanin-Protein-Fehlerindikatoren;
  • Figur 4 stellt Dosis-Reaktion-Kurven analytischer Streifen dar, die mit 5,5"-Dinitro-3',3"-dijod-3,4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein (DIDNTB), mit 1-(ω-Sulfopropyl)-2-(4'-hydroxy-3',5'dijodstyryl)-3,3- dimethylindoleninium-Betain (SPDIB) und einem Polypropylenglykol eines Molekulargewichts von 2000 (-Δ-) und mit Albustix (- -) imprägniert sind;
  • Figur 5 ist ein Balken-Diagramm, das die Dosis-Reaktion analytischer Teststreifen darstellt, die mit DIDNTB und SPDIB allein (- -), mit DIDNTB, SPDIB und Fenoil D4030 (- -), mit DIDNTB, SPDIB und P-2000 (- -), mit DIDNTB, SPDIB und KOK 10 071 (- -) sowie mit DIDNTB, SPDIB und Lutanol I-30 (- -) imprägniert sind.
  • Erfindungsgemäß ist herausgefunden worden, daß Teststreifen zur Bestimmung von in biologischen Flüssigkeiten vorhandenem Protein, welche eine deutlich erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Protein aufweisen, erhalten werden können, indem man einen analytischen Teststreifen herstellt, der die obigen Protein-Fehlerindikatoren enthält.
  • Teststreifen mit der oben beschriebenen Kombination von Protein- Fehlerindikatoren sind hellpfirsichfarben, und bei Eintauchen in eine biologische Probe, die Protein enthält, werden sie stark grün, blau oder purpurfarben gefärbt, wobei die Farbe die Konzentration von Protein in der Probe reflektiert. Die erzeugte grüne Farbe unterscheidet sich ganz klar von dem hellen Pfirsich-Farbton eines Netagiv-Tests.
  • Im Hinblick auf die erkennbare Farbänderung von hellpfirsichfarben zu grün, blau oder purpurfarben, stellen die Teststreifen gemäß der vorliegenden Erfindung ein diagnostisches Hilfsmittel zum Nachweis von Protein in biologischen Flüssigkeiten dar, indem eine unterschiedene und eindeutige Farbe in der Gegenwart von Protein erzeugt wird, welche von dem hellen Pfirsich-Farbton eines Negativ-Tests klar unterscheidbar ist. Dies stellt einen Unterschied zu anderen Teststreifen dar, welche sich nur schwach von dem einen Ton einer Farbe zu einem anderen in der Gegenwart von Albumin, z.B. von gelb nach gelbgrün, verändern. Das charakteristische Merkmal des hellen Pfirsich-Farbtons für einen Negativ-Test und die grüne, blaue oder purpurne Farbe bei einem Positiv-Test werden als signifikante Abweichung von früheren Verfahren und Indikatoren betrachtet, welche dazu verwendet wurden, Protein in biologischen Proben nachzuweisen. Insbesondere werden durch die vorliegende Erfindung Kliniker mit einem zuverlässigen, einfachen und genauen Verfahren zum Nachweis von Protein in biologischen Proben ausgestattet. Durch die Änderung von hellpfirsichfarben nach grün, blau oder purpurfarben sind die Testergebnisse einfach zu interpretieren. Dies führt zu weniger Fehldiagnosen und demzufolge zu geringeren Kosten für den Patient und Gesundheitsversorger.
  • Ferner weisen Teststreifen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, einen Bereich von ca. 2 bis ca. 500 mg/dl Protein in einer Probe positiv nach. Vor dem erfolgreichen Abschluß der vorliegenden Erfindung konnten Albumin-Konzentrationen von weniger als ca. 10 mg/dl nicht genau nachgewiesen werden. Der Nachweis von Protein bei diesen sehr geringen Konzentrationen unter Anwendung der vorliegenden Erfindung ermöglicht die rechtzeitige Diagnose verschiedener lebensbedrohender Pathobgien, einschließlich Diabetes und Nierenkrankheiten. Beispielsweise hilft der Nachweis von Albuminune bei Gehaltsmengen von 3 mg/dl und mehr Klinikern, Diabetes in ihren frühen Krankheitszuständen besser zu diagnostizieren. Im Lichte dieses signifikanten Fortschritts bei der Krankheitsdiagnose, welcher mit den absorbierenden Streifen der vorliegenden Erfindung erreicht wird, stellt die Kombination von Protein-Fehlerindikatoren in den Teststreifen der vorliegenden Erfindung einen beachtlichen technischen Fortschritt dar.
  • Durch die vorliegende Erfindung werden die oben beschriebenen beachtlichen Vorteile erreicht, indem eine neue Kombination von Protein- Fehlerindikatoren in einem analytischen Teststreifen zum Nachweis von in einer biologischen Probe vorhandenem Protein bereitgestellt wird. Die Erfindung ist auf einen analytischen Teststreifen gerichtet, der eine teilhalogenierte Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator-Verbindung mit Nitro- oder Nitroso-Substituenten-Gruppen in deren B- und/oder C-Ringen sowie einen Merocyanin-Prtein-Fehlerindikator enthält. Bis zum Zeitpunkt der Vollendung der vorliegenden Erfindung waren Merocyanin-Farbstoffe als Protein-Fehlerindikatoren unbekannt. Es wird angenommen, daß die Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikatoren der Erfindung empfindlicher gegenüber niedrigeren Konzentrationen von Albumin sind, wogegen die Merocyanin-Protein-Fehlerindikatoren empfindlicher gegenüber höheren Konzentrationen von Albumin sind. Somit ist die Reaktion dieser Verbindungen mit Protein nicht kompetitiv, und demnach ist der Effekt der neuen Kombination eher synergistisch als additiv.
  • Detaillierter gesagt, ist, gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung, der Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator der vorliegenden Erfindung durch die Verbindung dargestellt: worin gilt:
  • X sind -Cl, -Br oder -J, Y -NO&sub2; oder -NO und Z -Cl, -Br oder -J. Vorzugsweise sind X -J oder -Br, Y -NO&sub2; und Z -Br oder -Cl. Noch bevorzugter sind X -J, Y -NO&sub2; und Z -Br.
  • Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung wird eine Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator-Verbindung bereitgestellt, die die folgende Formel aufweist: worin gilt:
  • X sind -Cl, -Br oder -j, Y' -NO&sub2; oder -NO, Y" -Cl, -Br oder -J und Z -Cl, -Br oder -J. Noch bevorzugter sind X -J, Y' -NO&sub2;, Y" -Br und Z -Br. Der Merocyanin-Protein-Fehlerindikator der vorliegenden Erfindung ist durch die Verbindung dargestellt: worin gilt:
  • Q sind -Cl, -Br oder -J, m eine ganze Zahl von 1 bis 6, R S, Se, oder C(CnH2n+1)&sub2;, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, und T -SO&sub3;&supmin; oder -H. Bevorzugter sind Q -Br oder -J, m eine ganze Zahl von 2 bis 4, R C(CH&sub3;)&sub2; und T -SO&sub3;&supmin;. Am meisten bevorzugt sind Q -J und m 3.
  • Beispielhafte Merocyanin-Protein-Fehlerindikatoren sind:
  • 1-(ω-Sulfopropyl)-2-(4'-hydroxy-3',5'-dibromstyryl)-3,3-dimethylindoleninium-Betain; 1-(ω-Sulfobutyl)-2-(4'-hydroxy-3',5'-dijodstyryl)benzthiazolium-Betain; 1-(ω-Sulfoethyl)-2-(4'-hydroxy-3',5'-dijodstyryl)3,3-dimethylindoleninium-Betain; 1-(ω-Sulfopropyl)-2-(4'-hydroxy-3',5'- dijodstyryl)-3,3-dimethylindoleninium-Betain; 1-(ω-Sulfobutyl)-2-(4'- hydroxy-3',5'-dijodstyryl)-3,3-dimethylindoleninium-Betain und 1-(n-Butyl)2-(4'-hydroxy-3',5'-dijodstyryl)-3,3-dimethylindoleninium-Jodid. Detaillierte Protokolle zur Herstellung der oben genannten Merocyanin- Protein-Fehlerindikatoren sind in den Beispielen angegeben.
  • Was die Figuren betrifft, sind in Figur 1 ganz allgemein die Synthesen von zwei in der vorliegenden Erfindung verwendeten Dinitrososubstituierten Indikatoren dargestellt. Insbesondere zeigt Figur 1 mögliche Synthese-Protokolle für 3',3"-Dinitroso-5',5",3,5,6-hexabromphenolsulfonphthalein (Verbindung C von Figur 1) sowie für 3',3"-Dinitroso-5',5"- dijod-3,4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein (Verbindung E von Figur 1) aus dem im Handel erhältlichen 3,4,5,6-Tetrabromphenolsulfonphthalein (Verbindung A von Figur 1). Die Dibrom-Zwischenprodukt-Verbindung (Verbindung B von Figur 1) läßt sich leicht herstellen, indem man eine Lösung von Tetrabromphenolsulfonphthalein in Essigsäure (HOAc) mit 2 Äquivalenten von molekularem Brom bei Umgebungstemperatur behandelt. Diese Verbindung wird dann in Acetonitril (CH&sub3;CN) durch eine Säure-katalysierte Reaktion mit Isoamylnitrit nitrosyliert, um 3'3"-Dinitroso-5',5",3,4,5,6-hexabromphenolsulfonphthalein zu ergeben.
  • Die Dijod-Analoga werden auf ähnliche Weise hergestellt. 3,4,5,6- Tetrabromphenolsulfonphthalein wird durch Reaktion mit 3,0 Äquivalenten Jodmonochlorid (JCl) in HOAc bei Umgebungstemperatur jodiert, um die in Figur 1 als Verbindung D bezeichnete Verbindung zu ergeben. Diese Verbindung wird dann wie oben nitrosyliert, um 3',3"-Dinitroso-5',5'-dijod- 3,4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein zu ergeben. Gemäß dem oben beschriebenen Protokoll erfolgt die Synthese von analogen Verbindungen, welche weitere Halogene, Alkylgruppen oder Protonen (H) in den Positionen 3', 3", 3, 4, 5, 5', 5" oder 6 enthalten, in gleicher Weise und ergibt die entsprechenden Verbindungen.
  • In Figur 2 ist ganz allgemein die Synthese der Nitro-substituierten Protein-Fehlerindikatoren der vorliegenden Erfindung dargestellt. Die Behandlung einer Lösung von Verbindung A von Figur 2 in HOAc mit nicht mehr als 2 Äquivalenten Salpetersäure (HNO&sub3;) bei Umgebungstemperatur ergibt 3',3"-Dinitro-5',5"-dijod-3,4, 5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein (Verbindung B von Fig. 2). Die langsame Behandlung von Verbindung A von Figur 2 mit 1 Äquivalent HNO&sub3; in HOAc bei Umgebungstemperatur unter anschließender Behandlung mit überschüssigem Br&sub2; am Rückfluß ergibt das Mononitro-Analoge 3"-Nitro-5',5"-dijod-3,3',4,5,6-pentabromphenolsulfonphthalein (Verbindung C von Figur 2). Gemäß dem oben beschriebenen Protokoll erfolgt die Synthese analoger Verbindungen, die weitere Halogene, Alkylgruppen oder Protonen (H) in den Positionen 3', 3", 3, 4, 5, 5', 5" oder 6 enthalten, in gleicher Weise und ergibt die entsprechenden Verbindungen. Gemäß der unten beschriebenen Beispiele werden detaillierte Synthese-Protokolle zur Herstellung einer jeden der in Figuren 1 und 2 dargestellten Verbindungen angegeben.
  • Ohne die Erfindung einzuschränken, wird angenommen, daß die Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikatoren, die in den Teststreifen der vorliegenden Erfindung enthalten sind, die überraschende Protein- Empfindlichkeit der Kombination bedingen, insbesondere wird angenommen, daß die Substitution mit Nitro- oder Nitrose-Gruppe(n) in den Ringen B und C für die erhöhte Empfindlichkeit dieser Verbindungen gegenüber urinärem Albumin verantwortlich ist. Ferner wird angenommen, daß die pHänomene eines Elektronenabzugs und einer Ladungsverteilung sich verbinden bzw. ergänzen, um Indikatoren erhöhter Empfindlichkeit zu ergeben. Ebenfalls wird angenommen, daß das überraschende charakteristische Merkmal der Farbänderung von hellpfirsichfarben nach grün in der Gegenwart sehr geringer Konzentrationen von Protein der Wechselwirkung der beiden Protein-Fehlerindikatoren der vorliegenden Erfindung zuzuschreiben ist.
  • Detaillierter gesagt, wird bezüglich der Phenolsulfonphthalein Protein-Fehlerindikatoren der vorliegenden Erfindung angenommen, daß die hochelektronegativen Nitro- und Nitroso-Gruppen, die benachbart zu den Hydroxyl-Gruppen in den Positionen 4' und 4" angeordnet sind, die Reaktivität dieser Hydroxy-Gruppen erhöhen. Außerdem wird ebenfalls angenommen, daß die Reaktivität der Hydroxyl-Gruppen durch Resonanzstabilität weiter gesteigert wird. Schließlich wird angenommen, daß ionische Formen des Moleküls durch Ladungsverteilung stabilisiert werden. Die durch die als Substituenten vorliegenden Nitro- und Nitroso-Gruppen übertragene Resonanzstabilität erhöht die Azidität der benachbarten Hydroxyl-Wasserstoffatome an den Positionen 4' und 4". Diese pHänomene vereinigen bzw. ergänzen sich, und es wird von einer synergistischen Wirkung ausgegangen, welche dazu beiträgt, daß der pKa-Wert der Phenolsulfonphthalein- Indikatoren der vorliegenden Erfindung erniedrigt wird, wodurch sich die Empfindlichkeit des Erfindungskombinationsindikators gegenüber Albumin erhöht.
  • In Figur 3 ist ganz allgemein die Synthese verschiedener Merocyanin- Proteinindikator-Verbindungen der vorliegenden Erfindung dargestellt. Die damit zusammenhängende Chemie ist ziemlich einfach und geradlinig, wobei ganz allgemein die Kupplung eines aromatischen Hydroxyaldehyds mit einem heterocyclischen quarternären Salz unter basischen Reaktionsbedingungen eingeschlossen ist. Die bei der Herstellung der Merocyanin-Protein- Fehlerindikatoren angewandten allgemeinen Verfahrensmaßnahmen sind in Figur 3 dargestellt und im Detail in den unten folgenden Beispielen angegeben.
  • Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf einen analytischen Teststreifen zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe gerichtet, wobei der Teststreifen einen absorbierenden Träger umfaßt, der mit einer der oben beschriebenen Phenolsulfonphthalein-Protein- Fehlerindikator-Verbindungen sowie mit einer der ebenfalls oben beschriebenen Merocyanin-Protein-Fehlerindikator-Verbindungen imprägniert ist. Der absorbierende Träger des Teststreifens ist vorzugsweise Filterpapier. Weitere als absorbierende Träger einsetzbare Materialien schließen Filz, poröse Keramikstreifen und gewebte oder als Matte ausgestaltete Glasfasern ein, beschrieben in US 3 846 247. Ebenfalls vorgeschlagen sei die Verwendung von Holz-, Tuch- oder Schwamm-Material und tonartiger Substanzen, beschrieben in US 3 552 928. Alternativ dazu, kann der absorbierende Träger nicht-porös sein, wie verschiedene polymere Filme, Glas und dgl. Alle derartigen absorbierenden Trägermaterialien eignen sich zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung, was im übrigen auch für weitere Materialien gilt. Es ist allerdings herausgefunden worden, daß sich Filterpapier ganz besonders eignet.
  • Der absorbierende Streifen wird vorzugsweise mit einem Puffer imprägniert. Jedes Puffer-System, das sich auf einen pH-Wert von ca. 1,5 bis ca. 4,5 einstellen läßt, eignet sich zur Durchführung der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt wird das Puffer-System auf einen pH-Wert von ca. 2, bis ca. 3,0 und ganz besonders bevorzugt auf ca. 2,5 eingestellt.
  • Der Teststreifen kann auch mit einem Farbverstärkungspolymer imprägniert sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "Farbverstärkungspolymer" ein Polymer mit einem Molekulargewicht von ca. 400 bis ca. 25 000 bedeuten, wobei das Polymer sowohl die kinetischen Daten der Farbbildung als auch die Dosis-Reaktion der Protein- Fehlerindikatoren und/oder eine herabgesetzte Hintergrundfarbe für einen Negativ-Test erhöht. Bevorzugte Farbverstärkungspolymere schließen Polypropylenglykole, Polycarbonate, Polyvinylether und Polyethylenoxide ein. Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung ist das Farbverstärkungspolymer ein Polypropylenglykol. Sowohl mit Wasser mischbare als auch unmischbare Polypropylenglykole eignen sich bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung. Es ist bevorzugt, daß das Polypropylenglykol ein Molekulargewicht von ca. 100 bis ca. 10 000 aufweist. Bevorzugter weist das Polypropylenglykol ein Molekulargewicht von ca. 1 000 bis ca. 4 000 auf. Am meisten bevorzugt hat das Polypropylenglykol jedoch ein Molekulargewicht von ca. 2 000. Mit Wasser unmischbare Polypropylenglykole, die sich bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung ebenfalls eignen, sind im Detail in US 4 013 416 diskutiert. Nichtsdestoweniger ist ermittelt und festgestellt worden, daß sich mit Wasser mischbare Polypropylenglykole, die ein Molekulargewicht von ca. 400 aufweisen, zur Durchführung der vorliegenden Erfindung eignen. Weitere bevorzugte Farbverstärkungspolymere schließen ein: ein Polycarbonat, erhältlich unter der Bezeichhung KOK 10 071 von Bayer AG, Deutschland (ein Polyethercarbonat, erhältlich durch Reaktion kurzkettiger Polypropylenglykole (MW: 200 bis 800) mit Diphenylcarbonat unter Eliminierung von Phenol, gegebenenfalls unter Addition von Diolen und/oder Triolen, wobei die Polyethercarbonate Molekulargewichte von 1 000 bis 30 000, vorzugsweise von 1 500 bis 5 000, aufweisen sollten); ein Polypropylenoxid- und -ethylenoxid-Addukt von 2, 6-Dimethyl-4-nonylphenol, erhältlich unter der Handelsbezeichnung Fenoil D4030 von Bayer AG, Deutschland; sowie einen Polyvinylether, erhältlich unter der Handelsbezeichnung Lutonal 1-30 von BASF, US. Es ist ermittelt und festgestellt worden, daß Teststreifen der vorliegenden Erfindung, die bestimmte Farbverstärkungspolymere enthalten, d.h. Polypropylenglykole, KOK 10.071, Fenoil 04030 und Lutonal 1-30, einen vergrößerten Dosis-Reaktion-Bereich, eine erhöhte Auflösung zwischen Albumin-Gehaltsmengen sowie eine herabgesetzte Negativ-Färbung aufweisen bzw. hervorrufen.
    • Beispiele Beispiel 1 3',3",3,4,5,6-Hexabromphenolsulfonphthalein
  • Eine Lösung von 3'4,5,6-Tetrabromphenolsulfonphthalein, erhalten von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USA, (5,03 g, 7,5 mmol) in Essigsäure [(HOAc), 50 ml)] wurde bei Umgebungstemperatur unter einer Inertgas-Atmosphäre gehalten. Die Lösung wurde 10 min lang unter Zutropfen einer Brom-Lösung, erhalten von Aldrich Chemical Company (2,4 g, 15 mmol in HOAc, 10 ml), behandelt und danach über Nacht gerührt. Die aus der Reaktionsmischung abgeschiedenen Feststoffe wurde abfiltriert, mit HOAc gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 3',3",3,4,5,6-Hexabromphenolsulfonphthalein zu ergeben. Umkristallisation aus siedender HOAc ergab die analytisch reine Verbindung (1,93 g, 29,3%) als blaßrosafarbenes Pulver, das bei 159 bis 160ºC weich wurde, unter Gasentwicklung bei 162 bis 164ºC schmolz und sich dann mit keinem Schmelzpunkt unterhalb 270ºC wieder verfestigte. Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1
    • Beispiel 2
  • 5',5"-Dinitroso-3', 3", 3, 4, 5,6-hexabromphenolsulfonphthalein Eine gerührte Lösung von 3',3",3,4,5,6-Hexabromphenolsulfonphthalein (0,67 g, 0,8 mmol) in wasserfreiem Acetonitril (CH&sub3;CN, 50 ml) wurde hei Umgebungstemperatur unter einer Inertgas-Atmosphäre gehalten. Die Lösung wurde mit einer katalytischen Menge von HOAc (1 Tropfen) und mit Isoamylnitrit (0,56 g, 4,8 mmol) behandelt und danach 4 Tage lange gerührt. Die aus der Reaktionsmischung abgeschiedenen Feststoffe wurden abfiltriert und mit CH&sub3;CN (10 ml) gewaschen. Die Feststoffe wurden im Vakuum getrocknet, um 5',5"-Dinitroso-3',3",3,4,5,6-hexabromphenolsulfonphthalein (0,45 g, 64 %) als ein analytisch reines gelhes Pulver mit einem Schmelzpunkt von 267 - 269ºC zu ergeben. Eine zweite Ausbeute wurde anschließend aus den eingeengten Mutter-Flüssigkeiten erhalten (0,03 g; 4 %). Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben. Tabelle 2
    • Beispiel 3 3',3"-Dijod-3'4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein
  • 3,4,5,6-Tetrabromphenolsulfonphthalein (20,1 g, 30 mmol) wurde in HOAc (550 ml) von 70ºC aufgelöst und dann auf Umgebungstemperatur in einem Wasserbad abgekühlt. Die gerührte Lösung wurden unter einer Inertgas- Atmosphäre gehalten. Die Lösung wurde mit einer Lösung von Jodmonochlorid (JCl) (14,61 g, 90 mmol) in HOAc (50 ml) behandelt und bei Umgebungstemperatur 22,3 h lang stehen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde durch eine Schicht aus Celite 521 (Johns-Manville Corp., Denver, CO, USA) filtriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Das sich ergebende rote teerartige Produkt wurde in HOAc (150 ml) aufgenommen. Die aus dieser Lösung beim Stehenlassen abgeschiedenen Feststoffe wurden filtriert, mit HOAc gewaschen und im Vakuum getrocknet, um 3',3'-Dijod-3,4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein (9,66 g, 34,9 %) als rosafarbenes Pulver zu ergeben. Eine zweite Ausbeute wurde anschließend aus den eingeengten Mutter-Flüssigkeiten erhalten (4,03 g, 14,6 %). Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben. Tabelle 3
    • Beispiel 4 5',5"-Dinitroso-3',3"-dijod-3,4'5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein
  • Eine Lösung von 3',3"-Dijod-3,4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein (1,47 g, 1,6 mmol) in wasserfreiem CH&sub3;CN (50 ml) wurde bei Umgebungstemperatur unter einer Inertgas-Atmosphäre gehalten. Die Mischung wurde danach mit einer katalytischen Menge von HOAc (2 Tropfen) und mit Isoamylnitrit (2,3 g, 20 mmol) behandelt. Die sich ergebende Mischung wurde zwei Tage lang gerührt. Die aus der Reaktionsmischung abgeschiedenen Feststoffe wurden abfiltriert, mit kaltem CH&sub3;CN gewaschen und im Vakuum getrocknet, um die Verbindung 5',5"-Dinitroso-3',3"-dijod-3,4,5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein (0,41 g, 26 %) zu ergeben. Umkristallisation aus CH&sub3;CN (150 ml) ergab die analytische Probe als eine blaßgelbe Wolle, die keinen Schmelzpunkt unterhalb 270ºC aufwies. Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4
    • Beispiel 5 5',5"-Dinitro-3',3"-dijod-3'4'5,6-tetrabromphenolsulfonphthalein (DIDNTB)
  • Eine gerührte Lösung von 3',3"-Dijod-3,4,5,6tetrabromphenolsulfonphthalein (1,85 g, 2,0 mmol) in siedender HOAc (90 ml) wurde auf ca, 16 bis 20ºC abgekühlt. Die Lösung wurde tropfenweise, 4 min lang, mit einer Lösung 90%iger Salpetersäure (0,28 g, 4,0 mmol) in HOAc (10 ml) behandelt und über Nacht bei Umgebungstemperatur in einer Inertgas- Atmosphäre gerührt. Die aus der Reaktionsmischung abgeschiedenen Feststoffe wurden abfutriert, mit HOAc (5 ml) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um eine rohe Zubereitung von 5',5"-Dinitro-3',3"-dijod-3,4'5'6-tetrabromphenolsulfonphthalein zu ergeben. 1 Umkristallisation aus HOAc (110 ml) ergab die analytisch reine Verbindung 5',5"-Dinitro-3',3"-dijod-3'4,5,6- tetrabromphenolsulfonphthalein (0,90 g, 38 %) als gelbes Pulver. Dieses Material wies keinen genauen Schmelzpunkt auf. Allerdings schrumpfte das Material bei ca. 189 bis 190ºC, entwickelte Gas bei ca. 210 bis 220ºC und schmolz bei ca. 225'C. Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5
    • Beispiel 6
  • 5'-Nitro-3',3"-dijod-5",3,4,5,6-pentabromphenolsulfonphthalein Eine gerührte Lösung von 3',3"-Dijod-3,4,5'6-tetrabromphenolsulfonphthalein (0,92 g, 1,0 mmol) in siedender HOAc wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und unter einer Inertgas-Atmosphäre gehalten. Die Lösung wurde langsam tropfenweise, 1,5 h lang, mit 1 M HNO&sub3; in HOAc (1,05 ml; 1,05 mmol) behandelt. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung 5 min lang gerührt. Danach wurde die Reaktionsmischung mit einer Lösung von Br&sub2; in HOAc (1,5 ml; 1,5 mmol) behandelt und 5,5 h lang am Rückfluß gehalten. Die Mischung wurde dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt und im Vakuum zur Trockene eingedampft, um ein golden-braunes Glas (1,10 g) zu ergeben. Das Rohprodukt wurde in einem Minimalvolumen von Ethylacetat (EtOAc) aufgenommen und mit HOAc verdünnt, um einen kristallinen Feststoff zu ergeben. Nach 2 Umkristallisationen wurde analytisch reines 5'-Nitro-3',3"-dijod-5",3,4,5,6-pentabromphenolsulfonphthalein (0,57 g, 54,5 %) als hellgelbes Pulver erhalten. Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6
    • Beispiel 7 1-(ω-Sulfopropyl)-2-(4'-hydroxy-3,5'-dibromstyryl)-3'3- dimethyl indoleninium-Betain
  • Eine Lösung von 3,5-Dibrom-4-hydroxybenzaldehyd (Lancaster Syntheses, Ltd., Windham, NH, USA) (2,0 g, 7,14 mmol), von 1-(ω-Sulfopropyl)-2,3,3- trimethylindoleninium-Betain (BE 726 639; CA 73: P82538a) (2,0 g, 7,11 mmol) und von Piperidin (0,4 ml) in EtOH (30 ml) wurde unter einer Inertgas-Atmosphäre gehalten. Die Lösung wurde 50 min lang am Rückfluß gehalten und dann in einem Eisbad abgekühlt. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft und in einem Minimum an Methanol (MeOH) aufgenommen. Die Lösung wurde danach an Kieselgel (600 g) unter Entwicklung mit MeOH/CHCl&sub3; (1:4, V/V) chromatographiert. Fraktionen, enthaltend die purpurfarbene Hauptprodukt-Bande, wurden zusammengefaßt und mit überschüssiger HCl in 2-Propanol (i-PrOH) angesäuert, um eine Farbänderung von purpur nach goldgelb zu erzeugen. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in heißem EtOH (ca. 25 ml) aufgenommen und unter Kühlung kristallisiert. Die abgeschiedenen Feststoffe wurden abfiltriert, mit eiskaltem EtOH/Hexan (3:1, V/V) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um die analytisch reine Verbindung 1-(ω-Sulfopropyl)-2-(4'- hydroxy-3',5'-dibromstyryl)-3,3-dimethylindoleninium-Betain (0,96 g, 25 %) als goldgelbe Kristalle zu ergeben. Die Verbindung wies keinen genauen Schmelzpunkt auf, wurde jedoch bei Temperaturen oberhalb 200ºC dunkel. Das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung der Verbindung ist als Reaktion A in Figur 3 ganz allgemein dargestellt. Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7
    • Beispiel 8 1-(ω-Sulfobutyl)-2-(4'-hydroxy-3,5'-dijodstyryl)benzthiazolium- Betain
  • Eine Mischung aus 3',5-Dijod-4-hydroxybenzaldehyd (Lancaster Syntheses, Ltd., Windham, NH, USA) (3,74 g, 10 mmol), 3-(ω-Sulfobutyl)-2- methylbenzthiazolium-Betain (GB 742 112; CA 50: P11149e) (3,71 g, 13 mmol) und von Piperidin (0,8 ml) in EtOH (30 ml) wurde unter einer Inertgas- Atmosphäre gehalten. Die Lösung wurde 1 h lang am Rückfluß gehalten und dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Die Reaktionsmischung wurde mit genügend 1,93 M Salzsäure in i-PrOH angesäuert, um eine Farbänderung von purpur nach gelb zu bewirken, worauf sich Feststoffe aus der Lösung abschieden. Die Feststoffe wurden abfiltriert, mit EtOH gewaschen und getrocknet. Die Feststoffe wurden dann in warmen (55ºC) EtOH/MeOH/H&sub2;O (3:2:1, V/V/V) (300 ml), enthaltend 2 M wäßriges Natriumhydroxid (5,2 ml), aufgelöst, durch Celite (Johns-Manville Corp., Denver, CO, USA) filtriert und durch Zugabe von 3 M wäßriger Salzsäure (6 ml) ausgefällt. Nach Kühlung in einem Eisbad wurden die Feststoff abfiltriert, mit EtOH gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Feststoffe wurden dann in siedender Essigsäure (HOAc) (600 ml) gehalten, filtriert und im Vakuum bei 115ºC getrocknet, um die analytisch reine Verbindung 1-(ω-Sulfobutyl)-2-(4,-hydroxy-3',5'- dijodstyryl)benzthiazolium-Betain (5,10 g, 79 %) als gelbes Pulver zu ergeben. Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung der Verbindung ist als Reaktion B in Figur 3 ganz allgemein dargestellt. Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 8 angegeben. Tabelle 8
    • Beispiel 9 1-(ω-Sulfoethyl)-2-(4-hydroxy-3',5'-dijodstyryl)-3,3-dimethylindoleninium-Betain
  • Eine Mischung von 3,5-Dijod-4-hydroxybenzaldehyd (3,73 g, 10 mmol), von 1-(ω-Sulfoethyl)-2,3,3-trimethylindoleninium-Bromid (US 2 503 776; CA 44: P5738i) (6,61 g; 19 mmol) und von Piperidin (2,0 ml) in EtOH/MeOH (2:1, V/V) (60 ml) wurde unter einer Inertgas-Atmosphäre gehalten. Die Lösung wurde 4 h lang am Rückfluß gehalten, auf Umgebungstemperatur abgekühlt und im Vakuum zur Trockene eingedampft, worauf ein brauner Rückstand zurückblieb. Der braune Rückstand wurde in MeOH (2 bis 3 ml) aufgenommen. Dieses Lösungsmittel wurde mit Triethylamin (NEt&sub3;) (2 ml) behandelt und an Kieselgel unter Entwicklung mit MeOH/CHCl&sub3; (1:4, V/V) chromatographiert. Die Fraktionen mit der purpurfarbenen Produkt-Bande wurden zusammengefaßt und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Dieses Rohprodukt wurde in EtOH (10 ml) aufgenommen, mit genügend 1,93 M HCl in i-PrOH angesäuert, um eine Farbänderung von purpur nach gelb zu bewirken. Diese Lösung wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde dann in EtOH/Hexan (3:1, V/V) aufgenommen und im Kühlschrank stehen gelassen, bis sich Kristalle in der Lösung bildeten. Die abgeschiedenen kristallinen Feststoffe wurden abfiltriert. Diese Feststoffe wurden mit eiskaltem EtOH und dann mit EtOH/Hexan gewaschen. Die verbleibenden Feststoffe wurden im Vakuum getrocknet, um die Verbindung 1-(ω-Sulfoethyl)-2-(4 -hydroxy-3',5- dijodstyryl)-3,3-dimethylindoleninium-Betain (0,80 g; 12,8 %) zu ergeben. Umkristallisation aus EtOH/HOAc ergab die analytisch reine Verbindung als ein dunkelrötlich-braunes Pulver. Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung der Verbindung ist als Reaktion C in Figur 3 ganz allgemein dargestellt. Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 9 angegeben. Tabelle 9
    • Beispiel 10 1-(ω-Sulfopropyl)-2-(4'-hydroxy-3',5'-dijodstyryl)-3,3- dimethylindoleninium-Betain (SPDIB)
  • Eine Mischung von 3,5-Dijod-4-hydroxybenzaldehyd (3,73 g, 10 mmol), von 1-(ω-Sulfopropyl)-2,3,3-trimethylindoleninium-Betain (3,65 g, 13 mmol) und von Piperidin (0,8 ml) in EtOH (ca. 50 ml) wurde unter einer Inertgas- Atmosphäre gehalten. Die Lösung wurde 2,75 h lang am Rückfluß gehalten und dann in einem Eisbad abgekühlt. Die Lösung wurde mit 1,93 M HCl in i-PrOH (5,0 ml) angesäuert. Es schied sich ein dunkles teerartiges Produkt ab, das abfiltriert und mit siedender HOAc verrieben wurde. Die vereinigten Verreibungsprodukte wurden im Vakuum zur Trockene eingedampft, in HOAc (20 ml) aufgenommen, und man ließ sie kristallisieren. Die abgeschiedenen Feststoffe wurden abfiltriert, mit HOAc gewaschen und im Vakuum getrocknet, um die Verbindung 1-(ω-Sulfopropyl)-2-(4'-hydroxy-3',5'-dijodstyryl)-3,3- dimethylindoleninium-Betain (4,37 g, 68 %) als orangefarbenes Pulver zu ergeben. Die Verbindung wurde aus HOAc umkristallisiert, um die analytisch reine Verbindung zu ergeben. Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung der Verbindung ist als Reaktion D in Figur 3 ganz allgemein dargestellt. Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 10 angegeben. Tabelle 10
    • Beispiel 11 1-(ω-Sulfobutyl)-2-(4'-hydroxy-3',5'-dijodstyryl)-3,3-dimethylindoleninium-Betain
  • Eine Mischung von 3,5-Dijod-4-hydroxybenzaldehyd (1,87 g, 5 mmol), von 1-(ω-Sulfobutyl)-2,3,3-trimethylindoleninium-Betain (R. B. Mujumdar et al., Cytometry 10, 11 - 9 (1989)) (2,36 g, 8 mmol) und von Piperidin (0,4 ml) in EtOH (35 ml) wurde unter einer Inertgas-Atmosphäre gehalten. Die Lösung wurde 2,5 h lang am Rückfluß gehalten und dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Die Reaktionsmischung wurde mit überschüssiger 1,93 M HCl in i-PrOH angesäuert und im Vakuum zur Trockene eingedampft, um einen Rückstand zu hinterlassen. Der Rückstand wurde in EtOH (10 ml) aufgenommen. Im Kühlschrank schieden sich Feststoffe aus der Mischung ab. Die Feststoffe wurden abfiltriert, mit eiskalten EtOH/Hexan (3:1, V/V) gewaschen und im Vakuum getrocknet, um einen orangefarbenen Feststoff (3,36 g) zu ergeben. Das Rohprodukt wurde in siedendem EtOH (ca. 30 ml) aufgenommen und sofort erneut ausgefällt. Es wurde zusätzlicher siedender EtOH (ca. 220 ml) zugegeben, der Feststoff löste sich jedoch nicht wieder auf. Nach Kühlung in Eis wurden die Feststoffe abfiltriert, mit EtOH gewaschen und im Vakuum getrocknet, um die analytisch reine Verbindung 1-(ω-Sulfobutyl)-2-(4'- hydroxy-3',5'-dijodstyryl)-3,3-dimethylindoleninium-Betain (1,54 g, 47 %) als orangefarbenes Pulver zu ergeben. Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung der Verbindung ist als Reaktion E in Figur 3 ganz allgemein angegeben. Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 11 angegeben. Tabelle 11
    • Beispiel 12 1-(n-Butyl)-2-(4 -hydroxy-3',5-dijodstyryl)-3,3-dimethylindoleninium-Jodid
  • Eine Mischung aus 3,5-Dijod-4-hydroxybenzaldehyd (3,73 g, 10 mmol), von 1-((n-Butyl)-2,3,3-trimethylindoleninium-Jodid (D. P. Maisuradze et al., Soobschch, Akad. Nauk. Gruz. SSR 50, 77 - 82 (1968): CA 69: 106526r) (4,46 g, 13 mmol) und von Piperidin (0,8 ml) in EtOH (40 ml) wurde unter einer Inertgas-Atmosphäre gehalten. Die Lösung wurde 1 h am Rückfluß gehalten und dann auf Umgebungstemperatur abgekühlt. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft, um einen Rückstand zu hinterlassen. Der Rückstand wurde in EtOH (10 ml) aufgenommen und mit 1,93 M HCl in i-PrOH (3,0 ml) behandelt. Die Lösung wurde danach im Vakuum erneut zur Trockene eingedampft, um einen Rückstand zu hinterlassen. Der Rückstand wurde in EtOH (4 ml) aufgenommen. Die Lösung wurde in den Kühlschrank gestellt, und es bildeten sich spontan Kristalle. Die abgeschiedenen kristallinen Feststoffe wurden abfiltriert, mit eiskaltem EtOH gewaschen und im Vakuum getrocknet, um rohes 1-(n-Butyl)-2-(4'-hydroxy-3,5'-dijodstyryl)-3,3- dimethylindoleninium-Jodid (4,90 g, 80,7 %) zu ergeben. Die rohe Verbindung wurde in heißem EtOH (60 ml) aufgenommen, durch Papier filtriert und im Vakuum auf ca. 30 ml eingeengt. Man ließ die Lösung kristallisieren. Die abgeschiedenen Kristall-Feststoffe wurden gesammelt, gewaschen und wie oben getrocknet, um die analytisch reine Verbindung 1-(n-Butyl)-2-(4'-hydroxy- 3,5,-dijodstyryl)-3,3-dimethylindoleninium-Jodid (3,90 g, 56 %) als hellorangefarbenes Pulver zu ergeben. Das oben beschriebene Verfahren zur Herstellung der Verbindung ist als Reaktion F in Figur 3 ganz allgemein dargestellt. Spektroskopische Daten zur Identifizierung der Verbindung sind in der folgenden Tabelle 12 angegeben. Tabelle 12
    • Beispiel 13 Vergleich der Dosis-Reaktion von Reagenzstreifen der vorliegenden Erfindung und von Albustix
  • Ein Urin-Pool mit einem spezifischen Gewicht von 1,007, der gemäß Immunoassay-Verfahren kein Albumin aufwies, wurde bis zu verschiedenen klinisch signifikanten Gehaltsmengen mit Humanserumalbumin Pentex (Miles, Inc., Elkhart, Indiana) versetzt. Unter Anwendung eines Geräts Clinitek 200 (Miles, Inc., Elkhart, Indiana) wurden Protein-Messungen mit Teststreifen vorgenommen, die DIDNTB, SPDIB sowie ein Polypropylenglykol mit einem Molekulargewicht von ca. 2 000 enthielten.
  • Die Reagenzstreifen wurden wie folgt hergestellt. E & D 237 (Ahlstrom Filtration, Inc., Mount Holley Springs, PA, USA)-Papier wurde in eine Lösung getaucht, die einen 0,5 M Zitrat-Puffer, pH 2,5 in 20%igem Ethanol, und 0,08 mM SPDIB enthielt. Der Streifen wurde anschließend in eine zweite Lösung getaucht, enthaltend 0,3 mM DIDNTB und 1 % P-2000 (ein Polypropylenglykol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 2 000, erhältlich von Fluka Chemical Company unter der Handelsbezeichnung P-2000 ). Das Papier wurde dann getrocknet.
  • Das Auflösungsvermögen wurde quantitativ ermittelt und ausgedrückt in delta K/S-Werten zwischen Alumin-Gehaltsmengen, wie in Figur 4 gezeigt. Die K/S-Werte sind aus der Formel berechnet:
  • K/S = (1-R)²/3R
  • worin R der Reflexionsbrechungswert aus der Test-Vorrichtung, K eine Konstante und S der Lichtsteuungskoeffizient des besonderen reflektierenden Mediums sind. Die obige Gleichung ist eine vereinfachte Form der wohlbekannten Kubelka-Munk-Gleichung (siehe Gustav Kortum, "Reflectance Spectroscopy", S. 106 - 11, Springer Verlag, New York (1969)). Die K/S- Werte wurden bei 25 s ermittelt.
  • Die oben hergestellten Reagenzstreifen und ein Reagenzstreifen von Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, mit der Handelsbezeichnung Albustix , wurden bezüglich ihres Reaktionsverhaltens gegenüber verschiedenen Protein-Gehaltsmengen verglichen. Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind als Figur 4 zusammengefaßt. Der Streifen gemäß der Erfindung war empfindlicher gegenüber niedrigen Gehaltsmengen an Protein als Albustix. Ferner wird beim Erfindungsgegenstand ein besseres Auflösungsvermögen zwischen den Protein-Gehaltsmengen festgestellt.
    • Beispiel 14 Vergleich von Reagenzstreifen, die eines von verschiedenen ausgewählten Farbverstärkungspolymeren enthalten
  • Unter Einsatz desgleichen Urin-Pool wie oben wurden Messungen durchgeführt, wobei Teststreifen zur Anwendung gelangten, die DIDNTB und SPDIB sowie kein Farbverstärkungspolymer oder eines der Farbverstärkungspolymeren enthielten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fenoil D4030, P-2000 (ein Polypropylenglykol mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 2 000, erhältlich von Fluka Chemikal Company unter der Handelsbezeichnung P-2000), KOK 10.071 sowie aus Lutonal 1-30. Die K/S-Werte wurden bei 25 Sekunden ermittelt. Die Meßergebnisse sind in Figur 5 zusammengefaßt.
  • Die Hintergrundfärbung einer Leerprobe wurde durch Fenoil D4030, P-2000 , KOK 10.071 und durch Lutonal 1-30 herabgesetzt. Fenoil D4030 und P-2000 verursachten eine deutliche Steigerung bei der Dosis-Reaktion. Aus den in Figur 5 zusammengefaßten Daten ist ersichtlich, daß das P-2000 das am meisten bevorzugte ist, da es die größte Verbesserung beim Auflösungsvermögen zwischen verschiedenen Albumin-Konzentrationen zeigte. KOK 10.071 ist jedoch ebenfalls bevorzugt, da durch dieses Produkt die Hintergrundfärbung signifikant herabgesetzt wird.
    • Beispiel 15 Reagenzstreifen-Herstellung
  • Es wird nun 1 Verfahren zur Herstellung des hierin beschriebenen Reagenzstreifens für urinäres Protein angegeben. Das zu beschreibende Verfahren ist ein kontinuierliches Verfahren zur Massenproduktion von Reagenz-Teststreifen für urinäres Protein.
  • Gemäß dem Verfahren wird ein dünner absorbierender Streifen aus Papier entlang einer Bahn mit einer bevorzugten Geschwindigkeit von ca. 1,2 m (4 Fuß) pro Minute geführt. Ein bevorzugtes Papier ist E & D 237. Das Papier wird zuerst in ein bei pH 2,5 gepuffertes Bad getaucht, das den Merocyanin-Protein-Fehlerindikator SPDIB enthält, der in Ethanol oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst ist. Das Papier wird dann ein zweites Mal in ein Bad getaucht, das den Phenolsulfonphthalein- Protein-Fehlerindikator DIDNTB enthält, der in Ethanol oder einem anderen geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst ist.
  • Gemäß einem bevorzugten Verfahren enthalten das erste Bad einen 0,5 M Kahumzitrat-Puffer, pH 2,5, sowie 0,08 mM SPDIB in 20%igem Ethanol und das zweite Bad 0,3 M DIDNTB in Ethanol sowie ein Farbverstärkungspolymer.
  • Wird Polypropylenglykol als Farbverstärkungspolymer verwendet, sollte das zweite Ethanol-Bad eine 1%ige Lösung von Polypropylenglykol enthalten. Ein bevorzugtes Polypropylenglykol, das ein Durchschnittsmolekulargewicht von ca. 2 000 aufweist, ist von Fluka Chemical Company unter der Handelsbezeichnung P-2000 erhältlich. Wird allerdings ein Testpapier hergestellt, das kein Farbverstärkungspolymer aufweist, enthält das zweite Tauchbad lediglich DIDNTB in Ethanol.
  • Der Teststreifen wird dann durch einen Trockner unter Bedingungen eines Luftdrucks von 2,54 cm (1 Inch) Wassersäule und einer Temperatur von 60ºC mit einer Geschwindigkeit von 1,2 m (4 Fuß) pro Minute geleitet. Die Teststreifen werden dann zurechtgeschnitten und verpackt.
    • Beispiel 16 Reagenzstreifen, stabilisiert gegen thermische Belastung
  • Eine Hitzebelastung führt zu einem wesentlichen Verlust an Reaktivität beim entsprechenden Reagens. Es ist herausgefunden worden, daß durch Zugabe von Sorbit oder Glycerin zu einer Protein-Assay-Formulierung, die Polypropylenglykol enthält, die Stabilität gegenüber Hitzebelastung gesteigert wird. Verbesserungen bei der Hitzebelastungsbeständigkeit wurden ebenfalls belegt, als Polypropylenglykol durch ein anderes Polymer, insbesondere durch Lutonal 1-30, einen Polyvinylisobutylether von BASF, ersetzt wurde. Schließlich wurde die thermische Belastungsstabilität durch Ersatz der gewöhnlich in Protein-Assay-Verfahren (Teststreifen) verwendeten Zitrat-Puffer durch Glycin verbessert. Ebenfalls ist herausgefunden worden, daß Protein-Assay-Verfahren unter Einschluß des Polymer Lutonal 1-30 auch ein Reagens ergeben, das eine erhöhte Beständigkeit gegenüber Interferenz (Störung) durch Urin-Proben eines hohen spezifischen Gewichts (SG) aufweist. Das Polymer Lutonal 1-30 war gegenüber Polypropylenglykol bei der Herabsetzung dieser SG-Interferenz (Störung durch das spezifische Gewicht) überlegen.
  • Stabilitätsdaten wurden erhalten, indem die Reagenzstreifen mit Puffer-Lösungen in der Abwesenheit und Anwesenheit von zugefügtem Albumin (HSA) getestet wurden. Der Puffer enthielt 1 % NaCl, 2,5 % Harnstoff und 0,018 M Kaliumphosphat, pH = 7. Alle Reagentien wurden auf Whatman CCP500- Papier aufgebracht, wie beschrieben in Beispiel 13, und enthielten 0,3 mM DIDNTB, 0,08 mM SPDIB, 0,625 M Puffer, zusätzlich zu den angegebenen Komponenten.
    • Tabelle 13 Verlust an Netto-Reaktivität nach 4 Wochen bei 50ºC (verglichen mit 4 Wochen/20ºC oder 4 Wochen/25ºC) bei Testlösungen, enthaltend 30 mg/dl HSA
  • Wie hier ermittelt, rangierte der Verlust an Reaktivität bei Verwendung von Polypropylenglykol P-2000 von 28 bis 49 % und wurde durch die Zugabe von Sorbit oder Glycerin oder durch Ersatz des Zitrat-Puffers deutlich herabgesetzt. Ein derartiger Reaktivitätsverlust wurde vollständig vermieden, indem das Polypropylenglykol P-2000 durch das Polymer Lutonal 1-30 ersetzt wurde. Somit lassen sich Sorbit, Glycerin, Glycin und Lutonal 1-30 für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als Mittel zur Herabsetzung der thermischen Belastung kategorisieren, weil sie alle die thermische Stabilität eines Protein-Assay-Verfahrens bei deren Vorliegen in der Formulierung verbessern
  • Das überlegene Leistungsvermögen des Reagens Lutonal I-30 bei der Minimierung der SG-Interferenz wurde an 13 klinischen Proben von SG ≥ 1,020 aufgezeigt, und zwar mit einem Negativ-Befund für Proteinune mit dem Sulfosal-Verfahren. Diese Proben wurden auch bezüglich Gesamtprotein mit dem Coomassie-Blau (CBB)-Verfahren sowie bezüglich Albumin mit einem Immuno-Assay-Verfahren getestet. Die Schwelle für Proteinune sollte ganz allgemein hei 15 mg/dl Gesamtprotein und bei 3 mg/dl HSA liegen. Somit lagen, gemäß diesen Kriterien und den Sulfosal-Ergebnissen, diese Proben unterhalb der Proteinune-Schwelle und sollten als negativ eingestuft werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 angegeben. Tabelle 14
  • Es ist in dieser Gruppe von Proben mit hohem SG (spezifischem Gewicht) ersichtlich, daß das Reagens Lutonal 1-30 nur 1 mögliche falsche Spur ergab, während die Mehrheit der anderen Proben Spurenfärbungen mit dem Reagens P-2000 gewesen sein hätten können. Beispielsweise fiel die grüne Farbe zwischen den Negativ-Befund und den Spuren-Block und hätte als sowohl als auch eingestuft werden können.
  • Es sind spezifische Ausgestaltungen der Erfindung anhand von Beispielen aufgezeigt und hier im Detail beschrieben worden. Es sollte jedoch klar sein, daß die Erfindung nicht auf die offenbarten besonderen Formen eingeschränkt sein, sondern alle Ausgestaltungsformen abdecken soll, die unter den Rahmen der beigefügten Ansprüche fallen.

Claims (9)

1. Analytischer Teststreifen zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe, welcher einen absorbierenden Träger umfaßt, der mit einem Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator sowie einem Merocyanin- Protein-Fehlerindikator imprägniert ist, wobei der Phenolsulfonphthalein- Protein-Fehler indikator die Verbindung:
worin gilt:
X ist -J, -Br oder -Cl,
Y ist -NO&sub2; oder -NO, und
Z ist -J, -Br oder -Cl,
und wobei der Merocyanin-Proteln-Fehlerindikator die Verbindung sind:
worin gilt:
m ist eine ganze Zahl von 1 bis 6,
Q ist -Br, -J oder -Cl,
T ist -SO&sub3;&supmin; oder -H, und
R ist S, Se, O oder C(Cnh2n+1)&sub2;,
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist.
2. Analytischer Teststreifen gemäß Anspruch 1, worin X -Br oder -J, Y -NO&sub2;, Z -Br, m die Zahl 3 oder 4, Q -Br oder -J, R C(Cnh2n+1)&sub2;, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, und T -SO&sub3;&supmin;sind.
3. Analytischer Teststreifen gemaß einem der Ansprüche 1 und 2, worin X -Br, Y -NO&sub2;, Z -Br, Q -J, m die Zahl 3 und R C(CH&sub3;)&sub2; sind.
4. Analytischer Teststreifen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator und der Merocyanin- Protein-Fehlerindikator im Teststreifen in einem Molverhältnis von ca. 10 zu 1 bis ca. 1 zu 1 enthalten sind.
5. Analytischer Teststreifen gemäß jedem der Ansprüche 1 bis 4, worin der Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator und der Merocyanin- Protein-Fehlerindikator im Teststreifen in einem Molverhältnis von ca. 5 zu 1 bis ca. 2 zu 1 enthalten sind.
6. Analytischer Teststreifen zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe, welcher einen absorbierenden Träger umfaßt, der mit einem Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator und einem Merocyanin- Protein-Fehlerindikator imprägniert ist, wobei der Phenolsulfonphthalein- Protein-Fehlerindikator die Verbindung:
worin gilt:
X ist -J, -Br oder -Cl,
Y' ist -NO&sub2; oder -NO,
Y" ist -J, -Br oder -Cl, und
Z ist -J, -Br oder -Cl,
und wobei der Merocyanin-Protein-Fehlerindikator die Verbindung sind:
worin gilt: m ist eine ganze Zahl von 1 bis 6,
Q ist -Br, -J oder -Cl,
T ist -SO&sub3;&supmin; oder -H, und
R ist S, Se, O oder C(Cnh2n+1)&sub2;,
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist.
7. Analytischer Teststreifen gemäß Anspruch 6, worin der Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator und der Merocyanin-Protein- Fehlerindikator im Teststreifen in einem Molverhältnis von ca. 10 zu 1 bis ca. 1 zu 1 enthalten sind.
8.Verfahren zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe, wobei Stufen enthalten sind, in denen man
a) einen analytischen Teststreifen mit der biologischen Probe benetzt, wobei der Teststreifen einen absorbierenden Träger aufweist, der mit einem Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator und einem Merocyanin-Protein-Fehlerindikator imprägniert ist, und wobei der Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator die Verbindung:
worin gilt:
X ist -J, -Br oder -Cl,
Y ist -NO&sub2; oder -NO, und
Z ist -J, -Br oder -Cl,
und wobei der Merocyanin-Protein-Fehlerindikator die Verbindung sind:
worin gilt:
m ist eine ganze Zahl von 1 bis 6,
Q ist -Br, -J oder -Cl,
T ist -SO&sub3;&supmin; oder -H, und
R ist S, Se, O oder C(Cnh2n+1)&sub2;,
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, und man
b) eine Farbänderung des Teststreifens beobachtet und erfaßt, worin die Farbänderung ein Anzeichen von Protein in der biologischen Probe darstellt.
9. Verfahren zum Nachweis von Protein in einer biologischen Probe, wobei Stufen enthalten sind, in denen man
a) einen analytischen Teststreifen mit der biologischen Probe benetzt, wobei der Teststreifen einen absorbierenden Träger aufweist, der mit einem Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator und einem Merocin- Protein-Fehlerindikator imprägniert ist, und wobei der Phenolsulfonphthalein-Protein-Fehlerindikator die Verbindung:
worin gilt:
X ist -J, -Br oder -Cl,
Y' ist -NO&sub2; oder -NO,
Y" ist -J, -Br oder -Cl, und
Z ist -J, -Br oder -Cl,
und wobei der Merocyanin-Protein-Fehlerindikator die Verbindung sind:
worin gilt:
m ist eine ganze Zahl von 1 bis 6,
Q ist -Br, -J oder -Cl,
T ist -SO&sub3;&supmin; oder -H, und
R ist S, Se, O oder C(Cnh2n+1)&sub2;,
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist, und man
b) eine Farbänderung des Teststreifens beobachtet und erfaßt, worin die Farbänderung ein Anzeichen von Protein in der biologischen Probe darstellt.
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