DE60225802T2 - Verfahren und gerät zum nachweis des gesamten proteingehaltes bei niedrigen ph-werten - Google Patents
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Classifications
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- G—PHYSICS
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Description
- GEBIET DER ERFINDUNG
- Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Geräte zum Nachweis von Proteinen. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Verfahren und Geräte zum Nachweis von Proteinen bei niedrigeren pH-Werten mittels unterschiedlicher Puffer.
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Verfahren zum Nachweis von Proteinen im Urin weisen häufig eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Albumin als gegenüber anderen Proteinen im Urin auf. Es ist jedoch wichtig, neben Albumin auch andere Proteine nachweisen zu können, insbesondere im Fall der Bence-Jones-Proteinurie. Da eine differenzierte Entscheidung über die Wahl der empfohlenen klinischen Maßnahmen vom Nachweis der Proteinkonzentration im Urin eines Patienten abhängig ist, sollte der Proteinnachweis ein breites Spektrum von Proteinkonzentrationen abdecken. So zeigt beispielsweise eine anhaltende Proteinurie von über 50 mg/dl mit hoher Wahrscheinlichkeit eine Nierenerkrankung an, während ein Proteingehalt von über 300 mg/dl mit der Diagnose eines nephrotischen Syndroms zu vereinbaren ist. Eine Proteinkonzentration im Urin von über 800 mg/dl deutet auf einen massiven Proteinverlust hin und rechtfertigt eine Nierenbiopsie und/oder eine Steroidtherapie. In diesem Zusammenhang ist es offensichtlich, dass ein Test zur Feststellung des Proteingehaltes im Urin in der Lage sein sollte, Aufschluss über ein breites Spektrum von Proteinwerten zu geben.
- In der Literatur werden unterschiedliche Verfahren zur Bestimmung von Proteinen in wässriger Lösung beschrieben. Zu diesen Verfahren zählen das Kjeldahl-Verfahren, die Biuretmethode, die Proteinbestimmung nach Lowry, das Farbstoff-Kombinationsverfahren, das UV-Verfahren und das fluorimetrische Verfahren. In der Regel reagieren Proteine mit unterschiedlichen Substanzen, zu denen Farbstoffe wie etwa Bromphenolblau, Coomassie-Brillantblau und Eosin wie auch Metallionen wie etwa Silber (I), Kupfer (II), Zink (II) und Blei (II) zählen.
- Der Gehalt an Salzen im Urin ist individuell unterschiedlich. Einige dieser Salze können für den Fall, dass ein diagnostisches Testverfahren eine Umgebung mit einem anderen pH-Wert als dem der Urinprobe erfordert, als Puffer wirken. Urinproben mit Salzen wie Bikarbonat, Azetat oder Phosphat haben beispielsweise die Tendenz, einer Senkung des pH-Wertes zu widerstehen. Auch Kreatinin, ein gewöhnlicher Bestandteil des Urins, kann bei der Senkung des pH-Wertes als Puffer wirken. Als Ergebnis dieser Pufferung zeigt der Teststreifen bei einigen Urinproben in diesem Fall einen pH-Wert, der höher liegt als der Optimalwert. Ein über dem Optimalwert liegender Diagnosestreifen-pH-Wert kann bei den Protein-Indikatorfarbstoffen zu einer Farbentwicklung führen, die ein verfälschtes Ergebnis bei der Anzeige des Proteingehaltes zur Folge hat. Es ist wünschenswert, solche Effekte bei der Urinanalyse mittels eines Puffersystems zu reduzieren, das die chemischen Prozesse selbst nicht beeinflusst.
- Daher besteht die Notwendigkeit der Entwicklung eines Verfahrens und Gerätes, das in der Lage ist, beim Proteinnachweis ein breites Spektrum klinischer Konzentrationen und pH-Werte zu erfassen.
- ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
- Gemäß einer Ausführungsform beruht das Testverfahren zur Bestimmung von Protein in einer wässrigen Testlösung auf dem Vermischen der Testlösung mit einem Puffer und einem Farbstoff. Als Puffer stehen unter anderem Zitrullin, Cyanessigsäure, Methylphosphonsäure, Saccharin oder Kombinationen dieser Substanzen zur Wahl. Der Puffer wird in einer Menge hinzugefügt, die ausreicht, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung in dem gewählten pH-Wert-Sollbereich innerhalb des Bereichs von ca. 2,0 bis ca. 3,0 zu halten. Der Farbstoff hat einen pKa-Wert, der ihm die Fähigkeit verleiht, innerhalb des pH-Wert-Sollbereichs als Proteinindikator zu fungieren. Durch seine Affinität zu Protein ist der Farbstoff in der Lage, vorhandenes Protein ab einer Menge von ca. 15 mg/dl zu bestimmen, was bedeutet, dass die Analyse geeignet ist, das Gesamtprotein in der Testlösung nachzuweisen.
- Gemäß einer anderen Ausführungsform erfolgt die Bestimmung der Proteinwerte in einer flüssigen Testprobe mit Hilfe eines trocken arbeitenden Gerätes, welches ein saugfähiges Material umfasst, das mit einem Puffer und einem Farbstoff getränkt wurde. Als Puffer stehen unter anderem Zitrullin, Cyanessigsäure, Methylphosphonsäure, Saccharin oder Kombinationen dieser Substanzen zur Wahl. Der Puffer wird in einer Menge hinzugefügt, die ausreicht, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung in einem gewählten pH-Wert-Sollbereich innerhalb des Bereichs von ca. 2,0 bis ca. 3,0 zu halten. Der Farbstoff hat einen pKa-Wert, der ihm die Fähigkeit verleiht, innerhalb des pH-Wert-Sollbereichs als Proteinindikator zu fungieren. Durch seine Affinität zu Protein ist der Farbstoff in der Lage, bei Kontakt zwischen Gerät und flüssiger Testprobe vorhandenes Protein ab einer Menge von ca. 15 mg/dl zu bestimmen, was bedeutet, dass das Testverfahren geeignet ist, das Gesamtprotein in der flüssigen Testprobe nachzuweisen.
- Der Puffer wird in einer Menge hinzugefügt, die ausreicht, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung in einem gewählten pH-Wert-Sollbereich innerhalb eines Bereichs von ca. 2,0 bis ca. 3,0 zu halten. Der Farbstoff hat einen pKa-Wert, der ihm die Fähigkeit verleiht, innerhalb des pH-Wert-Sollbereichs als Proteinindikator zu fungieren, und durch seine Affinität zu Protein ist er in der Lage, vorhandenes Protein ab einer Menge von etwa 15 mg/dl zu bestimmen, was bedeutet, dass das Verfahren geeignet ist, das Gesamtprotein in der flüssigen Testlösung nachzuweisen.
- AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER DARGESTELLTEN AUSFÜHRUNGSFORM
- Das in der vorliegenden Erfindung vorgestellte Testverfahren zum Nachweis von Protein kann sowohl in Flüssigkeit als auch trocken durchgeführt werden. Am besten geeignet ist ein Teststreifen aus absorbierendem Material, der mit (a) einem Puffer – entweder Zitrullin, Cyanessigsäure, Methylphosphonsäure, Saccharin oder Kombinationen dieser Substanzen – und (b) einem Farbstoff, der durch seinen pKa-Wert in der Lage ist, bei einem pH-Wert von ca. 2,0 bis ca. 3,0 als Proteinindikator (beispielsweise als Farbindikator) zu fungieren, imprägniert ist.
- Puffer
- Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Puffer wird in einer Menge hinzugefügt, die ausreicht, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung innerhalb eines Bereichs zwischen ca. 2,0 und ca. 3,0 zu halten. Der pH-Wert des Puffers kann zuvor eingestellt werden, indem man in der Regel einer Lösung der Pufferchemikalie Säure oder Base hinzufügt, um einen speziellen pH-Wert zu erreichen, oder indem eine Mischung aus der Pufferchemikalie und ihrem Salz in einem ausgewählten Verhältnis zueinander hinzu gegeben werden, das zu dem gewünschten pH-Wert führt. Der Puffer wird vorzugsweise hinzugefügt, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung innerhalb eines Bereichs von ca. +/– 0,2 pH-Einheiten um den gewählten pH-Zielwert zu halten. Die Menge des zugefügten Puffers sollte möglichst ausreichen, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung in einem Bereich von ca. 2,4 bis ca. 3,0 zu halten.
- Bevorzugte Puffer sind Zitrullin, Malonsäure oder Kombinationen dieser Substanzen. Als Puffer stehen Zitrullin, Cyanessigsäure, Methylphosphonsäure, Saccharin oder Kombinationen dieser Substanzen zur Wahl. Es können unterschiedliche Konzentrationen dieser Puffer verwendet werden; die Konzentrationen der Puffer liegen jedoch üblicherweise in einem Bereich zwischen ca. 200 und ca. 500 mM.
- Zitrullin kann in Form von L-Zitrullin, D-Zitrullin und D,L-Zitrullin verwendet werden und wird als Struktur A dargestellt.
-
- Die für die vorliegende Erfindung nützliche Methylphosphonsäure wird als Struktur E dargestellt.
- Das für die vorliegende Erfindung nützliche Saccharin wird als Struktur G dargestellt.
- Zitrullin, Cyanessigsäure, Methylphosphonsäure und/oder Saccharin sind normalerweise im Handel erhältlich und können beispielsweise über die Firma Aldrich Chemical Company bezogen werden.
- Farbstoffe
- Durch ihre pKa-Werte sind die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Farbstoffe in der Lage, bei einem pH-Wert innerhalb eines Bereichs von ca. 2,0 bis ca. 3,0 als Proteinindikatoren zu fungieren. Die Farbstoffe können beispielsweise pKa-Werte haben, die in einem gewählten pH-Sollbereich innerhalb des pH-Bereichs von ca. 2,0 bis ca. 3,0 einen Farbunterschied anzeigen, wenn Protein vorhanden ist. Der gewählte pH-Wert-Sollbereich sollte vorzugsweise innerhalb von ca. +/– 0,2 pH-Einheiten um den gewählten pH-Zielwert liegen. Zudem können die Farbstoffe pKa-Werte haben, durch die bei Nichtvorhandensein von Protein innerhalb des gewählten pH-Wert-Sollbereichs kein signifikanter Farbunterschied angezeigt wird. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Farbstoffe haben vorzugsweise pKa-Werte, durch die sie in der Lage sind, bei einem pH-Wert innerhalb des Bereichs von ca. 2,4 bis ca. 3,0 als Proteinindikatoren zu fungieren. Wenn dies auch nicht theoretisch belegt wurde, so besteht doch die Annahme, dass solche Farbstoffe, die durch die Bindung an ein Protein einem anderen Milieu ausgesetzt sind, als wenn sie sich frei in einer Lösung befinden, praktisch einen niedrigeren pKa-Wert entwickeln, der sich wiederum auf die für die Farbveränderung wesentliche Ionisierung auswirkt. Wirkt der Farbstoff aber auch bei Nichtvorhandensein eines Proteins innerhalb des gewählten pH-Wert-Sollbereichs als pH- empfindlicher Farbindikator, so können hinzugefügte Proteine in der Regel nicht genau nachgewiesen werden.
- Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Farbstoffe sind in der Regel geeignet, einen Gesamtproteingehalt von ca. 2 bis ca. 500 mg/dl Protein nachweislich anzuzeigen. Die Farbstoffe sind vorzugsweise geeignet, einen Gesamtproteingehalt von ca. 15 bis ca. 300 mg/dl Protein in nachweislicher und insbesondere geeigneter Weise anzuzeigen. Es ist denkbar, dass Veränderungen der Farbstoffmenge zu verwertbaren Nachweisen auch außerhalb eines solchen bevorzugten Bereichs führen können.
- Beispiele für diese Farbstoffe sind unter anderem substituierte Phenolsulfonephthaleine, Pyrogallol-Rot oder Kombinationen dieser Substanzen. Es ist denkbar, dass auch andere Farbstoffe, die die Tendenz haben, im pH-Bereich von ca. 2 bis ca. 3 bei Nichtvorhandensein von Protein innerhalb des Farbstoff-Extinktions- oder Fluoreszenzspektrums eine nachweisliche Reaktion (in Form eines Farbumschlags) zu zeigen und eine davon verschiedene Reaktion bei Vorhandensein von Protein unter ansonsten gleichen Bedingungen, für die vorliegende Erfindung geeignet sind. Der für die unterschiedlichen Wirkungen beim Nachweis von Vorhandensein, bzw. Nichtvorhandensein von Protein notwendige pH-Wert dürfte mittels des in der vorliegenden Erfindung verwendeten Puffers innerhalb des pH-Bereichs aufrechterhalten werden können.
- Es ist beispielsweise denkbar, dass Farbstoffe wie Bromchlorphenolblau (3',3''-Dibrom-5',5''-Dichlorphenolsulfonephthalein), Bromphenolblau (Tetrabromphenolblau), Fuchsin (Basic Red 9), Kristallviolett 14, Martius- Gelb (Acid Yellow 24), Phloxin B (Acid Red 92), Methylgelb (Solvent Yellow 2), Kongo-Rot (Direct Red 28), Methyl-Orange (Acid Orange 52), und Ethyl-Orange(4-(4-Diethylaminophenylazo)benzensulfonsäure) für die vorliegende Erfindung geeignet sein können. Solche Farbstoffe können in Kombination mit Farbstoffen wie Phenolsulfonephthaleinen und Pyrogallol-Rot verwendet werden.
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- Struktur H stellt die Struktur eines Phenolsulfonephthalein-Derivats in protischen Lösungsmitteln wie Wasser oder einem Alkohol dar, während Struktur I die in trockenem Zustand oder aprotischen Lösungsmitteln vorherrschende Form wie diejenige von Äthern und Azetonitrilen darstellt. Die Phenolsulfonephthalein-„Protein-Error"-Indikatoren sind pH-Indikatoren, die ein ionisierbares Proton mit einem pKa-Wert enthalten, der bei bestimmten pH-Werten die Ionisierung des Protons verhindert, außer wenn Protein vorhanden ist.
- Der pKa-Wert eines gängigen Phenolsulfonephthalein-Indikators, wie er unten als Struktur J dargestellt wird, ist der pH-Wert, bei dem die Hälfte der Indikator-Moleküle die deprotonierte phenolische Hydroxylgruppe des C-Rings tragen. Im Fall des oben gezeigten Phenolsulfonephthalein-Protein-Error-Indikators finden zwei Deprotonierungen statt, was zu einer sichtbaren Farbveränderung führt. Bei der ersten Deprotonierung wird das Proton von der Arylsulfonsäure im A-Ring abgespalten und liefert so das Ion, wie dies unten in Struktur J dargestellt ist.
- Der pKa-Wert dieses Protons ist kleiner als 1, was bei allen geeigneten pH-Werten zur Ionisierung dieser Komponente führt. Diese ionisierbare Gruppe ist zudem verantwortlich für die Wasserlöslichkeit dieser Verbindungen. Bei der zweiten Deprotonierung wird ein Proton vom phenolischen Hydroxyl des C-Rings abgespalten und liefert so das Dianion, wie unten in Struktur K und L dargestellt.
- Bei dieser Art von Protein-Error-Indikator verursacht die zweite Deprotonierung die beobachtbare Farbveränderung, die das Vorhandensein von Protein in der untersuchten Probe anzeigt. Um eine Umgebung mit konstantem pH-Wert herzustellen, wird der Phenolsulfonephthalein-Protein-Error-Indikator üblicherweise zusammen mit einem Puffer auf ein saugfähiges Matrixmaterial aufgebracht, sodass sich die Farbveränderung zuverlässig auf das Vorhandensein von Protein zurückführen lässt, da ausgeschlossen werden kann, dass sie durch eine Veränderung des pH-Wertes bei Kontakt mit der Testlösung zustande gekommen ist.
- Nur Phenolsulfonephthalein-Protein-Error-Indikatoren mit einem zweiten pKa-Wert, der bei Vorhandensein von Protein das Stattfinden einer zweiten Deprotonierung bei einem pH-Wert im Bereich von ca. 2,0 bis ca. 3,0 gestattet, sind für die vorliegende Erfindung geeignet. Phenolsulfonephthalein-Protein-Error-Indikatoren mit einem zweiten pKa-Wert, der bei Nichtvorhandensein von Protein das Stattfinden der zweiten Deprotonierung außerhalb des beibehaltenen pH-Wertes gestattet, können für die Erfindung geeignet sein. Der zweite pKa-Wert findet sich vorzugsweise bei Nichtvorhandensein von Protein bei einem pH-Wert, der nicht innerhalb des Bereichs von ca. 2,4 bis ca. 3,0 liegt, am wünschenswertesten bei einem pH-Wert von über 3,0. Es ist denkbar, dass eine für das Vorhandensein von Protein empfindliche Ionisierung, die zudem eine nachweisbare Anzeige (z. B. in Form einer Farbveränderung) liefert, eine erste, zweite, usw. Deprotonierung mit einem anderen Sortiment ionisierbarer Substituenten sein kann. Viele Phenolsulfonephthalein-Protein-Error-Indikatoren haben ihren zweiten pKa-Wert in dem geeigneten Bereich und sind daher für die Verwendung in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung geeignet. Zu den geeigneten Phenolsulfonephthaleinen zählen auch solche, die mit Elektronen entziehenden und/oder Elektronen abgebenden Gruppen wie Amino-, Amido-, aromatischen, Alkyl-, Hydroxyl-, Thio-, Karboxyl-, Alkoxyl-, Ketoxyl-, Azetyl-, Halogen-, Nitro- und Cyangruppen in den A-, B- oder C-Ringen der Strukturen J und L substituiert werden. Es ist denkbar, dass einer oder mehrere Ringe noch ein Wasserstoffatom enthalten. Der bzw. die besonderen Substituenten und ihre Positionen im Farbstoffatom sind unbedenklich, solange der Endfarbstoff einen pKa-Wert in dem geeigneten Bereich aufweist und die erwünschten physikalischen Eigenschaften wie Löslichkeit, Proteinaffinität und Farbe behält.
- Nichtsubstituierte Phenolsulfonephthaleine sind nicht verwendbar, da ihre pKa-Werte nicht in dem geeigneten Bereich liegen. Es wurde festgestellt, dass die octasubstituierten Sulfonephthalein-Indikatoren, d. h. solche Phenolsulfonephthalein-Derivative, die in den Positionen 3', 3'', 5', 5'', 3, 4, 5 und 6 substituiert werden, sich für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung besonders gut eignen. Diese Indikatoren werden vorzugsweise mit Halogen- und Nitrogruppen substituiert und lassen sich als Struktur M darstellen: wobei: X für Nitro und Y und Z für Chlor, Brom oder Jod stehen. Ebenfalls verwendbar sind die nitrosubstituierten polyhalogenierten Phenolsulfonephthaleine, die in der
U. S.- Patentschrift Nr. 5,279,790 offenbart werden, wobei Y Nitro und X und Z Chlor, Brom oder Jod darstellen. Diese Indikatoren sollen die Fähigkeit besitzen, in einer flüssigen Probe Protein von ca. 2 bis 500 mg/dl nachzuweisen. Dennoch wäre das Analyseanordnungssystem gemäß vorliegender Erfindung in Situationen vorzuziehen, in denen eine Proteinurie von mehr als 30 mg/dl gemessen und gleichzeitig eine Mikroalbuminurie von 2 mg/dl nicht gemessen wird. - Beispielsweise ist es im Fall der Diagnostik von Nierenerkrankungen bei Kindern nicht wünschenswert, Mikroalbumin zu messen, da das Ergebnis aufgrund seiner schwankenden Natur eine Erkrankung vortäuschen kann. Offensichtlich können die aromatischen Ringe der für die vorliegende Erfindung geeigneten Phenolsulfonephthalein-Indikatoren vielfältige Substituentengruppen tragen. Eine Begrenzung solcher Substituen tengruppen ergibt sich nur in Abhängigkeit von dem Vermögen eines Durchschnittsfachmanns, stabile Verbindungen mit den angestrebten Eigenschaften eines Protein-Error-Indikators zu bilden, um sie für die vorliegende Erfindung geeignet zu machen.
- Einige spezifische Beispiele für Phenolsulfonephthalein-Farbstoffe sind solche, die in den Positionen 5', 5'' mit Nitro und in den Positionen 3', 3'', 3, 4, 5 und 6 mit Chlor, Brom oder Jod substituiert werden. Zu den verwendbaren Phenolsulfonephthalein-Farbstoffen zählen etwa 5,5''-Dinitro-3',3'',3,4,5,6-Hexabromophenolsulfonephthalein oder 5'-Nitro-5''-Iodo-3',3'',3,4,5,6-Hexabromophenolsulfonephthalein. Wie oben erörtert, ist einer der verwendbaren Farbstoffe Pyrogallol-Rot. Pyrogallol-Rot wird gewöhnlich ein Molybdat- oder Wolframatsalz zugesetzt, die eine kräftige Färbung fördern. Die
U. S.-Patentschrift Nr. 5,399, 498 offenbart, dass bei der Reaktion von Wolframat mit dem Indikator ein Komplex entsteht, dessen Farbe sich bei Vorhandensein von Protein in ähnlicher Weise verschiebt wie bei Molybdän. DieU. S.- Patentschrift Nr. 5,399,498 offenbart außerdem die Möglichkeit der Verwendung von Phytinsäure oder deren Derivaten, um die Hintergrundinterferenz bei dieser Art von Analyseanordnung zu reduzieren. Während diese Analyse zum Nachweis geringer Proteinmengen in Proben mit flüssiger Testlösung wie etwa Urin gut geeignet ist, fällt ihre Auflösung bei höheren Proteinkonzentrationen dramatisch ab, insbesondere bei solchen, die über ca. 150 mg/dl liegen. Es handelt sich bei diesem Verfahren um eine Methode zur Bestimmung des Gesamtproteins, da das Ergebnis nicht von der in der Probe vorhandenen Proteinart abhängt. Menschliches Serumalbumin liefert somit bei einer Konzentration von 15 mg/dl dasselbe Ergebnis wie IgG bei 15 mg/dl. Da Verfahren zur Bestimmung des Gesamtproteins bei der Erkennung bestimmter Krankheitsbilder von Nutzen sind und die potentielle Erkrankung um so ernster ist, je höher der Überschuss an Gesamtprotein im Urin liegt, ist ein Verfahren zur Bestimmung des Gesamtproteins wünschenswert, das auch bei hohen Proteinkonzentrationen eine nachweisbare Reaktion liefert. Das Molybdat/Wolframat-Verfahren ist jedoch – aufgrund der starken Affinität des Farbstoffs zu Protein – für die Bestimmung hoher Proteinspiegel, d. h. über ca. 150 mg/dl, ungeeignet. - Weitere mögliche Komponenten
- Das Analysegerät bzw. die Analysekomponente kann eine beliebige Anzahl von oberflächenaktiven Substanzen, Detergentien, Backgroundfarbstoffen, Enhancer-Polymeren oder Chelatbildnern enthalten, die als geeignet für Proteinnachweisverfahren, die auf dem Binden von Farbstoffen basieren, bekannt sind. In diesen Analysegeräten bzw. -komponenten befindet sich gewöhnlich ein protisches Lösungsmittel, z. B. eine Wasser/Methanolmischung in den in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen. Die Lösung enthält gewöhnlich einen Chelatbildner, z. B. Phytin- und/oder Oxalsäure, um eine Interferenz durch andere Komponenten in der Urin-Testprobe zu verhindern oder dieser vorzubeugen. Die bei dem Papier-Eintauchverfahren verwendeten Säuren können durch Hinzufügen von Natriumhydroxid oder dergleichen auf einen pH-Wert im Bereich von vorzugsweise ca. 2,4 bis ca. 3 eingestellt werden. TABELLE 1 Optionale Komponenten
Inhaltsstoff Funktion Verwendete Konzentration Allgemeiner Bereich Wasser Lösungsmittel 95 ml - Methanol Lösungsmittel 5 ml 0–40 ml Phytinsäure Chelat 1 g (15 mM) 0–500 mM Oxalsäure Chelat 0,11 g (12 mM) 0–40 mM - BEISPIELE
- Ein Beispiel für die Ausformung eines trocken arbeitenden Gerätes, wie etwa eines Diagnosestreifens, schließt das Eintauchen eines Materials wie Papier in eine wässrige Lösung ein. Der Diagnosestreifen kann aus unterschiedlichen Materialien bestehen, wird aber gewöhnlich aus Papier hergestellt, das auf einem Kunststoffträger befestigt wird. Ein Beispiel für ein geeignetes Papier ist Ahlstrom 204. Es ist denkbar, dass die Streifen auch aus anderen Stoffen wie etwa natürlichen oder synthetischen Web- oder Vliesstoffen bestehen können. Gemäß einer Ausführungsform wurde eine erste wässrige Lösung durch das Zusammenbringen von drei Untermischungskomponenten („Submixes 1–3") hergestellt. Für Submix 1 vermischte man 10 ml Methanol, 1,76 ml 125 mM TRIS ((Tris(hydroxymethyl)aminomethan)/Methanol) und 44,0 mg Pyrogallol-Rot. Diese Komponenten wurden ca. 20 bis ca. 30 Minuten lang miteinander vermischt, um Submix 1 herzustellen. Für die Herstellung von Submix 2 wurden 4,10 g (3,20 ml) 40%iger Phytinsäure, 8,00 ml 5%iger wässriger PVA (Polyvinylalkohol)) mit 31–50 K, 11,2 ml IN NaOH und 0,654 ml Natriummolybdat (100 mg/ml) und 45,6 ml Wasser miteinander vermischt. Das NaOH wurde hinzugefügt, um den pH-Wert auf annähernd 2,3 einzustellen. Diese Komponenten vermischte man ca. 60 Minuten lang miteinander, um Submix 2 herzustellen. Um Submix 3 herzustellen, wurden 217, 5 mg Dinatriumoxalat, 120,0 ml L-Zitrullin (500 mM) mit einem pH-Wert von 2,5 und 100,0 mg Cibacron-Brilliantgelb miteinander vermischt. Die Komponenten wurden ca. 30 Minuten miteinander vermischt, um Submix 3 herzustellen.
- Submix 1 und Submix 2 wurden ca. 10 Minuten miteinander vermischt, dann wurde Submix 3 hinzugefügt. Der pH-Wert lag bei 2,6 und die gemischten Submixe 1–3 wurden für vier Stunden stabilisiert und volumenmäßig abgestimmt. Die Submixe 1–3 bildeten eine erste Tauchlösung von ca. 200 ml. Das Papier wurde in die erste Tauchlösung eingetaucht und in einem Dreistufen-Trockenschrank bei 50/50/70°C mit einem 1-Zoll-Luftstrom getrocknet. Das verwendete Papier war Papier vom Typ „Ahlstrom 204".
- Danach wurde das Papier in eine zweite Tauchlösung von 160 ml getaucht. Die zweite Tauchlösung bestand aus einer Mischung aus 144 ml Toluol, 16 ml Tetrahydrofuran (stabilisiert), 0,48 g KOK (einem Polypropylenglykolkarbonat) – wie in der
U. S.- Patentschrift Nr. 5,424,215 offenbart – und 36,57 mg DNHB (5,5''Dinitro-3',3'',3,4,5,6-Hexabromophenolsulfonephthalein). Das Papier wurde in einem Dreistufen-Trockenschrank bei 50°/50°/50°C mit einem 1-Zoll-Luftstrom getrocknet, um das aktive Kissen für die Diagnosestreifen fertig zu stellen. Die Diagnosestreifen bestehen aus einem Polymerstreifen und dem darauf aufgeklebten aktiven Kissen.
Claims (27)
- Verfahren zur Bestimmung von Protein in einer wässrigen Testlösung, das darauf beruht, die Testlösung mit (a) einem Puffer, für den Zitrullin, Cyanessigsäure, Methylphosphonsäure, Saccharin oder Kombinationen dieser Substanzen zur Wahl stehen, wobei der Puffer in ausreichender Menge hinzugefügt wird, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung in einem gewählten pH-Wert-Sollbereich innerhalb eines Bereichs von 2,0 bis 3,0 aufrecht zu erhalten, und (b) einem Farbstoff mit einem pKa-Wert, der ihm die Fähigkeit verleiht, innerhalb des pH-Wert-Sollbereichs als Proteinindikator zu fungieren, und einer Proteinaffinität, die bei einem Vorhandensein von mehr als 15 mg/dl Protein eine nachweisbare Reaktion ermöglicht, wodurch die Analyseanordnung geeignet für die Bestimmung des Gesamtproteins in der Testlösung wird, zu kombinieren.
- Verfahren nach Anspruch 1, bei dem als Puffer Cyanessigsäure, Methylphosphonsäure, Saccharin oder Kombinationen dieser Substanzen zur Wahl stehen.
- Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Puffer in ausreichender Menge hinzugefügt wird, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung innerhalb eines Bereichs von 2,4 bis 3,0 aufrecht zu erhalten.
- Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Farbstoff ein substituiertes Phenolsulfonephthalein, Pyrogallol-Rot oder Kombinationen von beiden ist.
- Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Farbstoff ein substituiertes Phenolsulfonephthalein ist, wobei das substituierte Phenolsulfonephthalein mit Amino-, Amido-, aromatischen, Alkyl-, Hydroxyl-, Thio-, Karboxyl-, Alkoxyl-, Keto xyl-, Azetyl-, Halogen-, Nitro- oder Cyangruppen oder Kombinationen dieser Substanzen octasubstituiert ist.
- Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Farbstoff ein substituiertes Phenolsulfonephthalein ist, wobei das substituierte Phenolsulfonephthalein an den Positionen 5', 5'' mit Nitro und an den Positionen 3', 3'', 3, 4, 5 und 6 mit Chlor, Brom oder Jod substituiert ist.
- Das Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Farbstoff ein substituiertes Phenolsulfonephthalein ist, wobei das substituierte Phenolsulfonephthalein 5,5''-Dinitro-3',3'',3,4,5, 6-Hexabromophenolsulfonephthalein oder 5'-Nitro-5''-Iodo-3',3'',3,4,5,6-Hexabromophenolsulfonephthalein ist.
- Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Farbstoff Pyrogallol-Rot ist und das außerdem das Kombinieren der Testlösung mit einem Molybdat- oder Wolframatsalz beinhaltet.
- Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein Teststreifen aus saugfähigem Material mit dem Puffer und dem Farbstoff getränkt wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das nachweisbare Ergebnis eine gute Auflösung bei Proteinkonzentrationen zwischen 15 und 300 mg/dl bietet.
- Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Farbstoff bei Vorhandensein von Protein bei einem pH-Wert von 2,0 bis 3,0 als Farbindikator fungiert.
- Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der Farbstoff bei Vorhandensein von Protein bei einem pH-Wert im Bereich von 2,4 bis 3,0 als Farbindikator fungiert.
- Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Puffer den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung auf einem pH-Sollwert plus/minus ca. 0,2 pH-Einheiten hält.
- Verfahren nach Anspruch 1, das beinhaltet, dass die Testlösung mit (a) einem Puffer, für den Zitrullin, Cyanessigsäure, Methylphosphonsäure, Saccharin oder Kombinationen dieser Substanzen zur Wahl stehen, wobei der Puffer in ausreichender Menge hinzugefügt wird, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung auf einem pH-Wert +/– 0,2 pH-Einheiten innerhalb eines zwischen 2,0 und 3,0 gewählten pH-Bereichs aufrecht zu erhalten, und (b) einem Farbstoff mit einem pKa-Wert, der ihm die Fähigkeit verleiht, im pH-Sollbereich bei Vorhandensein von Protein als Farbindikator zu fungieren, und einer Proteinaffinität, die bei einem Vorhandensein von mehr als 15 mg/dl bis 500 mg/dl Protein eine nachweisbare Reaktion ermöglicht, wodurch die Analyse geeignet für die Bestimmung des Gesamtproteins in der Testlösung wird, zu kombinieren.
- Ein trocken arbeitendes Gerät, das den Proteinspiegel in einer flüssigen Testprobe mittels eines saugfähigen Materials bestimmt, das getränkt ist mit (a) einem Puffer, für den Zitrullin, Cyanessigsäure, Methylphosphonsäure, Saccharin oder Kombinationen dieser Substanzen zur Wahl stehen, wobei der Puffer in ausreichender Menge hinzugefügt wird, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung innerhalb eines gewählten pH-Sollbereichs im Bereich zwischen 2,0 und 3,0 aufrecht zu erhalten, und (b) einem Farbstoff mit einem pKa-Wert, der ihm die Fähigkeit verleiht, im pH-Sollbereich als Farbindikator zu fungieren, und einer Proteinaffinität, die bei Vorhandensein von mehr als 15 mg/dl Protein bei Kontakt zwischen dem Gerät und der flüssigen Testprobe eine nachweisbare Reaktion ermöglicht, wodurch das Gerät geeignet für die Bestimmung des Gesamtproteins in der flüssigen Testprobe wird.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 15, bei dem als Puffer Cyanessigsäure, Methylphosphonsäure, Saccharin oder Kombinationen dieser Substanzen zur Wahl stehen.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 15, bei dem der Puffer in ausreichender Menge hinzugefügt wird, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung innerhalb eines Bereichs von 2,4 bis 3,0 aufrecht zu erhalten.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 15, bei dem der Farbstoff ein substituiertes Phenolsulfonephthalein, Pyrogallol-Rot oder eine Kombination von beiden ist.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 18, bei dem der Farbstoff ein substituiertes Phenolsulfonephthalein ist, wobei das substituierte Phenolsulfonephthalein mit Amino-, Amido-, aromatischen, Alkyl-, Hydroxyl-, Thio-, Karboxyl-, Alkoxyl-, Ketoxy-, Azetyl-, Halogen-, Nitro-, Cyangruppen oder Kombinationen von diesen octasubstituiert ist.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 18, bei dem der Farbstoff ein substituiertes Phenolsulfonephthalein ist, wobei das substituierte Phenolsulfonephthalein an den Positionen 5', 5'' mit Nitro und an den Positionen 3', 3'', 3, 4, 5 und 6 mit Chlor, Brom oder Jod substituiert ist.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 18, bei dem der Farbstoff ein substituiertes Phenolsulfonephthalein ist, wobei das substituierte Phenolsulfonephthalein 5,5''-Dinitro-3',3'',3,4,5,6-Hexabromophenolsulfonephthalein oder 5'-Nitro-5''-Iodo-3',3'',3,4,5,6,-Hexabromophenolsulfonephthalein ist.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 15, bei dem der Farbstoff Pyrogallol-Rot ist und das außerdem das Kombinieren der Testlösung mit einem Molybdat- oder Wolframatsalz beinhaltet.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 15, bei dem das nachweisbare Ergebnis eine gute Auflösung bei Proteinkonzentrationen zwischen 15 und 300 mg/dl bietet.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 15, bei dem der Farbstoff bei Vorhandensein von Protein bei einem pH-Wert innerhalb des Bereichs zwischen 2,0 und 3,0 als Farbindikator fungiert.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 24, bei dem der Farbstoff bei Vorhandensein von Protein bei einem pH-Wert innerhalb des Bereichs zwischen 2,4 und 3,0 als Farbindikator fungiert.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 15, bei dem der Puffer den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung auf einem pH-Sollwert plus/minus ca. 0,2 pH-Einheiten hält.
- Trocken arbeitendes Gerät nach Anspruch 15, das ein saugfähiges Material enthält, das getränkt ist mit (a) einem Puffer, für den Zitrullin, Cyanessigsäure, Methylphosphonsäure, Saccharin oder Kombinationen dieser Substanzen zur Wahl stehen, wobei der Puffer in ausreichender Menge hinzugefügt wird, um den pH-Wert der die Testlösung enthaltenden Analyseanordnung innerhalb eines Bereichs von +/– 0,2 pH-Einheiten eines zwischen 2,0 und 3,0 gewählten pH-Wert-Sollbereichs aufrecht zu erhalten, und (b) einem Farbstoff mit einem pKa-Wert, der ihm die Fähigkeit verleiht, im pH-Sollbereich bei Vorhandensein von Protein als Farbindikator zu fungieren, und einer Proteinaffinität, die bei einem Vorhandensein von mehr als 15 bis 500 mg/dl Protein bei Kontakt zwischen dem Gerät und der flüssigen Testprobe eine nachweisbare Reaktion ermöglicht, wodurch das Gerät geeignet für die Bestimmung des Gesamtproteins in der flüssigen Testprobe wird.
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