JP5542888B2 - 蛋白質濃度評価方法、分析用具、及び分析装置 - Google Patents
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Description
前記試料と蛋白質指示薬とを接触させた後の呈色を光学分析すること、
前記試料のpHを測定すること、並びに、
前記光学分析の結果及び前記測定されたpHと、蛋白質濃度評価用データとに基づいて前記試料の蛋白質濃度を評価することを含み、
前記蛋白質指示薬は、pH及び蛋白質濃度によって発色が変化する蛋白質指示薬であり、
前記蛋白質濃度評価用データは、前記測定されたpHに対応した前記光学分析結果の評価の仕方を示す情報を含む、蛋白質濃度評価方法に関する。
本明細書において「蛋白質指示薬」とは、pH及び蛋白質濃度によって発色が変化するものをいう。前記蛋白質指示薬は、一又は複数の実施形態において、溶液中の蛋白質と接触すると色遷移を呈し、前記溶液中の蛋白質の存在の検出及び/又は濃度の測定を可能とするものいう。前記蛋白質指示薬としては、pHの変化に応じて色が変化するものが多く知られている。本明細書においても、特に言及がない場合、前記蛋白質指示薬は、pHの変化に応じて色が変化しうるものをいう。前記蛋白質指示薬としては、従来公知の及び/又は今後開発されるものが使用でき、例えば、特許文献1等に開示されるものが使用でき、オクタハロスルホフタレイン型色素、オクタハロフェノールフタレイン型色素、又はそれらの組み合わせが挙げられる。より具体的には、前記蛋白質指示薬としては、テトラブロモフェノールブルー、テトラクロロフェノールブルー、3′,3″,5,5″−テトラヨード−3,4,5,6−テトラブロモフェノールスルホフタレイン、3,3″−ジヨード−5,5″,3,4,5,6−ヘキサブロモフェノールスルホフタレイン、メチルイエロー(4−ジメチルアミノアゾベンゼン)及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものが挙げられる。これらの中でも、感度及び/又は精度の観点から、テトラブロモフェノールブルーが好ましい。
前記蛋白質指示薬を使用した蛋白質濃度の測定方法では、通常、pHを一定に維持するため、評価対象試料と混合させる際に緩衝剤が使用されることが多い。本開示の評価方法における前記蛋白指示薬と評価対象試料との接触時においても、緩衝剤を使用してもよい。緩衝剤としては、従来と同様のものを使用でき、維持させたいpHに応じて適宜選択できる。具体例としては、例えば、クエン酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、酒石酸、グリシン、及びリンゴ酸が挙げられ、これらの中でも、蛋白質指示薬を使用した蛋白質濃度評価の精度向上の観点から、リンゴ酸が好ましい。前記緩衝剤の使用量としては、評価対象試料1mLに対して0.01mg〜1mgとすることが一般的であり、蛋白質指示薬を使用した蛋白質濃度評価の精度向上及び経済性の観点から、評価対象試料1mLに対して0.02mg〜0.5mgが好ましい。なお、後述するとおり、評価対象試料のpH測定は、蛋白質指示薬を使用した蛋白質濃度評価の精度向上の観点から、前記蛋白指示薬と評価対象試料との接触時におけるバッファー条件と同様のバッファー条件下で行うことが好ましい。
本開示の評価方法は、評価対象試料のpHを測定すること含む。評価対象試料のpHの測定方法は特に制限されず、公知の方法を採用しうる。例えば、pH指示薬を用いた方法でもよく、或いは、pHメーターを用いた方法でもよい。前記pH測定は、蛋白質指示薬を使用した蛋白質濃度評価の精度向上の観点から、前記蛋白質指示薬と評価対象試料との接触時のバッファー条件と同じバッファー条件下で行われることが好ましい。例えば、前記蛋白質指示薬と評価対象試料との接触に際して緩衝剤を添加する場合には、pH測定の際にも評価対象試料に同じ緩衝剤を同じ濃度となるように添加することが好ましい。なお、特に言及しない限り、本明細書におけるpHは、25℃におけるpHをいう。
評価対象試料のpHをpH指示薬を用いて行う場合、前記pH指示薬は、蛋白質指示薬を使用した蛋白質濃度評価の精度向上の観点から、溶液中の蛋白質濃度に影響されにくいpH指示薬であることが好ましい。そのようなpH指示薬としては、これに限定されないが、エチルオレンジ(ethyl orange)が好ましい。
本明細書において「蛋白質濃度の評価」とは、評価対象試料の蛋白質濃度の評価であって、例えば、評価対象試料の蛋白質濃度を具体的に決定すること(例えば、評価対象試料の蛋白質濃度はxxμg/mLである、と評価すること)、評価対象試料の蛋白質濃度を有る範囲内であると決定すること(例えば、評価対象試料の蛋白質濃度はxx〜yyμg/mLである、と評価すること)、評価対象試料の蛋白質濃度が所定の閾値を超えるか否か決定すること(例えば、評価対象試料の蛋白質濃度は閾値xxμg/mL以上(未満)である、と評価すること)、或いは、評価対象試料の蛋白質濃度が所定の基準値に基づき設定された陽性と陰性のいずれかに該当するか決定すること(例えば、評価対象試料は陽性(陰性)である、と評価すること)を含み、これらに限定されない。
本明細書において「蛋白質濃度評価用データ」とは、試料のpHに応じた、蛋白質濃度の評価の仕方を示す情報を含むデータである。評価の仕方には、評価方法や評価基準が含まれる。評価方法は、例えば、測定値を光学分析の評価値又は濃度値に変換する式やその係数を示すデータで表すことができる。評価基準は、例えば、評価の基準となる、測定値若しくは濃度値の範囲又は閾値を示すデータにより表すことができる。蛋白質濃度評価用データには、蛋白質指示薬の光学分析結果、又は当該光学分析結果から得られる蛋白質濃度の評価を、測定対象溶液のpHに基づいて修正するためのデータが含まれる。すなわち、測定対象試料のpHによっては実際の蛋白質濃度とは誤差のある呈色をしてしまう蛋白質指示薬の分析結果をpHに基づいて修正するのに、蛋白質濃度評価用データを用いることができる。蛋白質濃度評価用データの一実施形態として、所定のpH範囲ごとに、蛋白質指示薬により得られた光学分析の結果の校正方法や評価基準など設定されているデータが挙げられる。例えば、光学分析の結果として得られた値(例えば、試料と接触した蛋白質指示薬の吸光度等)を前記試料の蛋白質濃度又はその評価値に変換するのに用いられる値(例えば、変換係数等)であって、所定のpH範囲ごとに設定された値を、蛋白質濃度評価用データに含めることができる。このような蛋白質濃度評価用データは、予め作成しておくことができる。
本開示の評価方法の評価対象試料としては、特に制限されず、生体試料、生化学試料、環境試料等が挙げられる。前記生体試料としては、体液、尿、血液、唾液等があげられる。
本開示の評価方法において、測定対象試料と蛋白質指示薬との接触と、測定対象試料のpH指示薬を用いたpH測定とは、上述のとおり、ともに、試薬ストリップ上の試薬層にて行うことができる。したがって、本開示は、その他の態様において、基板上に、蛋白質指示薬を含む試薬層及びpH指示薬を含む試薬層を備える分析用具(以下、「本開示の分析用具」ともいう。)に関する。本開示の分析用具を用いて、本開示の評価方法を行うことができる。
本開示は、また、その他の態様において、本開示の評価方法を行い得る分析装置(以下、「本開示の分析装置」ともいう)に関する。本開示の分析装置の一実施態様として、
試料と蛋白質指示薬とを接触させた後の呈色を光学分析する測定部と、
前記試料のpHを測定する測定部と、
前記光学分析の結果及び前記測定されたpHと、蛋白質濃度評価用データとに基づいて前記試料の蛋白質濃度を評価する評価部と、
評価後のデータを出力する出力部とを備え、
前記蛋白質指示薬は、pH及び蛋白質濃度によって発色が変化する蛋白質指示薬であり、
前記蛋白質濃度評価用データは、前記測定されたpH値に対応した前記光学分析結果の評価の仕方を示す情報を含む、分析装置が挙げられる。
図2に示す例では、蛋白質指示薬の測定部211とpHの測定部212は1つの測定部として構成されている。この場合、測定部21は、例えば、図1に示すような分析用具の各試薬層2の透過光又は散乱光を検出することで、吸光度、反射率又は透過率等を測定する。例えば、蛋白質指示薬を含む試薬層とpH指示薬を含む試薬層に、それぞれ試料を滴下し、これらの吸光度を測定することにより、試料を接触させた蛋白質指示薬及び、試料のpHを測定することができる。また、蛋白質指示薬とpH指示薬が1つの試薬層に含まれている場合、測定部21は、1つの試薬層の透過光又は散乱光を基に、蛋白質指示薬に対応する波長(又は帯域)及び、pH指示薬に対応する波長(又は帯域)それぞれについて、吸光度、透過率又は反射率を測定することができる。このように、1つの試薬層について、蛋白指示薬及びpH指示薬それぞれに対応する波長又は帯域の光を光学分析することにより、試料の蛋白質及び試料のpHに関する情報を得ることができる。
評価部22における、蛋白質濃度評価用データを使用した評価の方法は、本開示の評価方法で説明したように行われうる。一実施形態として、前記蛋白質濃度評価用データが、前記光学分析結果から前記試料の蛋白質濃度を算出する際に用いられる算出用データであって、前記試料のpHに応じて設定された算出用データを含み(例えば、上記表1参照)、前記評価部が、前記測定されたpH値及び前記光学分析結果を用いて、前記算出用データに基づき試料の蛋白質濃度を算出することができる。評価部は、例えば、前記試料のpHがいずれのpH範囲に属するかを判断し、試料のpHの属する範囲に対応する補正係数を算出用データとして取得することができる。この場合、評価部は、補正係数又は当該補正係数を含む式を用いて、光学分析結果から得られる蛋白質濃度を修正することができる。これにより、試料のpHによる光学分析結果の変動を考慮した、より正確な蛋白質濃度の評価が可能になる。
図3は、図2に示す分析装置20の変形例の構成を表す機能ブロック図である。図3に示す分析装置20aでは、蛋白質指示薬の測定部211と、pH測定部212が、それぞれ独立して設けられる。図3に示す例では、測定部211は、図2に示す分析装置20の測定部211と同様に光学分析により呈色を測定する測定器とし、測定部212は、pHメーターとすることができる。このように、蛋白質指示薬の測定系と試料のpHの測定系を別個に設けることにより、pH測定の信頼性を向上させることができる。測定部212のpHメーターとしては、例えば、ガラス電極と比較電極を備えたガラス電極法を用いたpH測定器が挙げられるが、pHメーターの構造は、特に限定されない。
図4は、図2又は図3に示す上記分析装置20、又は20a(以下、単に分析装置と称する)の動作例を示すフローチャートである。図4に示す例では、まず、分析装置のプロセッサが測定部211を制御し、試料と蛋白質指示薬を接触させる(S0)。測定部211は、試料と接触した蛋白質指示薬の呈色を光学分析により測定する(S1)。例えば、測定部211は、図1に示した分析用具の蛋白質指示薬を含む試薬層に試料を滴下することで接触させることができる。この場合測定部211は、試薬層の吸光度、反射率又は透過率を測定することで、試料と接触した蛋白質指示薬の呈色を光学分析することができる。測定部211による光学分析結果(例えば、吸光度等)は、評価部22に送信される。
図6は、分析装置20の具体例である尿分析装置を採用した全自動尿化学分析装置の外観斜視図である。図6に示す全自動尿化学分析装置は、本体部61、試験紙供給部62、試料供給部63、及びボトルユニット64を備えている。本体部61には、表示部65、操作部66、及びプリンタ部67が設けられている。
蛋白質指示薬としてテトラブロモフェノールブルーを用い、下記12種類のBSA溶液を作成した。これらのBSA溶液の吸光度(620nm)を分光光度計(日本分光社製)で測定した。その結果を下記表5に示す。
pHの調整は、NaOH(5規定)を用いて調整した。また、pHは、測定対象が25℃の状態で、pHメータ(堀場製作所製、商品名:F23)を用いて測定した。以下の実施例・比較例でも同様である。
0.1M リンゴ酸(pH3.7/4.1/4.5)
1.5mg/dL テトラブロモフェノールブルー(ナカライテスク社製)
BSA(ウシ血清アルブミン、シグマアルドリッチ社製)(0/10/25/50 mg/dL)
表5に示されたテトラブロモフェノールブルーの吸光度のみに基づいた下記の評価用データに従って、表5に示されたBSA溶液の蛋白質濃度につき、陽性か陰性かを評価した。なお、前記評価が陽性とは、蛋白質濃度が10mg/dL以上であることと設定し、前記評価が陰性とは、蛋白質濃度が10mg/dL未満であることと設定した。その結果を下記表6に示す。
吸光度が0.54未満で陰性、0.54以上で陽性。
(「0.54」は、pH3.7、BSA 0mg/dLの溶液の吸光度と、pH3.7、BSA 10mg/dLの溶液の吸光度との中間値である。)
表5に示されたテトラブロモフェノールブルーの吸光度と、BSA溶液のpHとに基づいた下記の評価用データとに従って、表5に示されたBSA溶液の蛋白質濃度につき、陽性か陰性かを評価した。なお、比較例1と同様に、前記評価が陽性とは、蛋白質濃度が10mg/dL以上であることと設定し、前記評価が陰性とは、蛋白質濃度が10mg/dL未満であることを設定した。その結果を下記表7に示す。
pH3.7では、吸光度が0.54未満で陰性、0.54以上で陽性。
(「0.54」は、pH3.7、BSA 0mg/dLの溶液の吸光度と、pH3.7、BSA 10mg/dLの溶液の吸光度との中間値である。)
pH4.1では、吸光度が0.62未満で陰性、0.62以上で陽性。
(「0.62」は、pH4.1、BSA 0mg/dLの溶液の吸光度と、pH4.1、BSA 10mg/dLの溶液の吸光度との中間値である。)
pH4.5では、吸光度が0.70未満で陰性、0.70以上で陽性。
(「0.70」は、pH4.5、BSA 0mg/dLの溶液の吸光度と、pH4.5、BSA 10mg/dLの溶液の吸光度との中間値である。)
尿にBSAを添加して下記のBSA添加尿試料を調製した。また、リンゴ酸とテトラブロモフェノールブルーの溶液である下記の蛋白質指示薬溶液を調製した。前記BSA添加尿試料と前記蛋白質指示薬溶液とを1:1で混合し、15種類の混合試料液を調製した。この混合試料液の吸光度(620nm)を分光光度計(日本分光社製)で測定した。その結果を下記表8に示す。
尿試料にBSA(ウシ血清アルブミン、シグマアルドリッチ社製)(0/5/10/15/20 mg/dL)を添加
〔蛋白質指示薬溶液組成〕
0.2M リンゴ酸(pH3.7/4.1/4.5)
3.0mg/dL テトラブロモフェノール(ナカライテスク社製)
表8に示されたテトラブロモフェノールブルーの吸光度のみに基づいた下記の評価用データに従って、表8に示された混合試料液の蛋白質濃度につき、陽性か陰性かを評価した。なお、前記評価が陽性とは、蛋白質濃度が10mg/dL以上であることと設定し、前記評価が陰性とは、蛋白質濃度が10mg/dL未満であることを設定した。その結果を下記表9に示す。
吸光度が0.53未満で陰性、0.53以上で陽性と定義。
(「0.53」は、pH3.7、BSA 7.5mg/dLの溶液の吸光度と、pH3.7、BSA 10mg/dLの溶液の吸光度との中間値である。)
表8に示されたテトラブロモフェノールブルーの吸光度と、混合試料液のpHとに基づいた下記の評価用データに従って、表8に示された混合試料液の蛋白質濃度につき、陽性か陰性かを評価した。なお、比較例2と同様に、前記評価が陽性とは、蛋白質濃度が10mg/dL以上であることと設定し、前記評価が陰性とは、蛋白質濃度が10mg/dL未満であることを設定した。その結果を下記表10に示す。
pH3.7では、吸光度が0.53未満で陰性、0.53以上で陽性と定義。
(「0.53」は、pH3.7、BSA 7.5mg/dLの溶液の吸光度と、pH3.7、BSA 10mg/dLの溶液の吸光度との中間値である。)
pH4.1では、吸光度が0.55未満で陰性、0.55以上で陽性と定義。
(「0.55」は、pH4.1、BSA 7.5mg/dLの溶液の吸光度と、pH4.1、BSA 10mg/dLの溶液の吸光度との中間値である。)
pH4.5では、吸光度が0.59未満で陰性、0.59以上で陽性と定義。
(「0.59」は、pH4.5、BSA 7.5mg/dLの溶液の吸光度と、pH4.5、BSA 10mg/dLの溶液の吸光度との中間値である。)
尿にBSAを添加して下記のBSA添加尿試料を調製した。また、リンゴ酸とエチルオレンジの溶液である下記のpH指示薬溶液を調製した。前記BSA添加尿試料と前記pH指示薬溶液とを1:1で混合し、15種類の混合試料液を調製した。この混合試料液の吸光度(480nm)を分光光度計(日本分光社製)で測定した。その結果を図7及び下記表11に示す。
尿試料にBSA(ウシ血清アルブミン、シグマアルドリッチ社製)(0/5/10/15/20 mg/dL)を添加
〔pH指示薬溶液組成〕
0.2M リンゴ酸(pH3.7/4.1/4.5)
2.0mg/dL エチルオレンジ(東京化成工業社製)
表8(実施例2及び比較例2)に示されたテトラブロモフェノールブルーの吸光度と、pH指示薬から算出されたpH(上記表12)とに基づいた下記の評価用データに従って、表8に示された混合試料液の蛋白質濃度につき、陽性か陰性かを評価した。なお、実施例2及び比較例2と同様に、前記評価が陽性とは、蛋白質濃度が10mg/dL以上であることと設定し、前記評価が陰性とは、蛋白質濃度が10mg/dL未満であることを設定した。その結果を下記表13に示す。
pH3.6以下は要注意(酸性)と定義。
pH3.7では、0.53未満で陰性、0.53以上で陽性と定義。
pH3.8、3.9では、0.54未満で陰性、0.54以上で陽性と定義。
pH4.0、4.1では、0.55未満で陰性、0.55以上で陽性と定義。
pH4.2では、0.56未満で陰性、0.56以上で陽性と定義。
pH4.3では、0.57未満で陰性、0.57以上で陽性と定義。
pH4.4では、0.58未満で陰性、0.58以上で陽性と定義。
pH4.5では、0.59未満で陰性、0.59以上で陽性と定義。
pH4.6以上は要注意(アルカリ)と定義。
2 試薬層
3 試薬層
4 試薬層
10 分析用具
Claims (14)
- 試料の蛋白質濃度を評価する方法であって、
前記試料と蛋白質指示薬とを接触させた後の呈色を光学分析すること、
前記試料のpHを測定すること、並びに、
前記光学分析の結果及び前記測定されたpHと、蛋白質濃度評価用データとに基づいて前記試料の蛋白質濃度を評価することを含み、
前記蛋白質指示薬は、pH及び蛋白質濃度によって発色が変化する蛋白質指示薬であり、
前記蛋白質濃度評価用データは、前記測定されたpHに対応した前記光学分析結果の評価の仕方を示す情報を含む、蛋白質濃度評価方法。 - 前記試料のpH測定が、前記蛋白質指示薬と試料との接触時のバッファー条件と同じバッファー条件下で行われる、請求項1記載の蛋白質濃度評価方法。
- 前記蛋白質指示薬が、オクタハロスルホフタレイン型色素、オクタハロフェノールフタレイン型色素、又はそれらの組み合わせである、請求項1又は2に記載の蛋白質濃度評価方法。
- 前記蛋白質指示薬が、テトラブロモフェノールブルー、テトラクロロフェノールブルー、3′,3″,5,5″−テトラヨード−3,4,5,6−テトラブロモフェノールスルホフタレイン、3,3″−ジヨード−5,5″,3,4,5,6−ヘキサブロモフェノールスルホフタレイン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1から3のいずれかに記載の蛋白質濃度評価方法。
- 前記試料のpH測定が、pH指示薬を用いて行われ、前記pH指示薬が、エチルオレンジである、請求項4記載の蛋白質濃度評価方法。
- 前記蛋白質濃度評価用データは、前記光学分析結果から前記試料の蛋白質濃度を算出する際に用いられるデータであって、前記試料のpHに応じて設定されたデータを含む、請求項1から5のいずれかに記載の蛋白質濃度評価方法。
- 前記蛋白質濃度評価用データは、前記光学分析結果に基づいて評価値を算出する際に基準となるデータであって、前記試料のpHに応じて設定されたデータを含む、請求項1から6のいずれかに記載の蛋白質濃度評価方法。
- 前記蛋白質濃度評価用データは、前記測定されたpHの正常範囲を定義するデータを含む、請求項1から7のいずれかに記載の蛋白質濃度評価方法。
- 試料が尿である、請求項1から8のいずれかに記載の蛋白質濃度評価方法。
- 前記蛋白質濃度の評価は、前記試料の蛋白質濃度を決定すること、前記試料の蛋白質濃度を有る範囲内であると決定すること、前記試料の蛋白質濃度が所定の閾値を超えるか否か決定すること、及び、前記試料の蛋白質濃度が所定の基準値に基づき設定された陽性と陰性のいずれかに該当するか決定することからなる群から選択される少なくとも一つを含む、請求項1から9のいずれかに記載の蛋白質濃度評価方法。
- 基板の上に複数の試薬層が形成された分析用具であって、
pH及び蛋白質濃度によって発色が変化する蛋白質指示薬を含有する試薬層A、及び、pH指示薬を含有する試薬層Bを備え、
前記試薬層A及び前記試薬層Bは、同じバッファー条件となるように緩衝剤を含む、請求項1から10のいずれかに記載の蛋白質濃度評価方法を行うための、分析用具。 - 試料と蛋白質指示薬とを接触させた後の呈色を光学分析する測定部と、
前記試料のpHを測定する測定部と、
前記光学分析の結果及び前記測定されたpHと蛋白質濃度評価用データとに基づいて前記試料の蛋白質濃度を評価する評価部と、
評価後のデータを出力する出力部とを備え、
前記蛋白質指示薬は、pH及び蛋白質濃度によって発色が変化する蛋白質指示薬であり、
前記蛋白質濃度評価用データは、前記測定されたpHに対応した前記光学分析結果の評価の仕方を示す情報を含む、分析装置。 - 請求項1から10のいずれかに記載の蛋白質濃度評価方法を行うための、請求項12記載の分析装置。
- 請求項11に記載の分析用具を用いて分析を行うための、請求項12又は13に記載の分析装置。
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