CN104777148B - 一种快速检测牛奶中总蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于拉曼光谱的快速检测牛奶中总蛋白的方法，即：只要将牛奶稀释后与指示物溶液混合均匀，再与拉曼增强基质溶胶混合后进行拉曼光谱分析，然后根据指示物特征峰的峰高，就能方便、快速地检测牛奶中的总蛋白的含量。本发明的测定方法不但快速而且也不受其他非蛋白含氮物质的干扰；此外配合手持拉曼分析仪能实现现场和户外的实时分析。

Description

一种快速检测牛奶中总蛋白的方法
技术领域
本发明涉及的是一种食品工程技术领域的方法，具体是一种采用拉曼光谱快速检测牛奶中总蛋白的方法。
背景技术
目前我国年产超过2000多万吨的液体奶，此外还有每年超过20万吨的进口奶。牛奶是一种营养丰富的食品，含有丰富的蛋白质、矿物质、维生素和碳水化合物。蛋白质是牛奶最重要的营养成分，牛奶中的蛋白能被人体100％吸收，除主要的酪蛋白外，还含有大量对人体有益的微量蛋白。生乳中的蛋白含量可达3％，要求大于2.8％，总蛋白含量是牛奶最重要的质量指标。因此，对于牛奶的生产，需要便捷、快速、准确的总蛋白测定方法是来控制、检测牛奶中的蛋白含量。
传统的总蛋白测定方法如凯氏定氮、双缩脲、考马斯亮蓝等方法费时且不能实现在线测定，因此，迫切需要开发适用于牛奶中总蛋白的快速测定方法。近年来表面增强拉曼光谱(SERS)作为一种简单、快速、高效的分析方法已经应用于多种生物样品的检测。表面增强拉曼光谱检测属于振动光谱检测，一般不需要复杂的预处理、方便原位在线检测，而且由于水的背景干扰低，因而表面增强拉曼光谱也特别适用于液体中生物样品的检测。
但是目前的研究表明，大部分蛋白的拉曼振动光谱很弱，无法通过表面增强拉曼光谱来检测。目前一些应用表面增强拉曼光谱检测蛋白的报道都集中于一些带特定辅基的复合蛋白如血红素等，因为这些辅基具有较强的表面增强拉曼光谱振动光谱；还有一些通过开发特定蛋白的探针来用表面增强拉曼光谱光谱特定蛋白。
本发明开发了一种利用表面增强拉曼光谱，快速分析牛奶中总蛋白方法。本发明利用磷钼酸作用拉曼光谱的指示物，由于磷钼酸与蛋白有普遍的作用，因而实现了利用表面增强拉曼光谱快速检测溶液中的总蛋白。根据我们的了解，直接用表面增强拉曼光谱测总蛋白的报道还没有，特别是测定牛奶中的总蛋白。此外，经过检索国家知识产权局数据中心(www.sipo.gov.cn)、世界产权组织(www.wipo.int)、欧洲专利局(www.espacenet.com)和美国专利商标局(www.uspto.gov)也没有发现与本专利保护请求相同的公开专利或授权专利。
发明内容
本发明提供一种采用拉曼光谱快速检测牛奶中总蛋白的方法。同现有的技术相比，本方法不受其他含氮物(如三聚氰胺)的干扰，测定快速、准确。此外利用手持式拉曼光谱仪，采用本发明的方法可以方便的实现现场、户外牛奶中总蛋白含量的实时、快速、准确测定。
本发明是通过以下技术方案实现的：将牛奶稀释后与指示物溶液混合均匀，再与拉曼增强基质溶胶混合后进行拉曼光谱分析，然后根据指示物特征峰的峰高来快速、准确地获得牛奶样品中总蛋白的含量。
所述的指示物溶液是指：磷钼酸的水溶液。
所述的拉曼增强基质溶胶是指：纳米银溶胶。
所述的拉曼光谱分析条件是指：拉曼光谱扫描范围为600－1600cm-1波数范围。
所述的指示物的特征峰是指：磷钼酸的特征峰，为871cm-1。
本发明的优点是：1)采用磷钼酸为指示物，对蛋白有普遍的拉曼光谱指示作用；2)测定过程简单、快速；3)采用磷钼酸871cm-1特征分析峰，避免了其他含氮非蛋白成分(三聚氰胺、铵盐等)的干扰，实现了蛋白的特异性分析。
附图说明
下面结合附图和实例对本发明进一步说明。
图1是各种物质的拉曼和表面增强拉曼光谱；其中a是酪蛋白的普通拉曼光谱，b是酪蛋白的表面增强拉曼光谱，c是磷钼酸的拉曼光谱，d是磷钼酸的表面增强拉曼光谱，e是酪蛋白与磷钼酸预先混合后磷钼酸的表面增强拉曼光谱。
图2是预先混合不同浓度的酪蛋白对磷钼酸表面增强拉曼光谱的影响；其中插图是不同酪蛋白浓度下具体的拉曼光谱，图中直线的酪蛋白浓度与磷钼酸特征峰高的线性回归线。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。
实施例1、纳米银溶胶的制备
将200ml、0.02％的硝酸银溶液预先加热至140℃，然后快速加入2ml、1％的柠檬酸三钠水溶液，在140℃、搅拌均匀的条件下反应15分钟后，迅速冷却至室温获得所需的纳米溶胶。制备好的纳米溶胶成淡黄色，纳米溶胶在使用前放4℃避光保存。在4℃避光保存条件下，三个月内银纳米溶胶可稳定使用。
实施例2、磷钼酸可以作为表面增强拉曼光谱检测蛋白的指示物
分别配制0.15mM、0.3mM的磷钼酸(PMA)溶液；以及0.1mg/ml、0.2mg/ml的酪蛋白(Casein)溶液。取1ml，0.1mg/ml的酪蛋白溶液分别与3ml的纳米银溶胶(实施例1制备，下同)或3ml的水混合于600－1600cm－1波数范围内获取拉曼光谱，结果如图1中b、a所示；取1ml，0.15mM的磷钼酸溶液分别与3ml的纳米银溶胶或3ml的水混合于600－1600cm－1波数范围内获取拉曼光谱，结果如图1中d、c所示；取0.5ml、0.3mM的磷钼酸溶液与0.5ml、0.2mg/ml的酪蛋白溶液预先混合后，再与3ml的纳米银溶胶混合于于600－1600cm－1波数范围内获取拉曼光谱，结果如图1中e所示。
从图1中可以看出，酪蛋白无论在普通拉曼(与水混合)或表面增强拉曼(与纳米溶胶混合)下，都没有特征光谱，说明蛋白的拉曼光谱比较弱，不能直接用拉曼光谱检测。但是磷钼酸有很强的表面增强拉曼光谱，在纳米银溶胶中，在871cm－1波数有特征光谱。而且当磷钼酸和酪蛋白预先混合后，磷钼酸的特征光谱明显减弱，如图1中e所示。说明磷钼酸可以作用指示物用于表面增强拉曼光谱检测蛋白质。
实施例3、检测酪蛋白具有非常好的线性关系
首先配制1.5mM的磷钼酸(PMA)与1mg/ml的酪蛋白(Casein)标准溶液。取0.5ml的磷钼酸标准溶液分别与0.1、0.2、0.4、0.5、1ml的酪蛋白标准溶液混合，然后各自加水定容至10ml；再分别从中每组中取出1ml与3ml银纳米溶胶混合后在600－1600cm－1波数范围内获取拉曼光谱，实验结果如图2所示。
从图2中可以看出，预先混合酪蛋白的溶度越高，最终磷钼酸表面增强特征峰的峰高就越低，将溶液中预先混合的酪蛋白浓度(x，以最终拉曼分析体系中的浓度计)与对应的体系中磷钼酸特征峰高(y)作图，可以看出有很好的相关性。相关方程为y＝－72.525x+3208.3；相关系数为0.987。
实施例4、实际牛奶体系中测定准确且不受三聚氰胺的干扰
表1：本发明的方法与其他常用方法测定结果的比较
牛奶选用光明全脂牛奶，并在牛奶中添加5mM的三聚氰胺配置成含三聚氰胺牛奶。分别对这两种牛奶测定其中总蛋白的含量。测定方法采用两种，一是本发明以磷钼酸为指示物的表面增强拉曼光谱检测方法，二是常用的凯氏定氮法。
采用本发明的方法测定时，具体步骤如下：首先将牛奶样品预先稀释100倍后；然后取1ml与0.5ml的磷钼酸溶液(1.5mM)混合后加水定容至10ml；再从中取出1ml与3ml银纳米溶胶混合后在600－1600cm－1波数范围内获取拉曼光谱。根据实施例3的线性关系，以磷钼酸871cm－1的峰高计算总蛋白的含量。测定结果见表1。
从表1中可以看出，对于正常的牛奶。采用本发明的方法和其他方法获得的结果是一致的。但是在有三聚氰胺时，采用本发明的方法没有受到干扰。

Claims (3)

1.一种利用拉曼光谱快速检测牛奶中总蛋白的方法，其特征在于，将牛奶稀释后与磷钼酸的水溶液混合均匀，再与拉曼增强基质溶胶混合后进行拉曼光谱分析，然后根据磷钼酸871cm－1波数的特征峰峰高来快速、准确地获得牛奶样品中总蛋白的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的拉曼增强基质溶胶是指：纳米银溶胶。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的拉曼光谱分析条件是指：拉曼光谱扫描范围为600－1600cm－1波数范围。
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