CN104122247B - 基于分子印迹技术和拉曼光谱的糖蛋白检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的糖蛋白检测方法。该方法先利用硼亲和分子印迹聚合物专一性富集目标糖蛋白，再利用硼亲和拉曼探针标记目标糖蛋白，最后对所形成的分子印迹聚合物‑糖蛋白‑拉曼探针三明治结构复合物进行拉曼光谱检测。该方法利用硼亲和分子印迹聚合物进行识别，具有专一性好、抗干扰能力强、结合及解析速度快、稳定性高和成本低等优点。此外，该方法利用拉曼光谱进行检测，结合合适的信号增强技术具有检测灵敏度高的特点，同时还具有检测速度快和可以现场检测等优点。本发明可以对实际样品中低丰度的糖蛋白进行专一性高灵敏快速检测，尤其是临床诊断、疗效评价中的糖蛋白检测。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测领域，具体说是一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的专一、灵敏和快速的糖蛋白的检测方法及其在糖蛋白疾病标志物检测中的应用。
背景技术
糖蛋白是一类具有重要生物学功能和临床意义的蛋白质。它们在生物体内广泛存在，例如，哺乳动物体内的总蛋白的一半以上为糖蛋白。糖蛋白在生理过程中发挥着重要作用，如分子识别、免疫应答、细胞内/间信号及发育调控等。此外，糖蛋白在重大疾病的早期诊断上也具有重要意义，如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病及糖尿病等等。在美国食品药物管理局(FDA)批准的疾病标志物中绝大多数是糖蛋白，如癌胚抗原(CEA)[Mach,J.P.；Pusztasz,G.,Immunochemistry(免疫化学)1972,9,1031-1032]、甲胎蛋白(AFP)[Bellet,D.H.；Wands,J.R.；Isselbacher,K.J.；Bohuon,C.,PNAS(美国科学院院报)1984，81,3869-3873]和前列腺特异抗原(PSA)[Uchiyama,N.；Kuno,A.；Tateno,H.；Kubo,Y.；Mizuno,M.；Noguchi,M.；Hirabayashi,J.,Proteomics(蛋白质组学)2008,8,3042-3050]等。再者，人类绒毛膜促性腺激素(HCG)和促红细胞生成素(EPO)等糖蛋白兴奋剂是体育运动中的禁用物质，这些兴奋剂的快速灵敏检测也具有很强的挑战性[Lasne,F.；Geaurriz,J.de.；Nature(自然),2000,405,635；何坚刚；刘震；刘晶；窦鹏；陈洪渊，色谱，2008,28,402-407]
在现有检测糖蛋白的方法中，免疫分析是最常用的方法之一，已被广泛用于临床检测中。免疫分析是基于抗原抗体的高专一性作用，结合了诸如放射性标记[Skelley,D.S.；Brown,L.P.；Besch,P.K.,Clin.Chem.(临床化学)1973,19,146-186]，酶催化[Engvall,E.；Perlman,P.,Immunochemistry(免疫化学)1971,8,871-874]，荧光[Jolley,M.E.；Wang,C.J.；Ekenberg,S.J.,J.Immunol.(免疫化学杂志)1984,67,21-35]，化学发光[Weeks,I.,Comprehensive Analytical Chemistry,ChemiluminescenceImmunoassay(综合分析化学，化学发光免疫分析)Elsevier New York,1992,87-110.]等的检测方法。免疫分析灵敏度高，专一性好，但是该方法任然存在许多问题。如放射性免疫分析中放射性同位素的使用会影响人体的健康，酶免疫分析中酶的使用过程中容易失去催化活性，而荧光和化学发光也易受环境影响而干扰检测。
拉曼光谱是一种用于观测分子转动和振动的光谱技术。它是基于光子的非弹性散射。当结合合适的增强方法(如表面增强拉曼光谱)，可以得到非常高的灵敏度，同时又能避免常规检测方法中存在的问题。目前已经发展出基于拉曼光谱检测的免疫分析方法用于蛋白质的检测[Ni,J.；Lipert,R.J.；Dawson,G.B.；Porter,M.D.,Anal.Chem.(分析化学)，1999,71,4903-4908；Grubisha,D.S.,Lipert,R.J.；Park,H.Y.；Driskell,J.；Porter,M.D.,Anal.Chem.(分析化学)，2003,75,5936-5943]。首先，通过抗体修饰的基底选择性结合样品中的目标分子，然后通过抗体修饰的拉曼探针通过免疫夹心的形式固定在被抓取的抗体上，最后通过检测拉曼探针来定量分析目标物质。由于抗体的使用不但增加了实验的成本，也降低了方法的稳定性，而且很多目标物的抗体难以制备，都限制了其应用。
发明内容
为了克服免疫分析方法在稳定性差、成本高、易受环境影响等缺点，本发明的目的在于提供一种可应用于实际分析任务的基于分子印迹技术和拉曼光谱的快速、高灵敏度、稳定性好、专一识别糖蛋白的检测方法。
为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的检测方法用于快速、高灵敏度、专一识别糖蛋白的检测方法。该方法是先在基底表面修饰分子印迹聚合物，然后利用分子印迹聚合物富集目标糖蛋白，再利用硼亲和功能化拉曼探针标记目标糖蛋白，最后对所形成的分子印迹聚合物-糖蛋白-拉曼探针三明治结构复合物进行拉曼光谱检测。
所述目标糖蛋白通过分子印迹聚合物产生的亲和力专一性结合于基底表面。
所述分子印迹聚合物是以取代硼酸为配基的硼亲和分子印迹材料。
所述基底可以是玻璃片、纸片，也可以是其他低成本、易制备的基底。
所述硼酸功能化拉曼探针可以是基于银纳米粒子、金纳米粒子，或者其他具有表面增强拉曼作用的纳米粒子制得的。
所述硼亲和功能化可以是使用巯基硼酸自组装，或者其他能够修饰在纳米粒子上的硼亲和功能化方法。
所述拉曼检测，通过测定探针上硼酸的拉曼信号，或者其他高灵敏的拉曼染料信号来定量地反应标记蛋白的量。
方法步骤如下：
首先在基底表面修饰分子印迹高分子材料，利用分子印迹材料与糖蛋白之间的亲和力将样品中的糖蛋白萃取到基底表面。然后再利用硼亲和功能化拉曼探针来标记基底表面的糖蛋白。最后通过拉曼光谱检测拉曼探针的量来定量分析目标糖蛋白。由于使用分子印迹材料和硼亲和功能化材料而避免使用抗体，因此克服了抗体稳定性差、易失活、难制备且成本高等缺点。由于使用拉曼光谱检测，因此，避免了放射性同位素等危害健康的试剂的使用，同时也避免了荧光、化学发光中不稳定化合物的使用。
上述基于分子印迹技术和拉曼光谱的糖蛋白检测方法的应用，尤其是复杂样品中低丰度糖蛋白的检测，该技术专一性好、成本低、灵敏高、检测快速和通用等优点。
有益效果：与现有技术相比，本发明首次描述了一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的糖蛋白检测方法的应用，它是基于分子印迹固定目标蛋白，硼亲和拉曼探针标记的技术，在保留传统免疫夹心分析所提供的优点的同时，能避免其缺点，是一种通用、便捷和高效的检测技术，目前尚未有类似文献和专利报道。该技术保留了类似抗体的专一性识别能力、抗干扰能力强，同时避免了抗体的缺点，同时还结合拉曼光谱检测，可以进行高灵敏检测。此外，该技术还具有样品处理简单、分析速度快、可高通量分析、现场检测等优点。该方法可广泛应用于临床诊断、和疗效评估等领域，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为硼亲和分子印迹夹心法的原理图。
图2为修饰前后的银纳米粒子拉曼光谱图。
图3为基于硼亲和分子印迹整体阵列的检测辣根过氧化物酶(HRP)拉曼光谱图。
图4为基于硼亲和分子印迹整体阵列的检测甲胎蛋白(AFP)拉曼光谱图。
图5为基于硼亲和定向表面印迹阵列检测辣根过氧化物酶(HRP)拉曼光谱图。
图6为基于硼亲和定向表面印迹阵列检测转铁蛋白(TRF)拉曼光谱图。
图7为基于硼亲和定向表面印迹阵列检测甲胎蛋白(AFP)拉曼光谱图。
图8为干扰实验拉曼光谱图
图9为检测血清中甲胎蛋白(AFP)的拉曼光谱图。
图10为使用硼亲和夹心法检测前后的阵列的扫描电子显微镜图。
具体实施方式
实施例1：硼亲和拉曼探针的制备
首先合成银纳米粒子溶液：将36mg硝酸银溶解于200mL水中，搅拌加热至沸腾，2min内加入新配制的柠檬酸钠溶液(质量浓度为1％，4mL)，继续加热搅拌大约1h，然后自然冷却到室温，得到银纳米粒子溶液。8μL4-巯基苯硼酸溶液(4-巯基苯硼酸溶液的浓度为1mM，溶解于0.2M NaOH溶液)加入到1mL银纳米粒子溶液中。室温(25℃-30℃)下搅拌反应20-120min；得到硼亲和表面增强拉曼探针。
实施例2：硼亲和拉曼探针的拉曼信号
将制备好的硼亲和拉曼探针和巯基苯硼酸固体使用拉曼光谱测试。结果分别如图2A,2B。相比与巯基苯硼酸固体的拉曼光谱，修饰后的纳米粒子拉曼光谱中的C-S，S-H键相关的拉曼位移(998cm-1，1021cm-1，1072cm-1)与苯环上的C-C键振动的拉曼位移(1573cm-1)的拉曼信号均有着大幅增强，说明巯基苯硼酸通过Ag-S键修饰在了纳米粒子的表面。
实施例3：基于硼亲和分子印迹整体阵列的辣根过氧化物酶(HRP)检测
先制备辣根过氧化物酶(HRP)印迹的硼亲和分子印迹整体阵列【制备方法参见以下文献：Li Li,Yue Lu,ZijunBie,Hong-Yuan Chen,Zhen Liu,Angew.Chem.Int.Ed.(德国应用化学),2013,125,7599-7602】，每个阵列点上加入5μL不同浓度的HRP溶液，湿盒孵育20min。用乙腈/水(30:70,v/v)清洗5min，再用5μL硼亲和·探针用标记2min。每个点用含30％(质量百分比)乙腈的磷酸盐溶液【含30％(质量百分比)乙腈的磷酸盐溶液的浓度为10mM，pH＝9.0】清洗5min，干燥后使用拉曼光谱仪读取1072cm-1的拉曼信号强度。每个点上不同的位置测定8次，结果为8次的平均值，结果如图3所示。显然，拉曼信号随着目标蛋白HRP浓度的增加而增加。
实施例4：基于硼亲和分子印迹整体阵列的甲胎蛋白(AFP)的检测
先制备甲胎蛋白(AFP)印迹的硼亲和分子印迹整体阵列【制备方法参见以下文献：Li Li,Yue Lu,ZijunBie,Hong-Yuan Chen,Zhen Liu,Angew.Chem.Int.Ed.(德国应用化学),2013,125,7599-7602】，每个阵列点上加入5μL不同浓度的AFP溶液，湿盒孵育20min。用乙腈/水(30:70,v/v)清洗5min，再用5μL硼亲和SERS探针用标记2min。每个点用含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液【含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液的浓度为10mM，pH＝9.0】清洗5min，干燥后使用拉曼光谱仪读取1072cm-1的拉曼信号强度。每个点上不同的位置测定8次，结果为8次的平均值，结果如图4所示。显然，拉曼信号随着目标蛋白AFP浓度的增加而增加。
实施例5：基于硼亲和定向表面印迹阵列的辣根过氧化物酶(HRP)检测
先制备辣根过氧化物酶(HRP)印迹的硼亲和定向表面印迹阵列【制备方法参见以下文献：Shuangshou Wang,Jin Ye,ZijunBie,Zhen Liu,Chem.Sci.(化学科学),2014,5,1135-1140】，每个阵列点上加入5μL不同浓度的HRP溶液，湿盒孵育20min。用磷酸盐溶液(磷酸盐溶液的浓度为100mM、pH＝8.5)冲洗残余试剂，再用5μL硼亲和SERS探针用标记2min。每个点用含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液【含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液的浓度为10mM，pH＝9.0】清洗5min，干燥后使用拉曼光谱仪读取1072cm-1的拉曼信号强度。每个点上不同的位置测定8次，结果为8次的平均值，结果如图5所示。相比与空白，含有目标蛋白HRP的样品具有明显的拉曼信号。
实施例6：基于硼亲和定向表面印迹阵列的转铁蛋白(TRF)检测
先制备转铁蛋白(TRF)印迹的硼亲和定向表面印迹阵列【制备方法参见以下文献：Shuangshou Wang,Jin Ye,ZijunBie,Zhen Liu,Chem.Sci.(化学科学),2014,5,1135-1140】，每个阵列点上加入5μL不同浓度的TRF溶液，湿盒孵育20min。用磷酸盐溶液(磷酸盐溶液的浓度为100mM，pH＝8.5)冲洗残余试剂，再用5μL硼亲和SERS探针用标记2min。每个点用含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液【含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液的浓度为10mM，pH＝9.0】清洗5min，干燥后使用拉曼光谱仪读取1072cm-1的拉曼信号强度。每个点上不同的位置测定8次，结果为8次的平均值，结果如图6所示。相比与空白，含有目标蛋白TRF的样品具有明显的拉曼信号。
实施例7：基于硼亲和定向表面印迹阵列的甲胎蛋白(AFP)检测
先制备甲胎蛋白(AFP)印迹的硼亲和定向表面印迹阵列【制备方法参见以下文献：Xiaodong Bi,Zhen Liu,Anal.Chem.(分析化学),2014,86,959-966】，每个阵列点上加入5μL不同浓度的AFP溶液，湿盒孵育20min。用磷酸盐溶液(磷酸盐溶液100mM，pH＝8.5)冲洗残余试剂，再用5μL硼亲和SERS探针用标记2min。每个点用含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液【含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液的浓度为10mM，pH＝9.0】清洗5min，干燥后使用拉曼光谱仪读取1072cm-1的拉曼信号强度。每个点上不同的位置测定8次，结果为8次的平均值，结果如图7所示。相比与空白，含有目标蛋白AFP的样品具有明显的拉曼信号。
实施例8：专一性识别模板糖蛋白的考察
先制备辣根过氧化物酶(HRP)印迹的硼亲和分子印迹整体阵列【制备方法参见以下文献：Li Li,Yue Lu,ZijunBie,Hong-Yuan Chen,Zhen Liu,Angew.Chem.Int.Ed.(德国应用化学),2013,125,7599-7602】，每个阵列点上加入5μL不同样品溶液，湿盒孵育20min。用乙腈/水(30:70,v/v)清洗5min，再用5μL硼亲和SERS探针用标记2min。每个点用含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液【含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液的浓度为10mM，pH＝9.0】清洗5min，干燥后使用拉曼光谱仪读取1072cm-1的拉曼信号强度。每个点上不同的位置测定8次，结果为8次的平均值，结果如图8所示。只有含有目标蛋白HRP的样品具有明显的拉曼信号，而其他干扰物没有明显信号。
实施例9：血清中甲胎蛋白(AFP)检测
先制备甲胎蛋白(AFP)印迹的硼亲和分子印迹整体阵列【制备方法参见以下文献：Li Li,Yue Lu,ZijunBie,Hong-Yuan Chen,Zhen Liu,Angew.Chem.Int.Ed.(德国应用化学),2013,125,7599-7602】，每个阵列点上加入5μL不同浓度的AFP血清样品，湿盒孵育20min。用乙腈/水(30:70,v/v)清洗5min，再用5μL硼亲和SERS探针用标记2min。每个点用含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液【含30％(质量)乙腈的磷酸盐溶液的浓度为10mM pH＝9.0】清洗5min，干燥后使用拉曼光谱仪读取1072cm-1的拉曼信号强度。每个点上不同的位置测定8次，结果为8次的平均值，结果如图9所示。显然，在实际样品中，拉曼信号随着目标蛋白AFP浓度的增加而增加。
实施例10：扫描电子显微镜(SEM)表征使用硼亲和夹心法检测前后的阵列
图10为使用前的阵列(图A)和使用后的阵列(图B)的SEM表征图。
Claims (7)
1.一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的糖蛋白检测方法，其特征在于，先在基底表面修饰分子印迹聚合物，然后利用分子印迹聚合物富集目标糖蛋白，再利用硼亲和功能化拉曼探针标记目标糖蛋白，最后对所形成的分子印迹聚合物-糖蛋白-拉曼探针三明治结构复合物进行拉曼光谱检测。
2.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的糖蛋白检测方法，其特征在于，所述目标糖蛋白通过分子印迹聚合物产生的亲和力专一性结合于基底表面。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的糖蛋白检测方法，其特征在于，所述分子印迹聚合物是以取代硼酸为配基的硼亲和分子印迹材料。
4.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的糖蛋白检测方法，其特征在于，所述硼亲和功能化拉曼探针是基于银纳米粒子、或者金纳米粒子，或者其他具有增强拉曼光谱作用的粒子制得的。
5.根据权利要求4所述的一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的糖蛋白检测方法，其特征在于，所述硼亲和功能化可以是使用巯基硼酸自组装，或者其他能够修饰在纳米粒子上的硼亲和功能化方法。
6.根据权利要求1所述的一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的糖蛋白检测方法，其特征在于，所述基底可以是玻璃片、或者纸片，或者其他低成本、易制备的基底。
7.权利要求1所述的一种基于分子印迹技术和拉曼光谱的糖蛋白检测方法在低丰度糖蛋白检测中的应用。
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