CN107782711B

CN107782711B - 用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107782711B
Application number: CN201710841142.4A
Authority: CN
Inventors: 周学敏; 李晓旭; 徐磊; 沈心; 李昺之
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2020-09-04
Anticipated expiration: 2037-09-18
Also published as: CN107782711A

Abstract

本发明公开了一种用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法和应用，该传感器的建立在于对糖蛋白特异性亲和及选择性捕获的分子印记聚合物层和具有糖蛋白特异性亲和作用的SERS探针的组合。该方法采用硼酸亲和MIPs与硼酸亲和SERS探针的组合来进行目标捕获和SERS信号产生，使用硼酸特异性亲和基表面印记方法制备MIPs层，用于选择性捕获痕量目标物；根据对数剂量反应关系实现人血清中糖蛋白的超敏感和定量检测，可快速和超灵敏地测定生物样品中痕量糖蛋白。本发明制备的传感器可以直接和非破坏性地检测大分子样品，可以检测实际生物样品中的许多临床生物标志物。

Description

用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器及其制备方法和应用。

背景技术

糖蛋白是共轭碳水化合物的一种，生物界种类繁多的糖蛋白有着千差万别的生物学功能。如分子识别，信号转换，细胞粘连，免疫反应和细胞发展的管理，糖蛋白的异常结构改变和表达，与各种疾病的存在和发展相关，许多糖蛋白已经应用为疾病生物标记。通常以酶或信号分子的形式出现的糖蛋白被认为在各种代谢过程(如分子识别和免疫应答)中起到信号转导作用。该功能使糖蛋白作为临床生物标志物，广泛应用于疾病的诊断和治疗。酸性磷酸酶(ACP)是一种在磷酸酶清除过程中起重要作用的糖蛋白。人体中ACP通常检测到为低浓度，但是ACP的异常升高往往预示着一些疾病的发生，例如前列腺癌，戈谢病和其他与静脉，肾脏和骨骼相关的疾病。因此，ACP被认为是血清学和组织学疾病生物标志物，可用于相关的病理生理学研究。前列腺酸性磷酸酶(ACP家族的成员)将在前列腺功能障碍例如前列腺肿瘤发生中快速释放到血液中，这可以被监测，并且反映这种疾病的进展。由于ACP通常自疾病开始以来被释放，所以早期快速和准确地检测ACP在许多疾病的早期诊断中是很有必要的。

生物样品中重要糖蛋白生物标志物的浓度很低，而且样品基质中有大量共存物质的高度干扰，因此很难直接在生物样品中鉴定痕量糖蛋白。从针对其靶标的特异性高的抗体获得的免疫测定一直是许多领域蛋白质分析的重要分析工具，如生物化学研究和临床诊断。然而，抗体的固有特性，如储存稳定性和环境敏感性差，极大地阻碍了其临床应用，更不用说它们的高价格和有限的来源。因此，非抗性免疫测定法的分析方法是非常需要的。

分子印记技术是一种有效识别和分离复杂基质中目标分析物的方法。分子印记聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)作为具有类似抗体样结合特征的经济和稳定的合成受体已被广泛应用于催化，传感器和分离领域。虽然这种技术在小分子检测方面已经获得了广泛的普及，但对于蛋白质的印记仍然面临很大的挑战。大多数障碍源于蛋白质的固有特性，包括分子尺寸大，传质差，构象灵活易变和溶解度受限。通常，蛋白质在常规聚合条件下容易变性。为了克服这些困难，已经提出了几种印记蛋白质的策略，如金属配位，表位印记和表面印记等。最近，基于硼酸和糖蛋白糖基之间的可逆共价结合来制备MIPs的温和简便的印记方法被提出。

硼酸可以与含有顺式二醇的分子(例如糖)产生共价相互作用以在碱性水溶液中构建稳定的环酯，并在酸性条件下可逆解离。这种开/关功保证了硼酸作为建立糖蛋白印记通用技术的亲和配体。可逆共价复合物的形成使得能够容易地洗脱和重新结合靶糖蛋白。在MIPs中产生的印记孔穴不仅可以与模板分子的形状互补，硼酸基团对模板糖蛋白具有特异性亲和力。因此，硼酸亲和修饰的MIPs表现出高特异性，高亲和力，和对干扰的极好耐受性，使得它们成为免疫测定应用中抗体的替代品。

近年来，MIPs和表面增强拉曼散射光谱(SERS)的结合已被应用于微量浓度化合物的检测。与其他检测程序相比，SERS显示了几个显著的优点，包括超高灵敏度，独特的光谱指纹，防紫外线和无损数据采集，快速读出速度和现场检测的可能性。MIP与SERS的组合可以创造出超越常规免疫测定的先进分析方法。然而，它们大多集中在小分子上，很少应用于检测大分子疾病生物标志物。

作为进一步的扩展，在这里，我们提出一种硼酸亲和的基于MIPs的SERS传感器，用于复杂生物样品中痕量糖蛋白的特异和灵敏测定。

发明内容

本发明的目的是克服以上不足，提供一种灵敏度高，对目标物选择性强，操作简单，具有良好的普适性的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼传感器，并公开了其制备方法和应用，利用该传感器特异性检测复杂生物样品中痕量糖蛋白。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器，该传感器的建立在于对糖蛋白特异性亲和及选择性捕获的分子印记聚合物层和具有糖蛋白特异性亲和作用的SERS探针的组合。

上述用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器具体是通过以下方法制备得到的：

a)分子印记聚合物层的制备：取功能单体，交联剂，引发剂，致孔剂超声混匀15～25min，滴涂于玻璃片，70～75℃反应1～2h合成聚合物骨架，然后以甲醇和蒸馏水分别冲洗除去未反应的溶剂；将制备的聚合物骨架浸入模板分子糖蛋白溶液中，随后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤以除去未吸附模板分子；加入含有多巴胺DA和过硫酸铵APS的磷酸盐缓冲液，每5ml该磷酸盐缓冲液含1.5～2.5mg多巴胺；将模板分子固定的聚合物骨架置于3～5℃下10～12h。然后用含有体积分数为25～35％乙腈的磷酸溶液洗涤以除去模板分子，得到分子印记聚合物层。

b)SERS探针的制备：将对巯基苯硼酸(MPBA)溶液加入到AuNPs胶体溶液中，并将混合溶液在室温下搅拌。

上述用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法包括分子印记聚合物层的制备和SERS探针的制备，其中，分子印记聚合物层的制备步骤是在硼酸亲和聚合物骨架上固定模板分子糖蛋白之后，在聚合物骨架表面上通过多巴胺的自聚合来制备；SERS探针的制备是SERS探针用硼酸修饰。

上述检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法包括以下步骤：

上述方法步骤a)中：所述的功能单体、交联剂、引发剂和致孔剂的重量比为1.8～2.2：7.3～7.7：0.09～0.12：33～35；其中优选功能单体用量为1.8～2.2mg；交联剂用量为7.3～7.7mg；引发剂用量为0.09～0.12mg；致孔剂用量为33～35mg。

上述功能单体为4-乙烯基苯硼酸(VPBA)，交联剂为季戊四醇三丙烯酸酯(PETA)，引发剂为2,2-偶氮二异丁腈(AIBN)，致孔剂为质量比为3:2的乙二醇和环己醇混合物。

上述方法步骤a)中所述的模板分子为酸性磷酸酶(ACP)，或转铁蛋白(TRF)，或辣根过氧化物酶(HRP)中的一种。

上述方法步骤a)中所述的模板分子浓度为0.10～0.12mg mL^-1，多巴胺(DA)的浓度优选为1.8～2.2mg mL^-1，过硫酸铵的浓度为9～10mM。

上述方法步骤b)中所述的对巯基苯硼酸溶液中对巯基苯硼酸浓度为20～22μM，搅拌时间为60～70min。

上述用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器在检测痕量糖蛋白中的应用，所述糖蛋白为酸性磷酸酶，或转铁蛋白，或辣根过氧化物酶中的一种或多种。

上述应用方法为：将MIPs层浸入样品溶液中吸附目标物60～80min。用PBS(0.1M，pH7.5)洗涤以除去过载蛋白后，通过与1～2mL SERS探针孵育来标记捕获的目标糖蛋白，孵育时间10～15min，然后用拉曼光谱仪检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所提供的传感器中MIPs可以选择性吸附目标物糖蛋白，硼酸修饰的拉曼探针对糖蛋白有特异性亲和作用，被MIPs捕获的目标物糖蛋白与拉曼探针结合后可进行SERS测定。

(2)在硼酸亲和聚合物骨架上固定模板分子糖蛋白之后，在聚合物骨架表面上通过多巴胺(DA)的自聚合制备MIPs层，识别位点不仅稳定，而且通过特异性亲和作用容易被目标物进入和绑定，具有良好的重现性。

(3)本发明所述方法采用硼酸亲和MIPs与硼酸亲和SERS探针的组合来进行目标捕获和SERS信号产生，使用硼酸特异性亲和基表面印记方法制备MIPs层，用于选择性捕获痕量目标物；根据对数剂量反应关系，实现人血清中糖蛋白的超敏感和定量检测，可快速和超灵敏地测定生物样品中痕量糖蛋白。

(4)本发明所述方法可以通过简便地修改，印记不同的糖蛋白，例如ACP、TRF和HRP，实现对不同糖蛋白的检测。

(5)本发明制备的基于MIPs的SERS传感器可以直接和非破坏性地检测大分子样品。因此，该方法具有很好的应用前景，可以检测实际生物样品中的许多临床生物标志物。

为了验证本发明实施例制备的MIPs-SERS传感器的性能，发明人进行了如下试验:

1.选择性吸附试验：对于ACP印记的MIPs，使用HRP(糖蛋白)，TRF(糖蛋白)，来自牛血的血红蛋白(Hb，非糖蛋白)，白蛋白(非糖蛋白)和葡萄糖作为干扰因素来研究MIPs的选择性。实验结果如图2所示，所有干扰物产生了与空白样相当或相对比较高的信号，而目标糖蛋白ACP的信号显著最高。另外还检测了HRP印记的MIPs和TRF印记的MIPs对不同蛋白质的选择性，如图3和图4所示，结果均表明本发明制备的硼酸亲和MIPs具有极好的特异性。

2.重现性和稳定性实验：在优化条件下，计算5批ACP印记的MIPs用于样品测定时在1077cm^-1拉曼强度相对标准偏差(RSD)为9.2％，说明了制备重现性良好。使用MIPs层5，10和15次。1077cm^-1处的拉曼强度的RSD分别为4.1％，6.3％和7.9％。通过将MIP层分别浸入甲苯，甲醇，氯仿，二氯甲烷和乙腈中分别测试MIP层的化学稳定性2小时。在显微镜观察下，没有发现明显的脱层和裂纹。这些结果表明MIPs是稳定和可重复的。

3.线性和检测限试验：ACP首先被用作印记的模板糖蛋白。检测了浓度范围为0.1ng mL^-1至10mg mL^-1的ACP的拉曼光谱。通过绘制在1077cm^-1处的信号强度与ACP浓度的对数的响应曲线得到，ACP浓度在1ng mL^-1到100μgmL^-1的范围内呈线性，如图5所示。回归方程为A＝101.07lgC+143.31，其中C(ng mL^-1)为ACP浓度，A为1077cm^-1处的拉曼强度(R2＝0.996)。检测限(LOD)为0.1ng mL^-1(S/N＝3.6)。

通过使用HRP和TRF代替ACP作为模板糖蛋白，证明了基于MIPs的SERS传感器的普遍适用性，如图6和图7所示。HRP印记的MIPs在HRP浓度为1ng mL^-1至100μgmL^-1(R2＝0.986)的范围内呈现线性响应。TRF印记的MIPs对于TRF浓度在0.1ng mL^-1至100μgmL^-1(R2＝0.985)范围内呈现线性响应。

4.实际样品测定：通过分别在人血清中测定糖蛋白ACP和TRF，证明了基于MIPs的SERS传感器在现实应用中的可行性。分别测定加入已知ACP和TRF浓度的血清样品。来自健康人的血清中的ACP浓度被确定为1.32ng mL^-1。用不同浓度的ACP加入血清样品，然后通过基于MIPs的SERS方法进行分析，结果示见表1，其表面增强拉曼光谱图如图8所示，拉曼光谱强度柱形图如图9所示。用PBS稀释500倍的健康人的血清中的TRF浓度确定为5.3μgmL^-1。分析了三种浓度水平下加入HRF的稀释血清样品的结果，如表1所示。

表1实际样品中糖蛋白的检测(n＝3)

SERS检测条件：

使用8mW功率和10×物镜的633nm激光记录拉曼光谱。收集时间为10秒，5轮累积，针孔为25微米。

附图说明

图1：(a)本发明实施例制备的MIPs层扫描电子显微镜图；(b)本发明实施例中金纳米粒透射电镜图；(c)本发明实施例中对巯基苯硼酸与金纳米粒合成的SERS探针透射电镜图。

图2：以酸性磷酸酶为模板分子制备的MIPs选择性吸附试验；

图中，ACP：酸性磷酸酶；TRF：转铁蛋白；HRP：辣根过氧化物酶；Hb：牛血红蛋白；albumin：白蛋白；glucose：葡萄糖；blank：空白样；MIPs：分子印记聚合物；NIPs：非分子印记聚合物。

图3：以HRP为模板分子制备的MIPs选择性吸附试验。

图4：以TRF为模板分子制备的MIPs选择性吸附试验。

图5：以ACP为模板分子制备的MIPs基于ACP浓度对数与1077cm^-1处拉曼强度所作线性图。

图6：以HRP为模板分子制备的MIPs基于HRP浓度对数与1077cm^-1处拉曼强度所作线性图。

图7：以TRF为模板分子制备的MIPs基于TRF浓度对数与1077cm^-1处拉曼强度所作线性图。

图8：以ACP为模板分子制备的MIPs用于实际样品中ACP检测表面增强拉曼光谱图；

图中，(a)空白血清样品；(b)加入1.34ngmL^-1ACP血清样品(c)加入6.70ng mL^-1ACP血清样品(d)加入13.4ng mL^-1ACP血清样品。

图9：以ACP为模板分子制备的MIPs用于实际样品中ACP检测所得拉曼光谱强度柱形图。

具体实施方式

下面将参照具体实施例更详细地描述本发明的优选实施方式。

实施例1：

(a)分子印记聚合物层的制备：取2.0mg功能单体(4-乙烯基苯硼酸，VPBA)，7.5mg交联剂(季戊四醇三丙烯酸酯，PETA)，0.10mg引发剂(2,2-偶氮二异丁腈AIBN)，34.3mg致孔剂(含有质量比为3:2的乙二醇/环己醇)超声混匀20min，滴涂于玻璃片(20mm×20mm)，75℃反应2h合成聚合物骨架，然后以甲醇和蒸馏水分别冲洗除去未反应的溶剂。将制备的聚合物骨架浸入0.10mg mL^-1模板分子酸性磷酸酶溶液中(ACP，溶于0.1M，pH7.5磷酸盐缓冲液)。随后，用磷酸盐缓冲液(PBS，0.1M，pH7.5)洗涤以除去未吸附ACP。加入含有1.8mg mL^-1多巴胺DA和10mM过硫酸铵APS的5mL PBS(pH 7.4)，将ACP固定的聚合物骨架置于4℃下10h。然后，将MIPs用含有30％乙腈(v/v)的0.2M磷酸溶液洗涤以除去模板分子ACP，得到了分子印记层(ACP-MIPs)。

(b)SERS探针的制备：将对巯基苯硼酸(MPBA)溶液加入到AuNPs胶体溶液中，得到的混合溶液中MPBA浓度为20μM，并将混合溶液在室温下搅拌60min。

根据本实施例方法制备的MIPs层扫描电子显微镜图，金纳米粒透射电镜图和对巯基苯硼酸与金纳米粒合成的SERS探针透射电镜图如图1所示。

实施例2：

(a)分子印记聚合物层的制备：取2.0mg功能单体(4-乙烯基苯硼酸，VPBA)，7.5mg交联剂(季戊四醇三丙烯酸酯，PETA)，0.11mg引发剂(2,2-偶氮二异丁腈AIBN)，33mg致孔剂(含有质量比为3:2的乙二醇和环己醇混合物)超声混匀20min，滴涂于玻璃片(20mm×20mm)，75℃反应2h合成聚合物骨架，然后以甲醇和蒸馏水分别冲洗除去未反应的溶剂。将制备的聚合物骨架浸入0.10mg mL^-1模板分子转铁蛋白溶液中(TRF，溶于0.1M，pH7.5磷酸盐缓冲液)。随后，用磷酸盐缓冲液(PBS，0.1M，pH7.5)洗涤以除去未吸附TRF。加入含有1.8mgmL^-1多巴胺DA和9mM过硫酸铵APS的5mL PBS(pH 7.4)，将TRF固定的聚合物骨架置于4℃下10h。然后，将MIPs用含有30％乙腈(v/v)的0.2M磷酸溶液洗涤以除去模板分子TRF，得到了分子印记层(TRF-MIPs)。

实施例3：

(a)分子印记聚合物层的制备：取2.0mg功能单体(4-乙烯基苯硼酸，VPBA)，7.5mg交联剂(季戊四醇三丙烯酸酯，PETA)，0.12mg引发剂(2,2-偶氮二异丁腈AIBN)，35mg致孔剂(含有质量比为3:2的乙二醇/环己醇)超声混匀20min，滴涂于玻璃片(20mm×20mm)，75℃反应2h合成聚合物骨架，然后以甲醇和蒸馏水分别冲洗除去未反应的溶剂。将制备的聚合物骨架浸入0.10mg mL-1模板分子辣根过氧化物酶溶液中(HRP，溶于0.1M，pH7.5磷酸盐缓冲液)。随后，用磷酸盐缓冲液(PBS，0.1M，pH7.5)洗涤以除去未吸附HRP。加入含有1.8mg mL^-1多巴胺DA和10mM过硫酸铵APS的5mL PBS(pH 7.4)，将HRP固定的聚合物骨架置于4℃下10h。然后，将MIPs用含有30％乙腈(v/v)的0.2M磷酸溶液洗涤以除去模板分子HRP，得到了分子印记层(HRP-MIPs)。

应用例1

将MIPs层浸入样品溶液中吸附目标物70min。用PBS(0.1M，pH7.5)洗涤以除去过载蛋白后，通过与1.5mL SERS探针孵育来标记捕获的目标糖蛋白，孵育时间15min，然后用拉曼光谱仪检测。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims

1.一种用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器，其特征在于该传感器的建立在于对糖蛋白特异性亲和及选择性捕获的分子印记聚合物层和具有糖蛋白特异性亲和作用的SERS探针的组合；

所述分子印记聚合物层是通过以下方法制备得到的：取功能单体，交联剂，引发剂，致孔剂超声混匀15~25min，滴涂于玻璃片，70~75゜C反应1~2h合成聚合物骨架，然后以甲醇和蒸馏水分别冲洗；将制备的聚合物骨架浸入模板分子糖蛋白溶液中，随后用磷酸盐缓冲液洗涤，加入含有多巴胺和过硫酸铵的磷酸盐缓冲液；将模板分子固定的聚合物骨架置于3~5℃下10~12h，然后，用含有体积分数为25~35％乙腈的磷酸溶液洗涤得到分子印记聚合物层；

所述的功能单体、交联剂、引发剂和致孔剂的重量比为1.8~2.2：7.3~7.7 ：0.09~0.12：33~35；所述的模板分子浓度为0.10~0.12mg mL^-1，多巴胺的浓度为1.8~2.2mg mL^-1，过硫酸铵的浓度为9~10mM，所述的功能单体为4-乙烯基苯硼酸，交联剂为季戊四醇三丙烯酸酯，引发剂为2,2-偶氮二异丁腈，致孔剂为质量比为3:2的乙二醇和环己醇混合物；

所述SERS探针是通过以下方法制备得到的：将对巯基苯硼酸溶液加入到AuNPs胶体溶液中，室温下搅拌。

2.一种权利要求1所述的用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，其特征在于包括分子印记聚合物层的制备和SERS探针的制备；其中，分子印记聚合物层的制备步骤是在硼酸亲和聚合物骨架上固定模板分子糖蛋白之后，在聚合物骨架表面上通过多巴胺的自聚合来制备；SERS探针的制备是SERS探针用硼酸修饰；

所述的用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法包括以下步骤：

a)分子印记聚合物层的制备：取功能单体，交联剂，引发剂，致孔剂超声混匀15~25min，滴涂于玻璃片，70~75゜C反应1~2h合成聚合物骨架，然后以甲醇和蒸馏水分别冲洗；将制备的聚合物骨架浸入模板分子糖蛋白溶液中，随后用磷酸盐缓冲液洗涤，加入含有多巴胺和过硫酸铵的磷酸盐缓冲液；将模板分子固定的聚合物骨架置于3~5℃下10~12h，然后，用含有体积分数为25~35％乙腈的磷酸溶液洗涤得到分子印记聚合物层；

b)SERS探针的制备：将对巯基苯硼酸溶液加入到AuNPs胶体溶液中，室温下搅拌；

其中，在步骤a) 中：所述的功能单体、交联剂、引发剂和致孔剂的重量比为1.8~2.2：7.3~7.7 ：0.09~0.12：33~35；所述的模板分子浓度为0.10~0.12mg mL^-1，多巴胺的浓度为1.8~2.2mg mL^-1，过硫酸铵的浓度为9~10mM，其中，功能单体为4-乙烯基苯硼酸，交联剂为季戊四醇三丙烯酸酯，引发剂为2,2-偶氮二异丁腈，致孔剂为质量比为3:2的乙二醇和环己醇混合物。

3.根据权利要求2所述的用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，其特征在于在步骤a) 中所述的模板分子为酸性磷酸酶，或转铁蛋白，或辣根过氧化物酶中的一种或多种。

4.根据权利要求2中所述的用于检测糖蛋白的基于分子印记聚合物的表面增强拉曼光谱传感器的制备方法，其特征在于在步骤b) 中所述的对巯基苯硼酸溶液中对巯基苯硼酸浓度为20~22μM，搅拌时间为60~70 min。