CN107446087B - 一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法 - Google Patents

一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种用于三聚氰胺检测的芯‑壳型表面分子印迹微球的制备方法，包括如下两个步骤：首先，将苯乙烯、甲基丙烯酸单体分散在水中，以过硫酸钾为引发剂在氮气气氛下反应制备表面富含羧基的聚苯乙烯微球；然后，再将三聚氰胺、甲基丙烯酸、亚苯基双丙烯酰胺、偶氮二异庚腈与上述所制备的聚苯乙烯微球表面反应，得到三聚氰胺分子印迹的芯‑壳型微球，洗脱位于印迹微球壳层中的三聚氰胺印迹分子，壳层的内部形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的芯‑壳型微球拥有对目标分析物三聚氰胺分子的特异性识别和敏感性检测的功能，彼此空间相互接近时，在浓度差推动力的作用下，实现对目标分析物三聚氰胺分子选择性识别和检测。

Description

一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备 方法
技术领域
本发明涉及材料科学领域，特别涉及具有对三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法。
背景技术
三聚氰胺是一种有机碱和三嗪骨架构成的含氮量达66%的有机物，因其高含氮量，近年来，为谋取不正当利益，诸多不法商人将三聚氰胺掺杂到食品或饲料中，以提升食品或饲料检测中的蛋白质含量。但三聚氰胺在人体内会发生水解反应，生成三聚氰酸，当二者在人体内相结合时，会形成大的网状结构，导致结石，对人体造成危害，因此，迫切需要开发一种既快速准确又便捷的检测食品中痕量三聚氰胺的技术。目前，对食品中三聚氰胺的检测方法通常为高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱法（GC-MS），其检测结果可靠、选择性强、可重复性高，但此类方法成本高、耗时长、步骤繁琐、并且样品必须脱离现场送往实验室检测，无法满足家庭和现场检测的需求。美国Yakes研究小组发表的学术论文（Journal of Agricultural and Food Chemistry，2017, 65(28):5789–5798），通过使用NIR、Raman光谱仪、1H的NMR、DART−MS等仪器对采用湿法共混法制备的喷雾干燥乳糖中痕量三聚氰胺进行了检测。其干燥乳糖中乳糖与三聚氰胺之间相互作用，导致分析物三聚氰胺的光谱特性发生了改变，使得高氮含量、低分子量的三聚氰胺容易被仪器检测，从而达到对食品中痕量三聚氰胺的检测。但此法预处理复杂、仪器设备昂贵且需要检测人员具备相关专业知识，因此，无法大范围推广应用。
美国加州大学Wei Fang等人2017年3月公开了发明专利（US20170074849）“A TestStrip for Melamine Detection”制备方法，该发明对痕量三聚氰胺的检测取得了新的成就，制备出一种检测试纸，内部具有可与三聚氰胺作用的金纳米粒子，当含有三聚氰胺的样品流经试纸时，试纸表面会产生两条肉眼可见的线，若不含三聚氰胺，则只产生一条可见的线，快速简便，稳定性高，不受检测现场资源的限制，但其所用材料含贵金属金，成本高，制备步骤繁琐，耗时长且检测过程中奶粉中所含某些不易溶解的成分，如固体颗粒或大分子，易造成膜孔道堵塞，导致检测结果不可靠。
英国Fodey发表学术论文（Analytical Chemistry，2011, 83(12):5012-5016）以一种化学结构类似三聚氰胺的化合物作为半抗原，用以提高多克隆抗体，并作为生物传感器芯片表面固定的抗原，制备出三聚氰胺生物传感器，通过免疫分析法对奶粉中痕量三聚氰胺进行检测，结果可靠，可重复性高。但上述生物传感器选择性识别功能不足，且蛋白质抗原在强酸强碱高温低温等环境下易失活，制备过程繁琐。
台北科技大学陈生明研究小组报道了一种对三聚氰胺具有良好吸附性的聚锗氧化多晶金电极，其使用差分脉冲伏安法，通过多晶锗氧化峰电流的改变，对奶粉中痕量三聚氰胺进行准确检测（Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010, 58(8):4537–4544）。中南大学陈立妙研究小组利用水热法合成银纳米粒子修饰的银/碳/银芯–壳纳米球，其通过与三聚氰胺发生作用的银/碳/银芯–壳纳米球SERS信号强度的改变，实现对食品中痕量三聚氰胺的检测（ACS Applied Materials & Interfaces，2011, 3(8):3091-3096）。印度理工学院（克勒格布尔）Tarasankar Pal研究小组以具有三个氨基基团的三聚氰胺作为目标分子，将其同时结合在两金属表面，制备出“三明治”形态的拉曼探针，此探针可显著增强拉曼振动信号，其检出限可达飞摩尔水平，灵敏度极高（The Journal of Physical Chemistry C，2014, 118(48):28152−28161）。印度科学教育研究学院Venkataramanan Mahalingam研究小组在缺电子3，5-二硝基苯甲酸上涂覆Er/Yb-NaYF4纳米晶上转换可以特异性地与富电子的三聚氰胺结合，这种选择性结合导致纳米晶上转换发光的猝灭，从而达到对痕量三聚氰胺的检测（ACS Applied Materials & Interfaces，2014, 6(10):7833−7839）。大连理工大学樊江莉研究团队采用胸腺嘧啶衍生物修饰金纳米粒子（AuNPs）制备比色传感器，基于胸腺嘧啶和三聚氰胺之间的互补氢键，当三聚氰胺加入时，肉眼可观察到明显的红色转变为蓝色的颜色变化，从而实现对痕量三聚氰胺的检测（Industrial & Engineering Chemistry Research，2015, 54(48):12011-12016）。中科院固体物理研究所孟国文等人发表的学术论文（ACS Sensors，2016, 1(10):1193-1197）基于表面增强拉曼光谱装置的吸管式罗勒种子检测牛奶中三聚氰胺，罗勒种子上沉积了电浆银纳米颗粒，通过移液管移取少量液体样品置于罗勒种子上，使二者充分接触，从而增强了装置的灵敏度，且多余的液体样品，可用移液管转移，因此，减少了不透明液体样品对SERS信号的干扰。
上述方法优点甚多，但其制备步骤繁琐，成本高，且某些检测方法对大型仪器的依赖性强，无法满足家庭和现场检测的需求。
近年来，对痕量三聚氰胺的检测技术层出不穷，2010年Magnotti Ralph等人公开了发明专利（WO2010101777）“Detection of melamine”的制备方法。该发明通过制备三聚氰胺抗体，利用免疫测定法检测三聚氰胺，从而确定样品中是否存在三聚氰胺或测定三聚氰胺的含量。2011年Krebs Joseph Francis等人公开了发明专利（US20110008809）“Methodfor the detection of melamine”的制备方法。该发明提供了一种利用微生物酶——三聚氰胺脱氨酶水解三聚氰胺生成三聚氰酸和氨，再测定所产生的氨含量，进而确定三聚氰胺含量的检测方法。2014年陈达等人公开了发明专利（CN201410591241.8）“一种牛奶和奶粉中三聚氰胺的检测方法”的制备方法。它采用了下述步骤：（1）用蒸馏水或纯水配制不同浓度的三聚氰胺储备液后，分别加入本身不含三聚氰胺的牛奶或奶粉溶解液中，充分振荡混匀得到混合液；（2）混合液与无水乙醇以适当比例混合，振荡均匀后，离心得到上层澄清提取液；（3）将澄清提取液滴在基底上，室温蒸发后得到咖啡环，对此咖啡环物质进行共聚焦显微拉曼光谱检测，得到其拉曼光谱图；（4）对三聚氰胺进行共聚焦显微拉曼光谱检测，得到其拉曼光谱；（5）对比分析咖啡环物质的拉曼谱峰位置及三聚氰胺的拉曼谱峰位置，判断有无三聚氰胺的存在。2015年李娜等人公开了发明专利（US20150004713）“Methods andmaterials for the detection of melamine”的制备方法。该发明将待测样品与三聚氰酸和金纳米颗粒相互作用后，通过观察其溶液颜色和浊度的改变，实现对痕量三聚氰胺的检测。2016年陈学松等人公开了发明专利（CN201610259923.8）“一种快速测定奶粉中三聚氰胺含量的方法”的制备方法。它采用了下述步骤：称取奶粉2g，用10g弗罗里硅土混匀，将混合均匀的样品装入萃取池中，以浓度为0.2％的乙酸溶液萃取；萃取完成后将萃取液在60℃条件下用旋转蒸发仪蒸干，用2mL乙腈将蒸干后的萃取液溶解后离心，离心后取上清液于高效液相色谱仪进行测定。2016年Katsunori Horii等人公开了发明专利（US20160169875）“Nucleic acid sensor for melamine analysis, device for melamine analysis, andmethod for melamine analysis”的制备方法。该发明主要阐述了一种对三聚氰胺具有特异性检测的核酸传感器的制备方法，其可以根据检测催化核酸分子催化功能的通断判断三聚氰胺是否与核酸分子结合，实现对痕量三聚氰胺的检测。
虽然上述发明有诸多可取之处，但是这些方法制备出的检测材料合成步骤繁琐，成本高，专一性差，且某些产物在高温高压强酸强碱下易变性，不利于保存。而分子印迹技术不仅可以克服上述缺陷，且其对痕量三聚氰胺检测具有高选择性、高灵敏性。在近年实用的检测技术中，人工合成分子印迹技术独占鳌头，其在医药、化学等领域的应用更是数之不尽，如控缓释药物、三聚氰胺检测、化学仿生传感器等。因此，基于分子印迹技术，对目标分析物具有检测作用的理想材料——芯-壳型表面分子印迹微球进入研究者的视野，因具有高选择性、强灵敏性、多结合位点、吸附动力学速度快、可重复使用且成本低廉等诸多优点，使其在化学检测与分析等领域中占据越来越重要的地位。
关贵检等人公开了发表学术论文（Chemistry-A European Journal，2012，18(15)：4692-4698），在羧基功能化的聚苯乙烯微球表面通过非共价键作用制备多种可控的高质量分子印迹壳层，其在聚苯乙烯微球悬浮液中加入模板分子TNT、功能单体APTS、交联剂TEOS，通过水解聚合反应得到壳层厚度可控，对TNT具有选择性识别的印迹分子核壳型人工抗体。此发明方法中聚苯乙烯微球表面富含吸电子羧基（功能单体）只能在弱碱性或碱性条件下，脱去羧基上的氢原子，变成供电子基团与拥有三个吸电子硝基的TNT（模板分子）以非共价键形式的作用。虽然制备过程中加入乙酸钠作为缓冲溶液调节溶液pH值，但是在印迹过程中，加入碱性的拥有供电子基团氨基的APTS后，模板分子TNT与聚苯乙烯微球表面羧基作用明显没有与APTS作用强，促使模板分子TNT向APTS分子富集，从而相互作用，离开聚苯乙烯微球的表面，且选择的交联剂是TEOS，即使是能够在聚苯乙烯微球表面印迹，由于聚苯乙烯微球是有机聚合物，而二氧化硅是无机物，性质差异较大，难以形成同质包覆。
耿军龙（中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑，2011，S2）制备了一种用于农药2，4-D选择性识别和检测的分子印迹材料——PS@CT核壳微球，利用苯乙烯制备聚苯乙烯微球，以2，4-D为模板分子、壳聚糖为功能单体、戊二醛为交联剂制备PS@CT核壳微球，基于静电作用，可与2，4-D分子特异性结合，达到检测的目的。此技术特点是2，4-D农药目标分子中的羧基官能团与溶解在乙酸溶液中的壳聚糖中氨基官能团相互作用，使得壳聚糖中氨基质子化，2，4-D分子的pKa（2.90，25℃）远大于体系中乙酸的pKa（4.76，25℃）导致2，4-D分子（模板分子）与壳聚糖（功能单体）之间形成静电作用，同时利用羧基功能化的PS微球表面的羧基与氨基质子化的壳聚糖之间的静电作用把壳聚糖吸附到PS微球周围，然后用戊二醛（交联剂）共聚反应交联，在PS微球表面形成2，4-D分子印迹水凝胶层，去除2，4-D模板分子后得到空穴空间结构与2，4-D分子相匹配的识别位点，从而获得了一种用于探测除草剂2，4-D分子的PS@CT人工抗体的制备方法。该聚苯乙烯微球表面功能化修饰羧基是与壳聚糖（功能单体）之间通过静电作用，而不是聚苯乙烯微球表面的羧基直接与2，4-D分子（目标分子）作用。
高大明等人公开了发明专利（ZL2015107402471）“一种用于探测百草枯分子的PS@SiO2人工抗体的制备方法，其特征在于：所述的人工抗体中洗脱位于SiO2壳层中的印记分子，SiO2壳层的内部形成具有与印记分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，其人工抗体具有对目标分析物分子的特异性识别位点，实现对其选择性识别和探测，此发明包括如下两个步骤：首先合成了单分散的、表面携带羧基功能单体的PS微球。然后其表面的羧基与百草枯分子通过静电相互作用，再在其表面包覆一层可控壳厚的SiO2壳层，洗脱百草枯，形成了识别和检测百草枯分子的人工抗体，其纳米壳层厚度可控，壳层的刚性强，比表面积大，形成识别位点的空间结构稳定、有效位点多、选择性好、对目标分子识别效率高。”其所制备的人工抗体利用分子印迹技术，以百草枯为模板分子、TEOS为交联剂、氨水为催化剂、在碱性条件下进行反应，从而制备PS@SiO2核壳微球，该微球中富含羧基的聚苯乙烯微球“芯”可与百草枯分子特异性结合，增加了结合位点，提高了检测效率，但其为使聚苯乙烯微球具备功能单体的作用，利用一定浓度氢氧化钠溶液来调节pH值，使得聚苯乙烯微球表面羧基成电负性，从而使带正电的百草枯分子通过静电直接作用粘附在聚苯乙烯微球的表面，此步骤过程较繁琐。
鉴于上述分子印迹（或者称之为“人工抗体”）技术，实现对不同目标分析物（目标分子）检测，我们知道分子印迹技术是一种制备对特定分子具有专一识别性能的聚合物的技术，分子印迹聚合物对模板分子的识别具有构效预定性、特异识别性和广泛实用性。其基本过程包括:（1）在一定溶剂（也称致孔剂）中，模板分子（即目标分子）与功能单体的预组装，这种组装来自于模板分子与聚合单体的功能基团的共价或者非共价键（如氢键、静电引力、金属螯合作用、电荷转移、疏水作用以及范德华力等）相互作用形成主客体配合物；（2）加入交联剂，通过引发剂引发进行光或热聚合，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成高交联的刚性聚合物；（3）将聚合物中的印迹分子洗脱或解离出来，这样在聚合物中便留下了与印迹分子大小和形状相匹配立体孔穴，同时孔穴中包含了精确排列的与模板分子官能团相补的由功能单体提供的功能基团，这便赋予该聚合物特异的“记忆”功能，提供了对印迹分子的特定结合位点和选择性的摄取能力，即类似于生物的自然识别系统，因此，也称之为人工抗体。根据上述分子印迹技术的特点，需要注意到的是目标分析物（模板分子，印迹分子）的理化性质、结构、大小以及所用的功能单体和交联剂，其均是影响分子印迹合成技术能否取得实质性进展和突破的重要因素，失之毫厘或谬以千里。
因此，我们根据三聚氰胺分子（目标分子）自身拥有三个供电子氨基基团的结构特点，功能单体选择含有吸电子的羧基基团的有机物单体，含有多个不饱和烯烃双键的有机物单体作为交联剂，制备出对三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球，实现对三聚氰胺分子选择性识别和敏感性检测。
在本发明中，我们报道了基于分子印迹技术制备的芯-壳型表面分子印迹微球，实现了对痕量三聚氰胺的检测。芯-壳型表面分子印迹微球尤其适合作为痕量三聚氰胺的检测工具，首先，芯-壳型表面分子印迹微球中易于洗脱了位于壳层的三聚氰胺印迹分子，壳层的内部形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的微球具有对目标分析物分子的特异性识别位点，其次，微球壳层识别位点表面富含吸电子的羧基基团，进入识别位点的目标分析物三聚氰胺分子拥有三个给电子的氨基基团，二者之间以非共价键形式相互作用，实现对目标分析物分子选择性识别和检测。这种对三聚氰胺分子具有专识性作用的芯-壳型表面分子印迹微球，以纳米技术和分子印迹技术为基础、自身富含吸电子羧基基团的特性，显现出对痕量三聚氰胺目标分子的高选择性、高灵敏性和痕量检测。因此，本发明所制备的一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球，其具有制备步骤简单，选择性高，灵敏性强，结合位点多，结合容量大，结合动力学速度快，可重复使用，成本低廉等优点。
发明内容
发明目的：针对目前现有技术存在的不足之处，本发明利用苯乙烯和甲基丙烯酸单体制备表面富含羧基的聚苯乙烯微球，以三聚氰胺作为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，亚苯基双丙烯酰胺为交联剂和偶氮二异庚腈为引发剂与上述制得的聚苯乙烯微球反应得到芯-壳型表面分子印迹微球，此印迹微球中洗脱了位于壳层的三聚氰胺印迹分子，壳层的内部形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的微球具有对目标分析物分子的特异性识别位点，微球壳层识别位点表面富含吸电子的羧基基团，进入识别位点的目标分析物三聚氰胺分子拥有三个给电子的氨基基团，二者之间以非共价键形式相互作用，从而实现对目标分析物分子选择性识别和检测，所述方法为化学合成法，以苯乙烯和甲基丙烯酸为原料制备表面富含羧基的聚苯乙烯微球后，以甲基丙烯酸为功能单体，亚苯基双丙烯酰胺为交联剂，偶氮二异庚腈为引发剂在上述聚苯乙烯微球表面进行聚合反应，制备出对三聚氰胺具有高选择性、高灵敏性识别和痕量检测作用的芯-壳型表面分子印迹微球。
本发明的技术方案是：一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法，其特征在于：所述的印迹微球中洗脱了位于壳层的三聚氰胺印迹分子，壳层的内部形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的微球具有对目标分析物分子的特异性识别位点，微球壳层识别位点表面富含吸电子的羧基基团，进入识别位点的目标分析物三聚氰胺分子拥有三个给电子的氨基基团，二者之间以非共价键形式相互作用，实现对目标分析物分子选择性识别和检测，所述的芯-壳型表面分子印迹微球的制备过程包括如下两个步骤：
1.1第一步是表面富含羧基的功能性单分散聚苯乙烯微球的制备：首先，量取90~100mL的苯乙烯单体，加入到250mL的分液漏斗中，用20~30mL的5%NaOH水溶液清洗3次，再用去离子水洗至中性，转移至250mL锥形瓶中，加无水硫酸钠干燥，干燥后的苯乙烯在氮气气氛保护下进行减压蒸馏，收集13.3kPa/82~83℃馏分，完成对苯乙烯单体的纯化，然后以250mL带有磨口塞的三口烧瓶为反应容器，将5~9mL苯乙烯、0.5~0.9mL甲基丙烯酸分散在80~85mL去离子水中，并加入过硫酸钾40~45mg，通氮气0.3h后，用磁力搅拌器在70℃，500rpm转速搅拌反应10h后，再升温至80℃反应0.5h，获得表面富含羧基的聚苯乙烯微球，再用95%乙醇多次超声分散清洗和离心，去除未反应的底物，最后将所得聚苯乙烯微球重新分散在去离子水中，密封避光保存待用；
1.2第二步是芯-壳型表面分子印迹微球的制备：量取上述制得的表面富含羧基的聚苯乙烯微球4~5mL置于100mL磨口锥形瓶中，再向此锥形瓶中加入35~40mL甲醇，8~10mL乙腈，超声5min，使其完全分散，再取25~30mg三聚氰胺超声分散在上述溶液中后，取9~10μL功能单体，95~100μL交联剂和5~6mg引发剂加至上述混合溶液中，冰浴超声5min，反应混和物在冰浴条件下通氮气10分钟后，在磨口玻璃塞的表面涂抹高温脂密封反应混合物体系，使其在氮气气氛中进行聚合反应，然后将上述混合溶液的锥形瓶置于摇床中，以300rpm转速分阶段升温，先在50℃下预聚合反应4小时后，升温至55℃下聚合反应4小时，再升温至60℃下聚合反应8小时，待反应完成，用乙腈清洗三次，再用甲醇清洗三次后，将所得的芯-壳型表面分子印迹微球在体积比为8:1:1的甲醇/乙腈/乙酸混合液中反复回流萃取三聚氰胺分子，直到提取液在240nm处无紫外吸收，最后将上述制得的芯-壳型表面分子印迹微球用甲醇洗涤，并浸泡过夜，再用甲醇超声分散和离心清洗多次，得到对三聚氰胺分子具有识别和检测功能的芯-壳型表面分子印迹微球，再将其重新分散在甲醇中，密封避光保存。
作为对现有技术的进一步改进，本发明所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中对苯乙烯进行纯化除去阻聚剂对苯二酚、水、固态杂质及其它聚合物；所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用功能单体为甲基丙烯酸；所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用交联剂为亚苯基双丙烯酰胺；所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用引发剂为偶氮二异庚腈；所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中用乙腈清洗三次，再用甲醇清洗三次，其目的是除去溶胀剂及残余有机单体等有机物；所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用的反复回流装置是索氏提取器；所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中的印迹壳层厚度可以通过改变交联剂和功能单体量来控制；所述芯-壳型表面分子印迹微球具有制备简单，易于操作，成本低，可重复使用，结合位点多，吸附动力学速度快，检测灵敏度高，可选择性检测的特点。
相对于现有技术的有益效果：
针对痕量三聚氰胺检测的必要性，国内外研究人员对此进行了具有创新性的发明与改进。2010年Magnotti Ralph等人公开了发明专利（WO2010101777）“Detection ofmelamine”的制备方法。该发明通过制备三聚氰胺抗体，利用免疫测定法检测三聚氰胺，从而确定样品中是否存在三聚氰胺或测定三聚氰胺的含量。2011年Krebs Joseph Francis等人公开了发明专利（US20110008809）“Method for the detection of melamine”的制备方法。该发明提供了一种利用微生物酶——三聚氰胺脱氨酶水解三聚氰胺生成三聚氰酸和氨，再测定所产生的氨含量，进而确定三聚氰胺含量的检测方法。2014年陈达等人公开了发明专利（CN201410591241.8）“一种牛奶和奶粉中三聚氰胺的检测方法”的制备方法。它采用了下述步骤：（1）用蒸馏水或纯水配制不同浓度的三聚氰胺储备液后，分别加入本身不含三聚氰胺的牛奶或奶粉溶解液中，充分振荡混匀得到混合液；（2）混合液与无水乙醇以适当比例混合，振荡均匀后，离心得到上层澄清提取液；（3）将澄清提取液滴在基底上，室温蒸发后得到咖啡环，对此咖啡环物质进行共聚焦显微拉曼光谱检测，得到其拉曼光谱图；（4）对三聚氰胺进行共聚焦显微拉曼光谱检测，得到其拉曼光谱；（5）对比分析咖啡环物质的拉曼谱峰位置及三聚氰胺的拉曼谱峰位置，判断有无三聚氰胺的存在。2015年李娜等人公开了发明专利（US20150004713）“Methods and materials for the detection of melamine”的制备方法。该发明将待测样品与三聚氰酸和金纳米颗粒相互作用后，通过观察其溶液颜色和浊度的改变，实现对痕量三聚氰胺的检测。2016年陈学松等人公开了发明专利（CN201610259923.8）“一种快速测定奶粉中三聚氰胺含量的方法”的制备方法。它采用了下述步骤：称取奶粉2g，用10g弗罗里硅土混匀，将混合均匀的样品装入萃取池中，以浓度为0.2％的乙酸溶液萃取；萃取完成后将萃取液在60℃条件下用旋转蒸发仪蒸干，用2mL乙腈将蒸干后的萃取液溶解后离心，离心后取上清液于高效液相色谱仪进行测定。2016年Katsunori Horii等人公开了发明专利（US20160169875）“Nucleic acid sensor formelamine analysis, device for melamineanalysis, and method for melamineanalysis”的制备方法。该发明主要阐述了一种对三聚氰胺具有特异性检测的核酸传感器的制备方法，其可以根据检测催化核酸分子催化功能的通断判断三聚氰胺是否与核酸分子结合，实现对痕量三聚氰胺的检测。
虽然上述发明有诸多可取之处，但是这些方法制备出的检测材料合成步骤繁琐，成本高，专一性差，且某些产物在高温高压强酸强碱下易变性，不利于保存。而芯-壳型表面分子印迹微球制备步骤简单，选择性高，灵敏性强，可重复使用且成本低廉，因此，芯-壳型表面分子印迹微球是检测痕量三聚氰胺的最佳选择。
本发明的第一步是表面富含羧基的功能性单分散聚苯乙烯微球的制备：首先，量取90~100mL的苯乙烯单体，加入到250mL的分液漏斗中，用20~30mL的5%NaOH水溶液清洗3次，再用去离子水洗至中性，转移至250mL锥形瓶中，加无水硫酸钠干燥，干燥后的苯乙烯在氮气气氛保护下进行减压蒸馏，收集13.3kPa/82~83℃馏分，完成对苯乙烯单体的纯化，然后以250mL带有磨口塞的三口烧瓶为反应容器，将5~9mL苯乙烯、0.5~0.9mL甲基丙烯酸分散在80~85mL去离子水中，并加入过硫酸钾40~45mg，通氮气0.3h后，用磁力搅拌器在70℃，500rpm转速搅拌反应10h后，再升温至80℃反应0.5h，获得表面富含羧基的聚苯乙烯微球，再用95%乙醇多次超声分散清洗和离心，去除未反应的底物，最后将所得聚苯乙烯微球重新分散在去离子水中，密封避光保存待用；
第二步是芯-壳型表面分子印迹微球的制备：量取上述制得的表面富含羧基的聚苯乙烯微球4~5mL置于100mL磨口锥形瓶中，再向此锥形瓶中加入35~40mL甲醇，8~10mL乙腈，超声5min，使其完全分散，再取25~30mg三聚氰胺超声分散在上述溶液中后，取9~10μL功能单体，95~100μL交联剂和5~6mg引发剂加至上述混合溶液中，冰浴超声5min，反应混和物在冰浴条件下通氮气10分钟后，在磨口玻璃塞的表面涂抹高温脂密封反应混合物体系，使其在氮气气氛中进行聚合反应，然后将上述混合溶液的锥形瓶置于摇床中，以300rpm转速分阶段升温，先在50℃下预聚合反应4小时后，升温至55℃下聚合反应4小时，再升温至60℃下聚合反应8小时，待反应完成，用乙腈清洗三次，再用甲醇清洗三次后，将所得的芯-壳型表面分子印迹微球在体积比为8:1:1的甲醇/乙腈/乙酸混合液中反复回流萃取三聚氰胺分子，直到提取液在240nm处无紫外吸收，最后将上述制得的芯-壳型表面分子印迹微球用甲醇洗涤，并浸泡过夜，再用甲醇超声分散和离心清洗多次，得到对三聚氰胺分子具有识别和检测功能的芯-壳型表面分子印迹微球，再将其重新分散在甲醇中，密封避光保存。
综上所述，本发明所得芯-壳型表面分子印迹微球，为用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球。
其一：本发明所提供的方法中，所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中对苯乙烯进行纯化除去阻聚剂对苯二酚、水、固态杂质及其它聚合物。
其二：本发明所提供的方法中，所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用功能单体是甲基丙烯酸。
其三：本发明所提供的方法中，所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用交联剂是亚苯基双丙烯酰胺。
其四：本发明所提供的方法中，所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用引发剂是偶氮二异庚腈。
其五：本发明所提供的方法中，所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中用乙腈清洗三次，再用甲醇清洗三次，其目的是除去溶胀剂及残余有机单体等有机物。
其六：本发明所提供的方法中，所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用的反复回流装置是索氏提取器。
其七：本发明所提供的方法中，所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中的印迹壳层厚度可以通过改变交联剂和功能单体量来控制。
其八：选择芯-壳型表面分子印迹微球的目的，是因为其具有以下优点：（1）制备简单，易于操作，成本低；（2）可重复使用；（3）检测灵敏度高，具有选择性检测特性；（4）结合位点多，吸附动力学速度快。
附图说明
图1是本发明所采用的合成芯-壳型表面分子印迹微球的示意图。
图2是本发明所采用的浓度为10-5mol·L-1甲基丙烯酸与不同浓度的三聚氰胺相互作用的紫外光谱图。
图3是本发明所采用的表面富含羧基的聚苯乙烯微球SEM图。
图4是本发明所采用的表面富含羧基的聚苯乙烯微球的傅里叶变换红外光谱图，A线为清洗3次的聚苯乙烯微球红外谱图；B线为清洗10次的聚苯乙烯微球红外谱图。
图5是本发明所采用的芯-壳型表面分子印迹微球SEM图。
图6是本发明所采用的芯-壳型表面分子印迹微球结合浓度分别为1.0×10-5mol·L-1、3.0×10-5mol·L-1、5.0×10-5mol·L-1、7.0×10-5mol·L-1、9.0×10-5mol·L-1的目标分析物三聚氰胺的等温吸附曲线，曲线（A）为三聚氰胺与芯-壳型表面分子印迹微球结合的等温吸附曲线；曲线（B）为莠去津与芯-壳型表面分子印迹微球结合的等温吸附曲线；曲线（C）为相同浓度的三聚氰胺在非印迹微球上的等温吸附曲线。
图7是本发明所采用的芯-壳型表面分子印迹微球和正常印迹微球上三聚氰胺分子的吸附动力学曲线，曲线（A）表示三聚氰胺分子在芯-壳型表面分子印迹微球上的吸附动力学曲线；曲线（B）表示三聚氰胺在正常印迹微球上的吸附动力学曲线。
根据附图进一步解释具体实施方式
图1是本发明所采用的合成芯-壳型表面分子印迹微球的示意图。首先，将苯乙烯和甲基丙烯酸单体超声分散溶解在水中，在氮气气氛下，用过硫酸钾作为引发剂，聚合反应制备得到表面富含羧基的聚苯乙烯微球，再将三聚氰胺作为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，亚苯基双丙烯酰胺为交联剂和偶氮二异庚腈为引发剂与上述制得的聚苯乙烯微球反应得到芯-壳型表面分子印迹微球，最后将印迹微球壳层中的三聚氰胺印迹分子洗脱，得到对三聚氰胺具有选择性识别和检测的芯-壳型表面分子印迹微球。
图2是本发明所采用的浓度为10-5mol·L-1甲基丙烯酸与不同浓度的三聚氰胺相互作用的紫外光谱图。图中从右到左的曲线依次表示浓度为5×10-5mol·L-1、4×10-5mol·L-1、3×10-5mol·L-1、2×10-5mol·L-1、1×10-5mol·L-1、0mol·L-1三聚氰胺溶液与甲基丙烯酸溶液的紫外光谱图。由图可知，随着三聚氰胺浓度的增加，谱图发生明显的红移现象，表明三聚氰胺分子的活性基团氨基（-NH2）上的孤对电子云移向了甲基丙烯酸的缺电子羧基（-COOH），形成氢键，致使吸收峰向波长长的方向移动。而且随着三聚氰胺溶液浓度的不断增加，谱线的红移现象愈加显著，说明甲基丙烯酸与三聚氰胺间的氢键作用越来越强。
图3是本发明所采用的表面富含羧基的聚苯乙烯微球SEM图。由图可知表面富含羧基的聚苯乙烯微球粒径约为350~390nm，粒子表面十分平滑，呈圆球状并高度分散。
图4是本发明所采用的表面富含羧基的聚苯乙烯微球的傅里叶变换红外光谱图，A线为清洗3次的聚苯乙烯微球红外谱图；B线为清洗10次的聚苯乙烯微球红外谱图。由图可知苯环的振动吸收峰出现在1450cm-1、1490cm-1处，2920cm-1，3025cm-1处的吸收峰归属于苯环中C-H键的伸缩振动，证明了产物中有苯环存在。在690~770cm-1内有两个强吸收峰（696cm-1、755cm-1），说明苯环为一元取代物，证明了产物中有聚苯乙烯存在。羰基的特征吸收峰出现在1700cm-1处，在2750~3250cm-1内有一个宽化的吸收峰，归属于羟基和羧基二聚体的伸缩振动，证明了产物中有羧基存在。因为聚丙烯酸是水溶性聚合物，在后处理过程中已去除，所以产物不是聚苯乙烯和聚丙烯酸的混合物。由以上结果可知，产物为含有羧基的功能性聚苯乙烯微球。
图5是本发明所采用的芯-壳型表面分子印迹微球SEM图。由图可知芯-壳型表面分子印迹微球粒径约为400nm，大小均匀一致，达到微纳级别，粒子高度分散，表面平滑，形貌呈圆球状。与图3中聚苯乙烯微球相比，其粒径明显增加，表明三聚氰胺印迹壳层已包覆在聚苯乙烯微球表面。
图6是本发明所采用的芯-壳型表面分子印迹微球结合浓度分别为1.0×10-5mol·L-1、3.0×10-5mol·L-1、5.0×10-5mol·L-1、7.0×10-5mol·L-1、9.0×10-5mol·L-1的目标分析物三聚氰胺的等温吸附曲线，曲线（A）为三聚氰胺与芯-壳型表面分子印迹微球结合的等温吸附曲线；曲线（B）为莠去津与芯-壳型表面分子印迹微球结合的等温吸附曲线；曲线（C）为相同浓度的三聚氰胺与非印迹微球结合的等温吸附曲线。比较图中曲线（A）和曲线（B）可知，芯-壳型表面分子印迹微球对三聚氰胺分子的最大平衡吸附量为37.7nmol，对莠去津分子的最大平衡吸附量为8.3nmol，其对三聚氰胺分子的平衡吸附量远远大于对莠去津分子的平衡吸附量，从而证实了本发明所制备的印迹材料可选择性识别目标分析物三聚氰胺。比较曲线（A）和曲线（C）可知，芯-壳型表面分子印迹微球对三聚氰胺的最大吸附量是非印迹材料的10倍，芯-壳型表面分子印迹微球对三聚氰胺具有较大的结合容量主要是由于微纳印迹材料具有高的比表面积、高比例的表面印迹位点以及能够完全除去印迹材料的模板分子的特性。本发明制备的芯-壳型表面分子印迹微球对目标分子的印迹能力更强，是由于聚合物微球具有超薄的微纳壳层，目标分析溶液更容易扩散到整个微纳壳层的表面，使三聚氰胺分子更容易接近位于微纳壳层表面或接近表面的印迹位点，也因此，芯-壳型表面分子印迹微球对三聚氰胺的结合容量更大。
图7是本发明所采用的芯-壳型表面分子印迹微球和正常印迹微球上三聚氰胺分子的吸附动力学曲线，曲线（A）为三聚氰胺分子在芯-壳型表面分子印迹微球上的吸附动力学曲线；曲线（B）为三聚氰胺在正常印迹微球上的吸附动力学曲线。取芯-壳型表面分子印迹微球甲醇溶液1mL（约含微球10mg）于15mL离心管中，加入浓度为5.0×10-5mol·L-1的三聚氰胺甲醇溶液10mL，测定不同吸附时间印迹材料吸附三聚氰胺分子的吸附量。正常三聚氰胺印迹的微粒吸附动力学测定方法同上。在达到平衡吸附前，三聚氰胺印迹的聚苯乙烯微球从溶液相中吸附三聚氰胺分子的速度要远远大于正常印迹的微球。芯-壳型表面分子印迹微球从溶液相中吸附三聚氰胺分子达到平衡吸附量的50%仅用时50min，远小于其达到平衡时的时间180min，如图7中曲线A所示。同时实验结果表明正常印迹的微球从溶液相中吸附三聚氰胺分子在达到平衡吸附量的50%时所需的时间约110min，而达到平衡吸附时间长达300min，如图7中曲线B所示。这是因为在芯-壳型结构的微球中大部分的识别位点是位于印迹材料的壳层表面以及表面附近，便于目标分子进入识别位点，同时也使三聚氰胺分子进入识别位点的扩散阻力小于正常印迹的微球；另一方面，芯-壳型结构的微球能够很好的分散在分析溶液中，进一步的减小质量传递阻力。
具体实施方式
一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法，其特征在于：所述的印迹微球中洗脱了位于壳层的三聚氰胺印迹分子，壳层的内部形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的微球具有对目标分析物分子的特异性识别位点，微球壳层识别位点表面富含吸电子的羧基基团，进入识别位点的目标分析物三聚氰胺分子拥有三个给电子的氨基基团，二者之间以非共价键形式相互作用，实现对目标分析物分子选择性识别和检测，所述的芯-壳型表面分子印迹微球的制备过程包括如下两个步骤：
1.1第一步是表面富含羧基的功能性单分散聚苯乙烯微球的制备：首先，量取90~100mL的苯乙烯单体，加入到250mL的分液漏斗中，用20~30mL的5%NaOH水溶液清洗3次，再用去离子水洗至中性，转移至250mL锥形瓶中，加无水硫酸钠干燥，干燥后的苯乙烯在氮气气氛保护下进行减压蒸馏，收集13.3kPa/82~83℃馏分，完成对苯乙烯单体的纯化，然后以250mL带有磨口塞的三口烧瓶为反应容器，将5~9mL苯乙烯、0.5~0.9mL甲基丙烯酸分散在80~85mL去离子水中，并加入过硫酸钾40~45mg，通氮气0.3h后，用磁力搅拌器在70℃，500rpm转速搅拌反应10h后，再升温至80℃反应0.5h，获得表面富含羧基的聚苯乙烯微球，再用95%乙醇多次超声分散清洗和离心，去除未反应的底物，最后将所得聚苯乙烯微球重新分散在去离子水中，密封避光保存待用；
1.2第二步是芯-壳型表面分子印迹微球的制备：量取上述制得的表面富含羧基的聚苯乙烯微球4~5mL置于100mL磨口锥形瓶中，再向此锥形瓶中加入35~40mL甲醇，8~10mL乙腈，超声5min，使其完全分散，再取25~30mg三聚氰胺超声分散在上述溶液中后，取9~10μL功能单体，95~100μL交联剂和5~6mg引发剂加至上述混合溶液中，冰浴超声5min，反应混和物在冰浴条件下通氮气10分钟后，在磨口玻璃塞的表面涂抹高温脂密封反应混合物体系，使其在氮气气氛中进行聚合反应，然后将上述混合溶液的锥形瓶置于摇床中，以300rpm转速分阶段升温，先在50℃下预聚合反应4小时后，升温至55℃下聚合反应4小时，再升温至60℃下聚合反应8小时，待反应完成，用乙腈清洗三次，再用甲醇清洗三次后，将所得的芯-壳型表面分子印迹微球在体积比为8:1:1的甲醇/乙腈/乙酸混合液中反复回流萃取三聚氰胺分子，直到提取液在240nm处无紫外吸收，最后将上述制得的芯-壳型表面分子印迹微球用甲醇洗涤，并浸泡过夜，再用甲醇超声分散和离心清洗多次，得到对三聚氰胺分子具有识别和检测功能的芯-壳型表面分子印迹微球，再将其重新分散在甲醇中，密封避光保存。
芯-壳型表面分子印迹微球中洗脱了位于壳层的三聚氰胺印迹分子，壳层的内部形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的微球具有对目标分析物分子的特异性识别位点，微球壳层识别位点表面富含吸电子的羧基基团，进入识别位点的目标分析物三聚氰胺分子拥有三个给电子的氨基基团，二者之间以非共价键形式相互作用，实现对目标分析物分子选择性识别和检测。
实施例：利用苯乙烯、甲基丙烯酸为原料，经两步反应可获得芯-壳型表面分子印迹微球。
第一步是表面富含羧基的功能性单分散聚苯乙烯微球的制备：首先，量取100mL的苯乙烯单体，加入到250mL的分液漏斗中，用30mL的5%NaOH水溶液清洗3次，再用去离子水洗至中性，转移至250mL锥形瓶中，加无水硫酸钠干燥，干燥后的苯乙烯在氮气气氛保护下进行减压蒸馏，收集13.3kPa/82~83℃馏分，完成对苯乙烯单体的纯化，然后以250mL带有磨口塞的三口烧瓶为反应容器，将8mL苯乙烯、0.8mL丙烯酸分散在80mL水溶液中，并加入过硫酸钾40mg，通氮气0.3h后，用磁力搅拌器在70℃，500rpm转速搅拌反应10h后，再升温至80℃反应0.5h，获得表面富含羧基的聚苯乙烯微球，再用95%乙醇的多次分散清洗和离心所得到的反应产物以去除未反应的底物，最后将所得聚苯乙烯微球重新分散在去离子水中，密封避光保存待用；
第二步是芯-壳型表面分子印迹微球的制备：量取上述制得的表面富含羧基的聚苯乙烯微球4mL置于100mL磨口锥形瓶中，再向此锥形瓶中加入35mL甲醇，8mL乙腈，超声5min，使其完全分散，再取25mg三聚氰胺超声分散在上述溶液中后，取9.2μL功能单体，100μL交联剂和5.8mg引发剂加到上述混合溶液中去，冰浴超声5min，反应混和物在冰浴条件下通氮气10分钟后，在磨口玻璃塞的表面涂抹高温脂密封反应混合物体系，使其在氮气气氛中进行聚合反应，然后将上述混合溶液的锥形瓶置于摇床中，以300rpm转速分阶段升温，先在50℃下预聚合反应4小时后，升温至55℃下聚合反应4小时，再升温至60℃下聚合反应8小时，待反应完成，用乙腈清洗三次，再用甲醇清洗三次后，将所得的芯-壳型表面分子印迹微球在体积比为8:1:1的甲醇/乙腈/乙酸混合液中反复回流萃取三聚氰胺分子，直到提取液在240nm处无紫外吸收，最后将上述制得的芯-壳型表面分子印迹微球用甲醇洗涤，并浸泡过夜，再用甲醇超声分散和离心清洗多次，得到对三聚氰胺具有识别和检测功能的芯-壳型表面分子印迹微球，再将其重新分散在甲醇中，密封避光保存。

Claims (8)

1.一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法，其特征在于：所述的印迹微球中洗脱了位于壳层的三聚氰胺印迹分子，壳层的内部形成具有与印迹分子结构、大小和功能基互补的空穴结构，洗脱印迹分子的微球具有对目标分析物分子的特异性识别位点，微球壳层识别位点表面富含吸电子的羧基基团，进入识别位点的目标分析物三聚氰胺分子拥有三个给电子的氨基基团，二者之间以非共价键形式相互作用，实现对目标分析物分子选择性识别和检测，所述的芯-壳型表面分子印迹微球的制备过程包括如下两个步骤：
1.1第一步是表面富含羧基的功能性单分散聚苯乙烯微球的制备：首先，量取90~100mL的苯乙烯单体，加入到250mL的分液漏斗中，用20~30mL的5%NaOH水溶液清洗3次，再用去离子水洗至中性，转移至250mL锥形瓶中，加无水硫酸钠干燥，干燥后的苯乙烯在氮气气氛保护下进行减压蒸馏，收集13.3kPa/82~83℃馏分，完成对苯乙烯单体的纯化，然后以250mL带有磨口塞的三口烧瓶为反应容器，将5~9mL苯乙烯、0.5~0.9mL甲基丙烯酸分散在80~85mL去离子水中，并加入过硫酸钾40~45mg，通氮气0.3h后，用磁力搅拌器在70℃，500rpm转速搅拌反应10h后，再升温至80℃反应0.5h，获得表面富含羧基的聚苯乙烯微球，再用95%乙醇多次超声分散清洗和离心，去除未反应的底物，最后将所得聚苯乙烯微球重新分散在去离子水中，密封避光保存待用；
1.2第二步是芯-壳型表面分子印迹微球的制备：量取上述制得的表面富含羧基的聚苯乙烯微球4~5mL置于100mL磨口锥形瓶中，再向此锥形瓶中加入35~40mL甲醇，8~10mL乙腈，超声5min，使其完全分散，再取25~30mg三聚氰胺超声分散在上述溶液中后，取9~10μL功能单体，95~100μL交联剂和5~6mg引发剂加至上述混合溶液中，冰浴超声5min，反应混和物在冰浴条件下通氮气10分钟后，在磨口玻璃塞的表面涂抹高温脂密封反应混合物体系，使其在氮气气氛中进行聚合反应，然后将上述混合溶液的锥形瓶置于摇床中，以300rpm转速分阶段升温，先在50℃下预聚合反应4小时后，升温至55℃下聚合反应4小时，再升温至60℃下聚合反应8小时，待反应完成，用乙腈清洗三次，再用甲醇清洗三次后，将所得的芯-壳型表面分子印迹微球在体积比为8:1:1的甲醇/乙腈/乙酸混合液中反复回流萃取三聚氰胺分子，直到提取液在240nm处无紫外吸收，最后将上述制得的芯-壳型表面分子印迹微球用甲醇洗涤，并浸泡过夜，再用甲醇超声分散和离心清洗多次，得到对三聚氰胺分子具有识别和检测功能的芯-壳型表面分子印迹微球，再将其重新分散在甲醇中，密封避光保存。
2.根据权利要求1所述的一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法，其特征是：所述的芯-壳型表面分子印迹微球制备中对苯乙烯进行纯化以去除阻聚剂对苯二酚、水、固态杂质及其它聚合物。
3.根据权利要求1所述的一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法，其特征是：所述的芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用功能单体是甲基丙烯酸。
4.根据权利要求1所述的一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法，其特征是：所述的芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用交联剂是亚苯基双丙烯酰胺。
5.根据权利要求1所述的一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法，其特征是：所述的芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用引发剂是偶氮二异庚腈。
6.根据权利要求1所述的一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法，其特征是：所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中用乙腈清洗三次，再用甲醇清洗三次，其目的是去除溶胀剂及残余有机单体等有机物。
7.根据权利要求1所述的一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法，其特征是：所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中所用的反复回流装置是索氏提取器。
8.根据权利要求1所述的一种用于三聚氰胺检测的芯-壳型表面分子印迹微球的制备方法，其特征是：所述芯-壳型表面分子印迹微球制备中的印迹壳层厚度可以通过改变交联剂和功能单体量来控制。
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