CN112067566A - 一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,该传感器在碱性的基础溶液中与糖化血红蛋白结合,并利用紫外吸光度法测定糖化血红蛋白的含量;该传感器包括由4‑MPBA与AuNPs共孵育得到的MPBA‑AuNPs。该传感器不仅灵敏、准确,而且操作简单,数据读取方便,对操作者的要求较低,具有更好的普适性。
Description
技术领域
本发明属于纳米生物材料领域,尤其是涉及一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器。
背景技术
糖化血红蛋白(HbA1c)是存在于红细胞中典型的糖基化蛋白,在长时间(2-3个月)的检测结果显示一致,因此成为监测糖尿病血糖控制的一种既定检测手段。糖尿病患者可以利用体内HbA1c水平来监测长期血糖控制情况,而不受血糖水平波动的影响。医生也可以通过患者体内HbA1c水平评估潜在的糖尿病并发症风险。
美国糖尿病协会规定,当HbA1c水平高于6.5%或者48mmol/mol时该测试者极大可能患有糖尿病或者血糖控制不佳。对于怀孕的糖尿病患者,HbA1c的检测也尤为重要,可以将先天畸形、妊娠并发症等风险降到最低。因此,需要准确、精确的方法来检测HbA1c,以更好地诊断和监测控制糖尿病的情况。
在近些年的研究中,根据HbA1c的特点,开发出了几十种HbA1c检测方法,例如免疫测定,离子交换色谱,硼酸酯亲和色谱,电泳法和酶法等。其中,高效液相色谱法(HPLC)是HbA1c的黄金参考方法。
虽然HPLC方法比较成熟,但是实验操作相对比较复杂,并且需要具备专业操作经验的工作人员来完成,适用于大型医院和研究机构。而对于偏远地区或者仪器及人员条件不具备的场所,该检测方法在操作简单、方便、快捷等方面仍然存在一定的局限性。
基于以上所述,本发明拟应用硼酸对糖化血红蛋白的糖基化部分的特异性识别的特点,构建一种基于金纳米颗粒聚集变色的比色传感器,能够简单、快速、方便、灵敏地检测糖化血红蛋白,为糖化血红蛋白在糖尿病诊断及监测方面提供一种新的技术手段。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提出一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,该传感器基于硼酸衍生物特异性识别糖化血红蛋白这一原理构建了一种糖化血红蛋白的比色传感器,该方法不仅灵敏、准确,而且操作简单,数据读取方便,对操作者的要求较低,具有更好的普适性。
一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,该传感器在碱性的基础溶液中与糖化血红蛋白结合,并利用紫外吸光度法测定糖化血红蛋白的含量;
该传感器包括由4-巯基苯硼酸(4-MPBA)与金纳米粒子(AuNPs)共孵育得到的MPBA-AuNPs。
进一步,所述AuNPs的粒径为10-100nm;优选地,AuNPs的粒径为所述AuNPs的粒径为30nm-40nm、40nm-50nm、50nm-60nm、60nm-70nm、70nm-80nm、80nm-90nm中的一种。
进一步,所述基础溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液;所述基础溶液的pH值为7.4-10。
本发明还在于公开MPBA-AuNPs的制备方法,至少包括如下步骤:
向AuNPs溶液中加入用有机溶液溶解的4-MPBA溶液,常温搅拌1-4h。
其中,AuNPs溶液浓度与4-MPBA在AuNPs溶液中的终浓度的比值为58:(1-4)。
本发明还在于公开上述传感器检测糖化血红蛋白的含量的过程如下:
(1)向基础溶液中加入MPBA-AuNPs浓缩液;
(2)向步骤(1)所得的溶液中加入HbA1c;
(3)将步骤(2)所得溶液离心,弃去上清液后用水复溶,静置;
(4)对步骤(3)所得溶液进行紫外吸光光度法测定,并对照HbA1c标准曲线,计算得到HbA1c浓度。
其中,步骤(1)所得溶液中MPBA-AuNPs的浓度与步骤(2)所得溶液中HbA1c的浓度比为(0.5-2):10,优选地,该浓度比为1:10;更优选地,步骤(1)所得溶液中MPBA-AuNPs的终浓度为0.2-0.5nM,步骤(2)所得溶液中HbA1c的终浓度为2-5nM。
其中,步骤(3)的离心时间为3-8min,离心转速为8000r/min-10000r/min。
本发明为基于硼酸衍生物构建的一种新型比色传感器。因为硼酸衍生物对HbA1c糖基化部分有特异性识别作用,所以我们在柠檬酸盐还原法得到的30nm AuNPs表面通过Au-S键修饰上4-MPBA用于特异性捕捉样品中的HbA1c。又根据HbA1c结构中含有两个及以上的糖基化位点,从而诱导MPBA-AuNPs发生聚集,有肉眼可见的红色变成蓝紫色,紫外吸收光谱会有新的吸收峰出现。通过吸收强度比值A600/A527的变化规律实现HbA1c的浓度检测。HbA1c检测的标准曲线,线性方程是y=0.13674x+0.1985,并且线性关系良好R2=0.989,线性范围是0-4nM,检测限为0.17nM。最后通过实验证明比色传感器具有良好的选择特异性和稳定性。在实际应用中,设计的新型比色传感器的检测结果与市售糖化血红蛋白检测试剂盒的检测结果对比差异性不明显(P>0.05)。设计的新型比色传感器具有以下优点:1)所需溶血液样品少;2)低成本;3)操作简单,且溶血液不需要进行前期变异性血红蛋白的预处理;4)灵敏度高,检测限比较低;5)整个测试时间控制在30min内;6)稳定性高,30天内检测结果显著性差异不明显P>0.05。因此,设计的新型比色传感器具有很大的应用前景。
附图说明
图1A为AuNPs(5.8nM)的溶液中,加入不同浓度的4-MPBA,对应的紫外吸收光谱;图1B为加入不同浓度的4-MPBA时,对应的反应液图片。
图2A为AuNPs、MPBA-AuNPs、MPBA-AuNPs+HbA1c的紫外吸收光谱图;图2B为AuNPs、MPBA-AuNPs的拉曼光谱图;图2C为AuNPs、MPBA-AuNPs的粒径分布图;图2D为AuNPs、MPBA-AuNPs电势图。
图3为AuNPs、MPBA-AuNPs、MPBA-AuNPs+HbA1c的透射电镜。
图4为HbA1c(4nM)在不同pH缓冲液中的紫外光谱图。
图5A、图5B、图5C为离心时间为5min,转速分别为8000r/min、9000r/min、10000r/min对应的紫外吸收光谱。
图6为HbA1c在不同孵育时间紫外吸收光谱中A600/A527对应的柱状图。
图7A为在文齐氏转化液中,不同浓度Hb的紫外吸收光谱;图7B为HiCN在540nm处的吸收强度与Hb浓度的线性关系图。
图8A为MPBA-AuNPs随HbA1c浓度变化的紫外吸收光谱;图8B为A600/A527随HbA1c浓度变化的关系图;图8C为A600/A527随HbA1c浓度变化的标准曲线。
图9A为比色传感器对HbA1c的选择性实验;图9B为比色传感器对HbA1c的竞争性实验。
图10为比色传感器与市售糖化血红蛋白试剂盒检测方法对比柱状图(两组数据对比P>0.05)。
图11为A600/A527的比值与纳米材料MPBA-AuNPs的放置时间关系柱状图。
具体实施方式
除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下面结合实施例来详细说明本发明。
一、实验部分
1检测材料AuNPs的制备
实验前,首先配制用于清洁玻璃实验用品的王水,浓盐酸和浓硝酸的体积比为3:1。一般是配制完成后半小时使用最佳。
1.1 13nm AuNPs种子液制备
实验前,将所有待使用的玻璃容器用王水浸泡30min,然后用自来水和娃哈哈纯净水冲洗多次。向加热煮沸的100mL HAuCl4(1mM)水溶液中快速加入沸腾的溶有114mg柠檬酸钠的10mL娃哈哈纯净水,加热搅拌回流15min。溶液的颜色由浅黄变成黑色,最终变成深红色。最后停止加热,搅拌冷却至室温,即得。
1.2 30nm AuNPs原材料制备
实验前,将待使用的玻璃容器用王水浸泡30min,并用自来水和娃哈哈纯净水清洗。13nm AuNPs的浓度根据紫外吸光度计算,加入一定体积的13nm AuNPs于125mL娃哈哈纯净水中,使终浓度为0.98nM。再加入1mL盐酸羟胺(0.2M),均匀搅拌1min。然后将208μLHAuCl4(100mM)溶解于10mL娃哈哈纯净水中,用恒压滴液漏斗逐滴加入,滴加完毕后均匀搅拌30min。最后加入1.6mL柠檬酸钠(W/W,5%),搅拌10min使30nm AuNPs更加稳定。30nmAuNPs溶液的颜色为红色。
1.3 MPBA-AuNPs检测材料的制备
因巯基和AuNPs表面很容易形成Au-S共价键,所以我们采用4-MPBA以Au-S键共价结合在AuNPs表面,又可以实现苯硼酸对HbA1c的糖基化部分进行特异性识别。
接下来,我们对4-MPBA与AuNPs的浓度比例进行筛选。首先我们通过紫外吸光度计算浓缩后AuNPs的浓度。浓缩后30nm AuNPs最终用0.1%的SDS分散,经过计算30nm AuNPs的浓度为5.8nM。然后配制浓度为10-4M的4-MPBA浓储液。分别向1mL的30nm AuNPs溶液中加入不同体积的4-MPBA浓储液,使4-MPBA的浓度梯度为0μM、0.06μM、0.08μM、0.10μM、0.20μM、0.30μM、0.40μM,常温搅拌2h。最终利用紫外吸收光谱及颜色变化判断30nm AuNPs的状态,选择最优4-MPBA的反应浓度。反应完成后用0.1%SDS的娃哈哈纯净水离心洗涤3次以上除去未参与反应的4-MPBA,然后浓缩,并通过紫外吸收光谱计算得到浓缩液的浓度,4℃保存。
2反应条件筛选
2.1 MPBA-AuNPs与HbA1c pH反应条件筛选
pH值是影响HbA1c与苯基硼酸之间稳定络合物形成的重要因素之一。因此接下来我们对反应体系中溶液的pH进行筛选。
首先配制25mM的HEPES作为反应的基础溶液,分别调节反应液的pH至7.2、7.4、8.0、8.8、9.6、10。然后向不同pH的HEPES缓冲液中加入一定量的MPBA-AuNPs浓缩液,稀释后使终浓度为0.4nM。最后向上述溶液中加入一定量的HbA1c,终浓度为4nM。室温静置5min后,9000r/min离心5min,弃去上清液,用娃哈哈纯净水复溶。将上述溶液静置15min,通过紫外吸收光谱判断MPBA-AuNPs的聚集程度筛选最佳pH。
2.2 MPBA-AuNPs与HbA1c离心转速筛选
接下来我们对离心机的转速进行筛选。首先向pH为8.5的25mM的HEPES中加入一定体积的MPBA-AuNPs,使终浓度为0.4nM。然后向其中加入不同体积的HbA1c浓储液,定容至500μL,使HbA1c的浓度分别为0nM、1.25nM、2.50nM、5.00nM、7.50nM,每个样品平行3个。设置离心参数分别为8000r/min、9000r/min和10000r/min,时间均为5min。弃去上清液,用娃哈哈纯净水复溶。将上述溶液静置15min,通过紫外吸收光谱的变化选出最优离心参数。
2.3 MPBA-AuNPs与HbA1c反应时间筛选
根据上面的实验,我们选定pH值为8.5,离心转数为9000r/min,离心时间为5min。接下来,我们又对反应时间进行了筛选。首先向pH为8.5的25mM的HEPES中加入一定体积的MPBA-AuNPs,使终浓度为0.4nM。然后向其中加入一定体积的HbA1c浓储液,定容至500μL,终浓度为4nM。离心5min后,分别测定1-20min的紫外吸收,平行制备3个样品进行测试,确定反应时间。
3标准曲线的建立
3.1 Hb标准曲线的建立
红细胞在娃哈哈纯净水吸水涨破释放出Hb,其颜色深浅与含量在一定范围内成正比。我们采用常见的文齐氏转化液对溶血液中Hb进行测定。其中文齐氏转化液的配制方法如下:K3Fe(CN)6 200mg、KCN 50mg、KH2PO4 140mg、Triton X-100 1mL,加蒸馏水定容至1000mL。接下来配制浓度为20g/L的Hb浓储液。分别加入不同体积的浓储液,用文齐氏转化液定容至1.5mL,使测试样品中Hb浓度分别为0μM、2.07μM、4.13μM、6.20μM、8.27μM、10.33μM、12.40μM、14.47μM,呈现一定的浓度梯度,室温静置10min,检测540nm处的紫外吸光度,平行制备3个样品进行测试。
3.2 HbA1c标准曲线的建立
HbA1c可以和MPBA-AuNPs发生特异性吸附,并且每个HbA1c含有两个以上的特异性识别部分,每个AuNPs会特异性吸附多个HbA1c,因此这种特异性吸附以及多个结合位点会导致AuNPs的聚集。这种聚集可以通过紫外吸收光谱进行定性和定量的判断。所以通过这种原理,我们进行了一下设计,不仅能定性的检测出HbA1c的存在,并且能定量的检测出HbA1c的含量。
首先向pH为8.5的25mM的HEPES中加入一定体积的MPBA-AuNPs,使终浓度为0.4nM。然后向其中加入不同体积的HbA1c浓储液,定容至500μL,使HbA1c的终浓度分别为0nM、0.5nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、4.0nM、5.0nM、6.0nM,呈现一定的浓度梯度,每个样品平行3个。离心参数设置为9000r/min,5min。最后弃去上清液,用娃哈哈水定容至500μL。静置15min,紫外分光光度计测试每个样品对应的紫外吸收光谱,平行制备3个样品进行测试。
4 特异性实验
4.1 选择性实验
根据正常人血液中各种小分子的含量与HbA1c比例范围,分别配制浓度0.1mM的葡萄糖(Gul)、半乳糖(Gal)、果糖(Fru)溶液,浓度为0.01mM的多巴胺(DA)、抗坏血酸(VC)溶液,以及浓度为25μM的Hb溶液,浓度为1μM的BSA、HbA1c溶液。
具体操作与3.2部分相似,仅将加样部分分别替换成上述浓度的Gul、半Gal、Fru、DA、VC、BSA、Hb以及HbA1c,加样量为5μL,其他操作相同,平行样品重复3次。
4.2竞争性实验
分别配制浓度0.2mM的Gul、Gal、Fru溶液,浓度为0.02mM的DA、VC溶液,以及浓度为50μM的Hb溶液,浓度为2μM的BSA、HbA1c溶液。
具体操作与3.2部分相似,仅将加样部分分别替换成2.5μL上述浓度的Gul、Gal、Fru、DA、VC、BSA、Hb,再加入2.5μL的2μM的HbA1c溶液,其他操作相同,平行样品重复3次。
4.3回收率和变异系数的测定
根据标准曲线的取值范围影响,本步实验操作选取1nM、2nM、4nM来检测HbA1c的回收率。具体操作与3.2部分相似,仅将加样部分替换成上述浓度的HbA1c,其他也操作相同,平行样品重复3次。每个浓度批间变异系数都以不同的3天的3个重复样品测得的数据来进行计算,每个浓度批内变异系数都以1天内3个重复样品测得的数据来进行计算。根据指定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算。
4.4纳米材料MPBA-AuNPs稳定性实验
接下来我们对检测材料MPBA-AuNPs的稳定性进行了实验。首先按照1.3的操作方法制备检测材料MPBA-AuNPs,并浓缩放置4℃储存。然后分别在1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、4d、8d、12d、20d、30d利用上述材料对终浓度为5nM的HbA1c进行测试。
5 实际体系检测的应用
5.1 葡萄糖孵育全血
1)配制浓度分别为0g/L、1.00g/L、2.00g/L、3.00g/L、4.00g/L、5.00g/L、6.00g/L、7.00g/L、8.00g/L九种浓度的葡糖糖生理盐水。
2)取4mL脱纤维全山羊血至于离心管中,以2000r/min,离心10min,弃去上清液的红细胞,再加入生理盐水2-4mL,离心机相同参数离心,按照上述方法用生理盐水重复洗涤2-3次,得到红细胞悬浮液。
3)将红细胞悬浮液与上述九种浓度的葡糖糖生理盐水体积比按照1:1的比例互溶,37℃摇床孵育8h。
4)离心除去剩余的葡萄糖,并且用生理盐水离心清洗2-3次,最后得到压积红细胞。
5)取压积红细胞1mL于EP管中,加入1.5mL冷娃哈哈纯净水,用涡旋混匀器充分震荡1min制得溶血液,此溶血液在-20℃,可以保存70天。
5.2糖化血红蛋白试剂盒检测HbA1c
1)溶血液的Hb浓度测定方法:取溶血液6μL加入1.5mL氰化高铁血红蛋白测试液混匀,室温放置10min,用紫外分光光度计测量波长540nm的吸光度值。将所得吸光度×0.3677即为Hb的含量g/mL。
2)溶血液的HbA1c浓度测定方法:a)酸化:取玻璃试管,表明“0”即空白管,“U”即测定管,在“0”管中加入娃哈哈纯净水2mL,“U”管中加入溶血液2mL,然后各管均加入试剂一1mL酸化。加入试剂一要缓慢,边滴边摇边加入。b)水解:将上述试管加橡皮塞或塑料薄膜,置沸水浴中或干燥箱100℃加热水解1h。c)显色:各管边滴边摇边缓慢加入蛋白沉淀剂1mL,加完后在漩涡混匀器上混匀,再3000r/min,离心10min。取上清液2mL,各个试管中加入显色剂0.5mL,40℃水浴保温30min。冷却后,波长443nm,光径1cm,娃哈哈纯净水调零,测定各管吸光度值。
HbA1c(%)=(每10g血红蛋白吸光度×0.001|0.0154)×100
5.3比色传感器与市售糖化血红蛋白试剂盒检测方法对比
1)溶血液中Hb浓度测定:取溶血液6μL加入1.5mL氰化高铁血红蛋白测试液混匀,室温放置10min,用紫外分光光度计测量波长540nm的吸光度值。根据标准曲线的方程式计算溶血液中Hb含量。
2)溶血液的HbA1c浓度测定:取10μL溶血液稀释20000倍做为测试样品。具体操作与2.2.6部分相似,仅将加样部分换成上述溶血液稀释液,加入体积相同,其他操作相同,平行样品重复3次。
上述5.2及5.3中的公式均由国际临床化学联合会(IFCC,InternationalFederation of Clinical Chemistry)制定。
二实验结果与讨论
1 4-MPBA浓度的筛选
首先,AuNPs表面极易与巯基发生共价结合,形成Au-S共价键,所以以此方法对AuNPs修饰上4-MPBA小分子,这样可以实现苯硼酸对HbA1c的糖基化部分进行特异性识别。另外,紫外吸收特征峰会随着AuNPs粒径的逐渐增大而发生一定程度的红移,AuNPs聚集会有新的紫外吸收峰产生,并且伴有肉眼可见的颜色变化,由红色变成蓝紫色。
实验结果如图1A所示,当加入的4-MPBA浓度大于0.20μM时,在大于600nm时有新的紫外吸收峰产生,说明高浓度的4-MPBA引发了AuNPs的聚集。反应液中4-MPBA的浓度小于0.20μM时,AuNPs的紫外吸收峰没有发生明显的变化。图1B为图1A中对应的图片,由图可知,AuNPs在从左至右的第六和第七个样品中AuNPs发生了不同程度的聚集,同时也证明了上述分析结果的正确性。因此,在AuNPs的浓度为5.8nM时,我们选择4-MPBA的反应浓度为0.2μM。
2 MPBA-AuNPs检测材料的表征
接下来,我们对4-MPBA功能化的AuNPs进行表征。前面提到,不同粒径的AuNPs紫外吸收光谱中有不同的特征峰,本实验用的30nm的AuNPs的紫外吸收特征峰为525nm,如图2A所示,当30nm AuNPs表面修饰上4-MPBA后,粒径会有些许的增大,故紫外吸收峰发生红移变成527nm。另外我们运用拉曼光谱图,对AuNPs、MPBA-AuNPs两种纳米材料进行表征。如图2B所示,在689、990、1014、1065、1272、1475和1561cm-1处观察到拉曼信号峰。在698cm-1处出现的拉曼峰应归属于C-C环、C-S键的伸缩振动,990和1014cm-1处的峰值分别是由苯环中C-C和C-H的弯曲振动产生的,在1065、1250-1400cm-1处的峰应该归属于苯硼酸基的B-OH和B-C伸缩振动,1561cm-1的强拉曼信号峰为苯环中C=C双键的伸缩振动峰。通过上述分析表明,MPBA通过Au-S键吸附在AuNPs表面。从图2C可以看出,通过纳米粒度分析仪可以测得AuNPs的粒径为32nm左右,经4-MPBA修饰后,MPBA-AuNPs的粒径分布在40nm左右,说明MPBA-AuNPs的粒径相较于4-MPBA修饰前有明显增大。另外,本实验我们采用的是柠檬酸钠还原法制备AuNPs,因此AuNPs表面附着有柠檬酸根负离子,电势为负。4-MPBA也同样携带有负电荷,所以AuNPs经4-MPBA修饰后电势降低,图2D中反映的电势变化与上述分析相符。上述数据分析结果均证明MPBA-AuNPs的成功合成。
然后我们又通过透射电子显微镜(TEM)证实了上述的猜想,一定浓度下的4-MPBA与AuNPs反应并不会引起聚集,如图3AuNPs、MPBA-AuNPs的透射电镜图所示。
3 MPBA-AuNPs与HbA1c pH反应条件筛选
苯硼酸与顺式二醇进行反应的溶液环境为偏碱性,当pH高于苯硼酸的pKa时,苯硼酸作为阴离子存在,形成的这种阴离子易于与顺式二醇发生酯化反应,因此Lewis碱的添加可以帮助苯基硼酸降低对pH的敏感性并改变结构从二元形式B(OH)2转变成三元形式B(OH)3,这种三元形式立体结构有利于和HbA1c中的顺式二醇形成稳定的复合物。因此pH的选择时本实验中非常重要的因素。
接下来我们分别在不同pH条件下进行实验,结果如图4所示。HbA1c的等电点为6-8,缓冲液pH值为7.2和7.4时,由于HbA1c和MPBA-AuNPs存在非特异性吸附,从而引起剧烈聚集,离心操作后不能复溶均匀分散,所以有如图4所示的曲线。缓冲液pH值为8.0和8.8时,HbA1c可以诱导MPBA-AuNPs发生聚集,并且能复溶均匀分散,说明在这两种pH条件下,HbA1c和MPBA-AuNPs能发生特异性吸附。缓冲液pH值为9.6和10.0时,通过紫外吸收光谱分析,HbA1c诱导MPBA-AuNPs聚集程度变小,可能是在这种pH条件下,HbA1c有可能发生了一定程度的变形,诱导聚集作用减弱。通过以上实验,因此我们选定pH 8.5作为反应的酸碱条件。
4 MPBA-AuNPs与HbA1c离心转速筛选
通过实验我们发现,如果使一定浓度的MPBA-AuNPs和HbA1c反应液,通过室温放置进行反应,反应时间比较长在24h左右。但如果通过离心富集的方式使其反应,则会节省反应时间。相同离心时间,如果离心转速过小,则达不到富集促进反应的效果,如果离心转速过大,则会影响离心后对反应液的复溶效果,所以对应的离心参数需要我们进行进一步的探讨。
本实验我们通过固定离心的时间为5min,设置离心转速分别为8000r/min、9000r/min、10000r/min,进行离心转速的筛选。实验结果如图5所示,图A、B、C分别为8000r/min、9000r/min、10000r/min对应的紫外吸收光谱,A中在600nm处出现的肩峰相较于B、C两个图的肩峰比较小,并且B、C两个图相比较时,尤其是在HbA1c浓度较大的情况下,B图的变化趋势要优于C图的变化趋势。通过以上分析,所以我们选定离心转速9000r/min,离心时间5min作为离心设置参数。
5 MPBA-AuNPs与HbA1c反应时间筛选
上面我们讨论到,适当的离心操作可以缩短MPBA-AuNPs与HbA1c的反应时间,接下来我们对离心参数为9000r/min,5min离心条件下的反应时间进行深入探索。首先选取一定浓度的MPBA-AuNPs与HbA1c进行反应,离心后弃去上清液,然后用含量为0.1%SDS的娃哈哈纯净水复溶,根据复溶时间进行反应时间检测。
在一定时间范围内,随着反应时间的延长,波长600nm处产生的肩峰吸收强度逐渐增强,当到达一定时间后,波长600nm处的吸收强度不再增加。另外,前面实验有提到,经4-MPBA修饰后的AuNPs的紫外吸收特征峰出现在波长527nm,并且浓度和吸收强度成正比,所以我们选定吸收强度比A600/A527作为检测HbA1c诱导MPBA-AuNPs聚集程度的参数。由图6所示,当反应时间小于15min时,随着反应时间的延长,A600/A527逐渐增大;当反应时间达到15min后,随反应时间的延长,A600/A527基本不再发生变化,即达到平台。通过以上分析,MPBA-AuNPs与HbA1c的反应时间在15min左右,且基本趋于稳定,因此我们选定反应时间为15min。
6 Hb标准曲线的建立
Hb的测定方法有酸化法、碱化法、硼砂法、十二烷基硫酸钠法(SDS)、测铁法等。WHO推荐氰化高铁(iHCN)法作为参考方法,因此本实验采用的是氰化高铁法检测Hb,其检测原理如下:高铁氰化钾可将Hb中的Fe2+氧化成Fe3+,即将Hb氧化成高铁血红蛋白(Hi)。Hi可以和氰化钾中的CN-反应形成HiCN,其特征吸收峰为540nm,并且其浓度和吸收峰强度成正比。
如图7所示,A为不同浓度的Hb加入相同体积的文齐氏转化液对应的紫外吸收光谱,从图中可以看出,随着Hb浓度的不断增高,540nm处的吸收峰强度逐渐增高。B图证实了540nm处的吸收峰强度与Hb浓度的确实有良好的线性关系,R2=0.986。其线性表达式为:
y=0.0360x-0.0119
其中,y表示540nm处的吸收峰强度,x表示Hb的浓度。
7 HbA1c标准曲线的建立
通过实验我们发现,纳米材料MPBA-AuNPs加入一定浓度的HbA1c后,会在600nm处出现新的肩峰,并且527nm处MPBA-AuNPs的特征吸收峰强度会有明显的减低,如图2A所示。我们通过对应的TEM图,如图3MPBA-AuNPs+HbA1c,可以发现HbA1c可以诱导纳米材料MPBA-AuNPs发生一定程度的聚集。
接下来我们对以上现象进行了深入研究,相同浓度的MPBA-AuNPs加入不同浓度的HbA1c离心后,再经过相同时间进行反应,发现在527nm和600nm处的吸收峰强度均发生变化。如图8A所示,随着HbA1c加入的浓度逐渐增加,527nm处的吸收峰强度逐渐减小,而600nm处的吸收峰强度逐渐增大。随着HbA1c加入的浓度逐渐增加,反应液的颜色由红色逐渐变成紫色再变成蓝紫色,纳米材料MPBA-AuNPs的聚集程度逐渐增大。通过以上分析,我们根据8A图绘制成A600/A527随HbA1c浓度变化的图像如图8B所示,在HbA1c浓度小于5nM时,A600/A527随HbA1c浓度的增大而增大,当HbA1c浓度大于5nM时,A600/A527基本不再发生变化,并且加入HbA1c浓度在0-4nM范围内,A600/A527的大小与加入HbA1c浓度具有良好的线性关系,R2=0.989,如图8C所示。其线性方程为:
y=0.13674x+0.1985
其中y表示600nm处与527nm处的吸收峰强度的比值,x表示HbA1c的浓度。
8选择特异性实验
本节中,我们对可能存在于溶血液中的小分子及蛋白是否影响新型比色传感器检测HbA1c进行探讨研究,以判断其选择特异性。
如图9A所示,在加入Glu、Gal、Fru、DA、VC、BSA、Hb、HbA1c等样品时,只有HbA1c组A600/A527值明显大于其他样品组。在上述各个样品浓度的基础上加入一定浓度的HbA1c,制成新的一批样品,用比色传感器进行检测。结果如图9B所示,加入HbA1c后,A600/A527的比值明显增大。产生上述现象的原因是溶血液中的其他小分子或蛋白不能诱导MPBA-AuNPs的聚集。上述分子或者蛋白可以分为两类:1)葡萄糖等单糖虽然有顺式二羟基结构,但是结构中有且仅有一个特异性识别位点,不能引发MPBA-AuNPs聚集;2)BSA等结构中不存在顺式二羟基结构,不能与MPBA-AuNPs发生特异性结合,故不会诱导MPBA-AuNPs聚集。综上所述,基于硼酸衍生物的比色传感器对HbA1c具有较强的识别能力和抗干扰能力。
9回收率和变异系数的测定
为了验证新型比色传感器检测的准确性,我们分别选取1nM、2nM、4nM三种浓度进行添加回收实验和变异系数实验。从表1可以看出,三种浓度下,三个平行检测的实验数据良好,批内和批间的变异系数在3.00-8.97%之间,回收率在96.60-108.88%之间,符合正常范围,因此可以说明这种方法是具有可行性的。
表1 HbA1c的回收率测定及批间变异系数
10比色传感器与市售糖化血红蛋白试剂盒检测方法对比
根据上述实验,我们通过对比色传感器的选择竞争性以及回收率、变异系数进行的实验,一定程度上说明比色传感器检测HbA1c具有一定的可行性和准确性。
接下来,我们对比色传感器与市售糖化血红蛋白试剂盒两种方法的检测结果进行对比,直接验证比色传感器的准确性。根据实验操作5.2中糖化血红蛋白试剂盒检测HbA1c的具体实验操作过程,可以测得几个羊溶血样品中HbA1c的含量,再通过计算公式获得羊溶血液中HbA1c占总血红蛋白的百分含量。然后根据5.3中比色传感器检测的具体操作过程,测得几个羊血样中HbA1c占总血红蛋白的百分含量。最后将两种测试方法测得的结果进行对比,结果如图10所示,两种方法结果对比显著性差异不明显(P>0.05),从而再次证明了比色传感器的可行性与准确性。
11纳米材料MPBA-AuNPs稳定性实验
本实验目的旨在构建一种纳米材料MPBA-AuNPs利用比色法对溶血液中的HbA1c进行检测。我们针对复杂多变的空气环境是否会对纳米材料MPBA-AuNPs造成影响进行了研究。将MPBA-AuNPs制备完成进行分装4℃保存,分别于1h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、4d、8d、12d、20d、30d对相同浓度的HbA1c进行测试。结果如图11所示,随着纳米材料MPBA-AuNPs放置时间的延长,反应后测试结果A600/A527的大小没有发生明显的变化。因此制备的纳米材料MPBA-AuNPs在4℃保存时,至少可以保存30天,具有良好的稳定性。
三总结
本发明利用MPBA-AuNPs可以特异性识别HbA1c糖基化部分从而诱导功能化AuNPs聚集这一特点,构建的新型比色传感通过常见仪器紫外可见分光光度计(UV)即可实现对HbA1c浓度的检测。
首先我们通过柠檬酸盐还原法制备基础纳米材料30nm AuNPs,并且通过对MPBA修饰前后的AuNPs进行紫外光谱,拉曼光谱等进行对比,证明MPBA可以通过Au-S键结合到AuNPs表面。然后通过对HbA1c和功能化MPBA-AuNPs的反应条件进行筛选,包括反应缓冲液pH值,反应离心参数,反应时间等,以获得最佳反应条件。接下来,通过UV检测,加入不同浓度的HbA1c导致MPBA-AuNPs纳米材料不同聚集程度,得到HbA1c检测的标准曲线,线性方程是y=0.13674x+0.1985,并且线性关系良好R2=0.989,线性范围是0-4nM,检测限为0.17nM。最后对比色传感器的选择特异性以及材料稳定性进行研究,发现材料不仅能特异性识别HbA1c,并且具有良好的稳定性,在30天内,对同种浓度的HbA1c检测结果基本一致。另外与市售的糖化血红蛋白检测试剂盒的检测结果对比显著性差异不明显(P>0.05),说明具有良好的可行性。
相对于其他方法,本发明设计的比色传感器检测限明显降低,灵敏度有明显提高,并且所需溶血样品体积很少,操作简单便捷,且成本低,有望应用到实际生产。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,其特征在于,该传感器在碱性的基础溶液中与糖化血红蛋白结合,并利用紫外吸光度法测定糖化血红蛋白的含量;
该传感器包括由4-MPBA与AuNPs共孵育得到的MPBA-AuNPs。
2.根据权利要求1所述的一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,其特征在于,所述AuNPs的粒径为10-100nm。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,其特征在于,所述AuNPs的粒径为30nm-40nm、40nm-50nm、50nm-60nm、60nm-70nm、70nm-80nm、80nm-90nm中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,其特征在于,所述基础溶液为HEPES缓冲液。
5.根据权利要求1所述的一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,其特征在于,所述基础溶液的pH值为7.4-10。
6.根据权利要求1所述的一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,其特征在于,MPBA-AuNPs的制备方法至少包括如下步骤:
向AuNPs溶液中加入用有机溶液溶解的4-MPBA溶液,常温搅拌1-4h。
7.根据权利要求6所述的一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,其特征在于,AuNPs溶液浓度与4-MPBA在AuNPs溶液中的终浓度的比值为58:(1-4)。
8.根据权利要求1所述的一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,其特征在于,该传感器检测糖化血红蛋白的含量的过程如下:
(1)向基础溶液中加入MPBA-AuNPs浓缩液;
(2)向步骤(1)所得的溶液中加入HbA1c;
(3)将步骤(2)所得溶液离心,弃去上清液后用水复溶,静置;
(4)对步骤(3)所得溶液进行紫外吸光光度法测定,并对照HbA1c标准曲线,计算得到HbA1c浓度。
9.根据权利要求8所述的一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,其特征在于,步骤(1)所得溶液中MPBA-AuNPs的浓度与步骤(2)所得溶液中HbA1c的浓度比为(0.5-2):10。
10.根据权利要求8所述的一种用于糖化血红蛋白定量分析的比色传感器,其特征在于,步骤(3)的离心时间为3-8min,离心转速为8000r/min-10000r/min。
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