CN113092553B - 一种无酶葡萄糖传感器检测葡萄糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型无酶葡萄糖传感器检测葡萄糖的方法，属于电化学检测领域。本发明通过一步水浴法成功合成了多孔单层镍铁层状双金属氢氧化物(PM‑LDHs)纳米片材料，将该材料修饰在玻碳电极上，实现了对于葡萄糖的快速准确的检测。本发明的无酶葡萄糖传感器具有灵敏度高、重现性好、选择性好、稳定性高、抗干扰能力强、检测范围宽等优点，对葡萄糖的检测范围为0.01‑2.49mM、检出限为3.2μM，灵敏度高达5179.11μAμM‑1cm‑2。本发明的制备传感器的修饰电极方法简单，检测方法响应速度快，1s即可达到稳态电流，操作简便，成本低廉，可批量大规模生产使用。在临床诊断、食品工业分析等领域具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种无酶葡萄糖传感器检测葡萄糖的方法，属于电化学检测领域。
背景技术
在过去的几十年中，数以百万计的人患有糖尿病的慢性病，这不仅导致严重的健康问题，而且导致沉重的医疗负担和间接的社会成本。不幸的是，由于无法治愈，糖尿病患者必须通过定期测量血糖水平来控制疾病。因此，需要一种方便可靠的葡萄糖测定方法。
迄今为止，已经开发了许多检测葡萄糖的方法，例如分光光度法，荧光分光光度法，比色法和红外光谱法。但这些方法存在一些缺点，如耗时、操作专业、设备昂贵等，限制了其临床应用。电化学方法具有快速，简便和廉价的显着优势，因此在日常检测人体血液中的葡萄糖水平方面具有巨大的应用潜力。两种主要类型的葡萄糖传感器在电化学方法中使用：酶和无酶葡萄糖传感器。尽管酶葡萄糖传感器具有响应速度快和选择性好的优点，但仍被高成本，复杂的酶固定过程和温度及pH等因素影响。而无酶葡萄糖电化学传感器除了避免了以上缺点，还具有线性范围宽、检测限低、响应速度快、成本低等众多优点。
在本发明中，以NiFe-PMLDHs修饰玻碳电极来检测葡萄糖分子，改性电极中丰富缺陷的多孔单层纳米片结构为电催化反应提供大的表面积。在最优的条件下，NiFe-PMLDHs修饰电极对葡萄糖的检测限低至3.2μM，检测范围为 0.01-2.49mM，灵敏度高达5179.11μAμM- 1cm-2。同时还表现出极高的稳定性、重复性与抗干扰能力。有很强的推广应用前景。
发明内容
本发明的目的是针对目前电化学方法检测葡萄糖分子过程中，工作电极选择的实际应用存在的不足，提供一种无酶葡萄糖传感器检测葡萄糖的方法。
解决本发明的技术问题所采用的技术方案如下：
首先，本发明提供了一种无酶葡萄糖传感器检测葡萄糖的方法，所述无酶葡萄糖传感器的工作电极的修饰材料为NiFe-PMLDHs纳米片材料，所述无酶葡萄糖传感器工作电极的制备方法如下：
步骤一、将镍盐，铁盐溶液超声混合分散在溶液中，记为溶液A；
步骤二、配制一定量的氢氧化钠溶液，记为溶液B；将一定量的硝酸钠和甲酰胺水溶液混合得到溶液C；
步骤三、在水浴锅磁性搅拌中，加热将溶液A和B同时加入溶液C中，反应完成后离心，洗涤，潮湿保存得到材料NiFe-PMLDHs；
步骤四、将步骤三得到的材料静置数小时，取其上清液，与一定量Nafion和乙醇混合超声得到分散液；取一定分散液滴加到抛光后的玻碳电极表面，使用红外灯干燥，即得所述无酶葡萄糖传感器工作电极。
优选地，在所述步骤一中，合成溶液A的原料为六水合硝酸镍和九水合硝酸铁，摩尔比为3：1，分散原料的溶剂为去离子水，混合液体积为20mL。
优选地，在所述步骤二中，氢氧化钠与去离子水的质量体积比为3.125g： 30mL；硝酸钠质量为0.172g，甲酰胺溶液和去离子水体积比为23：100，溶液 C的体积为20mL。
优选地，在所述步骤三中，油浴锅处理条件为80℃保持10分钟，搅拌速度为500rpm，反应溶液的pH维持在10左右，离心分离的转速为8000rpm；洗涤的溶剂是去离子水；洗涤的次数是五次；产物潮湿保存的溶剂为30mL去离子水。
优选地，在所述步骤四中，NiFe-PMLDHs材料的静置时间为24小时，其上清液、Nafion与乙醇体积比为500:500:2μL；玻碳电极的处理为，依次在麂皮上用1μm，0.3μm，50nm的氧化铝进行抛光，然后依次用无水乙醇和去离子水超声清洗；洗涤的次数是三次；分散液的滴加量为5μL。
本发明进一步提供了一种基于多孔单层镍铁层状双氢氧化物纳米片无酶葡萄糖传感器，采用前述制备方法制备得到。
本发明还提供了一种基于多孔单层镍铁层状双氢氧化物纳米片无酶葡萄糖传感器检测葡萄糖的方法，采用前述制备方法制备得到的工作电极，采用电化学方法用于检测葡萄糖分子。
具体地，所述电化学分析方法采用溶出伏安法，包括恒电位法、循环伏安法中的一种或者多种进行组合；检测的物质为葡萄糖分子。
本发明的原理如下：
LDH-Ni(Ⅱ)+OH-→LDH(OH-)-Ni(Ⅲ)+e- (1)
LDH(OH-)-Ni(Ⅲ)+葡萄糖→LDH-Ni(Ⅱ)+葡萄糖酸盐 (2)
首先，Ni-LDH的中心原子镍在碱性条件下失去一个电子变为三价，然后三价的Ni-LDH氧化葡萄糖为葡萄糖酸盐，其自身又被还原为二价的Ni-LDH。 LDH具有大的比表面积可以提供较多的活性位点，另外离子液体较高的导电性提高了Ni-LDH对葡萄糖的催化效果。利用Ni和Fe双金属的协同作用，提高了葡萄糖的检测灵敏度。
所得NiFe-PMLDHs修饰的玻碳电极具有优异的性能，可用于三电极体系。
前述条件的选择是根据检测信号来优化，最终得到了最优值，对于电极和检测效果至关重要。
将NiFe-PMLDHs材料修饰玻碳电极通过计时电流法应用于葡萄糖分子检测。电极修饰过程简单，在最优条件下检测限3.2μM，检测范围为0.01-2.49mM，灵敏度高达5179.11μAμM-1cm-2，且具有很好的再现性、重复性和稳定性，可以快速检测葡萄糖分子，有很强的推广应用前景。
与现有葡萄糖检测方法相比，本发明的优点在于：
1、本发明利用价格便宜的过渡金属镍盐和铁盐，制备了具有丰富缺陷单层多孔结构的纳米片材料，优化了材料结构与形貌，暴露了更多的活性位点，增强了无酶葡萄糖传感器性能。
2、本发明的检测方法检测速度快，1s即可达到稳态电流，操作简便。
3、本发明的检测方法灵敏度高(5179.11μAμM-1cm-2)，检测限低(3.2μM)，线性范围宽(0.01-2.49mM)。
4、本发明的测试方法过程更简单、测试时间短，重复性、重现性、稳定性和抗干扰能力好，能够解决电化学方法快速检测葡萄糖分子的实际应用问题。
附图说明
图1为实施例一步骤三制备的NiFe-PMLDHs材料的X-射线衍射图；
图2为实施例一步骤三制备的NiFe-PMLDHs材料的透射电镜图；
图3为实施例一步骤四制备的NiFe-PMLDHs修饰电极、对比实施例一制备的NiFe-LDHs修饰电极和玻碳电极在1mM葡萄糖/0.1M氢氧化钠的溶液中和无葡萄糖的氢氧化钠溶液中的循环伏安图对比。
图4为实施例一步骤四制备的NiFe-PMLDHs修饰电极进行葡萄糖检测的计时电流曲线。
图5为实施例一步骤四制备的NiFe-PMLDHs修饰电极进行葡萄糖检测的校准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面将结合附图和实施例对本发明进行进一步说明。
实施例一：
一种无酶葡萄糖传感器检测葡萄糖的方法，所述无酶葡萄糖传感器的工作电极的制备方法包括如下步骤：
步骤一、前驱体的制备
1、将7.5mmol六水合硝酸镍和2.5mmol九水合硝酸铁超声混分散到20mL 去离子水溶液中，记为溶液A；
2、配制2.5mmol氢氧化钠溶液30mL，记为溶液B；将23vol.％甲酰胺加入到含有0.1M硝酸钠的水溶液20mL中，记为溶液C。
步骤二、NiFe-PMLDHs纳米片材料的制备
将溶液A和B同时加入溶液C中，反应完成后离心，洗涤，潮湿保存得到材料NiFe-PMLDHs；在水浴锅磁性搅拌中，将溶液A和B同时缓慢滴入溶液 C中，油浴锅温度为80℃，搅拌速度为500rpm，维持反应溶液的pH在10左右，反应时间为10分钟。
步骤三、NiFe-PMLDHs纳米片材料的洗涤及保存
1、将制得的材料加入50mL离心管中，向其中加入30mL去离子水超声洗涤。
2、将超声完成的分散液离心5min，离心分离的转速为8000rpm，得到NiFe-PMLDHs纳米片材料沉淀。重复步骤1和2共5次，获得纯净的NiFe-PMLDHs纳米片材料。
3、将上面得到的材料进行潮湿保存并静置处理，潮湿保存溶剂为30mL 去离子水，静置时间为24小时。
步骤四、NiFe-PMLDHs纳米片材料修饰电极的制备
将玻碳电极依次在麂皮上用1μm，0.3μm和0.05μm的氧化铝进行抛光，然后依次用无水乙醇和去离子水超声清洗，得到镜面光亮的玻碳电极；
取步骤三得到的上清液500μL(约2mg材料)于2.5mL离心管中，并加入 2μLNafion和500mL乙醇混合，超声30分钟形成分散良好的分散液；取5μL 分散液滴涂在干净的玻碳电极上，使用红外灯干燥，得到NiFe-PMLDHs修饰的工作电极。
实施例二：传感器对葡萄糖的响应
使用实施例一所制得修饰电极作为工作电极，铂丝作对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极这三电极一端连接到电化学工作站(Autolab)，0.1M NaOH溶液作为电解液进行电化学测试。
具体测试条件为：
采用循环伏安测试技术，以传感器为工作在0V至0.7V的电位区间进行循环伏安扫描。传感器在1mM葡萄糖/0.1M氢氧化钠的溶液中和无葡萄糖的溶液中的循环伏安图对比(图3)。
测定结果为：
可以发现在加入1mM葡萄糖后，氧化峰电流约有400μA的显著提升，表明该传感器对葡萄糖有明显的电化学响应。
步骤五、传感器校准曲线绘制
使用实施例一所制得修饰电极作为工作电极，铂丝作对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极这三电极一端连接到电化学工作站(瑞士万通Autolab)，0.1M NaOH溶液作为电解液进行电化学测试。
具体测试条件为：
在0.5V应用电势下测试基于多孔单层镍铁层状双氢氧化物纳米片无酶葡萄糖传感器对已知浓度葡萄糖溶液的电流响应值，连续滴加不同浓度的葡萄糖溶液，根据葡萄糖浓度对应的电流响应值绘制计时电流曲线(图4)，根据葡萄糖浓度对应的电流响应值拟合绘制校准曲线(图5)。
测定结果为：
在0.5V的检测电位下滴加不同浓度的葡萄糖溶液，至传感器对所滴加的葡萄糖无响应为止，得到该传感器所能检测到的葡萄糖溶液最小浓度，即检测线为3.2μM。
进行线性测定时，该该传感器的线性范围为0.01mM-2.49mM，灵敏度为5179.11μAμM-1cm-2。此外，本发明的传感器也具有很好的再现性、重复性和稳定性，且相对标准偏差都在5％以下。
实施例三：传感器在实际血清样本中葡萄糖检测的应用
使用实施一所制得修饰电极作为工作电极，铂丝作对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极这三电极一端连接到电化学工作站(Autolab)，0.1M NaOH溶液作为电解液进行电化学测试。
具体测试条件为：
在0.5V应用电势下测试基于多孔单层镍铁层状双氢氧化物纳米片无酶葡萄糖传感器对已知浓度葡萄糖溶液的电流响应值，通过标准加样回收法检测 1％人体血清样品中的葡萄糖。通过添加已知浓度6.0，7.0，8.5mM的葡萄糖制备三个血清样品，进行安培法实验，并通过电化学工作站检测出待测溶液电流的大小，跟据葡萄糖浓度与电流响应值的校准曲线，计算待测溶液中的葡萄糖的含量和回收率。
测定结果为：
检测回收率为98.6-103.5％(见表1)，表明本发明可以用于实际样品的测定。
表1来自人血清样本的葡萄糖测定结果(n＝3)
由表1可知，良好的回收率(>98％)和较小的相对标准偏差(<2.5％) 表明，所制造的传感器可用于检测真实人血样品中的葡萄糖。
对比实施例一：
其他步骤与实施例一相同，不同之处在于：将步骤三中的潮湿保存改为在鼓风干燥箱中烘干，烘干温度为60℃，时间为12小时，得到常规干燥的粉末状NiFe-LDHs纳米片材料；取2mg材料于2.5mL离心管中，并加入2μLNafion和1mL乙醇混合，超声30分钟形成分散良好的分散液；取5μL分散液滴涂在干净的玻碳电极上，使用红外灯干燥，得到NiFe-LDHs的修饰电极。
测定结果为：在上述条件下，如图3所示，加入1mM葡萄糖后，氧化峰电流只有100μA的提升，响应信号较实施例一差，未进行后续测试。
对比实施例二：
其他步骤与实施例一相同，不同之处在于：将步骤四中的Nafion加入量调整为3μL。
测定结果为：在上述条件下，加入1mM葡萄糖后，氧化峰电流只有50μA 的提升，响应信号较实施例一差，未进行后续测试。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种无酶葡萄糖传感器检测葡萄糖的方法，其特征在于所述无酶葡萄糖传感器的工作电极的修饰材料为NiFe-PMLDHs纳米片材料，所述无酶葡萄糖传感器工作电极的制备方法如下：
步骤一、前驱体的制备
1)、将7.5mmol六水合硝酸镍和2.5mmol九水合硝酸铁超声混分散到20mL去离子水溶液中，记为溶液A；
2)、配制2.5mmol氢氧化钠溶液30mL，记为溶液B；将23vol.％甲酰胺加入到含有0.1M硝酸钠的水溶液20mL中，记为溶液C；
步骤二、NiFe-PMLDHs纳米片材料的制备
将溶液A和B同时加入溶液C中，反应完成后离心，洗涤，潮湿保存得到材料NiFe-PMLDHs；在水浴锅磁性搅拌中，将溶液A和B同时缓慢滴入溶液C中，油浴锅温度为80℃，搅拌速度为500rpm，维持反应溶液的pH在10左右，反应时间为10分钟；
步骤三、NiFe-PMLDHs纳米片材料的洗涤及保存
1)、将制得的材料加入50mL离心管中，向其中加入30mL去离子水超声洗涤；
2)、将超声完成的分散液离心5min，离心分离的转速为8000rpm，得到NiFe-PMLDHs纳米片材料沉淀；重复步骤1和2共5次，获得纯净的NiFe-PMLDHs纳米片材料；
3)、将上面得到的材料进行潮湿保存并静置处理，潮湿保存溶剂为30mL去离子水，静置时间为24小时；
步骤四、NiFe-PMLDHs纳米片材料修饰电极的制备
将玻碳电极依次在麂皮上用1μm，0.3μm和0.05μm的氧化铝进行抛光，然后依次用无水乙醇和去离子水超声清洗，得到镜面光亮的玻碳电极；
取步骤三得到的上清液500μL，上清液含2mg材料，于2.5mL离心管中，并加入2μLNafion和500mL乙醇混合，超声30分钟形成分散良好的分散液；取5μL分散液滴涂在干净的玻碳电极上，使用红外灯干燥，得到NiFe-PMLDHs修饰的工作电极。
2.一种基于多孔单层镍铁层状双氢氧化物纳米片无酶葡萄糖传感器，其特征在于，所述无酶葡萄糖传感器的工作电极的修饰材料为NiFe-PMLDHs纳米片材料，所述无酶葡萄糖传感器工作电极的制备方法如下：
步骤一、前驱体的制备
1)、将7.5mmol六水合硝酸镍和2.5mmol九水合硝酸铁超声混分散到20mL去离子水溶液中，记为溶液A；
2)、配制2.5mmol氢氧化钠溶液30mL，记为溶液B；将23vol.％甲酰胺加入到含有0.1M硝酸钠的水溶液20mL中，记为溶液C；
步骤二、NiFe-PMLDHs纳米片材料的制备
将溶液A和B同时加入溶液C中，反应完成后离心，洗涤，潮湿保存得到材料NiFe-PMLDHs；在水浴锅磁性搅拌中，将溶液A和B同时缓慢滴入溶液C中，油浴锅温度为80℃，搅拌速度为500rpm，维持反应溶液的pH在10左右，反应时间为10分钟；
步骤三、NiFe-PMLDHs纳米片材料的洗涤及保存
1)、将制得的材料加入50mL离心管中，向其中加入30mL去离子水超声洗涤；
2)、将超声完成的分散液离心5min，离心分离的转速为8000rpm，得到NiFe-PMLDHs纳米片材料沉淀；重复步骤1和2共5次，获得纯净的NiFe-PMLDHs纳米片材料；
3)、将上面得到的材料进行潮湿保存并静置处理，潮湿保存溶剂为30mL去离子水，静置时间为24小时；
步骤四、NiFe-PMLDHs纳米片材料修饰电极的制备
将玻碳电极依次在麂皮上用1μm，0.3μm和0.05μm的氧化铝进行抛光，然后依次用无水乙醇和去离子水超声清洗，得到镜面光亮的玻碳电极；
取步骤三得到的上清液500μL，上清液含2mg材料，于2.5mL离心管中，并加入2μLNafion和500mL乙醇混合，超声30分钟形成分散良好的分散液；取5μL分散液滴涂在干净的玻碳电极上，使用红外灯干燥，得到NiFe-PMLDHs修饰的工作电极。
3.根据权利要求1的一种无酶葡萄糖传感器检测葡萄糖的方法，其特征在于采用所述工作电极，采用电化学方法用于检测葡萄糖分子。
4.如权利要求3所述的一种无酶葡萄糖传感器检测葡萄糖的方法，其特征在于电化学分析方法采用溶出伏安法，包括恒电位法、循环伏安法中的一种或者多种进行组合；检测的物质为葡萄糖分子。
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