CN116027032B - 一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法、材料及应用 - Google Patents
一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法、材料及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法、材料及应用。所述检测方法包括以下步骤:步骤1)制备基底材料:Au@SnSe2纳米复合材料;步骤2)制备AgCit@NiFe‑LDHs纳米复合材料;步骤3)制备AgCit@NiFe‑LDHs纳米复合材料孵化新型冠状病毒抗体的二抗标记物;步骤4)制备检测新型冠状病毒抗原的电化学免疫传感器;步骤5)制备比色检测新型冠状病毒抗原的ELISA免疫传感器;步骤6)制备检测新型冠状病毒抗原的电化学和ELISA免疫传感器的工作曲线。本发明把电化学与比色相结合,用来检测新型冠状病毒,该方法具有较高的灵敏度、较宽的检测范围,较快的检测速度以及操作简单等优点,可用于实际样品的快速检测。
Description
技术领域
本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域技术领域,尤其是涉及一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法技术领域。
背景技术
感染SARS-CoV-2的人可以保持无症状或表现出非特异性临床症状,例如干咳,疲劳,发烧,腹泻和身体疼痛等症状。即使在潜伏期,感染者也具有高度传染性,可以将病毒传播给未感染者。因此,对SARS-CoV-2进行大规模快速诊断测试对于病毒检测、监测和快速管理暴发至关重要。SARS-CoV-2有四种主要的结构蛋白,包括刺突蛋白、膜蛋白、包膜蛋白和核衣壳蛋白。S蛋白是冠状病毒非常重要的表面蛋白,与病毒的传染性密切相关。因此,诊断SARS-CoV-2患者对于有效控制感染的快速传播至关重要。
到目前为止,金标准病毒检测是实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和最准确的实验室方法之一。市售qRT-PCR检测试剂盒的示例有Xpert Xpress SARS-CoV-2检测、CDC2019-新型冠状病毒实时RT-PCR诊断面板、ExProbeTM SARS-CoV-2检测试剂盒、雅培实时SARS-CoV-2RT-PCR试剂盒、和TaqPath COVID-19组合试剂盒。然而,这些方法也有缺点,因为它们耗时,需要专门的实验室设置,配备昂贵的仪器和操作熟练的人员。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测血清中的SARS-CoV-2抗体快速而简单,但需要昂贵的仪器,周转时间长,并且容易出现假阴性结果。因此,仍然迫切需要更便宜、更便携的生物传感设备来促进COVID-19的快速检测。
发明内容
比色免疫测定能够检测目标肉眼读数。电化学生物传感器,具有低成本、便携性、灵敏度和选择性。本发明利用ELISA和电化学以实现新型冠状病毒的灵敏检测。
本发明提供了一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法,所述ELISA生物免疫传感器方法包括:使用96孔板依次将新型冠状病毒抗体、牛血清白蛋白溶液、新型冠状病毒抗原溶液和Ab2生物探针孵育后,利用生物探针对3,3',5,5'-四甲基联苯胺的比色反应。
所述的电化学免疫传感器方法包括:工作电极,参比电极和对电极,新型冠状病毒特异性抗体,牛血清白蛋白溶液,新型冠状病毒抗原溶液,纳米复合材料孵化前列腺特异性抗体的二抗标记物,所述的参比电极为饱和甘汞电极,对电极为铂丝电极,工作电极为玻碳电极。其表面依次修饰金纳米粒子负载导电性较好的二硒化锡(Au@SnSe2)和具有优异催化性能的镍铁双氢氧化物负载柠檬酸银的纳米复合材料(AgCit@NiFe-LDHs)。
本发明的目的之一使用Au@SnSe2作为基底材料,AgCit@NiFe-LDHs作为探针材料以实现对电化学信号探针的放大效果。
本发明的目的之二使用AgCit@NiFe-LDHs作为探针材料,以实现对3,3',5,5'-四甲基联苯胺的催化效果。
本发明正是为了解决上述问题缺陷,提供一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法。本发明采用如下技术方案实现。
一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法,本发明所述检测方法包括以下步骤:
步骤1)制备基底材料:Au@SnSe2纳米复合材料;
步骤2)制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料;
步骤3)制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料孵化新型冠状病毒抗体的二抗标记物;
步骤4)制备检测新型冠状病毒抗原的电化学免疫传感器;
步骤5)制备比色检测新型冠状病毒抗原的ELISA免疫传感器;
步骤6)制备检测新型冠状病毒抗原的电化学和ELISA免疫传感器的工作曲线。
本发明所述步骤1)制备Au@SnSe2纳米复合材料包括:
①制备SnSe2
在12-80mL乙二醇溶液中加入0.3-2g SnCl2·2H2O和0.3-2g Se粉末;在混合物中加入0.5-3mL乙二胺,磁力搅拌30min后,将混合溶液置于高压釜中,120-180℃保持5h,得到的产物用去离子水和乙醇洗涤3次;最后,在60℃真空干燥过夜,得到SnSe2待用;
②制备Au@SnSe2
称取3-20mg步骤(1)制备好的SnSe2纳米花在溶解于1-5mL DW,然后在上述溶液中加入50mM的HAuCl4 10-60μL;室温搅拌10分钟后,缓慢滴加0.1-0.6mL 100mM Na3Cit,磁搅拌30分钟;最后,将悬浮液12000rpm离心5min,收集固体产物。
本发明所述步骤2)制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料包括:
①制备NiFe-LDHs
将0.03-0.3mmol Fe(NO3)3·9H2O和0.25-1mmol NiCl2·6H2O分散在10-100mL水中,然后在上述溶液中加入0.5-3mmol尿素,搅拌30分钟;将混合溶液移至高压釜中,在120℃下反应12h,离心冷冻干燥几次,离心收集得到NiFe-LDHs;
②制备AgCit@NiFe-LDHs
将0.03-2g NiFe-LDH、0.2-1g AgNO3和0.5-3g Na3Cit溶解在10ml水中,磁力搅拌30分钟,形成一个白色的球团;放置悬浮液过夜,离心收集,干燥备用。
本发明所述步骤3)制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料孵化新型冠状病毒抗体的二抗标记物(Ab2 bioconjugates)包括:
将100μL 10μg·mL-1的新型冠状病毒特异性抗体加入到2mL 0.5-3mg·mL-1的AgCit@NiFe-LDHs分散液中并在4℃条件下搅拌过夜;用PBS洗掉游离的抗体后,加入1%BSA100μL反应2-12h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在0.5-3mL的PBS中以获得0.2-1.2mg·mL-1的Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,将其储存在4℃备用。
本发明所述步骤4)制备光电双信号模式的新型冠状病毒免疫传感器的工作电极包括:
①将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝(Al2O3)粉抛光,并分别用乙醇溶液(50%)、硝酸溶液(50%)和去离子水(DW)分别超声清洗,用N2干燥备用;
②将10μL 0.2-1.2mg·mL-1的金纳米粒子负载的二硒化锡(Au@SnSe2)分散液滴在步骤①中处理好的电极上上并干燥;
③将10μL 6-12μg·mL-1Ab1溶液滴加到步骤②处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
④将浓度为0.00001-10ng·mL-1的新型冠状病毒溶液(SARS-CoV-2)分别滴加到步骤③处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
⑤将步骤④处理好的电极置于1-6mg·mL-1抗体的生物探针材料(Ab2/AgCit@NiFe-LDHs)中孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干,得到检测不同浓度的SARS-CoV-2的夹心型电化学免疫传感器;
⑥将50μL的0.1-1.2μg·mL-1Ab1加入到96孔板中,并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1;
⑦将100μL 1%的牛血清蛋白添加到步骤⑥处理好的96孔板中,在25℃下孵育1h;孵育结束后,将板用PBS洗涤并干燥;
⑧在步骤⑦处理好的板中加入100μL不同浓度的SARS-CoV-2,在25℃下孵育1h,然后用PBS洗涤并干燥;
⑨在步骤⑧处理好的板中加入100μL的0.1-10mg·mL-1Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,并在相同条件下孵育1h,并将未结合的物质用PBS去除。
本发明所述步骤5)制备电化学与比色相结合检测新型冠状病毒抗原的传感器工作曲线包括:①使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,所制备的传感器为工作电极,在10mL浓度为0.1M的pH=7.4的磷酸盐缓冲液中进行测试;②利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测,扫描电压为-0.1-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,记录电流峰值;
③使用酶标仪在652nm处测量检测新型冠状病毒的ELISA分析液;
④利用工作曲线法,得到待测样品中新型冠状病毒抗原的浓度。
一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测用材料,本发明所述的材料为基底材料:Au@SnSe2或Au@eHA或Au@Fe3O4或Au@rGO@COF;所述的二抗标记物为AgCit@NiFe-LDHs或Au@COF@SCX6-MnO2或Au@COF@Fe3O4。
本发明上述材料的应用为检测新型冠状病毒SARS-CoV-2。
本发明的线性检测范围是0.00001ng mL-1-10ng mL-1,最低检测下限为0.003fgmL-1。
本发明的ELISA传感器的检测范围为0.001-10ng·mL-1,检出限(LOD)达到了0.33fg/mL(S/N=3)。
本发明通过室温合成了探针材料Ab2/AgCit@NiFe-LDHs,金纳米粒子负载的二硒化锡(Au@SnSe2)固定在玻碳电极(GCE)上,构建了一种基于AgCit@NiFe-LDHs的电化学传感器。同时,以AgCit@NiFe-LDHs对TMB的显色反应,使用96孔板成功构建了三明治型ELISA,也实现了对新型冠状病毒的比色检测。本发明将电化学与比色相结合,用来检测新型冠状病毒。该方法具有较高的灵敏度、较宽的检测范围,较快的检测速度以及操作简单等优点,可用于实际样品的快速检测。
本发明的有益效果为,(1)本发明所构建的夹心型电化学免疫传感器实现了精确定量检测新型冠状病毒抗抗原的目的,其线性检测范围是0.00001ng mL-1-10ng mL-1,最低检测下限为0.003fg mL-1;
(2)ELISA传感器的检测范围为0.001-10ng·mL-1,检出限(LOD)达到了0.33fg/mL(S/N=3);
(3)本发明把电化学与比色相结合,用来检测新型冠状病毒。该方法具有较高的灵敏度、较宽的检测范围,较快的检测速度以及操作简单等优点,可用于实际样品的快速检测。
下面结合附图和具体实施方式本发明做进一步解释。
附图说明
图1为SnSe2(A、B)和Au@SnSe2(C、D)的SEM、TEM图;
图2为NiFe-LDHs(A)、AgCit(B)和AgCit@NiFe-LDHs(C)的SEM图;
图3为SnSe2及Au@SnSe2的Raman图;
图4为NiFe-LDHs、AgCit和AgCit@NiFe-LDHs的红外图;
图5为不同浓度SARS-CoV-2的SWV图(A)和标准曲线图(B);
图6为不同浓度SARS-CoV-2的紫外吸收谱图(A)和标准曲线(B)。
具体实施方式
实施例中所使用的化学试剂和溶剂均为分析纯;原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买;所述搅拌采用磁力搅拌器搅拌方式。
实施例1:一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法的具体步骤如下:
①将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝(Al2O3)粉抛光,并分别用乙醇溶液(浓度50%)、硝酸溶液(浓度50%)和去离子水(DW)分别超声清洗,用N2干燥备用;②将10μL 0.2mg·mL-1的金纳米粒子负载的二硒化锡(Au@SnSe2)分散液滴在步骤①中处理好的电极上上并干燥;
③将10μL 7μg·mL-1Ab1溶液滴加到步骤②处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
④将浓度为0.00001-10ng·mL-1的新型冠状病毒溶液(SARS-CoV-2)分别滴加到步骤③处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
⑤将步骤④处理好的电极置于1mg·mL-1抗体的生物探针材料(Ab2/AgCit@NiFe-LDHs)中孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干,得到检测不同浓度的SARS-CoV-2的夹心型电化学免疫传感器。
⑥将50μL的0.1μg·mL-1Ab1加入到96孔板中,并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
⑦将100μL 1%的牛血清蛋白添加到步骤⑥处理好的96孔板中,在25℃下孵育1h。孵育结束后,将板用PBS洗涤并干燥。
⑧在步骤⑦处理好的板中加入100μL不同浓度的SARS-CoV-2,在25℃下孵育1h,然后用PBS洗涤并干燥。
⑨在步骤⑧处理好的板中加入100μL的0.1mg·mL-1Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,并在相同条件下孵育1h,并将未结合的物质用PBS去除。
本发明所述步骤(1)制备Au@SnSe2纳米复合材料包括:
①制备SnSe2
在12mL乙二醇溶液中加入0.3g SnCl2·2H2O和0.3g Se粉末。在混合物中加入0.5mL乙二胺,磁力搅拌30min后,将混合溶液置于高压釜中,120℃保持5h,得到的产物用去离子水和乙醇洗涤3次。最后,在60℃真空干燥过夜,得到SnSe2待用;
②制备Au@SnSe2
称取2.5mg步骤(1)制备好的SnSe2纳米花在溶解于0.8mL DW,然后在上述溶液中加入50mM的HAuCl4 10μL。室温搅拌10分钟后,缓慢滴加0.1mL 100mM Na3Cit,磁搅拌30分钟。最后,将悬浮液12000rpm离心5min,收集固体产物。
制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料制备方法,具体步骤如下:
①制备NiFe-LDHs
将0.04mmol Fe(NO3)3·9H2O和0.2mmol NiCl2·6H2O分散在10mL水中,然后在上述溶液中加入0.5mmol尿素,搅拌30分钟。将混合溶液移至高压釜中,在120℃下反应6h,离心冷冻干燥几次,离心收集得到NiFe-LDHs。
②制备AgCit@NiFe-LDHs
将0.03g NiFe-LDH、0.1g AgNO3和0.5g Na3Cit溶解在2ml水中,磁力搅拌30分钟,形成一个白色的球团。放置悬浮液过夜,离心收集,干燥备用。
③Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针的制备
将100μL 2μg·mL-1的新型冠状病毒特异性抗体加入到2mL 0.5mg·mL-1的AgCit@NiFe-LDHs分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后,加入1%BSA 100μL反应2-12h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在0.5的PBS中以获得0.2-1.2mg·mL-1的Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,将其储存在4℃备用。
本发明所述一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法,具体步骤如下:
(1)使用电化学工作站,在三电极体系中,以所制备的特异性抗体的夹心型检测SARS-CoV-2的电化学免疫传感器为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,在10mL浓度为0.1M的pH=7.4的磷酸盐缓冲液中进行测试;
(2)利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测,扫描电压为-0.1-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,记录电流峰值;
(3)记录不同浓度下的SARS-CoV-2对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,检测不同浓度的SARS-CoV-2溶液,结果表明检测范围0.00001-10ng·mL-1,检出限(LOD)达到了0.003fg·mL-1(S/N=3)。
(5)使用酶标仪在652nm处测量检测SARS-CoV-2的ELISA分析液,结果表明检测范围为0.001-10ng·mL-1,LOD值为3.33fg·mL-1(S/N=3)。
实施例2:一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法的具体步骤如下:
①将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝(Al2O3)粉抛光,并分别用乙醇溶液(浓度50%)、硝酸溶液(浓度50%)和去离子水(DW)分别超声清洗,用N2干燥备用;②将10μL 0.4mg·mL-1的金纳米粒子负载的二硒化锡(Au@SnSe2)分散液滴在步骤①中处理好的电极上上并干燥;
③将10μL 8μg·mL-1Ab1溶液滴加到步骤②处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
④将浓度为0.00001-10ng·mL-1的新型冠状病毒溶液(SARS-CoV-2)分别滴加到步骤③处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
⑤将步骤④处理好的电极置于1.5mg·mL-1抗体的生物探针材料(Ab2/AgCit@NiFe-LDHs)中孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干,得到检测不同浓度的SARS-CoV-2的夹心型电化学免疫传感器。
⑥将50μL的0.2μg·mL-1Ab1加入到96孔板中,并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
⑦将100μL 1%的牛血清蛋白添加到步骤⑥处理好的96孔板中,在25℃下孵育1h。孵育结束后,将板用PBS洗涤并干燥。
⑧在步骤⑦处理好的板中加入100μL不同浓度的SARS-CoV-2,在25℃下孵育1h,然后用PBS洗涤并干燥。
⑨在步骤⑧处理好的板中加入100μL的0.2mg·mL-1Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,并在相同条件下孵育1h,并将未结合的物质用PBS去除。
本发明所述步骤(1)制备Au@SnSe2纳米复合材料包括:
①制备SnSe2
在15mL乙二醇溶液中加入0.4g SnCl2·2H2O和0.4g Se粉末。在混合物中加入1mL乙二胺,磁力搅拌30min后,将混合溶液置于高压釜中,130℃保持5h,得到的产物用去离子水和乙醇洗涤3次。最后,在60℃真空干燥过夜,得到SnSe2待用;
②制备Au@SnSe2
称取4.5mg步骤(1)制备好的SnSe2纳米花在溶解于1.5mL DW,然后在上述溶液中加入50mM的HAuCl4 20μL。室温搅拌10分钟后,缓慢滴加0.2mL 100mM Na3Cit,磁搅拌30分钟。最后,将悬浮液12000rpm离心5min,收集固体产物。
制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料制备方法,具体步骤如下:
①制备NiFe-LDHs
将0.05mmol Fe(NO3)3·9H2O和0.3mmol NiCl2·6H2O分散在20mL水中,然后在上述溶液中加入0.6mmol尿素,搅拌30分钟。将混合溶液移至高压釜中,在120℃下反应7h,离心冷冻干燥几次,离心收集得到NiFe-LDHs。
②制备AgCit@NiFe-LDHs
将0.04g NiFe-LDH、0.2g AgNO3和0.6g Na3Cit溶解在3ml水中,磁力搅拌30分钟,形成一个白色的球团。放置悬浮液过夜,离心收集,干燥备用。
③Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针的制备
将100μL 4μg·mL-1的新型冠状病毒特异性抗体加入到2mL 1mg·mL-1的AgCit@NiFe-LDHs分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后,加入1%BSA 100μL反应2-12h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在1的PBS中以获得0.2-1.2mg·mL-1的Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,将其储存在4℃备用。
本发明所述一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法,具体步骤如下:
(1)使用电化学工作站,在三电极体系中,以所制备的特异性抗体的夹心型检测SARS-CoV-2的电化学免疫传感器为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,在10mL浓度为0.1M的pH=7.4的磷酸盐缓冲液中进行测试;
(2)利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测,扫描电压为-0.1-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,记录电流峰值;
(3)记录不同浓度下的SARS-CoV-2对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,检测不同浓度的SARS-CoV-2溶液,结果表明检测范围0.00001-10ng·mL-1,检出限(LOD)达到了0.003fg·mL-1(S/N=3)。
(5)使用酶标仪在652nm处测量检测SARS-CoV-2的ELISA分析液,结果表明检测范围为0.001-10ng·mL-1,LOD值为3.33fg·mL-1(S/N=3)。
实施例3:一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法的具体步骤如下:
①将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝(Al2O3)粉抛光,并分别用乙醇溶液(浓度50%)、硝酸溶液(浓度50%)和去离子水(DW)分别超声清洗,用N2干燥备用;
②将10μL 0.5mg·mL-1的金纳米粒子负载的二硒化锡(Au@SnSe2)分散液滴在步骤①中处理好的电极上上并干燥;
③将10μL 9μg·mL-1Ab1溶液滴加到步骤②处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
④将浓度为0.00001-10ng·mL-1的新型冠状病毒溶液(SARS-CoV-2)分别滴加到步骤③处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
⑤将步骤④处理好的电极置于2mg·mL-1抗体的生物探针材料(Ab2/AgCit@NiFe-LDHs)中孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干,得到检测不同浓度的SARS-CoV-2的夹心型电化学免疫传感器。
⑥将50μL的0.4μg·mL-1Ab1加入到96孔板中,并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
⑦将100μL 1%的牛血清蛋白添加到步骤⑥处理好的96孔板中,在25℃下孵育1h。孵育结束后,将板用PBS洗涤并干燥。
⑧在步骤⑦处理好的板中加入100μL不同浓度的SARS-CoV-2,在25℃下孵育1h,然后用PBS洗涤并干燥。
⑨在步骤⑧处理好的板中加入100μL的0.4mg·mL-1Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,并在相同条件下孵育1h,并将未结合的物质用PBS去除。
本发明所述步骤(1)制备Au@SnSe2纳米复合材料包括:
①制备SnSe2
在30mL乙二醇溶液中加入0.5g SnCl2·2H2O和0.5g Se粉末。在混合物中加入1mL乙二胺,磁力搅拌30min后,将混合溶液置于高压釜中,140℃保持5h,得到的产物用去离子水和乙醇洗涤3次。最后,在60℃真空干燥过夜,得到SnSe2待用;
②制备Au@SnSe2
称取9mg步骤(1)制备好的SnSe2纳米花在溶解于3mL DW,然后在上述溶液中加入50mM的HAuCl4 30μL。室温搅拌10分钟后,缓慢滴加0.3mL 100mM Na3Cit,磁搅拌30分钟。最后,将悬浮液12000rpm离心5min,收集固体产物。
制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料制备方法,具体步骤如下:
①制备NiFe-LDHs
将0.06mmol Fe(NO3)3·9H2O和0.4mmol NiCl2·6H2O分散在30mL水中,然后在上述溶液中加入0.7mmol尿素,搅拌30分钟。将混合溶液移至高压釜中,在120℃下反应8h,离心冷冻干燥几次,离心收集得到NiFe-LDHs。
②制备AgCit@NiFe-LDHs
将0.05g NiFe-LDH、0.3g AgNO3和0.7g Na3Cit溶解在4ml水中,磁力搅拌30分钟,形成一个白色的球团。放置悬浮液过夜,离心收集,干燥备用。
③Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针的制备
将100μL 6μg·mL-1的新型冠状病毒特异性抗体加入到2mL 1.5mg·mL-1的AgCit@NiFe-LDHs分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后,加入1%BSA 100μL反应2-12h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在1.5的PBS中以获得0.2-1.2mg·mL-1的Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,将其储存在4℃备用。
本发明所述一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法,具体步骤如下:(1)使用电化学工作站,在三电极体系中,以所制备的特异性抗体的夹心型检测SARS-CoV-2的电化学免疫传感器为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,在10mL浓度为0.1M的pH=7.4的磷酸盐缓冲液中进行测试;
(2)利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测,扫描电压为-0.1-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,记录电流峰值;
(3)记录不同浓度下的SARS-CoV-2对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,检测不同浓度的SARS-CoV-2溶液,结果表明检测范围0.00001-10ng·mL-1,检出限(LOD)达到了0.003fg·mL-1(S/N=3)。
(5)使用酶标仪在652nm处测量检测SARS-CoV-2的ELISA分析液,结果表明检测范围为0.001-10ng·mL-1,LOD值为3.33fg·mL-1(S/N=3)。
实施例4:一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法的具体步骤如下:
①将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝(Al2O3)粉抛光,并分别用乙醇溶液(浓度50%)、硝酸溶液(浓度50%)和去离子水(DW)分别超声清洗,用N2干燥备用;
②将10μL1 mg·mL-1的金纳米粒子负载的二硒化锡(Au@SnSe2)分散液滴在步骤①中处理好的电极上上并干燥;
③将10μL10μg·mL-1Ab1溶液滴加到步骤②处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
④将浓度为0.00001-10ng·mL-1的新型冠状病毒溶液(SARS-CoV-2)分别滴加到步骤③处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
⑤将步骤④处理好的电极置于2.5mg·mL-1抗体的生物探针材料(Ab2/AgCit@NiFe-LDHs)中孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干,得到检测不同浓度的SARS-CoV-2的夹心型电化学免疫传感器。
⑥将50μL的0.6μg·mL-1Ab1加入到96孔板中,并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
⑦将100μL 1%的牛血清蛋白添加到步骤⑥处理好的96孔板中,在25℃下孵育1h。孵育结束后,将板用PBS洗涤并干燥。
⑧在步骤⑦处理好的板中加入100μL不同浓度的SARS-CoV-2,在25℃下孵育1h,然后用PBS洗涤并干燥。
⑨在步骤⑧处理好的板中加入100μL的0.6mg·mL-1Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,并在相同条件下孵育1h,并将未结合的物质用PBS去除。
本发明所述步骤(1)制备Au@SnSe2纳米复合材料包括:
①制备SnSe2
在60mL乙二醇溶液中加入1g SnCl2·2H2O和1g Se粉末。在混合物中加入2mL乙二胺,磁力搅拌30min后,将混合溶液置于高压釜中,160℃保持5h,得到的产物用去离子水和乙醇洗涤3次。最后,在60℃真空干燥过夜,得到SnSe2待用;
②制备Au@SnSe2
称取15mg步骤(1)制备好的SnSe2纳米花在溶解于5mL DW,然后在上述溶液中加入50mM的HAuCl4 40μL。室温搅拌10分钟后,缓慢滴加0.4mL 100mM Na3Cit,磁搅拌30分钟。最后,将悬浮液12000rpm离心5min,收集固体产物。
制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料制备方法,具体步骤如下:
①制备NiFe-LDHs
将0.1mmol Fe(NO3)3·9H2O和4mmol NiCl2·6H2O分散在60mL水中,然后在上述溶液中加入7mmol尿素,搅拌30分钟。将混合溶液移至高压釜中,在120℃下反应10h,离心冷冻干燥几次,离心收集得到NiFe-LDHs。
②制备AgCit@NiFe-LDHs
将0.05g NiFe-LDH、1.5g AgNO3和3.5g Na3Cit溶解在8ml水中,磁力搅拌30分钟,形成一个白色的球团。放置悬浮液过夜,离心收集,干燥备用。
③Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针的制备
将100μL 8μg·mL-1的新型冠状病毒特异性抗体加入到2mL 2mg·mL-1的AgCit@NiFe-LDHs分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后,加入1%BSA 100μL反应2-12h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在2的PBS中以获得0.2-1.2mg·mL-1的Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,将其储存在4℃备用。
本发明所述一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法,具体步骤如下:
(1)使用电化学工作站,在三电极体系中,以所制备的特异性抗体的夹心型检测SARS-CoV-2的电化学免疫传感器为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,在10mL浓度为0.1M的pH=7.4的磷酸盐缓冲液中进行测试;
(2)利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测,扫描电压为-0.1-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,记录电流峰值;
(3)记录不同浓度下的SARS-CoV-2对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,检测不同浓度的SARS-CoV-2溶液,结果表明检测范围0.00001-10ng·mL-1,检出限(LOD)达到了0.003fg·mL-1(S/N=3)。
(5)使用酶标仪在652nm处测量检测SARS-CoV-2的ELISA分析液,结果表明检测范围为0.001-10ng·mL-1,LOD值为3.33fg·mL-1(S/N=3)。
实施例5:一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法的具体步骤如下:
①将玻碳电极(GCE)分别用0.3和0.05μm的三氧化二铝(Al2O3)粉抛光,并分别用乙醇溶液(浓度50%)、硝酸溶液(浓度50%)和去离子水(DW)分别超声清洗,用N2干燥备用;
②将10μL1.5 mg·mL-1的金纳米粒子负载的二硒化锡(Au@SnSe2)分散液滴在步骤①中处理好的电极上上并干燥;
③将10μL 12μg·mL-1Ab1溶液滴加到步骤②处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
④将浓度为0.00001-10ng·mL-1的新型冠状病毒溶液(SARS-CoV-2)分别滴加到步骤③处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干;
⑤将步骤④处理好的电极置于3mg·mL-1抗体的生物探针材料(Ab2/AgCit@NiFe-LDHs)中孵育1h,孵育完成后用pH=7.4的PBS清洗电极表面,晾干,得到检测不同浓度的SARS-CoV-2的夹心型电化学免疫传感器。
⑥将50μL的1μg·mL-1Ab1加入到96孔板中,并在冰箱中孵育过夜,然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1。
⑦将100μL 1%的牛血清蛋白添加到步骤⑥处理好的96孔板中,在25℃下孵育1h。孵育结束后,将板用PBS洗涤并干燥。
⑧在步骤⑦处理好的板中加入100μL不同浓度的SARS-CoV-2,在25℃下孵育1h,然后用PBS洗涤并干燥。
⑨在步骤⑧处理好的板中加入100μL的1mg·mL-1Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,并在相同条件下孵育1h,并将未结合的物质用PBS去除。
本发明所述步骤(1)制备Au@SnSe2纳米复合材料包括:
①制备SnSe2
在75mL乙二醇溶液中加入2g SnCl2·2H2O和2g Se粉末。在混合物中加入2mL乙二胺,磁力搅拌30min后,将混合溶液置于高压釜中,180℃保持5h,得到的产物用去离子水和乙醇洗涤3次。最后,在60℃真空干燥过夜,得到SnSe2待用;
②制备Au@SnSe2
称取30mg步骤(1)制备好的SnSe2纳米花在溶解于10mL DW,然后在上述溶液中加入50mM的HAuCl4 60μL。室温搅拌10分钟后,缓慢滴加0.6mL 100mM Na3Cit,磁搅拌30分钟。最后,将悬浮液12000rpm离心5min,收集固体产物。
制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料制备方法,具体步骤如下:
①制备NiFe-LDHs
将0.2mmol Fe(NO3)3·9H2O和8mmol NiCl2·6H2O分散在80mL水中,然后在上述溶液中加入8mmol尿素,搅拌30分钟。将混合溶液移至高压釜中,在120℃下反应12h,离心冷冻干燥几次,离心收集得到NiFe-LDHs。
②制备AgCit@NiFe-LDHs
将0.1g NiFe-LDH、3g AgNO3和7g Na3Cit溶解在10ml水中,磁力搅拌30分钟,形成一个白色的球团。放置悬浮液过夜,离心收集,干燥备用。
③Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针的制备
将100μL 10μg·mL-1的新型冠状病毒特异性抗体加入到2mL 2.5mg·mL-1的AgCit@NiFe-LDHs分散液中并在4℃条件下搅拌过夜。用PBS洗掉游离的抗体后,加入1%BSA100μL反应2-12h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在2.5的PBS中以获得0.2-1.2mg·mL-1的Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,将其储存在4℃备用。
本发明所述一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法,具体步骤如下:
(1)使用电化学工作站,在三电极体系中,以所制备的特异性抗体的夹心型检测SARS-CoV-2的电化学免疫传感器为工作电极,铂丝电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极,在10mL浓度为0.1M的pH=7.4的磷酸盐缓冲液中进行测试;
(2)利用方波伏安法(SWV)对目标物进行检测,扫描电压为-0.1-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05s,记录电流峰值;
(3)记录不同浓度下的SARS-CoV-2对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,检测不同浓度的SARS-CoV-2溶液,结果表明检测范围0.00001-10ng·mL-1,检出限(LOD)达到了0.003fg·mL-1(S/N=3)。
(5)使用酶标仪在652nm处测量检测SARS-CoV-2的ELISA分析液,结果表明检测范围为0.001-10ng·mL-1,LOD值为3.33fg·mL-1(S/N=3)。
图1为实施例3中步骤(1)中SnSe2(A、B)和Au@SnSe2(C、D)的扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM);其中SnSe2具有纳米花结构(图A、B);与金负载之后,SnSe2出现了一层很明显的纳米片;如图C、D所示,可以看到Au NPs均匀地分布在SnSe2的表面;这些结果也说明Au@SnSe2复合材料的成功制备。
图3为实施例3中步骤(2)中NiFe-LDHs(A)、AgCit(B)和AgCit@NiFe-LDHs(C)的SEM图,其中AgCit具有珊瑚状结构(图A);NiFe-LDHs具有纳米片的结构(图B);与AgCite负载之后,可以看到珊瑚状AgCit边缘有一层较薄的膜(图C)。这些结果也说明AgCit@NiFe-LDHs复合材料的成功制备。
图4为实施例3中步骤(3)中NiFe-LDHs(A)、AgCit(B)和AgCit@NiFe-LDHs(C)的Raman图,图3显示出了在143和237cm–1处观察到两个拉曼峰。可归为面内振动模式(Eg)和面外振动模式(A1g)。原始SnSe2和Au@SnSe2的A1g/Eg峰强度比分别为1.73,2.04。这表明Au纳米粒子的改性改变了SnSe2的表面张力并抑制了其面内振动模式。
图5为实施例3中步骤(3)中NiFe-LDHs(A)、AgCit(B)和AgCit@NiFe-LDHs(C)的红外图,在1584、1391和1273cm-1的吸收带是由于柠檬酸盐内部的C=O拉伸、-OH弯曲和C-O拉伸,条带出现在612cm-1分配给Ag-O的伸缩振动。3447和1593cm-1处的吸收峰分别代表O-H和水分子的伸缩振动,CO3 2–的伸缩振动和弯曲振动显示在1387和623cm-1的峰值处。表明AgCit@NiFe-LDHs复合成功。
实施例5制备得到的9个生物免疫传感器进行SWV(电位范围-0.1-0.5V)测试,如图5A所示,在0.00001-10ng·mL-1的浓度范围内,随着SARS-CoV-2浓度的增加,电流响应的值也增加,这归因于在更高浓度的SARS-CoV-2溶液下,在电极上固定的Ab2的生物共轭物也越多;如图5B所示,电流强度(I)与logCSP之间有良好的线性关系,根据3σ准则,LOD为0.003fg·mL-1(S/N=3);相关系数(R2)为0.9605。基于AgCit@NiFe-LDHs具有卓越催化性能,以改善电化学信号的产生,制备的生物传感器具有更强的分析性能、更低的检出限、更高的灵敏度和更宽的线性范围。
图6为实施例3中步骤⑦-⑨中制备的ELISA不同浓度的紫外吸收谱图以及标准曲线。将所构建的ELISA使用酶标仪在652nm条件下来对不同浓度的的SARS-CoV-2进行检测,随着的SARS-CoV-2浓度的增加,吸光度值逐渐增加(图6A)。如图6B所示,吸光度与的SARS-CoV-2浓度的对数具有良好的线性关系,相关系数(R2)为0.9955,LOD为3.33fg·mL-1(S/N=3),显示出了良好的线性和较低的LOD值。
序号 | 英文缩略语/本领域专业术语 | 英文全称/术语解释 |
1 | SARS-CoV-2 | Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 |
2 | TMB | 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine |
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例,方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述(包括但不仅限于简写、缩写、本领域惯用的单位)。应当指出,上述实施例不以任何方式限制本发明,对于本领域的技术人员来说,凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准,说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (5)
1.一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法,其特征在于,所述检测方法用于非疾病诊断目的,包括以下步骤:
步骤1)制备基底材料:Au@SnSe2纳米复合材料;
步骤2)制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料;
步骤3)制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料孵化新型冠状病毒抗体的二抗标记物;
步骤4)制备检测新型冠状病毒抗原的电化学免疫传感器;
步骤5)制备比色检测新型冠状病毒抗原的ELISA免疫传感器;
步骤6)制备检测新型冠状病毒抗原的电化学和ELISA免疫传感器的工作曲线,利用方波伏安法SWV和ELISA法对目标物进行检测;
所述步骤1)制备Au@SnSe2纳米复合材料包括:
(1)制备SnSe2
在12-80 mL乙二醇溶液中加入0.3-2 g SnCl2·2H2O和0.3-2 g Se粉末;在混合物中加入0.5-3 mL乙二胺,磁力搅拌30 min后,将混合溶液置于高压釜中,120-180℃保持5 h,得到的产物用去离子水和乙醇洗涤3次;最后,在60°C真空干燥过夜,得到SnSe2待用;
(2) 制备Au@SnSe2
称取3-20 mg步骤(1)制备好的SnSe2纳米花在溶解于1-5 mL DW,然后在上述溶液中加入50 mM的HAuCl4 10-60µL;室温搅拌10分钟后,缓慢滴加0.1-0.6 mL 100mM Na3Cit,磁搅拌30分钟;最后,将悬浮液12000 rpm离心5 min,收集固体产物;
所述步骤2)制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料包括:
(1)制备NiFe-LDHs
将0.03-0.3 mmol Fe(NO3)3·9H2O和0.25-1 mmol NiCl2·6H2O分散在10-100 mL水中,然后在上述溶液中加入0.5-3 mmol尿素,搅拌30分钟;将混合溶液移至高压釜中,在120℃下反应12 h,离心冷冻干燥几次,离心收集得到NiFe-LDHs;
(2)制备AgCit@NiFe-LDHs
将0.03-2 g NiFe-LDH、0.2-1 g AgNO3和0.5-3 g Na3Cit溶解在10 ml水中,磁力搅拌30分钟,形成一个白色的球团;放置悬浮液过夜,离心收集,干燥备用。
2.如权利要求1所述一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法,其特征在于,所述步骤3)制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料孵化新型冠状病毒抗体的二抗标记物 Ab2bioconjugates 包括:
将新型冠状病毒特异性抗体加入到AgCit@NiFe-LDHs分散液中并在4℃ 条件下搅拌过夜;用PBS洗掉游离的抗体后,加入BSA反应2-12 h将所得溶液离心分离并将沉淀分散在PBS中以获得Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,将其储存在4℃备用。
3.如权利要求1所述一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法,其特征在于,所述步骤4)制备检测新型冠状病毒抗原的电化学免疫传感器;包括:
(1)将玻碳电极GCE分别用三氧化二铝 Al2O3 粉抛光,并分别用乙醇溶液、硝酸溶液和去离子水分别超声清洗,用N2干燥备用;
(2)将10 μL 0.2-1.2 mg·mL−1的金纳米粒子负载的二硒化锡Au@SnSe2 分散液滴在步骤(1)中处理好的电极上上并干燥;
(3)将Ab1溶液滴加到步骤(2)处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用PBS清洗电极表面,晾干;
(4)将新型冠状病毒溶液SARS-CoV-2分别滴加到步骤(3)处理好的电极表面,在25℃下孵育1h,孵育完成后用PBS清洗电极表面,晾干;
(5)将步骤(4)处理好的电极置于抗体的生物探针材料 Ab2/AgCit@NiFe-LDHs中孵育1h,孵育完成后用PBS清洗电极表面,晾干,得到检测不同浓度的SARS-CoV-2的夹心型电化学免疫传感器;
(6)将Ab1加入到96孔板中,并在冰箱中孵育过夜, 然后用PBS溶液洗去未结合的Ab1;
(7)将牛血清蛋白添加到步骤(6)处理好的96孔板中,在25 °C下孵育1h;孵育结束后,将板用PBS洗涤并干燥;
(8)在步骤(7)处理好的板中加入100 μL不同浓度的SARS-CoV-2,在25 °C下孵育1 h,然后用PBS洗涤并干燥;
(9)在步骤(8)处理好的板中加入Ab2/AgCit@NiFe-LDHs生物探针材料,并在相同条件下孵育1 h,并将未结合的物质用PBS去除。
4.如权利要求1所述一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测方法,其特征在于,所述步骤6)制备电化学与比色相结合检测新型冠状病毒抗原的传感器工作曲线,利用方波伏安法SWV和ELS法对目标物进行检测;包括:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,所制备的传感器为工作电极,在磷酸盐缓冲液中进行测试;
(2)利用方波伏安法SWV对目标物进行检测,扫描电压为-0.1-0.5V,脉冲振幅为0.05V,脉冲宽度为0.05 s,记录电流峰值;
(3)使用酶标仪在652 nm处测量检测新型冠状病毒的ELISA分析液;
(4)利用工作曲线法,得到待测样品中新型冠状病毒抗原的浓度。
5.一种基于光电双信号模式的新型冠状病毒检测用材料,其特征在于,所述的材料为基底材料:Au@SnSe2;二抗标记物为AgCit@NiFe-LDHs;
步骤1)制备Au@SnSe2纳米复合材料包括:
(1)制备SnSe2
在12-80 mL乙二醇溶液中加入0.3-2 g SnCl2·2H2O和0.3-2 g Se粉末;在混合物中加入0.5-3 mL乙二胺,磁力搅拌30 min后,将混合溶液置于高压釜中,120-180℃保持5 h,得到的产物用去离子水和乙醇洗涤3次;最后,在60°C真空干燥过夜,得到SnSe2待用;
(2) 制备Au@SnSe2
称取3-20 mg步骤(1)制备好的SnSe2纳米花在溶解于1-5 mL DW,然后在上述溶液中加入50 mM的HAuCl4 10-60µL;室温搅拌10分钟后,缓慢滴加0.1-0.6 mL 100mM Na3Cit,磁搅拌30分钟;最后,将悬浮液12000 rpm离心5 min,收集固体产物;
步骤2)制备AgCit@NiFe-LDHs纳米复合材料包括:
(1)制备NiFe-LDHs
将0.03-0.3 mmol Fe(NO3)3·9H2O和0.25-1 mmol NiCl2·6H2O分散在10-100 mL水中,然后在上述溶液中加入0.5-3 mmol尿素,搅拌30分钟;将混合溶液移至高压釜中,在120℃下反应12 h,离心冷冻干燥几次,离心收集得到NiFe-LDHs;
(2)制备AgCit@NiFe-LDHs
将0.03-2 g NiFe-LDH、0.2-1 g AgNO3和0.5-3 g Na3Cit溶解在10 ml水中,磁力搅拌30分钟,形成一个白色的球团;放置悬浮液过夜,离心收集,干燥备用。
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2022
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