CN109444240B - 一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器及基于该传感器所建立的电化学免疫传感方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器及基于该传感器所建立的电化学免疫传感方法和应用，所述电化学免疫传感器是由基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰壳聚糖‑普鲁士蓝纳米复合物、金纳米粒子和肿瘤标志物捕获抗体组成；将该电化学免疫传感器与脲酶功能化硅纳米探针结合即可测定样品中肿瘤标志物的含量；本发明具有制备工艺简单、可控、稳定性好、灵敏度高、线性范围宽、成本低等优良分析性能，在临床肿瘤标志物检测领域中具有很好的实用前景。

Description

一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器及基于该传感器所建 立的电化学免疫传感方法和应用
技术领域
本发明涉及电化学生物传感技术领域，具体是一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器及基于该传感器所建立的电化学免疫传感方法和应用。
背景技术
肿瘤标志物的准确测定对于癌症早期筛查和临床诊断具有十分重要的意义。与其它方法相比，将高特异性免疫识别反应与各种光、电传感技术相结合发展起来的免疫传感器，由于具有选择性高、样品消耗量小、操作简单、分析速度快等独特优点，近年来在肿瘤标志物检测中得到人们广泛研究和应用。其中，基于电分析化学方法发展起来的电化学免疫传感器由于不需要昂贵的大型仪器，且灵敏度较高，因而在临床诊断领域具有很好的实用前景。
传统电化学免疫传感器的制备一般需要十分繁琐的电极界面修饰过程，因而对传感器的重复性造成较大影响。此外，为了满足癌症早期诊断中低丰度肿瘤标志物准确检测的需要，人们通常利用可负载高含量酶标记物的纳米探针对传感器的信号转导及放大作用来提高其分析灵敏度。其中，具有优良催化能力和较低成本的辣根过氧化酶的应用最为普遍。然而，这类纳米探针在电化学信号转导中通常面临着溶解氧电化学还原信号的干扰问题。
作为一种重要的人工过氧化物酶，普鲁士蓝（PB）不仅制备简单，成本低廉，而且可以在溶解氧共存条件下表现出优良的电化学性质，因而在生物传感领域得到人们广泛关注。然而值得注意的是，传统方法一般通过铁离子与亚铁氰根离子混合，或者通过亚铁离子与铁氰根离子混合来进行PB的合成。由于两种试剂之间反应速度过快，从而会对所得产物和传感器的重复性造成较大影响。因此，如何有效避免上述缺陷，发展一种操作简单、重复性较好，且具有较高灵敏度等优良分析性能的一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器及基于该传感器所建立的电化学免疫传感方法和应用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的就是针对传统方法操作复杂、重复性较差，且通常面临溶解氧干扰等问题，提供一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器及基于该传感器所建立的电化学免疫传感方法和应用，基于壳聚糖-普鲁士蓝（CS-PB）纳米复合物制备的传感器，具有制备工艺简单、可控、稳定性好，而用于信号转导的脲酶功能化硅纳米探针可以通过酶催化反应实现多手段电化学信号放大，因而使得该方法拥有灵敏度高、线性范围宽、成本低等优良分析性能，在临床肿瘤标志物检测领域中具有很好的实用前景。
本发明的一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器，所述电化学免疫传感器是由基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰壳聚糖-普鲁士蓝纳米复合物、金纳米粒子和肿瘤标志物捕获抗体组成。
本发明的一种基于普鲁士的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）壳聚糖-普鲁士蓝纳米复合物的制备
向5mL 5mg/mL壳聚糖（CS）的质量分数为1%醋酸溶液中加入2mL含有50mM FeCl3、50mM K3Fe(CN)6和1.0M KCl的质量分数为0.1%醋酸溶液，混合均匀后升温至95℃，搅拌下反应12h；所得产物经10000rpm离心25min，弃去上清液，再使用质量分数为1%醋酸溶液洗涤后重新分散于5.0mL质量分数为 1%醋酸溶液中，即可得到CS-PB纳米复合物；
（2）电化学免疫传感器的制备
向玻碳电极（GCE）上滴加5µL CS-PB纳米复合物，室温晾干之后向其表面滴加8µL平均粒径为13nm的金纳米粒子（Au-NP），室温组装8h；用超纯水洗净后，继续滴加3µL0.5mg/mL CEA捕获抗体（Ab1），4℃静置反应过夜；用pH=6.9的PBS缓冲溶液洗净后，继续滴加8µL含有质量分数为2% BSA的pH=6.9 PBS缓冲溶液，室温封闭60min；最后将所得电极用含有质量分数为0.05%吐温-20的pH=6.9 PBS缓冲溶液（PBST）及pH=6.9 PBS缓冲溶液交替洗净、晾干，即得。
本发明的一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器所建立的电化学免疫传感方法，包括以下步骤：
（1）电化学免疫传感器的制备
向5mL 5mg/mL壳聚糖（CS）的质量分数为1%醋酸溶液中加入2mL含有50mM FeCl3、50mM K3Fe(CN)6和1.0M KCl的质量分数为0.1%醋酸溶液，混合均匀后升温至95℃，搅拌下反应12h；所得产物经10000rpm离心25min，弃去上清液，再使用质量分数为1%醋酸溶液洗涤后重新分散于5.0mL质量分数为 1%醋酸溶液中，即可得到CS-PB纳米复合物；向玻碳电极（GCE）上滴加5µL CS-PB纳米复合物，室温晾干之后向其表面滴加8µL平均粒径为13nm的金纳米粒子（Au-NP），室温组装8h；用超纯水洗净后，继续滴加3µL 0.5mg/mL CEA捕获抗体（Ab1），4oC静置反应过夜；用pH=6.9的PBS缓冲溶液洗净后，继续滴加8µL含有质量分数为2%BSA的pH=6.9 PBS缓冲溶液，室温封闭60min；最后将所得电极用含有质量分数为0.05%吐温-20的pH=6.9 PBS缓冲溶液（PBST）及pH=6.9 PBS缓冲溶液交替洗净、晾干，即得；
（2）脲酶功能化硅纳米探针的制备
向700µL 50mM pH=7.4 PBS缓冲溶液中加入100µL 5mg/mL粒径为100nm的氨基化硅纳米球分散液和200µL质量分数为2.5%的戊二醛溶液（GA），室温下搅拌反应3h；所得产物经离心后弃去上清液，再用PBS缓冲溶液洗净之后重新分散于1.0mL PBS缓冲溶液中；继续向其中加入10µL 1.0mg/mL的CEA信号抗体 (Ab2)，室温混匀反应1h后加入25μL 20mg/mL脲酶（urease），继续混匀反应2h；所得产物经过离心后除去上清液，再重新分散于500µL含有质量分数为2% BSA的PBS缓冲溶液中，室温封闭反应1h即得；将得到的脲酶功能化硅纳米探针经反复离心、洗净之后分散于1.0mL 50mM pH=6.9 的PBS缓冲溶液中即得脲酶功能化硅纳米探针分散液，于4℃保存待用；
（3）标准溶液中肿瘤标志物CEA的检测
向步骤（1）制备的电化学免疫传感器表面滴加8µL不同浓度的CEA标准溶液，室温下温育反应50min后采用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；继续滴加8µL步骤（2）制备的脲酶功能化硅纳米探针分散液，室温下温育反应50min后再次用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；再滴加8µL含有0.1M尿素（urea）和0.1M多巴胺（DA）的水溶液，室温反应20min后用超纯水洗净；最后置于含有0.1M KCl的50mM pH=6.9 PBS缓冲溶液中，通过示差脉冲伏安法在0.7-0V范围内记录其电流响应值，从而检测出标准溶液中CEA的含量；
（4）血清样品中CEA蛋白质标记物的检测
取临床人血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，向步骤（1）中制备好的电化学免疫传感器表面依次滴加8μL血清样品和步骤（2）制备的8µL脲酶功能化硅纳米探针分散液，室温下温育反应50min后再次用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；再滴加8µL含有0.1M尿素（urea）和0.1M多巴胺（DA）的水溶液，室温反应20min后用超纯水洗净；最后置于含有0.1M KCl的50mM pH=6.9 PBS缓冲溶液中，通过示差脉冲伏安法在0.7-0V范围内记录其电流响应值，从而检测血清样品中CEA的含量。
本发明步骤（2）中所述的氨基化硅纳米球分散液的制备方法是：首先制备平均粒径约为100nm的单分散SiO2纳米球，制备方法在《“Disposable immunosensor array forultrasensitive detection of tumor markers using glucose oxidase-functionalized silica nanosphere tags”，Guosong Lai等，Biosensors andBioelectronics 26 (2011) 3782–3787》中有记载。称取5mg制备好的SiO2纳米球，向其中加入含有200µL氨基硅烷（APTES）的800µL无水乙醇中，混合反应12h，反应产物经过离心，乙醇、水洗涤三次后，分散于50mM pH=7.4的PBS缓冲溶液中，即可得到5mg/mL的氨基化硅纳米球分散液。
本发明还提供了一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器所建立的电化学免疫传感方法在检测肿瘤标志物中的应用。
本发明的工作原理是：在铁离子与铁氰根离子的混合溶液中，利用具有良好生物兼容性的壳聚糖（CS）的弱还原作用，“一锅法”原位合成了一种性能稳定、分散性良好的CS-PB纳米复合物；将其用于修饰玻碳电极后，利用金纳米粒子(Au NP)在电极表面的组装作用固定抗体来简单制备成免疫传感器；通过传感器上的夹心免疫反应，可将制备的脲酶功能化硅纳米探针定量捕获到传感器表面；由于脲酶标记物可催化水解其尿素底物生成氢氧根离子并引起体系的pH值升高，因而一方面可诱导引起多巴胺在电极表面的自聚合沉积，另一方面氢氧根离子还可渗透破坏PB的晶格结构，从而实现对传感器上PB的电化学信号放大抑制作用；基于此信号转导机制，即可建立用于肿瘤标志物检测的定量关系。
本发明构建的生物传感器可以方便、简单的用于人血清中CEA等肿瘤标志物含量的定量检测，电化学信号可在0.1pg/mL~100ng/mL浓度范围内实现对CEA的定量响应，具有灵敏度高、线性范围宽、样品消耗量小、检测速度快，成本低廉等优良分析性能，很好克服了传统方法操作繁琐，重复性较差，且通常面临溶解氧的电化学信号干扰等缺陷。
附图说明
图1是电化学免疫传感器的制备过程示意图；
图2是脲酶功能化硅纳米探针的制备过程示意图；
图3是肿瘤标志物CEA的检测原理示意图。
具体实施方式
实施例1
本实施例的一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器，所述电化学免疫传感器是由基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰壳聚糖-普鲁士蓝纳米复合物、金纳米粒子和肿瘤标志物捕获抗体组成。
本实施例的一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）壳聚糖-普鲁士蓝纳米复合物的制备
向5mL 5mg/mL壳聚糖（CS）的质量分数为1%醋酸溶液中加入2mL含有50mM FeCl3、50mM K3Fe(CN)6和1.0M KCl的质量分数为0.1%醋酸溶液，混合均匀后升温至95℃，搅拌下反应12h；所得产物经10000rpm离心25min，弃去上清液，再使用质量分数为1%醋酸溶液洗涤后重新分散于5.0mL质量分数为 1%醋酸溶液中，即可得到CS-PB纳米复合物；
（2）电化学免疫传感器的制备
向玻碳电极（GCE）上滴加5µL CS-PB纳米复合物，室温晾干之后向其表面滴加8µL平均粒径为13nm的金纳米粒子（Au-NP），室温组装8h；用超纯水洗净后，继续滴加3µL0.5mg/mL CEA捕获抗体（Ab1），4℃静置反应过夜；用pH=6.9的PBS缓冲溶液洗净后，继续滴加8µL含有质量分数为2% BSA的pH=6.9 PBS缓冲溶液，室温封闭60min；最后将所得电极用含有质量分数为0.05%吐温-20的pH=6.9 PBS缓冲溶液（PBST）及pH=6.9 PBS缓冲溶液交替洗净、晾干，即得。
实施例2
本实施例的一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器所建立的电化学免疫传感方法，包括以下步骤：
（1）电化学免疫传感器的制备
向5mL 5mg/mL壳聚糖（CS）的质量分数为1%醋酸溶液中加入2mL含有50mM FeCl3、50mM K3Fe(CN)6和1.0M KCl的质量分数为0.1%醋酸溶液，混合均匀后升温至95℃，搅拌下反应12h；所得产物经10000rpm离心25min，弃去上清液，再使用质量分数为1%醋酸溶液洗涤后重新分散于5.0mL质量分数为 1%醋酸溶液中，即可得到CS-PB纳米复合物；向玻碳电极（GCE）上滴加5µL CS-PB纳米复合物，室温晾干之后向其表面滴加8µL平均粒径为13nm的金纳米粒子（Au-NP），室温组装8h；用超纯水洗净后，继续滴加3µL 0.5mg/mL CEA捕获抗体（Ab1），4oC静置反应过夜；用pH=6.9的PBS缓冲溶液洗净后，继续滴加8µL含有质量分数为2%BSA的pH=6.9 PBS缓冲溶液，室温封闭60min；最后将所得电极用含有质量分数为0.05%吐温-20的pH=6.9 PBS缓冲溶液（PBST）及pH=6.9 PBS缓冲溶液交替洗净、晾干，即得；
（2）脲酶功能化硅纳米探针的制备
向700µL 50mM pH=7.4 PBS缓冲溶液中加入100µL 5mg/mL粒径为100nm的氨基化硅纳米球分散液和200µL质量分数为2.5%的戊二醛溶液（GA），室温下搅拌反应3h；所得产物经离心后弃去上清液，再用PBS缓冲溶液洗净之后重新分散于1.0mL PBS缓冲溶液中；继续向其中加入10µL 1.0mg/mL的CEA信号抗体 (Ab2)，室温混匀反应1h后加入25μL 20mg/mL脲酶（urease），继续混匀反应2h；所得产物经过离心后除去上清液，再重新分散于500µL含有质量分数为2% BSA的PBS缓冲溶液中，室温封闭反应1h即得；将得到的脲酶功能化硅纳米探针经反复离心、洗净之后分散于1.0mL 50mM pH=6.9 的PBS缓冲溶液中即得脲酶功能化硅纳米探针分散液，于4℃保存待用。
实施例3 标准溶液中肿瘤标志物CEA的检测
向实施例2步骤（1）制备的电化学免疫传感器表面滴加8µL不同浓度的CEA标准溶液，室温下温育反应50min后采用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；继续滴加8µL实施例2步骤（2）中制备的脲酶功能化硅纳米探针分散液，室温下温育反应50min后再次用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；再滴加8µL含有0.1M尿素（urea）和0.1M多巴胺（DA）的水溶液，室温反应20min后用超纯水洗净；最后置于含有0.1M KCl的50mM pH=6.9PBS缓冲溶液中，通过示差脉冲伏安法在0.7-0V范围内记录其电流响应值，从而检测出标准溶液中CEA的含量，得到的CEA标准溶液的工作曲线，见下表1。
表1 CEA标准溶液工作曲线
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例4 血清样品中CEA蛋白质标记物的检测
取临床人血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，向实施例2步骤（1）中制备好的电化学免疫传感器表面依次滴加8μL血清样品和实施例2步骤（2）制备的8µL脲酶功能化硅纳米探针分散液，室温下温育反应50min后再次用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；再滴加8µL含有0.1M尿素（urea）和0.1M多巴胺（DA）的水溶液，室温反应20min后用超纯水洗净；最后置于含有0.1M KCl的50mM pH=6.9 PBS缓冲溶液中，通过示差脉冲伏安法在0.7-0V范围内记录其电流响应值，从而检测血清样品中CEA的含量。
经检测样品中CEA的浓度见下表2，将上述三个临床血清样品使用本实施例方法与贝克曼化学发光免疫分析仪的测定结果比较，结果下表2。
表2 本实施例与贝克曼化学发光免疫分析仪的测定结果比较
Figure DEST_PATH_IMAGE003
从上表2可以看出，本实施例测试结果的相对标准偏差（RSD）为3.3-4.1%，相对误差为-6.5-2.0%，说明本实施例的免疫分析方法具有较高的重复性和稳定性。将本实施例的测试结果与贝克曼化学发光免疫分析仪检测结果相比较，1号样品的相对误差为-6.5%，2号样品的相对误差为-5.3%，3号样品的相对误差为2.0%，由此可见，本实施例的免疫分析方法具有较高的准确度。
实施例5
本实施例还提供了一种基于普鲁士蓝修饰电极的电化学免疫传感器所建立的电化学免疫传感方法在检测肿瘤标志物中的应用。
使用该方法在测定AFP时，只需要将实施例2中的CEA捕获抗体（Ab1）和CEA信号抗体 (Ab2)相应地换成AFP捕获抗体和AFP捕获抗体，即可达到测定样品中AFP的含量。

Claims (2)

1.一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器的制备方法，所述电化学免疫传感器是由基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰壳聚糖-普鲁士蓝纳米复合物、金纳米粒子和肿瘤标志物捕获抗体组成，其特征在于，所述电化学免疫传感器的制备方法包括以下步骤：
（1）壳聚糖-普鲁士蓝纳米复合物的制备
向5mL 5mg/mL壳聚糖的质量分数为1%醋酸溶液中加入2mL含有50mM FeCl3、50mM K3Fe(CN)6和1.0M KCl的质量分数为0.1%醋酸溶液，混合均匀后升温至95℃，搅拌下反应12h；所得产物经10000rpm离心25min，弃去上清液，再使用质量分数为1%醋酸溶液洗涤后重新分散于5.0mL质量分数为 1%醋酸溶液中，即可得到CS-PB纳米复合物；
（2）电化学免疫传感器的制备
向玻碳电极上滴加5µL CS-PB纳米复合物，室温晾干之后向其表面滴加8µL平均粒径为13nm的金纳米粒子，室温组装8h；用超纯水洗净后，继续滴加3µL 0.5mg/mL CEA捕获抗体，4℃静置反应过夜；用pH=6.9的PBS缓冲溶液洗净后，继续滴加8µL含有质量分数为2% BSA的pH=6.9 PBS缓冲溶液，室温封闭60min；最后将所得电极用含有质量分数为0.05%吐温-20的pH=6.9 PBS缓冲溶液及pH=6.9 PBS缓冲溶液交替洗净、晾干，即得。
2.一种基于普鲁士蓝的电化学免疫传感器的电化学免疫传感方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）电化学免疫传感器的制备
向5mL 5mg/mL壳聚糖的质量分数为1%醋酸溶液中加入2mL含有50mM FeCl3、50mM K3Fe(CN)6和1.0M KCl的质量分数为0.1%醋酸溶液，混合均匀后升温至95℃，搅拌下反应12h；所得产物经10000rpm离心25min，弃去上清液，再使用质量分数为1%醋酸溶液洗涤后重新分散于5.0mL质量分数为 1%醋酸溶液中，即可得到CS-PB纳米复合物；向玻碳电极上滴加5µLCS-PB纳米复合物，室温晾干之后向其表面滴加8µL平均粒径为13nm的金纳米粒子，室温组装8h；用超纯水洗净后，继续滴加3µL 0.5mg/mL CEA捕获抗体，4℃静置反应过夜；用pH=6.9的PBS缓冲溶液洗净后，继续滴加8µL含有质量分数为2% BSA的pH=6.9 PBS缓冲溶液，室温封闭60min；最后将所得电极用含有质量分数为0.05%吐温-20的pH=6.9 PBS缓冲溶液及pH=6.9 PBS缓冲溶液交替洗净、晾干，即得；
（2）脲酶功能化硅纳米探针的制备
向700µL 50mM pH=7.4 PBS缓冲溶液中加入100µL 5mg/mL粒径为100nm的氨基化硅纳米球分散液和200µL质量分数为2.5%的戊二醛溶液，室温下搅拌反应3h；所得产物经离心后弃去上清液，再用PBS缓冲溶液洗净之后重新分散于1.0mL PBS缓冲溶液中；继续向其中加入10µL 1.0mg/mL的CEA信号抗体，室温混匀反应1h后加入25μL 20mg/mL脲酶，继续混匀反应2h；所得产物经过离心后除去上清液，再重新分散于500µL含有质量分数为2% BSA的PBS缓冲溶液中，室温封闭反应1h即得；将得到的脲酶功能化硅纳米探针经反复离心、洗净之后分散于1.0mL 50mM pH=6.9 的PBS缓冲溶液中即得脲酶功能化硅纳米探针分散液，于4℃保存待用；
（3）标准溶液中肿瘤标志物CEA的检测
向步骤（1）制备的电化学免疫传感器表面滴加8µL不同浓度的CEA标准溶液，室温下温育反应50min后采用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；继续滴加8µL步骤（2）制备的脲酶功能化硅纳米探针分散液，室温下温育反应50min后再次用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；再滴加8µL含有0.1M尿素和0.1M多巴胺的水溶液，室温反应20min后用超纯水洗净；最后置于含有0.1M KCl的50mM pH=6.9 PBS缓冲溶液中，通过示差脉冲伏安法在0.7-0V范围内记录其电流响应值，从而检测出标准溶液中CEA的含量；
（4）血清样品中CEA蛋白质标记物的检测
取临床人血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，向步骤（1）中制备好的电化学免疫传感器表面依次滴加8μL血清样品和步骤（2）制备的8µL脲酶功能化硅纳米探针分散液，室温下温育反应50min后再次用pH=6.9的PBST溶液及PBS缓冲溶液交替洗净；再滴加8µL含有0.1M尿素和0.1M多巴胺的水溶液，室温反应20min后用超纯水洗净；最后置于含有0.1MKCl的50mM pH=6.9 PBS缓冲溶液中，通过示差脉冲伏安法在0.7-0V范围内记录其电流响应值，从而检测血清样品中CEA的含量。
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