CN114720515A

CN114720515A - 一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法及应用

Info

Publication number: CN114720515A
Application number: CN202210225513.7A
Authority: CN
Inventors: 陈翊平; 冯牛; 董永贞; 鲁鹏; 魏巧玲
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-03-07
Filing date: 2022-03-07
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2042-03-07
Also published as: CN114720515B

Abstract

本发明涉及一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法及应用，在纳米酶催化过氧化氢过程中，盐酸多巴胺会迅速聚合生成聚多巴胺，聚多巴胺表面丰富的官能团对金属离子（如Fe³⁺、Cu²⁺等）具有良好的络合作用，因此引起金属离子浓度的改变，而金属离子本身具有很强的电导率信号，从而建立纳米酶与电导率信号改变值的相关性。结合免疫反应，目标物的含量能够控制结合在免疫磁珠上纳米酶的含量，进而调控金属离子的电导率信号，通过便携式电导率仪对电信号读出实现目标物的定量分析。本发明不需要对电极进行修饰，解决了传统的电化学免疫传感器需要修饰电极导致稳定性较差、操作较复杂等问题。

Description

一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法及应用

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法及应用。

背景技术

理化分析法和生物化学法是目前分析技术领域的主要定量方法。理化分析法的样品前处理步骤较为复杂，需要专业的技术人员，检测成本较高，制约了其在现场快速分析检测的应用。生物化学法又可分为微生物分析法和免疫分析法。微生物分析法受到较多因素影响，不能准确定量，且重复性欠佳。免疫分析法主要包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、化学发光免疫分析法和胶体金免疫层析法等方法。ELISA操作较为简单、特异性好，但由于其灵敏度较低，并不适用于生活中痕量有毒有害物质的精准检测。化学发光免疫分析法相较于ELISA，具有灵敏度高、准确性好等优点，但是其化学发光底物比较贵，成本比较高，影响了其进一步的应用。胶体金免疫层析试纸条具有结构简单、检测快速、制造成本低、适合现场快速检测等优点，但其灵敏度比 ELISA低，且其检测结果收到操作人员影响较大，无法满足大批量、低含量危害物质精准监测的需求。因此，研发一种具有多重优点，能够很好解决现场、快速、稳定、准确的分析定量检测方法显得尤为重要。

目前，电导率分析法由于其成本低廉、灵敏度高、分析速度快、稳定性好等优点，在食品安全领域和体外诊断方面得以应用，将电导率的高灵敏性和免疫分析高特异性的优势结合起来，将为食品安全、临床诊断等领域提供一个有力的工具。目前已有的电导率免疫分析方法，大多采用在工作电极上进行修饰的方式，实现免疫分析与电导率检测的结合。此类方法受到修饰用量、修饰条件等因素的限制，导致其稳定性和重现性欠佳，因此开发一种无需电极修饰的电导率方法将可以极大地提高方法的稳定性。

通过电导率测定金属离子是一种简单有效的免修饰途径。而通过无机材料实现金属离子的调控是一种有潜力的结合方法。在众多无机材料中，聚多巴胺因其丰富的表面活性基团和优异的重金属吸附能力被广泛报道。聚多巴胺由盐酸多巴胺单体氧化聚合而成，当辣根过氧化物酶和过氧化氢同时存在的条件下，其氧化聚合过程会大大加快，盐酸多巴胺单体会迅速氧化聚合生成聚多巴胺。聚多巴胺已被证明可以依附在许多基材表面。由于其具有大量的儿茶酚羟基，使得其具有很强的配位金属离子的能力。

发明内容

本发明提供了一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法及应用，且可以应用于食品安全、环境检测、体外诊断快速检测领域中的新型免电极修饰、稳定性好的电导率免疫传感器，该方法通过基于级联酶促作用，构建不同信号放大策略，最后利用聚多巴胺吸附金属离子实现电信号可调放大和读出，且不需要对电极进行修饰。

本发明技术方案如下：

本发明首先通过免疫反应，目标物的含量能够控制结合在免疫复合物上纳米酶的含量，纳米酶催化过氧化氢促进聚多巴胺生成，而聚多巴胺表面丰富的官能团对金属离子(如Fe³⁺、Cu²⁺等)具有良好的络合作用，引起金属离子浓度的改变，进而引起不同的电导率信号变化值。通过聚多巴胺的引入解决电极修饰引起的分析方法不稳定、耗费高的难题，并通过基于纳米酶促-聚多巴胺聚合介导的金属离子调控体系提高方法的灵敏度。

同时，本发明通过将不同信号放大策略有机地结合起来，实现了线性范围可调。这很好地满足了针对不同检出要求目标物对方法学的要求。在实际应用中，针对不同的目标物，通常需要不同灵敏度、线性范围的检测方法，才能实现精准检测。例如，针对检出要求较低的目标物，我们通过选用灵敏度较低、线性范围较窄的方法，此时，既能满足检测要求，也不会造成试剂、时间的损耗。但是，针对检出要求高、痕量的待测目标物，我们则采用高灵敏度、宽线性范围的检测方法，由此可以很好地满足痕量目标物的准确检测。这为危害因子的精准检测提供了良好的手段。

为达到线性范围可调的目的，本发明使用了三种不同模式的信号放大策略，以满足不同浓度待测目标物的检测需求。使用的主要技术手段如下：

一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法，以小分子为例，包括以下步骤：

S1-A方案1：当待测目标物的浓度为高于10ng/mL时，选用方案A作为检测方案，包括以下步骤：

S1-A.1在磁珠表面偶联生物识别分子A，得到偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体，在铂金纳米颗粒表面偶联生物识别分子B，得到偶联待测物特异性生物识别分子B的铂金纳米颗粒载体；

S1-A.2使偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体、偶联待测物特异性生物识别分子B的金纳米颗粒载体和待测物发生特异性识别反应；

S1-A.3向反应后的混合液中加入过氧化氢和盐酸多巴胺的混合溶液，进行铂金纳米颗粒的催化反应，催化反应完成后，磁分离弃去上清液，使用纯水洗涤复合物；

S1-A.4向洗涤后的复合物中注入铜离子溶液进行吸附反应，吸附反应完成后，磁分离收集上清液，使用电导率仪检测其电导率值，通过电导率值的变化来间接得到待测目标物的含量。

S1-B方案2：当待测目标物的浓度为10ng/mL以下时，选用方案B作为检测方案，包括以下步骤：

S1-B.1在磁珠表面偶联生物识别分子A，得到偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体，在在铂金纳米颗粒表面修饰点击试剂分子Ⅱ，得到修饰点击试剂分子Ⅱ的铂金纳米颗粒载体；

S1-B.2使偶联待测物特异性生物识别分子A的磁珠载体、制备好的点击试剂Ⅰ修饰的生物识别分子B进行免疫反应，形成免疫复合物；

S1-B.3再向步骤S1-B.2中形成的免疫复合物中加入修饰点击试剂分子Ⅱ的铂金纳米颗粒载体，通过点击反应，进一步形成复合物；

S1-B.4向反应后的混合液中加入过氧化氢和盐酸多巴胺的混合溶液，进行催化反应，催化反应完成后磁分离弃去上清液，使用纯水洗涤复合物；

S1-B.5向洗涤后的复合物中注入铜离子溶液进行吸附反应，吸附反应完成后，磁分离收集上清液，使用电导率仪检测其电导率值，通过电导率值的变化来间接得到待测目标物的含量。

优选地，所述生物识别分子A和生物识别分子B可以分别为捕获抗体和检测抗体、检测抗体和捕获抗体、抗体和完全抗原、完全抗原和抗体、DNA捕获探针和DNA 检测探针或DNA检测探针和DNA捕获探针。

进一步优选地，所述生物识别分子A和生物识别分子B的浓度为1-20μg/mL。

优选地，S1-A.3及S1-B.4所述盐酸多巴胺溶液的浓度为5-50mM。

优选地，S1-A.3或S1-B.4中的催化反应时间范围是5-30min，温度范围是35-40℃。

优选地，所述铂金纳米颗粒溶液，其浓度为1-100μg/mL。

优选地，所述待测目标物为小分子物质和大分子物质，小分子物质时，所述待测目标物为真菌毒素或抗生素；当为大分子物质时，所述待测目标物为炎症标志物、细菌和病毒。

所述线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法的应用，所述方法应用于食品安全、环境监测或体外诊断的检测。

本发明的检测原理如下：

盐酸多巴胺，在纳米酶和双氧水存在的条件下，会迅速被氧化，聚合生成聚多巴胺。由于聚多巴胺表面含有丰富的官能团，能够对诸多金属离子进行络合，导致金属离子溶液的浓度发生改变，相应的电导率值也发生改变。于是笔者通过使用金属离子作为信号探针，利用制备的金核铂壳纳米酶的免疫功能载体性质及催化活性，将其引入免疫分析检测中，大大提升了分离、分析速度，很好地提高了该方法的稳定性和现场性。

参考附图1B，对于检测浓度含量高、对方法检出限要求低的待测物，以检测呕吐毒素为例(国标GB2761-2011中规定了谷物及谷物制品中(包括玉米、玉米面、大麦、小麦、麦片和小麦粉)呕吐毒素DON的限量标准为1μg/mL)，采用如下检测方法：预先将呕吐毒素的抗体偶联至磁颗粒表面，将呕吐毒素的完全抗原偶联至金核铂壳纳米颗粒表面。然后在目标物存在的情况下，三者会进行竞争型免疫反应。当目标物含量越多，能够通过免疫反应结合在磁颗粒表面的金核铂壳纳米酶越少，则其可以催化盐酸多巴胺生成聚多巴胺的量也会越少，最终能荷载的金属离子越少，上清液中金属离子溶液的电导率值越大。反之，当目标物含量越少，则上清液中电导率值越小。

参考附图1C，对于检测浓度含量低、对方法检出限要求高的待测物，以检测赭曲霉毒素OTA为例(国标GB2761-2011中规定了谷物及谷物制品中(包括玉米、玉米面、大麦、小麦、麦片和小麦粉)赭曲霉毒素OTA的限量标准为5ng/mL)，采用如下检测方法：预先将赭曲霉毒素抗体偶联至磁颗粒表面，将点击试剂Ⅰ修饰于赭曲霉毒素完全抗原上，当目标物存在时，三者之间发生竞争型免疫反应。反应结束后，向体系中加入点击试剂Ⅱ修饰的金核铂壳纳米酶颗粒，在点击反应的作用下，免疫复合物上的点击试剂Ⅰ会与金核铂壳纳米酶颗粒表面的点击试剂Ⅱ结合。最后再引入多巴胺溶液和金属离子，并使用电导率进行信号读出。由于点击试剂间的高效反应，并且这种分步组装的方式有效地降低了空间位阻，提升了反应效率，进而提高了该方法的灵敏度。当目标物含量越多，能够通过免疫反应和点击化学反应结合在磁颗粒表面的金核铂壳纳米酶越少，则其可以催化盐酸多巴胺生成聚多巴胺的量也会越少，最终能荷载的金属离子越少，上清液中金属离子溶液的电导率值越大。反之，当目标物含量越少，则上清液中电导率值越小。

上述反应均为竞争免疫反应，当溶液中不含目标物时，其结合的金核铂壳纳米酶最多，所络合的金属离子最多，此时对应上清液在电导率检测中的σ值最小；当待测物溶液中的目标物含量逐渐增多，其结合的金核铂壳纳米酶逐渐减少，催化生成的聚多巴胺越少，因此络合金属离子逐渐减少，其对应的σ值逐渐增加，故σ值的改变量 (Δσ＝σ_样品-σ_空白样品)与待测物溶液中的目标物的含量呈正相关。因此，可通过检测Δσ值得出待测物溶液中的目标物含量。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过使用不同信号放大策略，实现了检测方法的灵敏度、线性范围可调节，从而可以满足不同检测需求目标物的精准检测。利用辣根过氧化物酶和双氧水的催化特性使得多巴胺迅速聚合生成聚多巴胺，以金属离子作为信号探针，同时将聚多巴胺络合金属离子作为信号放大手段，使用微米磁颗粒作为免疫磁分离载体。无需对检测电极进行修饰，避免修饰电极所存在的修饰过程繁琐、稳定性低、重现性差等缺陷，进而提该方法的稳定性。

(2)本发明通过使用金核铂壳纳米酶代替辣根过氧化物酶，提高了方法的稳定性与现场可操作性。同时，使用便携式电导率仪作为信号读出设备，进一步提高了方法的稳定性。

(3)本发明中金核铂壳纳米酶对多巴胺的高效催化作用：金核铂壳纳米酶可以加速多巴胺的氧化聚合，使其聚合速率提高约300倍，有利于提高方法的灵敏度和节省反应时间。

(4)聚多巴胺对金属离子有良好的络合作用，并且金属离子溶液稳定性高，有利于使用灵敏度高的电导率分析仪进行电导率信号读出，进而提高方法的灵敏度。并且不仅工艺简单，反应可控，而且试剂和材料易于获取、价格便宜，检测中不依赖昂贵、操作复杂的仪器设备，具有稳定性好、操作简单、成本低廉等优点。

附图说明

图1示出了此款电导率免疫传感器的工作原理；

图2示出了电导率仪对Cu²⁺、Fe³⁺检测的标准曲线；

图3示出了对无信号放大策略电导率免疫传感器检测呕吐毒素中的BSA-DON浓度优化结果；

图4示出了对无信号放大策略电导率免疫传感器检测呕吐毒素的单克隆抗体浓度优化结果；

图5示出了对无信号放大策略电导率免疫传感器检测呕吐毒素的的多巴胺浓度优化结果；

图6示出了对无信号放大策略电导率免疫传感器检测呕吐毒素催化多巴胺反应时间优化结果；

图7示出了对无信号放大策略电导率免疫传感器检测呕吐毒素的Cu²⁺浓度优化结果；

图8示出了无信号放大策略电导率免疫传感器检测呕吐毒素的标准曲线及线性范围；

图9示出了点击化学介导的信号放大策略电导率免疫传感器检测呕吐毒素的标准曲线及线性范围；

图10示出了点击化学介导的信号放大策略电导率免疫传感器检测赭曲霉毒素的标准曲线及线性范围；

图11示出了点击化学介导的信号放大策略电导率免疫传感器检测降钙素原的标准曲线及线性范围；

图12示出了点击化学介导的信号放大策略电导率免疫传感器检测沙门氏菌的标准曲线及线性范围；

图13示出了点击化学介导的信号放大策略电导率免疫传感器检测降钙素原时的对比试验结果

具体实施方式

下面以呕吐毒素为例通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本实施例中使用的试剂、材料、溶液和仪器如下：

试剂和材料：辣根过氧化物酶(HRP)来自Sigma-Aldrich公司(USA)；呕吐霉毒素单克隆抗体(2.5mg/mL)、呕吐霉毒素完全抗原(1.5mg/mL)购自上海羽朵生物科技有限公司；降钙素原捕获抗体、降钙素原检测抗体购自abcam公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG来自JacksonImmunoResearch；牛血清白蛋白购自Sigma-Aldrich公司(中国，上海)；丝网印刷电极购于禅谱科技股份有限公司(中国，台湾)。

溶液配制：

磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.00g NaCl，0.20gKCl，0.20g KH₂PO₄和2.90g Na₂HPO₄·12H₂O溶于1000mL水中，摇匀；

Tris-HCl缓冲液：先配置同样浓度的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液和HCl溶液，将两者混匀后加水稀释；

洗涤液：在配制好的1000mL磷酸盐缓冲液中加入0.5mL吐温-20，摇匀，配成 PBST洗涤液；

呕吐毒素和呕吐毒素单克隆抗体溶液、沙门氏菌抗体溶液检测抗体溶液、降钙素原捕获抗体溶液、降钙素原检测抗体溶液均使用PBS缓冲液配置，然后于4℃保存。

盐酸多巴胺溶液：用10mM，pH＝8.5Tris-HCl缓冲液(浓度为1M的过氧化氢含量：2％)配置不同浓度的盐酸多巴胺溶液，使用前配置，不可久放。

仪器：电导率分析仪DDS-11A购于上海雷磁，用于电导率值检测。

实施例1利用生物识别分子修饰磁珠

1、磁珠的活化

1)取2mg磁珠(平均直径1μm)于离心管中，用500μL MEST(10mM MES, 0.05％Tween20,pH 6.0)洗涤2次，磁分离移除上清液；

2)用10mM MES(pH 6.0)配制5mg/mL EDC溶液和5mg/mL NHS溶液；

3)向装有磁珠的离心管中分别加入100μL EDC(5mg/mL)和50μL NHS(5 mg/mL)，使用涡旋器混匀使磁珠充分悬浮，用MES稀释至500μL，放置于旋转混匀仪上，37℃活化30min；

4)磁分离，除去上层清液，加入500μL MEST，并将磁珠转移至新的离心管中；

5)磁分离，除去上层清液，用500μL MEST洗涤2次，磁分离，除去上层清液。

经上述步骤，磁珠表面的羧基已被活化。

2、磁珠与生物识别分子的偶联

以呕吐毒素完全抗原为例，对偶联过程进行说明，其余生物识别分子包括降钙素原抗体、氨基修饰的DNA探针等也能采用类似的方法。

1)将100μg呕吐毒素完全抗原加入到上述装有磁珠的离心管中，用PBST调节总体积至500μL，轻摇混匀磁珠和抗体；

2)将上述混合物置于旋转混匀仪上，37℃反应3h；

3)磁分离，除去上层清液，加入含1％BSA的PBST(pH 7.4)500μL，重新悬浮磁珠，置于旋转混匀仪上，37℃封闭30min；

4)磁分离，除去上层清液，500μL PBST洗涤3次；

5)磁分离，除去上层清液，所得到的呕吐毒素完全抗原修饰的磁珠用1mL PBST(pH 7.4，0.5％BSA)重新悬浮，置于4℃保存。

实施例2金核铂壳纳米的合成与生物修饰

1、金核铂壳纳米酶的合成

为避免制备的纳米粒子不纯净，在实验开始前需将实验所需的器皿用新鲜制备的王水(浓硝酸：浓盐酸为1:3)浸泡3h，用超纯水冲净，干燥以供使用。AuNPs的制备引入了微波合成法，5min便可完成AuNPs的制备。将200μL HAuCl4(48μM) 和9.8mL 超纯水中加入反应釜中，在100℃微波加热下，保持沸腾1min。然后开启磁力搅拌，一次性迅速加入1mL1wt％的柠檬酸钠，在100℃下保持4min，随后冷却至室温，得到红色的AuNPs悬浮液。采用种子生长法在AuNP表面铂沉合成 Au@PtNPs。将200μL的15nmAuNP与800μL超纯水混合，加入50μL 20wt％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，MW，10kDa)。之后将该溶液在涡流旋转振荡仪上旋涡震荡并37℃温育5min，使PVP包覆并稳定AuNPs。然后将40μL 100mg/mL L-抗坏血酸 (L-Ascorbic Acid)和40μL氯铂酸水合物(Chloroplatinic acid hydrate，100mM)，加入混合物中混合，并立即在65℃孵育1h直至溶液的颜色从红色变为棕色/黑色，表明铂沉积成功。将制备的Au@PtNPs悬浮液冷却至室温，并通过三个连续的洗涤循环(在12000rpm下离心15min)去除多余的试剂，然后重悬于1mL超纯水中。

2、金核铂壳纳米酶的生物修饰

1)用0.01M NaOH溶液将1mL上述Au@PtNPs悬浮液的PH调节至8-9；

2)加入200μL生物识别分子(100μg/mL)，并用涡流旋转振荡仪在4℃下轻轻摇动反应5h；

3)然后将80μL含有10wt％BSA的PBS(pH 7.4)加入混合物中，在4℃下孵育12h，以封闭Au@PtNPs上的残留位点；

4)通过离心(10000r/min，15min，4℃)收集Au@PtNPs偶联物，最后将其分散到含有1.0wt％BSA，0.05％吐温-20的1mL PBS(pH 7.4)中，于4℃中储存以备后用。

实施例3对无信号放大策略电导率免疫传感器反应条件的优化

于磁珠上偶联不同质量(20μg,50μg,100μg,150μg)的呕吐毒素完全抗原，其它实验步骤如上所述。结果如图2所示，完全抗原浓度为20μg时电导率免疫传感器具有最优的响应效果。

使用不同浓度(1μg/mL,2μg/mL,3μg/mL,4μg/mL)的呕吐毒素单克隆抗体进行竞争免疫反应，其它实验步骤如上所述。结果如图4所示，吐毒素单克隆抗体浓度为2μg/mL时电导率免疫传感器具有最优的响应效果。

设置不同浓度(1mg/mL,3mg/mL,5mg/mL,10mg/mL)的盐酸多巴胺溶液，其他实验步骤如上所述。结果如图5所示，盐酸多巴胺溶液浓度为10mg/mL时电导率免疫传感器具有最优的响应效果。

设置不同催化时间(5min,10min,20min,25min)，其他实验步骤如上所述。结果如图6所示，催化反应时间为15min时电导率免疫传感器具有最优的响应效果。

设置不同浓度Cu²⁺(0.05mM,0.1mM,0.5mM,1mM,)，其他实验步骤如上所述。结果如图7所示，Cu²⁺浓度为0.5mM时电导率免疫传感器具有最优的响应效果。

从以上结果可以得出，呕吐毒素的完全抗原浓度为20μg单克隆抗体浓度为 2μg/mL、盐酸多巴胺浓度为5mg/mL，催化反应时间为25分钟和Cu²⁺浓度为0.5mM 时电导率免疫传感器具有最优的响应效果。

实施例4无信号放大策略电导率免疫传感器对呕吐毒素的检测

(1)偶联：以实施例1与实施例2中的步骤，制备呕吐毒素抗体修饰的磁珠与呕吐毒素完全抗原修饰的金核铂壳纳米颗粒，使用PBS稀释至20μg/mL，待用。

(2)免疫反应：预先将100μL不同浓度的呕吐毒素标准溶液与100μL呕吐毒素单克隆抗体修饰的磁珠于1.5mL EP管混匀，37℃反应15min后，于对应的EP管中加入稀释后的呕吐毒素完全抗原修饰的金核铂壳纳米颗粒溶液200μL，置于37℃，颠倒混匀反应30min。

(4)催化反应：PBST洗涤5次后，磁分离，向磁分离产物中加入100μL盐酸多巴胺溶液(5mg/mL)，37℃反应25min。

(5)注入金属离子：磁分离弃去未被催化的多巴胺溶液，用超纯水清洗复合物三次，每次3min。然后加入Cu²⁺溶液150μL，37℃反应20min。

(6)进行电导率检测：取上清液100μL于电导率分析仪进行检测，记录下电导率值。

实验结果如图8所示，以不含呕吐毒素时的电导率值(σ)为参照，则σ值的改变量随着呕吐毒素溶液的浓度增加而逐渐增大，该方法对呕吐毒素的检测具有良好的灵敏度。

实施例5无信号放大电导率免疫传感器检测呕吐毒素的加标回收率

步骤(2)中，洗涤磁珠后，于对应的离心管中加入100μL加标动物饲料样品提取液，然后加入稀释后的呕吐毒素完全抗原修饰的金核铂壳纳米颗粒溶液200μL，轻轻震荡混匀，置于37℃中反应30min。

其它检测步骤均与实施例3相同。

实验结果如表1所示，动物饲料样品中不同呕吐毒素加标水平的加标回收率和变异系数表明该方法对呕吐毒素的检测具有良好的准确性和精密度。

表1动物饲料中不同呕吐毒素加标水平的加标回收率和变异系数

实施例6点击化学介导信号放大策略电导率免疫传感器对呕吐毒素的检测

(1)偶联：以实施例1与实施例2中的步骤，制备呕吐毒素抗体修饰的磁珠、 TCO标记的呕吐毒素完全抗原与TZ标记的的金核铂壳纳米颗粒，使用PBS稀释至 20μg/mL，待用。

(2)免疫反应：预先将100μL不同浓度的呕吐毒素标准溶液与100μL呕吐毒素单克隆抗体修饰的磁珠于1.5mL EP管混匀，37℃反应15min后，于对应的EP管中加入稀释后的TCO标记的呕吐毒素完全抗原，置于37℃，颠倒混匀反应30min。

(4)点击化学反应：PBST洗涤5次后，磁分离，向磁分离产物中加入200μLTZ 标记的金核铂壳纳米酶颗粒溶液，37℃反应15min。

(5)催化反应：PBST洗涤5次后，磁分离，向磁分离产物中加入100μL盐酸多巴胺溶液(5mg/mL)，37℃反应25min。

(6)注入金属离子：磁分离弃去未被催化的多巴胺溶液，用超纯水清洗复合物三次，每次3min。然后加入Cu²⁺溶液150μL，37℃反应20min。

(7)进行电导率检测：取上清液100μL于电导率分析仪进行检测，记录下电导率值。

实验结果如图9所示，以不含呕吐毒素时的电导率值(σ)为参照，则σ值的改变量随着呕吐毒素溶液的浓度增加而逐渐增大，该方法对呕吐毒素的检测具有良好的灵敏度。

实施例7点击化学介导信号放大策略电导率免疫传感器对赭曲霉毒素的检测

(1)偶联：以实施例1与实施例2中的步骤，制备赭曲霉毒素抗体修饰的磁珠、 TCO标记的赭曲霉毒素完全抗原与TZ标记的的金核铂壳纳米颗粒，使用PBS稀释至20μg/mL，待用。

(2)免疫反应：预先将100μL不同浓度的赭曲霉毒素标准溶液与100μL赭曲霉毒素单克隆抗体修饰的磁珠于1.5mL EP管混匀，37℃反应15min后，于对应的EP 管中加入稀释后的TCO标记的赭曲霉毒素完全抗原，置于37℃，颠倒混匀反应30min。

实验结果如图10所示，以不含呕吐毒素时的电导率值(σ)为参照，则σ值的改变量随着赭曲霉毒素溶液的浓度增加而逐渐增大，该方法对呕吐毒素的检测具有良好的灵敏度。

实施例8击化学介导信号放大策略电导率免疫传感器对降钙素原的检测

(1)偶联：以实施例1与实施例2中的步骤，制备降钙素原捕获抗体修饰的磁珠、TCO标记的降钙素原检测抗体与TZ标记的的金核铂壳纳米颗粒，使用PBS稀释至20μg/mL，待用。

(2)免疫反应：预先将100μL不同浓度的降钙素原标准溶液与100μL降钙素原捕获抗体修饰的磁珠于1.5mL EP管混匀，37℃反应15min后，于对应的EP管中加入稀释后的TCO标记的降钙素原检测抗体，置于37℃，颠倒混匀反应30min。

实验结果如图11所示，以不含降钙素原时的电导率值(σ)为参照，则σ值的改变量随着降钙素原溶液的浓度增加而逐渐增大，该方法对降钙素原的检测具有良好的灵敏度。

实施例9击化学介导信号放大策略电导率免疫传感器对沙门氏菌的检测

(1)偶联：以实施例1与实施例2中的步骤，制备沙门氏菌捕获抗体修饰的磁珠、TCO标记的沙门氏菌检测抗体与TZ标记的的金核铂壳纳米颗粒，使用PBS稀释至20μg/mL，待用。

(2)免疫反应：预先将100μL不同浓度的沙门氏菌标准溶液与100μL沙门氏菌捕获抗体修饰的磁珠于1.5mL EP管混匀，37℃反应15min后，于对应的EP管中加入稀释后的TCO标记的降钙素原检测抗体，置于37℃，颠倒混匀反应30min。

实验结果如图12所示，以不含沙门氏菌时的电导率值(σ)为参照，则σ值的改变量随着沙门氏菌溶液的浓度增加而逐渐增大，该方法对沙门氏菌的检测具有良好的灵敏度。

通过上述实施例来解释本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述具体实施例才能实施。所属领域的技术人员在本发明基础上进行的任何改进，或者对本发明所选用的材料的等效替换等，均落在专利的保护范围之内。

实施例10击化学介导信号放大策略电导率免疫传感器对降钙素原的检测

参照实施例8中所述步骤，但设置三个对照组：一号对照组为不使用点击化学介导的信号放大策略；二号对照组为使用HRP酶替换纳米酶；三号对照组为不使用多巴胺。从图13可见，只有使用点击化学介导、纳米酶催化、多巴胺富集等级联过程时，所引起的金属离子浓度改变最大，表现在电导率值改变值最大，这表明，其信号放大效果最佳，具有高灵敏度的特点，具有能够很好的检测痕量危害因子的潜力。而当省略其中任意一个步骤时，改变金属离子的浓度效果均差于上述实验组，这很好地说明了我们这项级联放大技术的优越性和必要性。

Claims

1.一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法，以小分子为例，其特征在于，包括以下步骤：

S1-A方案1：当待测目标物的浓度为高于10 ng/mL时，选用方案A作为检测方案，包括以下步骤：

S1-A.4向洗涤后的复合物中注入铜离子溶液进行吸附反应，吸附反应完成后，磁分离收集上清液，使用电导率仪检测其电导率值，通过电导率值的变化来间接得到待测目标物的含量；

2.根据权利要求1所述线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法，其特征在于：所述生物识别分子A和生物识别分子B可以分别为捕获抗体和检测抗体、检测抗体和捕获抗体、抗体和完全抗原、完全抗原和抗体、DNA捕获探针和DNA检测探针或DNA检测探针和DNA捕获探针。

3.根据权利要求2所述线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法，其特征在于：所述生物识别分子A和生物识别分子B的浓度为1-20μg/mL。

4.根据权利要求1所述线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法，其特征在于：S1-A.3及S1-B.4所述盐酸多巴胺溶液的浓度为5-50 mM。

5.根据权利要求1所述线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法，其特征在于：S1-A.3或S1-B.4中的催化反应时间范围是5-30min，温度范围是35-40℃。

6.根据权利要求1所述线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法，其特征在于：所述铂金纳米颗粒溶液，其浓度为1-100μg/mL。

7.根据权利要求1所述线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法，其特征在于：所述待测目标物为小分子物质和大分子物质，小分子物质时，所述待测目标物为真菌毒素或抗生素；当为大分子物质时，所述待测目标物为炎症标志物、细菌和病毒。

8.权利要求1-7任意一项所述线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法的应用，其特征在于：所述方法应用于食品安全、环境监测或体外诊断的检测。