CN110187104A - 基于生物正交反应的横向弛豫时间免疫传感器的制备方法、传感器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于生物正交反应的横向弛豫时间免疫传感器的制备方法、传感器及其应用,涉及食品安全和体外诊断分析领域,该方法包括:在纳米微球表面偶联纳米磁颗粒,得到纳米微球‑磁颗粒,将纳米微球‑磁颗粒与抗体偶联,得到纳米微球‑磁颗粒‑抗体;在磁珠表面修饰完全抗原或捕获抗体,磁珠的粒径大于纳米磁颗粒。该免疫传感器包括纳米微球‑磁颗粒‑检测抗体,当待测目标物的相对分子量≤5000时,磁珠偶联完全抗原;当待测目标物的相对分子量>5000时,磁珠偶联捕获抗体。本发明传感器基于生物正交反应,在不同粒径的纳米微球表面偶联数量不同的纳米磁颗粒,制备磁信号不同的磁探针,具有线性范围可调的特点,且灵敏度较高。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全和体外诊断领域,具体涉及一种基于生物正 交反应的横向弛豫时间免疫传感器的制备方法、传感器及其应用。
背景技术
食品安全是关乎国计民生和国际声誉的热点问题,抗生素由于具 有杀菌活性较强、毒副作用小的特点,在动物饲养过程中被广泛使用, 由于长期使用抗生素会导致细菌产生抗药性,为了得到较好的杀菌效 果,通常会增加抗生素的用量。
但是,过量使用抗生素会造成大量的抗生素残留在环境和动物体 内,并通过食物链在人体内富集,造成抗药性、过敏、人体菌落失衡 等严重的安全问题,进而引发组织器官病变,人体免疫能力降低,严 重者甚至可能造成药物中毒、诱发癌变等,国际组织与各国食品安全 管理部门均制订了相应食品中抗生素的最高限量指标。
不同种类的抗生素残留水平差异大,需要简便、快速、高灵敏度 且较宽线性范围的分析手段对其进行有效的检测与监控。
体外诊断和人民的健康直接相关。发展高灵敏、简单,快速的诊 断方法对于体外诊断具有重要的意义。血清中的降钙素原是一种特异 性良好的细菌感染生物标志物,正常的人体中降钙素原的含量很低, 当人体被细菌感染之后其在血液中的浓度才会显著上升,因此其被作 为一种细菌感染的生物标志物,广泛应用于临床诊断领域。高灵敏检 测血清中的降钙素原,一方面可以及时诊断细菌感染疾病,早发现早 治疗;另一方面,可以有效地指导抗生素的合理使用,避免抗生素的 滥用。
沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌,是引起我国食物中毒的首 要病菌,据资料统计,在我国细菌性食物中毒中,70%-80%是由沙门 氏菌引起的,人体感染沙门氏菌会导致胃肠炎、伤寒、副伤寒和败血 症等疾病,会严重危害人民身体健康和生命安全。
目前,对食品中抗生素残留定性定量分析的主要手段包括仪器分 析法、免疫分析法和生物传感器,仪器分析方法主要通过气相色谱仪、 高效液相色谱仪、高效液相色谱-质谱联用仪等大型精密仪器进行检 测,具有灵敏度高、准确性好等优势,但是仪器分析的样品前处理比 较复杂,仪器昂贵,检测成本较高,同时,还需要高水平的专业技术 人员操作,不适合现场快速检测。
免疫分析法主要包括ELISA(enzyme linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附测定法)和胶体金免疫层析试纸条方法,ELISA 具有操作相对简单、高通量等优势,但其灵敏度一般在ng/mL级别, 线性范围较窄,且不适用于痕量检测。胶体金免疫层析试纸条具有操 作简单、反应速度快、适合现场快速检测等优点,但其灵敏度比ELISA 低,无法满足痕量抗生素残留的分析。
生物传感器通过将待测目标物浓度转换为信号进行检测,主要包 括固定化的生物敏感材料作为识别元件、理化转换器和信号放大装置 构成的分析工具,生物传感器具有分析速度快、成本低、便携性好等 优点,易于实现现场即时检测,已广泛应用于食品安全、体外诊断等 领域。
横向弛豫时间免疫传感器是一种典型的生物传感器,该免疫传感 器的基本原理是:将偶联有抗体的超顺纳米磁颗粒作为磁信号探针, 通过抗体-抗原的识别作用,超顺纳米磁颗粒的状态会由原来的分散 状态变成聚集状态,导致磁场均匀性发生改变,进而引起周围水分子 质子的横向弛豫时间(transverse relaxation time,T2)发生显著改变, 由于磁信号(T2)的改变与超顺磁性纳米颗粒的状态改变相关,而超 顺磁性纳米颗粒状态的改变和样品中目标物的含量相关。因此通过测 量T2可以间接得到目标分子的含量。
横向弛豫时间免疫传感器的主要优势在于:(1)信号的读出不 依赖光信号,避免了复杂基质的干扰,减少了样品前处理等复杂步骤; (2)检测体系是一种均相反应体系,减少了传统酶联免疫分析中多 次洗板和显色等步骤,大大提高了检测效率。但是该方法由于依赖单 个的纳米小磁颗粒,缺少有效的信号放大系统和信号调控系统,因此 线性范围比较窄,灵敏度较低。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷,本发明的目的在于提供一种基于生 物正交反应的横向弛豫时间免疫传感器的制备方法、传感器及其应 用,该传感器具有较宽的线性范围,且灵敏度较高。
为达到以上目的,本发明采取的技术方案是:
一种基于生物正交反应的横向弛豫时间免疫传感器的制备方法, 包括以下步骤:在纳米微球表面偶联纳米磁颗粒,得到纳米微球-磁 颗粒,将所述纳米微球-磁颗粒与抗体偶联,得到纳米微球-磁颗粒- 抗体;在磁珠表面修饰完全抗原或捕获抗体,所述磁珠的粒径大于纳 米磁颗粒。
一种基于生物正交反应的横向弛豫时间的免疫传感器,所述免疫 传感器包括纳米微球-磁颗粒-检测抗体,磁珠-完全抗原/捕获抗体; 当待测目标物的相对分子量≤5000时,磁珠偶联与待测目标物相对 应的完全抗原;当待测目标物的相对分子量>5000时,磁珠偶联与 待测目标物特异性识别的捕获抗体,所述磁珠的粒径大于纳米磁颗 粒,所述待测目标物含量越低,相对应的纳米微球粒径越大。
进一步的,所述磁珠的粒径为250~3000nm。
进一步的,所述纳米磁颗粒的粒径为20~100nm。
进一步的,所述纳米微球的粒径为200~3000nm。
一种免疫传感器的应用,所述免疫传感器用于检测抗生素、生物 标志物或细菌。
一种采用免疫传感器检测抗生素的方法,包括以下步骤:将纳米 微球-磁颗粒-抗体和磁珠-完全抗原加入含有待测目标物的溶液中进 行免疫反应后磁分离,收集上清液,对上清液进行横向弛豫时间的测 定,确定待测目标物的含量。
进一步的,所述完全抗原为待测抗生素和牛血清白蛋白的偶联 物,所述抗体为与待测目标物相对应的抗体。
一种采用免疫传感器检测生物标志物或细菌的方法,包括以下步 骤:将纳米微球-磁颗粒-抗体和磁珠-捕获抗体加入含有待测目标物的 溶液中进行免疫反应后磁分离,收集上清液,对上清液进行横向弛豫 时间的测定,确定待测目标物的含量。
进一步的,所述待测抗生素为磺胺类、土霉素或氯霉素,所述生 物标志物为降钙素原,所述细菌为沙门氏菌与现有技术相比,本发明 的优点在于:
(1)本发明中基于生物正交反应的横向弛豫时间免疫传感器, 包括纳米微球-磁颗粒-抗体,磁珠-完全抗原/捕获抗体,当待测目标 物相对分子量≤5000(即小分子)时,磁珠偶联的是与待测目标物相 对应的完全抗原,当待测目标物相对分子量>5000(即大分子)时, 磁珠偶联的是与待测目标物相对应的捕获抗体,纳米微球-磁颗粒-抗 体为偶联有纳米磁颗粒的纳米微球,在使用时,将上述免疫传感器直 接加入含有目标物的溶液中,当待测目标物为小分子时,进行竞争免 疫反应;为大分子时,进行夹心免疫反应,反应完成后,因为磁珠的 磁饱和强度大,很容易磁分离,在0.01T的磁场中,吸附在磁珠表面 的物质均可在1min内完全分离;而纳米磁颗粒的磁饱和强度较小, 在在0.01T的磁场中分离时间大于5min,因此,可以在0.01T的磁 场将二者分离。
当待测目标物为小分子时,在纳米微球-磁颗粒-抗体过量的情况 下,小分子能够和磁珠-完全抗原竞争性地结合纳米微球-磁颗粒-抗 体,即分离出的纳米微球-磁颗粒-抗体-小分子目标物免疫反应产物 (通过分离得到上清液即可)浓度与待测小分子浓度相对应,通过对 分离出的上清液中的PS-MNPX-检测抗体-小分子免疫复合物进行横 向弛豫时间(T2)的测定即可;当为大分子时,进行夹心免疫反应, 通过检测抗体-PS1000-MNP30偶联物过量添加,在同一反应体系中,检 测抗体-PS1000-MNP30偶联物、大分子目标物、磁珠-捕获抗体三者形 成双抗夹心结构,反应完成后,通过磁分离,收集上清液,即为未参 加反应的检测抗体-PS1000-MNP30偶联物,通过差量法,计算加入反 应体系与未参加反应的检测抗体-PS1000-MNP30偶联物之差,即为待测 目标物的浓度。
本发明的免疫传感器具有较宽的线性范围,且灵敏度较高。
(2)本发明中基于生物正交反应的横向弛豫时间免疫传感器, 通过在不同粒径的纳米微球上面组装纳米磁颗粒,因为不同粒径的纳 米微球表面偶联的纳米磁颗粒的数量不同,因此可以制备不同磁信号 强度的磁探针,能够实现线性范围的大幅度调节(pg/mL~μg/mL), 具有检测浓度范围跨度大的特点。针对不同目标物的浓度不同,选择 不同磁信号强度的微球,进行可以实现浓度范围不同的多个目标物的 检测。
(3)本发明中基于生物正交反应的横向弛豫时间免疫传感器的 检测方法,前处理简单,操作简便,降低了检测成本,且检测速度较 快,避免使用HPLC-MS等大型仪器,提高了检测效率。
附图说明
图1为本发明实施例中基于生物正交反应的横向弛豫时间免疫 传感器检测小分子的原理图;
图2为本发明实施例中基于生物正交反应的横向弛豫时间免疫 传感器检测大分子的原理图;
图3为本发明实施例中Tz用量优化图;
图4为本发明实施例中Tz-MNP30/TCO-PS1000比例优化图;
图5为本发明实施例中T2值与NH2-MNP30个数的关系图;
图6为本发明实施例中不同粒径的PS-MNP30偶联物与T2值的关 系;
图7为本发明实施例中横向弛豫时间免疫传感器检测氯霉素残 留的标准曲线图;
图8为本发明实施例中横向弛豫时间免疫传感器检测磺胺类抗 生素残留的标准曲线图;
图9为本发明实施例中横向弛豫时间免疫传感器检测土霉素素 残留的标准曲线图;
图10为本发明实施例中横向弛豫时间免疫传感器检测三种抗生 素残留的线性范围图;
图11为本发明实施例中横向弛豫时间免疫传感器检测降钙素原 的线性范围图;
图12为本发明实施例中横向弛豫时间免疫传感器检测沙门氏菌 的线性范围图;
图13为本发明实施例中横向弛豫时间免疫传感器检测氯霉素的 特异性结果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步详细说明。
参见图1和图2所示,本发明实施例提供一种基于生物正交反应 的横向弛豫时间免疫传感器的制备方法,基于以下原理:
将纳米磁颗粒组装在不同粒径的纳米微球的表面,大粒径的纳米 微球表面可以偶联较多的纳米磁颗粒,因此磁信号强度大,而小粒径 的纳米微球由于偶联的纳米磁颗粒少,故而磁信号强度较弱,基于上 述原因,通过改变纳米微球的粒径,可以改变整个磁探针的磁信号强 弱,进而实现整个磁传感器线性范围的可调。针对不同的目标物,使 用粒径不同的纳米微球,选择不同粒径的纳米微球对应不同的磁信号 强度,进一步实现线性范围可调和高灵敏检测,最终实现浓度范围不 同的多个目标物的检测。
纳米微球可以为聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乙烯、聚丙烯、聚酯纤 维等粒径为200~3000nm的高分子微球。(本实施例中选用聚苯乙 烯微球,即PS,其他高分子微球均能达到同样的效果)
在此基础上,将待测目标物对应的抗体偶联在纳米微球表面的纳 米磁颗粒上(简称PS-MNPX-Ab,X为20~100nm,远小于磁珠的粒 径,Ab代表抗体)。
根据待测目标物的相对分子量,在磁珠表面偶联完全抗原或捕获 抗体:当待测目标物的相对分子量≤5000时,在磁珠表面偶联与待 测目标物相对应的完全抗原;当待测目标物的相对分子量>5000时, 在磁珠表面偶联与待测目标物特异性识别的捕获抗体。
参见图1所示,在检测抗生素时,由于抗生素的相对分子量≤ 5000:将待测目标物特异性完全抗原偶联在250~3000nm磁珠(本 实施例中以粒径为1000nm的磁珠为例,即MNP1000)表面,得到完 全抗原-MNP1000。基于抗原-抗体的免疫反应,待测目标物特异性完全抗原-MNP1000偶联物与样品中的目标物竞争结合PS-MNPX-Ab。
因为MNP1000的磁饱和强度大,容易磁分离,在0.01T的磁场中, 完全抗原-MNP1000以及免疫反应生成的“PS-MNPX-Ab-完全抗原 -MNP1000”免疫复合体均可在1min内完全分离。
而小粒径的MNPX由于磁饱和强度小,在0.01T的磁场中很难磁 分离,需要分离24h,同时,PS-MNPX-Ab与小分子待测目标物免疫 结合后在该磁场条件下,分离时间也大于5min,因此,可以在该磁 场下将PS-MNPX-Ab与“PS-MNPX-Ab-完全抗原-MNP1000”免疫复合 体分离出来,在PS-MNPX-Ab过量的情况下,待测目标物和完全抗原 -MNP1000竞争结合PS-MNPX-Ab,通过磁分离,与待测目标物反应生 成的PS-MNPX-Ab-待测目标物则留在上清液中,并且上清液中的 PS-MNPX-Ab-待测目标物复合物浓度与样品待测目标物浓度相对应。
进一步的,在外加磁场的作用下,通过一台0.47T低场核磁共振 仪对分离出的上清液中的PS-MNPX-Ab-待测目标物的含量进行横向 弛豫时间(T2)的测定即可。
参见图2所示,在检测生物标志物或细菌时,其相对分子量> 5000,将待测目标物捕获抗体偶联在250~3000nm磁珠表面(即 MNP1000-捕获抗体),MNP1000-捕获抗体、检测抗体-PS1000-MNP30偶联物与待测目标物特异性结合进行免疫反应,其中,检测抗体 -PS1000-MNP30偶联物过量添加,在同一反应体系中,三者形成双抗夹 心结构,反应完成后,通过磁分离,收集上清液,即为未参加反应的 检测抗体-PS1000-MNP30偶联物,通过差量法,计算加入反应体系与 未参加反应的检测抗体-PS1000-MNP30偶联物之差,即为待测目标物的 浓度。
本发明提供一种基于生物正交反应的横向弛豫时间免疫传感器 的制备方法,在纳米微球表面偶联纳米磁颗粒,得到纳米微球-磁颗 粒,将所述纳米微球-磁颗粒与抗体偶联,得到纳米微球-磁颗粒-抗体; 当待测目标物的相对分子量≤5000时(简称小分子),磁珠表面偶 联和小分子对应的完全抗原;当待测目标物相对分子量>5000时(简 称大分子),磁珠表面偶联和大分子对应的捕获抗体。本发明中的小 分子为抗生素,大分子为生物标志物或细菌。
免疫传感器的制备方法具体包括以下步骤:
本实施例中,MNPx选用MNP30,即X=30;磁珠选用MNP1000, 在实际实验和生产中,纳米磁颗粒和磁珠的粒径可以根据实际需要进 行选择。
S1、制备MNP30-Tz
将浓度为5mg/mL MNP30(粒径为30nm的纳米磁颗粒)与浓度 为10mg/mL的Tz-PEG4-NHS ester(Tetrazine-PEG4-NHS ester,四嗪 聚乙二醇活性酯)加入浓度为0.01M、pH为7.4的PBS(Phosphate Buffered Saline,磷酸盐缓冲液)缓冲液中,在室温下缓慢涡旋1~2h 混合均匀,通过磁分离除去未反应的Tz-PEG4-NHS ester,并用PBST (即浓度为0.01M的PBS加浓度为0.05%Tween 20配置的pH为7.4 的溶液)洗涤,最后用浓度为0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液重悬 得到MNP30-Tz偶联物,将MNP30-Tz偶联物存放在4℃的环境中。
本实施例中优化了制备Tz-MNP30偶联物过程中Tz-PEG4-NHS ester的用量,具体方法如下:取不同质量的Tz-PEG4-NHS ester与 MNP30进行偶联,测定其横向横向弛豫时间T2值,参见图3所示, 当Tz-PEG4-NHS ester的用量为0.2mg时,T2值变化最显著,因此将 0.2mg选作最终Tz-PEG4-NHS ester的用量,在实际情况中,可以根 据具体情况调整Tz-PEG4-NHSester的用量。
S2、制备TCO-PS1000、TCO-PS500与TCO-PS200偶联物
取100μL粒径为1000nm、表面偶联有氨基的聚苯乙烯微球(以 下简称PS1000,另外,PS500、PS200分别指代粒径为500nm、200nm 的聚苯乙烯微球),加入浓度为0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液中 在室温下进行孵化。
加入浓度为10mg/mL的TCO-PEG4-NHS ester (Trans-Cyclooctene-PEG4-NHSester,反式环辛烯-四聚乙二醇-活性 脂,TCO即指反式环辛烯),在室温下缓慢涡旋反应1~1.5h,高速 离心10min后使用PBST洗涤,最后用浓度为0.01M、pH为7.4的 PBS缓冲液重悬得到TCO-PS1000偶联物,将TCO-PS1000偶联物存放 在4℃的环境中。
TCO-PS500与TCO-PS200偶联物制备流程与TCO-PS1000偶联物制 备流程,除了使用的聚苯乙烯微球的粒径不相同外,其他均相同。
S3、TCO-抗体(以下简称TCO-Ab)偶联物的制备
将浓度为10mM的TCO-PEG4-NHS ester、浓度为2mg/mL的 抗体(抗体根据实际需要而选择)加入浓度为0.01M、pH为7.4的 PBS中混匀并孵化1~2h,然后加入浓度为0.05M、pH值为8.0的 Tris-HCl缓冲溶液(Tris(hydroxymethyl)aminomethane,三(羟甲 基)氨基甲烷)终止反应,将混合溶液离心20min去除多余的TCO- PEG4-NHS ester,将得到TCO-Ab偶联物,将TCO-Ab偶联物存放 于-20℃的环境中。
S4、制备PS-MNP30-Ab磁探针
取200μL Tz-MNP30偶联物于离心管中,加入100μL TCO- PS1000偶联物,在室温下缓慢涡旋反应2~3h后离心10min,除去 未结合的Tz-MNP30偶联物,并用PBST重悬得到的PS1000-MNP30偶 联物,并振荡3~5min进行洗涤,重复离心洗涤两到四次至完全除 去未结合的Tz-MNP30偶联物,最后用浓度为0.01M、pH为7.4的 PBS溶液重悬PS1000-MNP30偶联物备用。
优化Tz-MNP30/TCO-PS1000比例
本实施例考察了不同比例的Tz-MNP30/TCO-PS1000进行点击化学 反应制备得到的PS1000-MNP30偶联物T2的值差别。
参见图4所示,当Tz-MNP30/TCO-PS1000为1:2时,PS1000-MNP30偶联物的T2值变化最显著。因此,选用Tz-MNP30/TCO-PS1000=1:2 作为最终实验比例,在实际使用中,Tz-MNP30/TCO-PS1000的比例 可以为1:10~1:1中的任意值,均能得到较好的效果,同时使用该方 法时包括但不限于本发明实施例的比例。
将100μLTCO-Ab偶联物与100μL PS1000-MNP30偶联物混 匀,在室温下反应1~2h后离心并洗涤,除去未结合的TCO-Ab偶 联物,得到PS-MNP30-Ab,用浓度为0.01M、pH为7.4的PBS缓 冲液重悬制备的PS-MNP30-Ab偶联物,放置于温度为4℃环境中保 存备用。
计算一个PS上偶联的MNP30个数
测定MNP30浓度与T2值的关系:质量浓度为5mg/mL的NH2- MNP30对应的摩尔浓度为0.17nmol/mL。
参见图5所示,NH2-PS1000(50mg/mL)其粒子个数为1.9×109个/mL,在偶联过程中,NH2-MNP30过量,因此PS1000-MNP30偶联 物的个数等于NH2-PS1000(50mg/mL)的粒子个数。
在实际使用中,由于MNP30溶液(可以为NH2-MNP30或其他溶 液)、PS1000溶液(可以为NH2-PS1000或其他溶液)的摩尔浓度配置 时可知,测定不同浓度MNP30溶液的T2值后,将过量的MNP30溶液 与PS1000溶液作用,得到PS1000-MNP30偶联物,PS1000-MNP30偶联 物的浓度与PS1000溶液浓度一致,粒子数量也一致。
同时,PS1000-MNP30偶联物的T2信号来源于MNP30,所以可由 T2值与NH2-MNP30个数的关系,计算一个PS1000表面可以偶联的 MNP30的个数(N),N=MNP30的总数/PS1000的总数。
参见图6所示,为PS1000-MNP30偶联物个数与T2值的线性关系, PS200、PS500微球上偶联的MNP30个数计算过程与PS1000微球相同(图 中,由左至右依次为PS1000-MNP30、PS200-MNP30、PS500-MNP30)。
由图可知,在相同PS微球的个数下,PS的粒径越大,其比表面 积越大,偶联的MNP30个数越多,其在低浓度条件下信号越强,因 此,该方法对应的检出限越低,灵敏度越高,在针对不同的待测目标 物时,可以根据具体检出限的要求来选择PS的大小,实现智能检测,大大提高了检测效率和检测结果的准确性。
S5、“MNP1000-BSA-抗原”偶联物的制备
将MNP1000(10mg/mL)进行磁分离、洗涤,并用浓度为0.01, pH值为6.0M的MES(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate, 2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液重悬,向重悬液中加入浓度为10mg/mL 的EDC(1-Ethyl-3-(3’-dimethylaminopropyl)carbodiimide,1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和浓度为10mg/mL的NHS (N-Hydroxysuccinimide,N-羟基丁二酰亚胺),在室温下反应10~ 20min后,将混合液进行磁分离,并用浓度为0.01M、pH值为7.4 的PBS溶液重悬。将BSA-氯霉素半抗原偶联物(可以根据需要选择 偶联物)加入MNP1000重悬液中,室温下孵化2~3h并加入浓度为 3%的BSA,在室温下反应20~50min后,磁分离并洗涤四次后,得 到“MNP1000-BSA-抗原”偶联物(本实施例中为MNP1000-BSA-氯 霉素抗原),放置于温度为4℃环境中保存备用。
制作标准曲线
根据实际样品中抗生素残留浓度的检测要求不同,例如氯霉素这 种不得检出的抗生素,我们采用磁信号强度大的磁探针,即粒径大的 PS(≥1000)微球作为载体,而限用的抗生素,我们采用中等粒径的 PS微球(<1000)作为载体。
在此基础上,以PS-MNP30偶联物为磁探针,以样品浓度(ng/mL) 的对数为横坐标,以△T2值为纵坐标作图,其中,氯霉素对应的磁探 针中微球的粒径为1000nm、磺胺对应的磁探针中微球的粒径为500 nm、土霉素对应的磁探针中微球的粒径为200nm,参见图7、图8和图9所示,随着待测目标物浓度的增加,弛豫时间的变化逐渐增大, 且在浓度为pg/mL~μg/mL均成立。
使用粒径为250nm的磁珠、50nm的纳米磁颗粒,200nm、400 nm和900nm的聚苯乙烯微球,重复上述步骤S1至S5,制备相应的 磁探针并用于测定氯霉素、磺胺和土霉素,该探测能够测量的浓度在 pg/mL~μg/mL均成立。
使用粒径为3000nm磁珠、10nm的纳米磁颗粒,200nm、400nm 和900nm的聚苯乙烯微球,重复上述步骤S1至S5,制备相应的磁 探针并用于测定氯霉素、磺胺和土霉素,该探测能够测量的浓度在 pg/mL~μg/mL均成立。
因此,本实施例通过不同粒径的PS微球的磁探针,实现了线性 范围的大幅度调节(pg/mL~μg/mL),具有检测浓度范围跨度大的 特点,同时,由于不同微球与不同的目标物相作用,且对应的线性关 系不相同,因此,可以实现多重目标物的检测。
本发明还提供一种采用上述方法制备的基于生物正交反应的横 向弛豫时间的免疫传感器,该免疫传感器包括纳米微球-磁颗粒-检测 抗体,磁珠-完全抗体/捕获抗体,当待测目标物的相对分子量≤5000 时,磁珠偶联与待测目标物相对应的完全抗原;当待测目标物的相对 分子量>5000时,磁珠偶联与待测目标物特异性识别的捕获抗体, 所述磁珠的粒径大于纳米磁颗粒,所述待测目标物含量越低,相对应 的纳米微球粒径越大。
抗体、捕获抗体均与目标物(作为抗原)相对应;磁珠的粒径为 250~3000nm,纳米磁颗粒的粒径为20~100nm,纳米微球的粒径 为200~3000nm。
本发明提供一种基于生物正交反应的横向弛豫时间的免疫传感 器的应用,该免疫传感器用于检测抗生素、生物标志物或细菌,抗生 素为磺胺类、土霉素或氯霉素,生物标记志物为降钙素原、细菌为沙 门氏菌。
上述免疫传感器检测降钙素原的方法,包括以下步骤:将聚苯乙 烯微球-纳米磁颗粒-检测抗体和磁珠-捕获抗体加入含有待测降钙素 原的溶液中进行免疫反应后磁分离,收集上清液,对上清液进行横向 弛豫时间的测定,确定待测降钙素原的含量。
采用上述免疫传感器对降钙素原样品进行检测的具体方法为:
A、将50μL MNP1000-捕获抗体与50μL检测抗体-PS1000-MNP30偶联物混匀,加入不同浓度的降钙素原标准品,本实施例中选用的以 ng/mL为单位的浓度:0,0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.5,1,5, 10,50,100,500,1000,5000。
B、在室温下进行双抗夹心免疫反应,即MNP1000-捕获抗体、检 测抗体-PS1000-MNP30偶联物与降钙素原特异性结合进行免疫反应, 在同一反应体系中,三者形成双抗夹心结构,反应完成后,通过磁分 离,收集上清液,即为检测抗体-PS1000-MNP30偶联物。
C、对上清液进行信号读出。
通过一台0.47T低场核磁共振仪分别对反应前的和反应后上清液 中的检测抗体-PS1000-MNP30偶联物进行横向弛豫时间(T2)的测定, 即可通过差量法得到降钙素原的含量。
上述免疫传感器检测沙门氏菌的方法,包括以下步骤:将聚苯乙 烯微球-纳米磁颗粒-检测抗体和磁珠-捕获抗体加入含有待测沙门氏 菌的溶液中进行免疫反应后磁分离,收集上清液,对上清液进行横向 弛豫时间的测定,确定待测沙门氏菌的含量。
采用上述免疫传感器对沙门氏菌样品进行检测的具体方法为:
A、将50μL MNP1000-捕获抗体与50μL检测抗体-PS1000-MNP30偶联物混匀,加入不同浓度的沙门氏菌标准溶液,本实施例中选用的 以cfu/mL为单位的浓度:100,5×101,102,5×102,103,5×103, 104,105,106,107。
B、在室温下进行免疫反应,即MNP1000-捕获抗体、检测抗体 -PS1000-MNP30偶联物与沙门氏菌特异性结合进行免疫反应,在同一 反应体系中,三者形成双抗夹心结构,反应完成后,通过磁分离,收 集上清液,即为检测抗体-PS1000-MNP30偶联物。
C、对上清液进行信号读出。
通过一台0.47T低场核磁共振仪分别对反应前的和反应后上清液 中的检测抗体-PS1000-MNP30偶联物进行横向弛豫时间(T2)的测定, 即可通过差量法得到沙门氏菌的含量。
参见图10(从左至右依次为氯霉素、磺胺、土霉素),图11(降 钙素原)和图12(沙门氏菌)可知,采用本实施例的免疫传感器检 测降钙素原、沙门氏菌时,R2均不低于0.98,拟合度较高,采用该免 疫传感器及方法能够准确测定相应目标物的含量。
同时,根据3S/M标定曲线计算检测限(LOD),其中S是空白 样品的标准,M是标准曲线在低浓度范围内的斜率,本实施例的免疫 传感器对氯霉素的线性检测范围为0.001~5000ng/mL,检测限为8.5 pg/mL(S=26.4,M=9333),灵敏度较高、检测范围较广。对磺胺类药物的检测的线性范围为0.5~500ng/mL、对土霉素的线性检测范围 为0.05~50μg/mL,对降钙素原的线性范围是0.01ng/mL~100 ng/mL、沙门氏菌的线性检测范围为50~107cfu/mL。
因此,本发明的检测范围在0.001ng/mL~50μg/mL均能实现, 灵敏度较高,检测范围较广。
将本实施例的方法与传统方法的分析性能进行比较
a、检测限(LOD)和线性检测范围,根据本横向弛豫时间免疫 传感器,该方法具有如下的优势:(1)线性范围宽,可以根据待测 目标物的浓度不同,选择不同强度的磁信号探针,实现智能分析;(2) 灵敏度高,因为通过生物正交组装,可以在微球表面组装大量的纳米 磁颗粒,实现信号的放大。
b、在特异性试验中,使用甲砜霉素、头孢菌素、四环素、磺胺 和庆大霉素作为类似物来测定以氯霉素为检测样本时传感器的灵敏 度,其中,氯霉素与类似物的浓度比均设定为1:10。参见图13可知, 只有目标抗生素能够导致T2值的显著变化,其他类似物对磁信号的 影响可以忽略不计。
c、回收率采用标准加入法进行了研究,即在空白牛奶样品中加 入不同浓度的氯霉素,氯霉素的检测回收率为96%~120%,表明了 本实施例方法准确度较高。
实际样品检测
基于PS-MNP 30探针的横向弛豫时间免疫传感器和HPLC(GB 29694-2013)/HPLC-MS(GB 22990-2008)定量测定15个随机牛 奶样品(样品均采集自中国检验检疫研究院)中氯霉素、磺胺类和土 霉素,结果参见表1所示。
表1不同方法检测牛奶样品中的氯霉素、磺胺和土霉素
参见表1可知:采用本发明实施例的免疫传感器和传统的 HPLC-MS检测牛奶样品中的氯霉素、磺胺和土霉素,二者所得到的 结果偏差较小,因此,本发明实施例的免疫传感器能够作为替代 HPLC-MS用于检测食品中的氯霉素、磺胺和土霉素。
同时,由于本发明实施例的检测方法是直接将免疫反应试剂加入 待测样品溶液中,不需要对样品进行前处理,缩短了检测时间,降低 了检测难度和检测成本,同时,本实施例的结果读出是通过磁信号读 出,避免了传统光信号读出时基底的干扰,准确度较高。
本实施例中所使用的试剂和仪器设备来源入下:
羧基偶联的1000nm磁珠:Dynabeads(美国热电公司, ThermaFisher);
氨基偶联的30nm磁纳米粒子:OceanNanoTech公司(美国);
氨基偶联的聚苯乙烯微球(1000nm,500nm,200nm): Partikeltechnologie GmbH公司(德国);
氯霉素-BSA、氯霉素抗体、磺胺-BSA、磺胺抗体、土霉素-BSA、 土霉素抗体:北京勤邦生物科技有限公司;
Terazine(Tz)-PEG4-NHS ester,trans-cyclooctene(TCO) -PEG4-NHS ester:Click Chemistry Tools公司(美国);
牛血清白蛋白、卡那霉素、氯霉素、土霉素、头孢菌素、四环素、 磺胺、庆大霉素:上海Sigma-Aldrich公司;
磁分离架:上海万润纳米科技公司;0.47T核磁共振仪(PQ 001): 上海纽迈科技公司;15个随机牛奶样品:采集自中国检验检疫研究 院。
本发明不仅局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下 都可得出其他各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变 化,凡是具有与本发明相同或相近似的技术方案,均在其保护范围之 内。
Claims (10)
1.一种基于生物正交反应的横向弛豫时间免疫传感器的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:在纳米微球表面偶联纳米磁颗粒,得到纳米微球-磁颗粒,将所述纳米微球-磁颗粒与抗体偶联,得到纳米微球-磁颗粒-抗体;在磁珠表面修饰完全抗原或捕获抗体,所述磁珠的粒径大于纳米磁颗粒。
2.一种采用权利要求1所述方法制备的基于生物正交反应的横向弛豫时间的免疫传感器,其特征在于:所述免疫传感器包括纳米微球-磁颗粒-检测抗体,磁珠-完全抗原/捕获抗体;当待测目标物的相对分子量≤5000时,磁珠偶联与待测目标物相对应的完全抗原;当待测目标物的相对分子量>5000时,磁珠偶联与待测目标物特异性识别的捕获抗体,所述磁珠的粒径大于纳米磁颗粒,所述待测目标物含量越低,相对应的纳米微球粒径越大。
3.如权利要求2所述的一种基于生物正交反应的横向弛豫时间的免疫传感器,其特征在于:所述磁珠的粒径为250~3000nm。
4.如权利要求2所述的一种基于生物正交反应的横向弛豫时间的免疫传感器,其特征在于:所述纳米磁颗粒的粒径为20~100nm。
5.如权利要求2所述的一种基于生物正交反应的横向弛豫时间的免疫传感器,其特征在于:所述纳米微球的粒径为200~3000nm。
6.一种权利要求6所述免疫传感器的应用,其特征在于:所述免疫传感器用于检测抗生素、生物标志物或细菌。
7.一种采用权利要求6所述免疫传感器检测抗生素的方法,其特征在于:包括以下步骤:将纳米微球-磁颗粒-抗体和磁珠-完全抗原加入含有待测目标物的溶液中进行免疫反应后磁分离,收集上清液,对上清液进行横向弛豫时间的测定,确定待测目标物的含量。
8.如权利要求7所述的免疫传感器检测抗生素的方法,其特征在于:所述完全抗原为待测抗生素和牛血清白蛋白的偶联物,所述抗体为与待测目标物相对应的抗体。
9.一种采用权利要求6所述免疫传感器检测生物标志物或细菌的方法,其特征在于:包括以下步骤:将纳米微球-磁颗粒-抗体和磁珠-捕获抗体加入含有待测目标物的溶液中进行免疫反应后磁分离,收集上清液,对上清液进行横向弛豫时间的测定,确定待测目标物的含量。
10.如权利要求9所述的免疫传感器检测生物标志物或细菌的方法,其特征在于:所述捕获抗体与检测抗体为待测目标物相对应的抗体,所述生物标志物为降钙素原,所述细菌为沙门氏菌。
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Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110726841A (zh) * | 2019-10-21 | 2020-01-24 | 华中农业大学 | 一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法 |
CN111007252A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-14 | 武汉市农业科学院 | 一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法 |
CN111413264A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-07-14 | 华中农业大学 | 一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置及检测方法 |
CN112540097A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-03-23 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 基于生物传感器来检测生物标志物的核磁共振检测方法及试剂盒 |
CN112595759A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-04-02 | 华中农业大学 | 一种基于绝缘微球状态变化导致微通道电阻改变的均相分析方法 |
CN112964868A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-06-15 | 华中农业大学 | 一种基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法 |
CN114231598A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-03-25 | 华中农业大学 | 基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法及其配套设备 |
CN114720515A (zh) * | 2022-03-07 | 2022-07-08 | 华中农业大学 | 一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法及应用 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1539793A (zh) * | 2003-04-21 | 2004-10-27 | 中国科学院理化技术研究所 | 用纳米磁性氧化铁颗粒包覆有机微球制备复合亚微米磁性颗粒的方法 |
CN102030952A (zh) * | 2010-11-12 | 2011-04-27 | 厦门大学 | 一种磁性核壳高分子复合材料微球及其制备方法 |
US20130210047A1 (en) * | 2011-12-28 | 2013-08-15 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Silica nanoparticles with aggregation induced emission characteristics as fluorescent bioprobe for intracellular imaging and protein carrier |
CN103278521A (zh) * | 2012-11-30 | 2013-09-04 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种检测生物大分子的磁共振免疫传感方法 |
CN104538168A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-22 | 苏州大学 | 一种磁珠的制备方法及应用 |
CN104614513A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-05-13 | 国家纳米科学中心 | 一种基于磁分离的弛豫时间免疫传感分析方法 |
CN106226513A (zh) * | 2016-08-02 | 2016-12-14 | 北京乐普医疗科技有限责任公司 | 一种免疫磁珠定量检测相关抗原的方法及其应用 |
-
2019
- 2019-06-13 CN CN201910509892.0A patent/CN110187104B/zh active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1539793A (zh) * | 2003-04-21 | 2004-10-27 | 中国科学院理化技术研究所 | 用纳米磁性氧化铁颗粒包覆有机微球制备复合亚微米磁性颗粒的方法 |
CN102030952A (zh) * | 2010-11-12 | 2011-04-27 | 厦门大学 | 一种磁性核壳高分子复合材料微球及其制备方法 |
US20130210047A1 (en) * | 2011-12-28 | 2013-08-15 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Silica nanoparticles with aggregation induced emission characteristics as fluorescent bioprobe for intracellular imaging and protein carrier |
CN103278521A (zh) * | 2012-11-30 | 2013-09-04 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种检测生物大分子的磁共振免疫传感方法 |
CN104538168A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-22 | 苏州大学 | 一种磁珠的制备方法及应用 |
CN104614513A (zh) * | 2015-01-26 | 2015-05-13 | 国家纳米科学中心 | 一种基于磁分离的弛豫时间免疫传感分析方法 |
CN106226513A (zh) * | 2016-08-02 | 2016-12-14 | 北京乐普医疗科技有限责任公司 | 一种免疫磁珠定量检测相关抗原的方法及其应用 |
Non-Patent Citations (10)
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110726841A (zh) * | 2019-10-21 | 2020-01-24 | 华中农业大学 | 一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法 |
CN111007252B (zh) * | 2019-12-30 | 2023-04-07 | 武汉市农业科学院 | 一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法 |
CN111007252A (zh) * | 2019-12-30 | 2020-04-14 | 武汉市农业科学院 | 一种基于纳米磁颗粒数量和状态变化的磁弛豫时间传感器检测农药残留的方法 |
CN111413264A (zh) * | 2020-04-02 | 2020-07-14 | 华中农业大学 | 一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置及检测方法 |
CN111413264B (zh) * | 2020-04-02 | 2021-04-06 | 华中农业大学 | 一种用于检测微米颗粒的多通道颗粒检测装置及检测方法 |
CN112595759A (zh) * | 2020-11-09 | 2021-04-02 | 华中农业大学 | 一种基于绝缘微球状态变化导致微通道电阻改变的均相分析方法 |
CN112595759B (zh) * | 2020-11-09 | 2021-12-10 | 华中农业大学 | 一种基于绝缘微球状态变化导致微通道电阻改变的均相分析方法 |
CN112540097A (zh) * | 2020-12-01 | 2021-03-23 | 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 | 基于生物传感器来检测生物标志物的核磁共振检测方法及试剂盒 |
CN112964868A (zh) * | 2021-02-05 | 2021-06-15 | 华中农业大学 | 一种基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法 |
CN112964868B (zh) * | 2021-02-05 | 2022-06-28 | 华中农业大学 | 一种基于磁分离同时检测多种目标物的生化分析方法 |
CN114231598A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-03-25 | 华中农业大学 | 基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法及其配套设备 |
CN114231598B (zh) * | 2021-11-08 | 2024-05-03 | 华中农业大学 | 基于点击反应信号放大可视化检测多目标物的均相分析方法及其配套设备 |
CN114720515A (zh) * | 2022-03-07 | 2022-07-08 | 华中农业大学 | 一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法及应用 |
CN114720515B (zh) * | 2022-03-07 | 2024-04-09 | 华中农业大学 | 一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法及应用 |
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