CN107389919A - 一种免标记荧光适配体传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种免标记荧光适配体传感器及其制备方法和在快速检测虾致敏蛋白中的应用。本发明免标记荧光适配体传感器包括磁性纳米微球、捕获探针和适配体，磁性纳米微球表面修饰有捕获探针，捕获探针与适配体通过碱基互补配对连接形成双链DNA；适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明免标记荧光适配体传感器用于虾致敏蛋白的快速检测，具有抗干扰能力强、检测准确度高、稳定性好、重复性强等优点，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

一种免标记荧光适配体传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及蛋白分析检测技术领域，具体涉及一种利用适配体识别技术和免标记荧光探针制得的免标记荧光适配体传感器及其在虾致敏蛋白的快速检测中的应用。
背景技术
随着人们生活水平的日渐提高，食物过敏现已逐渐成为一个公众广泛关注的食品安全问题。然而，对于食物过敏还没有有效的医学治疗方法，最有效的手段是严格避免接触食物过敏原。因此，全面认识食物过敏发生机制和开发不同过敏原的检测分析方法显得尤为必要。
虾及其制品味道鲜美，营养丰富，作为一种重要的海鲜产品，越来越受到消费者的喜爱。但虾原肌球蛋白是世界上公认的八大食物致敏原之一，具有高致敏性，约20％的过敏病人对虾过敏，小儿发病率高达60％，严重影响了患者的生活质量。所以，急需研究出快速检测虾致敏蛋白的方法，以达到预防的目的。目前，有关虾原肌球蛋白的检测方法主要包括基于抗体的酶联免疫法、色谱法、质谱法等，这些检测手段都比较繁琐，需要昂贵的设备和专业人才。因此，如何构建快速简便、灵敏有效的虾致敏蛋白检测方法引起了业内的广泛关注。
核酸适配体是一类在体外通过指数富集配体系统进化技术(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选得到的寡核苷酸，能够特异性地识别小分子、毒素、蛋白质、细胞甚至致病菌等，具有稳定性好、易合成与标记、分子量小及毒性低等优点，在临床诊断与治疗和食品安全监测与控制等领域均显示了广阔的应用前景。由于其操作简单、稳定性好、灵敏度高、成本低等优点，基于核酸适配体的荧光生物传感器已成为代替传统检测方法的潜在选择。近年来，一系列用于蛋白质检测的荧光适配体传感器已有比较多的报道。但这些已有的方法都需要利用一些先进的纳米材料作为荧光基团或淬灭基团来标记核酸适配体，这样的标记工作不仅增加了成本而且降低了核酸适配体对目标物质的亲和力。另外，这些基于纳米材料及生化反应的信号增强策略容易导致重复性低、操作流程复杂等缺点。由于磁性纳米微球功能化的灵活性及简单性，适配体结合到磁性纳米微球表面构建传感探针引起了广泛的关注。磁分离操作简单，而且能够有效的减少或消除复杂基质的干扰，因此磁性纳米微球是极具吸引力的构建生物传感器的选择。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有虾致敏蛋白快速检测中存在的不足，提供一种经济、简便、准确、灵敏度高且可实现定量检测虾致敏蛋白的免标记荧光适配体传感器及其制备方法。
为了实现本发明上述目的，本发明提供了一种免标记荧光适配体传感器，其包括磁性纳米微球、捕获探针和适配体，所述磁性纳米微球表面修饰有所述捕获探针，所述捕获探针与所述适配体通过碱基互补配对连接形成双链DNA；所述适配体的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
作为本发明免标记荧光适配体传感器的一种优选技术方案，所述磁性纳米微球的直径为10～500nm。
作为本发明免标记荧光适配体传感器的一种优选技术方案，所述磁性纳米微球为用聚合材料或二氧化硅包裹四氧化三铁纳米粒子的微球，其表面连接有活性基团。
作为本发明免标记荧光适配体传感器的一种优选技术方案，所述聚合材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚氯乙烯。
作为本发明免标记荧光适配体传感器的一种优选技术方案，所述活性基团为-COOH、-NH2或-SH。
为了实现本发明上述目的，本发明还提供了上述免标记荧光适配体传感器的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将磁性纳米微球分散于含有捕获探针、磷酸盐缓冲液和偶联试剂的混合液中，使所述捕获探针通过其5’端活性基团与所述磁性纳米微球表面的活性基团通过共价键固定在所述磁性纳米微球的表面，得到组装有捕获探针的磁性纳米微球；
(2)将步骤(1)所得的组装有捕获探针的磁性纳米微球分散于含有适配体与Tris-HCl缓冲液的混合液中，95℃孵育5～10min，再冷却至室温，使所述捕获探针与所述适配体互补配对连接形成双链DNA，得到免标记荧光适配体传感器。
作为本发明免标记荧光适配体传感器的制备方法的一种优选技术方案，步骤(1)中，所述偶联试剂为乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐。
作为本发明免标记荧光适配体传感器的制备方法的一种优选技术方案，其包括如下步骤：
(1)用0.01～0.1mol/L pH 7.5的磷酸盐缓冲液调节磁性纳米微球浓度为5～200μg/mL；1ml的磁性纳米微球中加入20～100μg/mL的偶联试剂，振荡混匀，室温孵育40～100min；磁分离后，活化的磁性纳米微球用0.01～0.1mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲液调节至浓度为5～200μg/mL，再加入捕获探针0.5～2nmol，充分混合后，室温反应24～30h，得到组装有捕获探针的磁性纳米微球；
(2)用0.01～0.1mol/L pH 7.5的Tris-HCl缓冲液调节前述所得组装有捕获探针的磁性纳米微球浓度为5～200μg/mL；加入适配体0.1～1nmol，充分混合后，95℃孵育5～10min，再缓慢冷却至室温，得到适配体与捕获探针互补杂交形成双链DNA(dsDNA)探针。
本发明免标记荧光适配体传感器可用于食品基质中虾致敏蛋白的快速检测。
为了实现本发明上述发明目的，本发明还提供了一种快速检测虾致敏蛋白的方法，其包括如下步骤：
(1)将免标记荧光适配体传感器与待测物在37℃下孵育，如待测蛋白中含有虾致敏蛋白，则适配体从双链DNA中脱离，并与待测物中的虾致敏蛋白形成复合物；
(2)磁分离，除去未形成复合物的免标记荧光适配体传感器；
(3)在步骤(1)所得复合物中加入荧光探针，根据产生的荧光信号定量分析，得到待测物中虾致敏蛋白的含量。
作为本发明快速检测虾致敏蛋白的方法的一种优选技术方案，所述荧光探针为OliGreen，其是能在溶液中实现高灵敏度定量寡核苷酸和单链DNA的荧光试剂。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明利用磁性纳米微球作为载体，使与虾致敏蛋白结合的适配体容易与未与虾致敏蛋白结合的适配体分离开，具有稳定且单分散性好、可准确定量检测虾致敏蛋白的优点；
(2)免标记荧光适配体通过碱基互补杂交结合在磁性纳米微球表面，只有存在虾致敏蛋白时，适配体才能因与目标蛋白结合而从磁性纳米微球表面解离下来，因此，本发明免标记荧光适配体传感器具有优异的选择性和特异性；
(3)本发明免标记荧光适配体传感器通过磁分离用于减少或消除反应体系的干扰，简化了检测过程，具有良好的抗干扰能力，能对食品基质中的虾致敏蛋白实现定性和定量检测；
(4)本发明检测方法是一种共性的检测方法，不仅可以用于虾致敏蛋白的快速检测，还可以用于检测其它蛋白质、毒素或抗生素。
附图说明
图1是基于荧光探针OliGreen的免标记适配体传感器的构建及其检测虾致敏蛋白的原理示意图。
图2是本发明免标记荧光适配体传感器检测不同浓度虾致敏蛋白与荧光变化的线性曲线图(A)，不同浓度虾致敏蛋白引起的荧光光谱图(A中插图)；本发明方法检测其他蛋白的结果(B)，其中虾致敏蛋白的浓度均为5μg/mL，其他蛋白的浓度为10μg/mL。
图3是本发明免标记荧光适配体传感器在实际样品检测中的应用。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例1
1.dsDNA探针的制备：表面连接有氨基的磁性纳米微球(1mL，20μg/mL)与偶联试剂Sulfo-SMCC(10μL，5mg/mL)混合，室温下孵育60min；磁分离除去过量的偶联试剂，加入5’端巯基修饰的捕获探针(1mL，2μmol/L)，充分混合，室温孵育24h。磁分离除去反应液，磁性纳米微球用0.01mol/L pH 7.5的Tris-HCl缓冲液洗涤三次，后加入适配体(1mL，0.5μmol/L)混合均与，95℃孵育5min，缓慢冷却至室温。磁性纳米微球用0.01mol/L、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液洗涤三次后，重新分散于1mL、0.01mol/L、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液，得到组装有捕获探针的磁性纳米微球。
2.虾致敏蛋白的定量检测：取40μL传感探针储备液用0.01mol/L、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液稀释至150μL，分别加入50μL不同浓度的虾致敏蛋白混匀，37℃孵育120min。磁分离除去磁性纳米微球，加入等体积的OliGreen工作液，避光室温孵育40min后立即上机测荧光信号。在最优的实验条件下，虾致敏蛋白在0～5μg/mL的范围内与相对荧光强度(F-F0)呈线性相关(y＝19.3x-1.05，R2＝0.997)(图2-A)，最低检出限为77ng/mL。
实施例2
检测其他蛋白：
取40μL传感探针储备液用0.01mol/L、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液稀释至150μL，分别加入50μL、5μg/mL的虾致敏蛋白(Tropomyosin)及50μL、10μg/mL牛血清蛋白(BSA)、溶菌酶(Lysozyme)、链酶亲和素(Streptavidin)、β-伴大豆球蛋白(β-Conglycinin)等混匀，37℃孵育120min。磁分离除去磁性纳米微球，加入等体积的OliGreen工作液，避光室温孵育40min后立即上机测定，观察荧光信号的变化。结果显示(图2-B)，由虾致敏蛋白引起的荧光信号变化非常显著，而其他蛋白只引起了荧光强度微小的改变。该结果表明本发明免标记荧光适配体传感器具有高特异性和专一性。
实施例3
在实际样品中的检测：
50mg虾酱、番茄酱及沙拉酱，分别与1mL、0.02mol/L、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液混合均质20min，然后4℃过夜，离心(15000g，30min)除去大颗粒及悬浮物，取上清得原始提取液。该提取液及其用0.02mol/L、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液10倍稀释的提取液作为实际样品。然后按照上述免标记适配体传感器检测方法对样品进行检测，检测结果如图3所示。与虾酱一样，番茄酱及沙拉酱的原始提取液引起的荧光信号变化非常显著，但用0.02mol/L、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液10倍稀释后，只引起了可忽略的荧光信号变化。而阳性样品虾酱仍然引起可信的荧光信号改变。该结果表明本发明免标记荧光适配体传感器通过简单的稀释处理就可以消除干扰，并对实际阳性样品具有良好的检测效果。
实施例4
检测食品基质中的虾致敏蛋白：
50mg番茄酱及沙拉酱，分别与1mL、0.02mol/L、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液混合均质20min，然后4℃过夜，离心(15000g，30min)除去大颗粒及悬浮物，取上清并用0.02mol/L、pH7.5的Tris-HCl缓冲液稀释100倍作为食品基质。
每个番茄酱样品中分别加入不同浓度的虾致敏蛋白，然后按照上述免标记适配体传感器定量检测方法对样品中的虾致敏蛋白进行检测，检测结果如表1所示。
表1番茄酱样品中虾致敏蛋白的检测
SD:Standard Deviation(n＝3)
每个沙拉酱样品中分别加入不同浓度的虾致敏蛋白，然后按照上述免标记适配体传感器定量检测方法对样品中的虾致敏蛋白进行检测，检测结果如表2所示。
表2沙拉酱样品中虾致敏蛋白的检测
SD:Standard Deviation(n＝3)。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
SEQ ID NO:1 适配体的核苷酸序列
TACTAACGGTACAAGCTACCAGGCCGCCAACGTTGACCTAGAAGCACTGCCAGACCCGAACGTTGACCTAGAAGC
SEQ ID NO:2 捕获探针的核苷酸序列
GCTTCTAGGTCAACGTT

Claims (10)

1.一种免标记荧光适配体传感器，其特征在于，包括磁性纳米微球、捕获探针和适配体，所述磁性纳米微球表面修饰有所述捕获探针，所述捕获探针与所述适配体通过碱基互补配对连接形成双链DNA；所述适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的免标记荧光适配体传感器，其特征在于，所述磁性纳米微球的直径为10～500nm。
3.根据权利要求1所述的免标记荧光适配体传感器，其特征在于，所述磁性纳米微球为用聚合材料或二氧化硅包裹四氧化三铁纳米粒子的微球，其表面连接有活性基团。
4.根据权利要求3所述的免标记荧光适配体传感器，其特征在于，所述聚合材料为聚苯乙烯、聚乙烯或聚氯乙烯。
5.根据权利要求3所述的免标记荧光适配体传感器，其特征在于，所述活性基团为-COOH、-NH2或-SH。
6.权利要求1～5中任意一条权利要求所述免标记荧光适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将磁性纳米微球分散于含有捕获探针、磷酸盐缓冲液和偶联试剂的混合液中，使所述捕获探针通过其5’端活性基团与所述磁性纳米微球表面的活性基团通过共价键固定在所述磁性纳米微球的表面，得到组装有捕获探针的磁性纳米微球；
(2)将步骤(1)所得的组装有捕获探针的磁性纳米微球分散于含有适配体与Tris-HCl缓冲液的混合液中，95℃孵育5～10min，再冷却至室温，使所述捕获探针与所述适配体互补配对连接形成双链DNA，得到免标记荧光适配体传感器。
7.根据权利要求6所述免标记荧光适配体传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述偶联试剂为乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐。
8.权利要求1～5中任意一条权利要求所述免标记荧光适配体传感器在虾致敏蛋白的检测中的应用。
9.一种快速检测虾致敏蛋白的方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
(1)将免标记荧光适配体传感器与待测物在37℃下孵育，如待测蛋白中含有虾致敏蛋白，则适配体从双链DNA中脱离，并与待测物中的虾致敏蛋白形成复合物；
(2)磁分离，除去未形成复合物的免标记荧光适配体传感器；
(3)在步骤(1)所得复合物中加入荧光探针，根据产生的荧光信号定量分析，得到待测物中虾致敏蛋白的含量。
10.根据权利要求9所述的快速检测虾致敏蛋白的方法，其特征在于，所述荧光探针为OliGreen。
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