CN110684772A - 一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体及其应用 - Google Patents

一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110684772A
CN110684772A CN201910899017.8A CN201910899017A CN110684772A CN 110684772 A CN110684772 A CN 110684772A CN 201910899017 A CN201910899017 A CN 201910899017A CN 110684772 A CN110684772 A CN 110684772A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aptamer
tropomyosin
solution
screening
crustacean
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910899017.8A
Other languages
English (en)
Inventor
傅玲琳
王彦波
周瑾茹
李林芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Gongshang University
Original Assignee
Zhejiang Gongshang University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Gongshang University filed Critical Zhejiang Gongshang University
Priority to CN201910899017.8A priority Critical patent/CN110684772A/zh
Publication of CN110684772A publication Critical patent/CN110684772A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4712—Muscle proteins, e.g. myosin, actin, protein

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体及其应用。本发明的原肌球蛋白的核酸适配体具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。本发明所述的原肌球蛋白核酸适配体对原肌球蛋白具有高特异性和良好的亲和力。本发明的核酸适配体能与修饰有核酸适配体互补序列的多巴胺纳米球结合，从而制成对原肌球蛋白响应灵敏的荧光生物传感器以及用于检测原肌球蛋白的试剂盒。本发明所述的核酸适配体具有高特异性、高灵敏度、分子量小、成本低廉、易于保存等优点，其制成的检测试剂盒，可用于定量检测原肌球蛋白，与传统检测方法相比更加准确、灵敏、稳定，大大提高了检测效率，同时也节约了成本。

Description

一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明涉及食品安全生物技术领域，具体涉及一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体及其应用。
背景技术
水产品营养丰富，口味鲜美，深受人们的喜爱，是全球食物消费的重要组成部分，中国已多年居水产养殖和消费总量第一大国的地位，并且，其水产养殖及消费总量呈持续增长的趋势。然而，甲壳类食品作为八大食物过敏原之一，经常会引起人类严重的食物过敏反应，对人们的生命健康造成了巨大威胁。因此，加强甲壳类食物过敏原的研究力度，并对其进行有效的检测，对该类食物过敏的预防和诊断具有重要意义。
原肌球蛋白(Tropomyosin，TM)广泛存在于甲壳类动物中，是甲壳类食品主要过敏原。其具有高热稳定性，序列保守性高，且种间能够发生明显交叉反应。其过敏患者可能会出现红肿、鼻炎、哮喘等过敏性症状，严重时还会伴有虚脱、休克，甚至危及生命，严重影响身体健康和生活质量。
目前，甲壳类原肌球蛋白的检测方法主要有ELISA、PCR、RT-PCR等技术，这些技术存在检测时间长、灵敏度和精确度不高(易出现假阳性)等问题。因此，原肌球蛋白的检测方式仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体。该核酸适配体具有高特异性、高灵敏度、分子量小、成本低廉、易于保存等优点，其制成的原肌球蛋白检测试剂盒，可用于定量检测原肌球蛋白。
为此，在本发明的第一个方面，本发明提出了一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
根据本发明的一种核酸适配体，其具有良好的特异性、灵敏度和亲和力，可特异性结合甲壳类原肌球蛋白，可用于定量、定性确定食品中甲壳类过敏原的含量，其检测阈值可达到0.5μg/mL。
根据本发明的实施例，所述核酸适配体的5’端经荧光基团修饰。
在本发明的第二方面，本发明提出了上述核酸适配体的筛选方法，其包括：
构建甲壳类原肌球蛋白随机DNA文库，对文库进行预处理，处理条件为：95℃热变性5min，冰温冷却5min，用100mmol/L pH为8.2的硼砂-硼酸盐溶液溶解，得到随机ssDNA文库；
将ssDNA文库与原肌球蛋白按最终浓度比2:1混合，混合成200μL体系，37℃下孵育30min，得到混合溶液；
所述混合溶液通过毛细管电泳法筛选，获得核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的适配体，所述适配体以SEQ ID NO:3～4所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，并进行平衡解离常数的测定，选择解离常数最小的，即获得特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体。
根据本发明的筛选适配体的方法，可快速准确的筛选出高特异性的核酸适配体。
根据本发明的实施例，所述混合溶液通过毛细管电泳法筛选包括：检测波长为214nm，进样方式为压力进样，分离电压为+8kv，毛细管柱温为25℃，运行缓冲液为100mmol/L硼砂缓冲溶液；将第一轮产物收集到装有原肌球蛋白的样品瓶中，37℃孵育30min，用于进行第二轮筛选；以上步骤循环多轮；直至循环至第四轮，适配体的峰面积维持稳定，停止筛选，以获得所述适配体。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种生物传感器，包括多巴胺纳米球和核酸探针，所述多巴胺纳米球上修饰有上述的核酸适配体的互补序列的核酸和mPEG，所述核酸探针为上述的核酸适配体，所述多巴胺纳米球和所述核酸探针通过碱基互补配对连接。
根据本发明的生物传感器，将修饰有上述核酸适配体的互补序列的多巴胺纳米球与核酸探针中的核酸适配体通过碱基互补配对进行紧密连接，可减少核酸探针在多巴胺纳米球上的堆积，使其暴露多个结合位点，增强其检测甲壳类原肌球蛋白的灵敏度；并且相对纳米材料具有易团聚、易氧化等缺点，该聚多巴胺粒子的生物相容性更强、水溶性好，且易于修饰。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种甲壳类原肌球蛋白的检测试剂盒，包括如上述的生物传感器、原肌球蛋白核酸适配体检测溶液以及盐溶液。
根据本发明的试剂盒，通过上述生物传感器相对于传统的生物传感器具有抗干扰、灵敏性强等优点，使得该试剂盒可特异性识别甲壳类原肌球蛋白，且灵敏性高、特异性强、不易出现假阳性、成本低、设备要求低且检测周期短，广泛适用于甲壳类原肌球蛋白的检测。
根据本发明的实施例，所述盐溶液为Tris-HCl缓冲液，盐浓度为10～15mmol，pH为8.5～9.0。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明所述试剂盒荧光回复率与原肌球蛋白浓度之间的线性关系。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
原肌球蛋白的制备：
(1)取50g南美白对虾肌肉，去虾头、尾、壳及肠线。
(2)将虾肌肉用小刀切成泥状，溶于Buffer A(50mmol/L KCl和2mmol/L NaHCO3)中，充分均质后于4℃下抽提20min。
(3)将步骤(2)抽提后的溶液于4℃、10000r/min下离心20min后取沉淀，将沉淀重悬在10倍体积的Buffer A中，4℃、10000r/min离心20min后取沉淀，重复5次。
(4)将步骤(3)获得的沉淀经预冷丙酮充分洗涤至无色后用六层纱布过滤取沉淀，沉淀于室温晾干，除去脂肪及脂溶性色素等杂质得到对虾丙酮粉。
(5)将对虾丙酮粉溶于Buffer B(0.02mol/L的Tris-HCl、1mol/L的KCl和0.1mmol/L的DTT，pH 7.5)中，抽提72h。
(6)将步骤(5)获得的抽提液用六层纱布过滤取滤液，滤液隔水加热20min。
(7)将步骤(6)加热后的滤液于4℃、10000r/min下离心20min后，取上清液，按每100mL上清液加入16.4g硫酸铵的用量缓慢加入硫酸铵，使滤液的硫酸铵终浓度为30％，于4℃下静置1h。
(8)将静置后的液体于4℃、10000r/min下离心20min后取沉淀，采用1mol/L PBS复溶，获得原肌球蛋白液。
(9)将原肌球蛋白液用DEAE Sepharose F.F.阴离子交换柱，0.5mol/L NaCl溶液梯度洗脱，收集洗脱产物，得到原肌球蛋白，备用。
实施例2
核酸适配体的筛选：
本发明利用毛细管电泳进行筛选。操作步骤如下：
(1)构建甲壳类原肌球蛋白随机DNA文库。(文库容量为1014，片段长度为75bp，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成)
(2)在使用前，将文库进行预处理，处理条件为：95℃热变性5min，冰温冷却5min，用100mmol/L pH为8.2的硼砂-硼酸盐溶液溶解，得到随机ssDNA文库。
(3)将ssDNA文库与实施例1制得的原肌球蛋白以最终浓度比为2:1混合，混合成200μL体系，其中ssDNA文库的初始浓度为100nmol/L，原肌球蛋白的初始浓度为1μmol/L；然后，置于37℃下孵育30min，得到ssDNA、原肌球蛋白及核酸适配体的混合溶液，备用。
(4)毛细管预处理:选用未涂层石英毛细管柱(45cm×75μm，P/ACETM MDQ System，Beckman公司)，首次使用时依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，0.1mol/L NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲洗2min。
(5)确定收集时间：利用毛细管电泳分离含有ssDNA、原肌球蛋白及核酸适配体的混合液，根据相应出峰时间确定适配体收集时间。分离条件为：检测波长为214nm，进样方式为压力进样(0.5psi，8s)，分离电压为+8kV，毛细管柱温为25℃，运行缓冲液为100mmol/L硼砂缓冲溶液(pH 8.2)。
(6)毛细管电泳分离时，将第一轮产物收集到装有原肌球蛋白的样品瓶中，37℃孵育30min，用于进行第二轮筛选；以上步骤循环多轮，直至循环至第四轮，适配体的峰面积维持稳定，停止筛选，获得核苷酸序列表为SEQ ID NO:2所示的适配体；将适配体进行PCR扩增，其扩增所需的上游引物为：5’-TACTAACGGT ACAAGCTA-3’(SEQ ID NO:3)；下游引物为：5’-AACGTTGACC TAGAAGC-3’(SEQ ID NO:4)。再利用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物得到核酸适配体片段；通过高通量测序，获得6条核苷酸序列。氨基功能化的核酸适配体(浓度为0～200nmol/L，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成)与1μmol/L的原肌球蛋白于黑暗处孵育2h，在10000r/min，4℃条件下离心15min，取上清液测试其荧光值。数据分析得到解离常数(Kd)如表1所示，解离常数小则亲和性强，其中，最强亲和性的核苷酸序列为所需序列，即如SEQ ID NO:1所示，命名为核酸适配体A1，对其进行氨基功能化，溶于PBS缓冲液中备用。
表1适配体序列及解离常数
Figure BDA0002211192940000051
实施例3
生物反应器的制备：
将实施例2获得的核酸适配体的5’端经荧光基团FAM修饰，以获得标记有荧光团FAM的核酸探针。
将实施例2获得的核酸适配体的互补序列的核酸和mPEG通过π—π堆积力修饰在多巴胺钠米球的表面上，其中，实施例2的上游引物SEQ ID NO:3的互补序列如SEQ ID NO:5所示；该序列末尾的多个T用于增加链长，可减少适配体和其互补序列互补时的空间位阻。
取上述修饰有核酸适配体互补序列的核酸及mPEG的多巴胺纳米球0.15mg与100nmol标记有荧光团FAM的核酸探针混合于1mL超纯水中，使得修饰有核酸适配体互补序列的多巴胺纳米球可以通过碱基互补配对与核酸探针紧密连接，形成生物反应器。
甲壳类原肌球蛋白的检测试剂盒的制备：
将上述的生物反应器与原肌球蛋白核酸适配体检测溶液(包含SEQ ID NO:1所示的原肌球蛋白的特异性核酸适配体)、盐溶液搭配包装，获得检测试剂盒；其中，原肌球蛋白核酸适配体检测溶液中的原肌球蛋白核酸适配体的浓度为0.1μmol/L～10μmol/L；原肌球蛋白核酸适配体为实施例2获得的适配体。其中，盐溶液为Tris-HCl缓冲液，盐浓度为10～15mmol，pH为8.5～9.0。
该检测试剂盒使用时，首先将待测样品溶于Tris-HCl缓冲液中，并将等量的生物传感器加入到待测样品中，加入原肌球蛋白核酸适配体检测溶液，其中原肌球蛋白核酸适配体会与待测样品中的原肌球蛋白进行结合，并与多巴胺纳米粒子表面的适配体互补序列进行竞争性结合，使多巴胺纳米粒子荧光恢复，随着样品中原肌球蛋白含量的增多，荧光值越高，通过检测荧光值的大小，即可达到检测原肌球蛋白的目的。
实施例4
灵敏度检测，绘制标准曲线，检测虾原肌球蛋白。
精密配制虾原肌球蛋白标准溶液0.5、1、5、10、20、50、100μg/mL进样，使用实施例3获得的检测试剂盒检测，每个样品重复3次，以相对荧光强度
Figure BDA0002211192940000061
计算荧光信号输出值，其中F520 nm和F0520 nm分别表示在存在和不存在原肌球蛋白的情况下，在波长520nm处的适体传感器的荧光强度。当则表明存在原肌球蛋白。对其结果进行线性回归。结果如图1所示，其检测阈值可达到0.5μg/mL，在0.5～100μg/mL的范围内线性关系良好，回归方程为Y＝0.05753X+0.5274，R2＝0.998。
实施例5
虾制品中原肌球蛋白的检测。
使用实施例3的检测试剂盒检测不同虾制品中的原肌球蛋白含量。以检测虾丸样品为例：首先将待测样品等量溶解于PBS缓冲液中，充分均质，得到待测溶液。此后，按照实施例3所述方法，应用试剂盒对其进行检测，首先将虾丸溶于Tris-HCl缓冲液中，并将等量的生物反应器加入到待测样品中，加入原肌球蛋白核酸适配体检测溶液，其中原肌球蛋白核酸适配体会与待测样品中的原肌球蛋白进行结合，并与多巴胺纳米粒子表面的适配体互补序列进行竞争性结合，使多巴胺纳米粒子荧光恢复，随着样品中原肌球蛋白含量的增多，荧光值越高，通过检测荧光值的大小，即可达到检测原肌球蛋白的目的。根据实施例4所绘标准曲线，得到待测样品的相应浓度。如表2所示。
表2人工添加样品检测结果(n＝6)
Figure BDA0002211192940000071
结果表明：在5-100μg/mL浓度添加范围内，回收率在92％～104％，表明该方法可以用于实际样品的检测。
实施例6
检测其他蛋白：
使用实施例5所述方法对不同蛋白进行检测。以检测虾皮样品为例：首先将添加有不同蛋白的待测样品等量溶解于PBS缓冲液中，充分均质，得到待测溶液。此后，按照实施例4所述方法，应用试剂盒对其进行检测，首先将虾皮溶于Tris-HCl缓冲液中，充分混匀均质，并将等量的生物反应器加入到待测样品中，加入原肌球蛋白核酸适配体检测溶液，通过检测样品荧光值。并根据实施例4所绘标准曲线，得到待测样品的相应浓度。如表3所示。
表3人工添加不同过敏原蛋白样品检测结果(n＝6)
蛋白种类 实际浓度(μg/mL) 样品检出值(μg/mL) 回收率％
TM 20 19.63±0.14 98
AK 20 3.21±0.17 16
MLC 20 2.12±0.13 10
SCP 20 2.22±0.12 11
HCS 20 1.93±0.11 9
检测结果如表3所示，当添加量为20μg/mL时，TM的回收率高达98％，而其他过敏原蛋白的回收率为9％-16％，由此可以证明本试剂盒可用于特异性检测虾原肌球蛋白。
综上，本发明通过核酸适配体-多巴胺纳米颗粒特异性结合样品中的原肌球蛋白，从而检测不同样品中的原肌球蛋白，再根据变化曲线换算待测样品中甲壳类过敏原中原肌球蛋白的浓度，达到定量检测的水平。利用本发明所得试剂盒检测的方法操作简便，实验室人员稍加培训即可操作，检测灵敏度高，结果判定不受主观因素影响，储存简单，可以定量、定性确定食品中甲壳类过敏原的含量，具备极高的推广价值。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 浙江工商大学
<120> 一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体及其应用
<130> 2019
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tactaacggt acaagctagc atcagggagc gcagttaagg ctggcaggta ggagtccgaa 60
cgttgaccta gaagc 75
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcagggagc gcagttaagg ctggcaggta ggagtcttcg 40
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tactaacggt acaagcta 18
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacgttgacc tagaagc 17
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttttttatga ttgccatgtt cgat 24

Claims (7)

1.一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体，其特征在于，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的5’端经荧光基团修饰。
3.权利要求1所述的核酸适配体的筛选方法，其特征在于，包括：
构建甲壳类原肌球蛋白随机DNA文库，对文库进行预处理，处理条件为：95℃热变性5min，冰温冷却5min，用100mmol/L pH为8.2的硼砂-硼酸盐溶液溶解，得到随机ssDNA文库；
将ssDNA文库与原肌球蛋白按最终浓度比2:1混合，混合成200μL体系，37℃下孵育30min，得到混合溶液；
所述混合溶液通过毛细管电泳法筛选，获得核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示的适配体，所述适配体以SEQ ID NO:3～4所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，并进行平衡解离常数的测定，选择解离常数最小的，即获得特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体。
4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述混合溶液通过毛细管电泳法筛选包括：检测波长为214nm，进样方式为压力进样，分离电压为+8kv，毛细管柱温为25℃，运行缓冲液为100mmol/L硼砂缓冲溶液；将第一轮产物收集到装有原肌球蛋白的样品瓶中，37℃孵育30min，用于进行第二轮筛选；以上步骤循环多轮；直至循环至第四轮，适配体的峰面积维持稳定，停止筛选，以获得所述适配体。
5.一种生物传感器，其特征在于，包括多巴胺纳米球和核酸探针，所述多巴胺纳米球上修饰有权利要求1所述的核酸适配体的互补序列的核酸和mPEG，所述核酸探针为权利要求2所述的核酸适配体，所述多巴胺纳米球和所述核酸探针通过碱基互补配对连接。
6.一种甲壳类原肌球蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求5所述的生物传感器、原肌球蛋白核酸适配体检测溶液以及盐溶液。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述盐溶液为Tris-HCl缓冲液，盐浓度为10～15mmol，pH为8.5～9.0。
CN201910899017.8A 2019-09-23 2019-09-23 一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体及其应用 Pending CN110684772A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910899017.8A CN110684772A (zh) 2019-09-23 2019-09-23 一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910899017.8A CN110684772A (zh) 2019-09-23 2019-09-23 一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110684772A true CN110684772A (zh) 2020-01-14

Family

ID=69109805

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910899017.8A Pending CN110684772A (zh) 2019-09-23 2019-09-23 一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110684772A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113341153A (zh) * 2021-05-08 2021-09-03 浙江工商大学 一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用
CN115350507A (zh) * 2022-05-25 2022-11-18 河北省食品检验研究院（国家果类及农副加工产品质量监督检验中心、河北省食品安全实验室） 一种原肌球蛋白的免疫亲和柱、制备方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676508A (zh) * 2012-04-20 2012-09-19 华森新科（苏州）纳米技术有限公司 基于纳米金和适配体的小分子探针及其制备方法
WO2015166689A1 (ja) * 2014-04-30 2015-11-05 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 エビアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途
CN107389919A (zh) * 2017-07-27 2017-11-24 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种免标记荧光适配体传感器及其制备方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102676508A (zh) * 2012-04-20 2012-09-19 华森新科（苏州）纳米技术有限公司 基于纳米金和适配体的小分子探针及其制备方法
WO2015166689A1 (ja) * 2014-04-30 2015-11-05 Ｎｅｃソリューションイノベータ株式会社 エビアレルゲンに結合する核酸分子およびその用途
CN107389919A (zh) * 2017-07-27 2017-11-24 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 一种免标记荧光适配体传感器及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
QIANG WEIBING等: "《Aptamer/Polydopamine Nanospheres Nanocomplex for in Situ Molecular Sensing in Living Cells》", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
WANG GUIXIANG等: "《Mixed Self-Assembly of Polyethylene Glycol and Aptamer on Polydopamine Surface for Highly Sensitive and Low-Fouling Detection of Adenosine Triphosphate in Complex Media》", 《ACS APPLIED MATERIALS & INTERFACES》 *
ZHANG JUAN等: "《Aptamer-Based Multicolor Fluorescent Gold Nanoprobes for Multiplex Detection in Homogeneous Solution》", 《SMALL》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113341153A (zh) * 2021-05-08 2021-09-03 浙江工商大学 一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用
CN115350507A (zh) * 2022-05-25 2022-11-18 河北省食品检验研究院（国家果类及农副加工产品质量监督检验中心、河北省食品安全实验室） 一种原肌球蛋白的免疫亲和柱、制备方法及应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108034658B (zh) 一种检测人葡萄膜黑色素瘤细胞的核酸适体
CN110684772A (zh) 一种特异性结合甲壳类原肌球蛋白的核酸适配体及其应用
JP2020054339A (ja) アレルゲン検出のための組成物及び方法
CN101196463A (zh) 一种动物源性成分的鉴别方法
CN113341151B (zh) 一种甲壳类致敏原的检测卡及其制备方法、应用
CN108414628B (zh) 一种牛奶中A2-β-酪蛋白的检测方法
CN103898203B (zh) 微小隐孢子虫的检测方法及检测试剂盒
CN109161547B (zh) 一种核酸适配体及其在检测致病性溶藻弧菌中的应用
CN104561008A (zh) 同型半胱氨酸核酸适体HCy1及其制备方法
CN108918885B (zh) 一种特异性结合鱼类小清蛋白的核酸适配体、试剂盒及检测方法
CN108866060B (zh) 一种特异性结合甲壳类精氨酸激酶的核酸适配体、试剂盒及检测方法
CN113341153A (zh) 一种用于检测甲壳类原肌球蛋白的夹心式传感器及其应用
CN103045602B (zh) 一种能特异结合河豚毒素的dna适配子及其应用
CN105647931A (zh) 与岩沙海葵毒素特异性结合的高亲和力适配体及其应用
NL2025926A (en) Crustacean allergen test card and application thereof
CN111118014B (zh) 一种抗虹彩病毒的核酸适配体及其构建方法和应用
CN116836987A (zh) 一种特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体及试剂盒
CN109182349A (zh) 一种翘嘴鳜tlr7基因及其应用
Konečná et al. Optimalization of deoxyribonucleic acid extraction using various types of magnetic particles
CN116355908B (zh) 一种用于检测β-乳球蛋白的磁性适配体生物传感器
CN103397106A (zh) 杂交鳢弹状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN110257387B (zh) 识别草鱼出血病病毒的核酸适配体及其构建方法和应用
CN112251493B (zh) 基于荧光共振能量转移和外切酶辅助循环扩增策略的物质检测方法
CN110257384B (zh) 一种核酸适配体及其构建方法和应用
CN113278621B (zh) 一种ssDNA核酸适配体及其在识别、检测哈维氏弧菌中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200114

RJ01 Rejection of invention patent application after publication