CN116836987A - 一种特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体及试剂盒，该特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体的核苷酸序列为GCTGAGGCATTTAGAGCCCACACTGATAACCCTAAAAGCAGTGGTCCCCC。本发明提供的核酸适配体的分子量较小，制备周期短，重现性好，便于体外化学合成，便于标记，序列稳定易于运输和保存。该核酸适配体对石斑鱼虹彩病毒具有较高的特异性和亲和力，并且无免疫原性。

Description

一种特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体及试剂盒

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别地，涉及一种特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体及试剂盒。

背景技术

近年来，我国海洋经济迅猛发展，《2021年中国海洋经济统计公报》数据显示2021年全国海洋生产总值达到9.03万亿元，其中海洋渔业经济在海洋经济中占比超过15.6％。石斑鱼营养丰富，肉质肥美鲜嫩，是一种低脂肪、高蛋白的优质食用鱼类，是海水养殖最名贵的种类之一。我国大部分种类的石斑鱼分布于南海，随着人工苗种繁育技术取得重大突破，苗种培育和成鱼养殖技术迅速发展，因此，我国石斑鱼产业逐步进入规模化养殖阶段。2021年我国石斑鱼总量超过20万吨，经济价值极高。然而，伴随着石斑鱼养殖规模的迅速扩大，鱼类病毒性疾病暴发频繁，危害日益严重。

虹彩病毒(Iridovirus)是公认的高致病性、高传染性的病毒病原，在石斑鱼、鳜鱼、真鲷、鲈鱼、虹鳟、大黄鱼、大菱鲆等多种淡水和海水养殖鱼类中均有报道，致死率高，造成了严重的经济损失。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)是一种高致病性鱼类传染性病毒，严重危害我国石斑鱼养殖业的健康发展。SGIV作为严重威胁石斑鱼养殖产业的病毒性病原之一，应及早发现及提前采取有效防控措施可有效降低损失。因此研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的快速检测技术，对于控制石斑鱼虹彩病毒的危害极其重要。

核酸适体指的是经过指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。核酸适体具有亲和性和特异性高、稳定性强、易于化学合成和修饰等诸多优点，即核酸适体能够高特异性识别靶细胞的生物学特性，因而被广泛应用于检测技术开发和生物传感器的构建，实现对靶目标的精确检测诊断。因此利用核酸适体的特点开发精准检测石斑鱼虹彩病毒将具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体及试剂盒，以提高石斑鱼虹彩病毒的检测水平，有效提高防控石斑鱼虹彩病毒的效率。

根据本发明的第一个方面，提供一种特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列上的至少一个碱基被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。

优选地，核酸适体的二级结构如下：

优选地，核酸适体上结合有标记物，标记物选自生物素、发光物质、酶中的至少一种。

根据本发明的第二个方面，提供上述核酸适体在制备用于检测石斑鱼虹彩病毒的产品中的应用，该应用不包括在疾病诊断中的应用。

根据本发明的第三个方面，提供一种用于检测石斑鱼虹彩病毒的试剂盒，该试剂盒含有上述特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体。

优选地，试剂盒的使用方法包括以下步骤：使核酸适体与待测样品进行孵育，接着洗涤待测样品，最后对待测样品进行标记物的标记信号检测，通过标记信号的强度作出待测样品中是否含有石斑鱼虹彩病毒的判断。

优选地，在核酸适体与待测样品进行孵育前，先将核酸适体在90～95℃下变形5～10min，再在0℃下复性10min。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：

①本发明提供的核酸适体，对石斑鱼虹彩病毒具有高敏感性，与现有的蛋白类抗体相比，本发明通过SELEX技术筛选得到的核酸适体对石斑鱼虹彩病毒具有更高的亲和力和特异性，而且还具有蛋白类抗体所不具备的特点，包括筛选周期短、适用于毒素和低免疫原性抗原、工作浓度低、批次差异性小、放大工艺简单、成本低、稳定易保存、可以常温运输等。

②利用该核酸适体构建的试剂盒，再结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测设备，达到精确检测石斑鱼虹彩病毒含量的目的，且操作简单迅速、能够达到较高的准确率和灵敏度。本发明提供的核酸适体不仅为石斑鱼虹彩病毒的快速检测提供了重要手段之一，还拓宽了核酸适体在石斑鱼虹彩病毒的检测领域中的应用前景。

附图说明

图1为核苷酸序列为SEQ ID NO.1的核酸适体的二级结构预测图；

图2为实施例2中的样品FAM荧光值的测试结果；

图3为实施例3中的样品FAM荧光值的测试结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例和实施例中的附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例为筛选和制备可以特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体。

S1.第一ssDNA文库的构建和引物的合成

设计合成第一ssDNA文库Library 50，其核苷酸序列如下：5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC。其中，两端为固定序列，中间50个核苷酸为随机序列。

上游引物包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，并被羟基荧光素(FAM)标记，其具体的序列为：5’-FAM-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’。

下游引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，并被生物素(Biotin)标记，其具体的序列为：5’-Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3’。

第一ssDNA文库和引物均由上海生工生物有限公司合成。

S2.SELEX筛选获得特异性识别石斑鱼虹彩病毒细胞的核酸适体(阳性筛选)

S2.1将10nmol上述第一ssDNA文库溶解在500μL PBS中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssDNA文库与石斑鱼虹彩病毒细胞在冰上孵育1h；

S2.2孵育结合完成后，离心移除上清，用10mL的PBS洗涤石斑鱼虹彩病毒细胞，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清，即为特异性识别石斑鱼虹彩病毒细胞的第二ssDNA文库。

S3.PCR扩增

取100μL筛选得到的第二ssDNA文库，使其与上游引物、下游引物进行PCR扩增。

PCR反应体系如下(1000μL)：10×Buffer 100μL,dNTP Mix(2.5mM)80μL，上游引物40μL，下游引物40μL，第二ssDNA文库100μL，rTaq酶12.5μL，ddH₂O 627.5μL。

按照如下程序进行PCR扩增：92℃5分钟，92℃1分钟，60℃30秒，72℃1分钟，经过25轮循环；72℃5分钟。第一轮循环筛选后得到的上清，要全部用于进行后续的PCR扩增，得到扩增后的dsDNA文库。

S4.第三ssDNA文库的制备

将100μL链酶亲和素标记的磁珠与dsDNA文库在常温下孵育20min，利用dsDNA文库上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将dsDNA文库结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2mL PBS洗涤磁珠，然后在EP管中加入200μL NaOH溶液(200mM)，常温反应15min，使dsDNA文库变性解链，带有生物素的一条链与链亲和素结合留在磁珠上，以与磁珠结合的单链DNA作为第三ssDNA文库，利用磁性分离架回收得到上清液；将上清液中正向单链核酸用PCR纯化回收试剂盒纯化回收，收集到的溶液用于下一轮的筛选。

S5.反复筛选

将S4中得到的第三ssDNA文库代替第一ssDNA文库，重复S2～S4所示的阳性筛选过程、PCR扩增及单链DNA文库的制取过程12次。

S6.阴性筛选

在S5的第二轮及第二轮以后筛选中，用正常石斑鱼脾细胞(GS)为对照，将S5后筛选得到的ssDNA文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：将筛选得到的ssDNA文库溶解，在92℃下恒温水浴，与GS细胞在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液，即为经过阴性筛选的ssDNA文库。

S7.12轮筛选

将S6中收集到含有ssDNA文库的上清液，经过S3的PCR扩增和S4的ssDNA文库制备后，依次重复进行S6、S2、S3和S4的过程，利用流式细胞仪检测所得ssDNA文库对石斑鱼虹彩病毒细胞的识别能力的变化情况，重复进行11轮筛选，此时得到的ssDNA文库对石斑鱼虹彩病毒识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例中可用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其核苷酸序列为：

GCTGAGGCATTTAGAGCCCACACTGATAACCCTAAAAGCAGTGGTCCCCC(SEQ ID NO.1)

利用MFOLD软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)在线预测SEQ ID NO.1的二级结构，预测结果如图1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.1的核酸适体形成特殊的茎环结构和发卡结构。

实施例2

本实施例为检测实施例1中筛选出来的核酸适体对感染不同病毒的石斑鱼脾细胞(GS细胞)的结合效果及其特异性。

参试对象：实验Ⅰ组、对照I组、对照II组、对照III组中经过孵育所得到的细胞重悬液。

实验Ⅰ组：利用羟基荧光素(FAM)对SEQ ID NO.1核酸适体进行标记，取10nmol被标记后的SEQ ID NO.1核酸适体溶解在500μL PBS中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的核酸适体与感染石斑鱼虹彩病毒的GS细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清液。

对照I组：本对照组参照实验组提供的孵育方法，制备得到细胞重悬液，本对照组与实验Ⅰ组的区别在于：在孵育过程中，将实施例2中感染SGIV病毒的GS细胞替换成正常的GS细胞。其余原料和制备方法与实验组严格保持一致。

对照II组：本对照组参照实验组提供的孵育方法，制备得到细胞重悬液，本对照组与实验Ⅰ组的区别在于：在孵育过程中，将实施例2中感染SGIV病毒的GS细胞替换成感染大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)的GS细胞。其余原料和制备方法与实验组严格保持一致。

对照III组：本对照组参照实验组提供的孵育方法，制备得到细胞重悬液，本对照组与实验Ⅰ组的区别在于在孵育过程中，将实施例2中感染SGIV病毒的GS细胞替换成感染中华鳖虹彩病毒(STIV)的GS细胞。其余原料和制备方法与实验组严格保持一致。

测试方法：利用多功能酶标仪分别检测参试对象所得到的细胞重悬液。

实验结果：测试结果如图2所示，将图2中实验Ⅰ组与对照I组、对照II组、对照III组的荧光值进行对比，多功能酶标仪检测到实验Ⅰ组的细胞表面羟基荧光素(FAM)的荧光值更高。由此说明，序列为SEQ ID NO.1的核酸适体对感染石斑鱼虹彩病毒的GS细胞具有高特异性识别能力。

实施例3

本实施例为检测实施例1中筛选出来的核酸适体对石斑鱼肝脾肾组织中分离出的细胞的结合情况。

参试对象：实验II组、对照Ⅳ组中经过孵育所得到的细胞重悬液。

实验II组：利用羟基荧光素(FAM)对SEQ ID NO.1核酸适体进行标记，取10nmol被标记后的SEQ ID NO.1核酸适体溶解在500μL PBS中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的核酸适体、从患有石斑鱼虹彩病毒的石斑鱼的肝脾肾组织中分离出感染SGIV病毒的细胞，在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清液。

对照Ⅳ组：本对照组参照实验II组提供的孵育方法，制备得到细胞重悬液，本对照组与实验II组的区别在于在孵育过程中，将实验II组中从患有石斑鱼虹彩病毒的石斑鱼的肝脾肾组织中分离出感染SGIV病毒的细胞，替换成从健康石斑鱼的肝脾肾组织中分离出未感染SGIV病毒的细胞。其余原料和制备方法与实验组严格保持一致。

测试方法：利用多功能酶标仪分别检测参试对象所得到的细胞重悬液。

实验结果：测试结果如图3所示，将图3中实验II组与对照Ⅳ组的荧光值进行对比，多功能酶标仪检测到实验II组的细胞表面羟基荧光素(FAM)的荧光值更高。由此说明，序列为SEQ ID NO.1的核酸适体对感染石斑鱼虹彩病毒的细胞具有高特异性识别能力。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.一种特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其特征在于：如所述SEQID NO.1所示的核苷酸序列上的至少一个碱基被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。

3.如权利要求1所述特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的二级结构如下：

4.如权利要求1～3任一项所述特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其特征在于：所述核酸适体上结合有标记物，所述标记物选自生物素、发光物质、酶中的至少一种。

5.如权利要求1～3任一项所述核酸适体在制备用于检测石斑鱼虹彩病毒的产品中的应用，所述应用不包括在疾病诊断中的应用。

6.一种用于检测石斑鱼虹彩病毒的试剂盒，其特征在于：含有如权利要求4所述特异性识别石斑鱼虹彩病毒的核酸适体。

7.如权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

使所述核酸适体与待测样品进行孵育，接着洗涤所述待测样品，最后对待测样品进行所述标记物的标记信号检测，通过所述标记信号的强度作出所述待测样品中是否含有石斑鱼虹彩病毒的判断。

8.如权利要求7所述试剂盒，其特征在于，在所述核酸适体与待测样品进行孵育前，先将所述核酸适体在90～95℃下变形5～10min，再在0℃下复性10min。