CN116891851A - 一种用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体及荧光分子检测探针 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体及荧光分子检测探针，该用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其衍生物。本发明提供的用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，不仅对石斑鱼虹彩病毒具有较高的特异性和亲和力，还具有分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒、无免疫原性等优点。采用本发明的核酸适体进行石斑鱼虹彩病毒检测，不仅灵敏度高、特异性好，而且测量范围宽、操作简单，可以快速准确的检测石斑鱼虹彩病毒。

Description

一种用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体及荧光分子检测 探针

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别地，涉及一种用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体及荧光分子检测探针。

背景技术

石斑鱼(Epinephelus sp.)属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲈形目(Perciformes)、鳍科(Serranidae)、石斑鱼亚科(Epinephelinate)，是暖水性底栖鱼类，是我国南方和东南亚国家主要的经济养殖海水鱼类。鞍带石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)是近些年在我国广东、福建等南方沿海地区引进的石斑鱼养殖品种，具有肉味鲜美、营养价值高、生长速度快、适应性强等优点。而且作为父本与老虎斑杂交后培育出的珍珠鞍带石斑鱼，目前养殖量已占据海南石斑鱼养殖总量的70％。然而，随着石斑鱼养殖规模的扩大，品种单一化、养殖集约化程度提高及养殖环境恶化等问题，由细菌性、病毒性或寄生虫等病原引起的疾病日益频繁爆发，对石斑鱼养殖造成重大经济损失。病害问题已经逐渐成为制约石斑鱼养殖产业健康发展的主要瓶颈。

石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)最初是从新加坡养殖的患病石斑鱼中分离和鉴定的高致病性虹彩病毒，属于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Iridovirus)。目前对SGIV尚无较好的治疗手段，主要以预防为主，需及早检测发现。因此研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的快速检测技术，对于控制石斑鱼虹彩病毒的危害极其重要。

核酸适体指的是经过指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。核酸适体具有亲和性和特异性高、稳定性强、易于化学合成和修饰等诸多优点，即核酸适体能够高特异性识别靶细胞的生物学特性，因而被广泛应用于检测技术开发和生物传感器的构建，实现对靶目标的精确检测诊断。因此利用核酸适体的特点开发精准检测石斑鱼虹彩病毒将具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体及荧光分子检测探针，以提高石斑鱼虹彩病毒的检测水平，有效提高防控石斑鱼虹彩病毒的效率。

根据本发明的第一个方面，提供一种用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列上的至少一个碱基被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。

优选地，核酸适体的二级结构如下：

优选地，用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体上接有功能基团，功能基团选自生物素标记物、发光标记物、酶标记物中的至少一种。

根据本发明的第二个方面，提供上述用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体在制备检测石斑鱼彩虹病毒的产品中的应用，应用不包括在疾病诊断中的应用。

根据本发明的第三个方面，提供一种石斑鱼虹彩病毒的荧光分子检测探针，其特征在于，包括上述用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，功能基团为发光标记物。

优选地，发光标记物选自羟基荧光素、异硫氰酸荧光素或羧基四甲基罗丹明中的至少一种。

本发明提供的核酸适体对石斑鱼虹彩病毒具有高敏感性。本发明通过SELEX技术筛选得到的核酸适体与现有的蛋白类抗体相比，具有分子量小、稳定性更佳、易改造修饰、无免疫原性、制作周期短、可以通过人工合成等优势，并且易于制备，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程，而且对石斑鱼虹彩病毒具有更高的亲和力和特异性。其次，采用基于本发明提供的荧光分子检测探针对石斑鱼虹彩病毒进行检测，该荧光分子检测探针结合了核酸适体的分子识别特性和荧光探针优异的光学检测性能，在生化分析和生物成像领域有着广阔的应用前景，并且操作简单迅速、能够达到较高的准确率和灵敏度。本发明提供的核酸适体增加了业内人员在需要对石斑鱼虹彩病毒进行检测时可采用的方法，对于石斑鱼虹彩病毒的快速检测具有重要意义。

附图说明

图1为核苷酸序列为SEQ ID NO.1的核酸适体的二级结构预测图；

图2为实施例2中的样品FAM荧光值的测试结果；

图3为实施例3中的样品FAM荧光值的测试结果。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例和实施例中的附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例为筛选和制备可以用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体。

S1.第一ssDNA文库的构建和引物的合成

设计合成第一ssDNA文库Library 50，其核苷酸序列如下：5’-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC。其中，两端为固定序列，中间50个核苷酸为随机序列。

上游引物包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，并被羟基荧光素(FAM)标记，其具体的序列为：5’-FAM-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’。

下游引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，并被生物素(Biotin)标记，其具体的序列为：5’-Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3’。

第一ssDNA文库和引物均由上海生工生物有限公司合成。

S2.SELEX筛选获得特异性识别石斑鱼虹彩病毒细胞的核酸适体(阳性筛选)

S2.1将10nmol上述第一ssDNA文库溶解在500μL PBS中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssDNA文库与石斑鱼虹彩病毒细胞在冰上孵育1h；

S2.2孵育结合完成后，离心移除上清，用10mL的PBS洗涤石斑鱼虹彩病毒细胞，92℃恒温水浴10min，12000g离心收集上清，即为特异性识别石斑鱼虹彩病毒细胞的第二ssDNA文库。

S3.PCR扩增

取100μL筛选得到的第二ssDNA文库，使其与上游引物、下游引物进行PCR扩增。

PCR反应体系如下(1000μL)：10×Buffer 100μL,dNTP Mix(2.5mM)80μL，上游引物40μL，下游引物40μL，第二ssDNA文库100μL，rTaq酶12.5μL，ddH₂O 627.5μL。

按照如下程序进行PCR扩增：92℃5分钟，92℃1分钟，60℃30秒，72℃1分钟，经过25轮循环；72℃5分钟。第一轮循环筛选后得到的上清，要全部用于进行后续的PCR扩增，得到扩增后的dsDNA文库。

S4.第三ssDNA文库的制备

将100μL链酶亲和素标记的磁珠与dsDNA文库在常温下孵育20min，利用dsDNA文库上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将dsDNA文库结合到磁珠表面，利用磁性分离器上除去上清，用2mL PBS洗涤磁珠，然后在EP管中加入200μL NaOH溶液(200mM)，常温反应15min，使dsDNA文库变性解链，带有生物素的一条链与链亲和素结合留在磁珠上，以与磁珠结合的单链DNA作为第三ssDNA文库，利用磁性分离架回收得到上清液；将上清液中正向单链核酸用PCR纯化回收试剂盒纯化回收，收集到的溶液用于下一轮的筛选。

S5.反复筛选

将S4中得到的第三ssDNA文库代替第一ssDNA文库，重复S2～S4所示的阳性筛选过程、PCR扩增及单链DNA文库的制取过程12次。

S6.阴性筛选

在S5的第二轮及第二轮以后筛选中，用正常石斑鱼脾细胞(GS)为对照，将S5后筛选得到的ssDNA文库进行阴性筛选以提高筛选效率。具体的阴性筛选过程为：将筛选得到的ssDNA文库溶解，在92℃下恒温水浴，与GS细胞在冰上孵育1h，孵育完成后离心收集上清溶液，即为经过阴性筛选的ssDNA文库。

S7.12轮筛选

将S6中收集到含有ssDNA文库的上清液，经过S3的PCR扩增和S4的ssDNA文库制备后，依次重复进行S6、S2、S3和S4的过程，利用流式细胞仪检测所得ssDNA文库对石斑鱼虹彩病毒细胞的识别能力的变化情况，重复进行11轮筛选，此时得到的ssDNA文库对石斑鱼虹彩病毒识别能力达到最强。将所得扩增产物经克隆测序分析后，最终得到本实施例中可用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其核苷酸序列为：

GGTCTACCAGGTTAATGCGCTATTGTAGAAGACCTTACACTACGAGTTGG(SEQ ID NO.1)

利用MFOLD软件(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)在线预测SEQ ID NO.1的二级结构，预测结果如图1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.1的核酸适体形成特殊的茎环结构和发卡结构。

实施例2

2.1主要仪器

无菌操作台(赛默飞世尔科技)、InfiniteM200Pro酶标仪(瑞士)。

2.2实验组设置方式

利用FAM分别标记实施例1构建的如SEQ ID NO.1所示的核酸适体。

实验组1：将10nmol如SEQ ID NO.1所示的核酸适体溶解在500μL PBS中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssDNA文库与感染石斑鱼虹彩病毒(SGIV)的石斑鱼脾细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清。

对照组1：将10nmol SEQ ID NO.1核酸适体溶解在500μL PBS中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssDNA文库与感染大口黑鲈虹彩病毒(LMBV)的GS细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清。

利用酶标仪分别检测实验组1和对照组1的参试核酸适体与石斑鱼脾细胞的结合效果及特异性。

2.3实验结果

酶标仪的检测结果如图2所示，结果证实，与对照组中酶标仪检测到的感染LMBV的石斑鱼脾细胞表面的荧光值相比，实验组中酶标仪检测到感染SGIV的石斑鱼脾细胞表面的荧光值显著升高，即上述如SEQ ID NO.1所示的核酸适体对感染SGIV的石斑鱼脾细胞具有高特异性识别能力。

实施例3

3.1主要仪器

低温高速离心机(赛默飞世尔科技)、InfiniteM200Pro酶标仪(瑞士)。

3.2实验组设置方式

利用FAM分别标记实施例1构建的SEQ ID NO.1核酸适体。

实验组2：将10nmol SEQ ID NO.1核酸适体溶解在500μL PBS中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssDNA文库与从患病石斑鱼肝脾肾组织分离出来，感染SGIV病毒的细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清。

对照组2：将10nmol SEQ ID NO.1核酸适体溶解在500μL PBS中，92℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min，将处理后的第一ssDNA文库与感从正常石斑鱼肝脾肾组织分出来，未感染SGIV病毒的细胞在冰上孵育1h，孵育结合完成后，离心移除上清。

利用酶标仪分别检测实验组和对照组的参试核酸适体与石斑鱼肝脾肾组织分离出的细胞的结合效果及特异性。

3.3实验结果

酶标仪的检测结果如图3所示，结果证实，与对照组2中酶标仪检测到的正常石斑鱼肝脾肾组织分离出细胞表面的荧光值相比，实验组2中酶标仪检测到患病石斑鱼脾肾组织分离出感染SGIV的细胞表面的荧光值显著升高，即上述SEQ ID NO.1核酸适体对感染SGIV的细胞具有高特异性识别能力。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其特征在于：所述用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其特征在于：如所述SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列上的至少一个碱基被磷酸化、巯基化、甲基化、氨基化或同位素化。

3.如权利要求1所述用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的二级结构如下：

4.如权利要求1～3任一项所述用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，其特征在于：所述用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体上接有功能基团，所述功能基团选自生物素标记物、发光标记物、酶标记物中的至少一种。

5.如权利要求1～3任一项所述用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体在制备检测石斑鱼彩虹病毒的产品中的应用，所述应用不包括在疾病诊断中的应用。

6.一种石斑鱼虹彩病毒的荧光分子检测探针，其特征在于，包括如权利要求4所述用于检测石斑鱼虹彩病毒的核酸适体，所述功能基团为发光标记物。

7.如权利要求6所述荧光分子检测探针，其特征在于：所述发光标记物选自羟基荧光素、异硫氰酸荧光素或羧基四甲基罗丹明中的至少一种。