CN106916821A - 一种ssDNA核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种ssDNA核酸适配体及其应用，ssDNA核酸适配体包括SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列。本发明ssDNA核酸适配体对神经坏死病毒感染的石斑鱼脑细胞具有高特异性、高亲和力，可以应用于石斑鱼神经坏死病毒的快速检测和治疗方案。

Description

一种ssDNA核酸适配体及其应用
技术领域
本发明属遗传资源检测技术领域，具体涉及一种可用于检测石斑鱼神经坏死病毒的ssDNA核酸适配体。
背景技术
石斑鱼是海水养殖最名贵的经济鱼类之一，在国内外市场供不应求。其肉质细嫩鲜美，体色斑斓吉祥。近年来，我国南方省区的石斑鱼网箱养殖规模迅速扩大，石斑鱼的各种病害也呈现迅速上升的势头，给养殖业主带来巨大经济损失，严重制约了石斑鱼养殖业的发展。鱼类病毒性神经坏死病又称空泡性脑病和视网膜病，是世界范围(除非洲以外)的一种鱼类流行性传染病，为重要的鱼类病害。该病对仔鱼和幼鱼危害很大，严重者在一周内死亡率可达100％，对成鱼也有很高的致死率。目前针对神经坏死病毒还缺乏有效的防治手段和快速检测手段。
指数富集的配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,SLEXE)技术是上世纪九十年代产生的一种新型组合化学技术。应用SELEX技术从一个大容量随机寡聚核苷酸文库中筛选到的针对靶物质的高亲和性和特异性的适配体，被广泛应用于制药、分子生物学、医学等众多研究领域。适配体相比于其他治疗性的生物分子，具有诸多优势：筛选到之后可以大量合成，不需要细胞或者动物；不仅靶标范围广，而且特异性强；作为核酸分子，稳定性强，室温也可以保存；对缓冲条件的要求范围广。
基于适配体的这些优势，可以着力开发出针对石斑鱼神经坏死病毒感染的细胞筛选出高特异性、高亲和力的适配体，应用于石斑鱼神经坏死病毒的快速检测和治疗方案。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有针对神经坏死病毒缺乏有效防治和检测手段的问题，提供一种ssDNA核酸适配体及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种ssDNA核酸适配体，其包括SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列。
还可对上述ssDNA核酸适配体进行修饰和改造，因此，作为本发明ssDNA核酸适配体的一种改进，所述步骤(1)中，所述ssDNA核酸适配体包括与SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列的同源性为60％以上的序列。
作为本发明ssDNA核酸适配体的一种改进，所述ssDNA核酸适配体包括与SEQ IDNO:1～3中任意一条或几条序列进行杂交的序列。
作为本发明ssDNA核酸适配体的一种改进，所述ssDNA核酸适配体包括与SEQ IDNO:1～3中任意一条或几条序列转录的RNA序列。
作为本发明ssDNA核酸适配体的一种改进，所述核酸适配体序列上的若干个位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
作为本发明ssDNA核酸适配体的一种改进，所述核酸适配体序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。
作为本发明ssDNA核酸适配体的一种改进，所述ssDNA核酸适配体包括SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列衍生出的硫代磷酸脂骨架，或由SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列改造成的相应的肽核酸。
以上不论是经部分取代或经过修饰后的核酸适配体或衍生物，都具有与原核酸适配体基本相同或类似的分子结构、理化性质和功能。
本发明ssDNA核酸适配体可用于制备石斑鱼神经坏死病毒的检测探针、药物载体或药物分离与纯化。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明ssDNA核酸适配体对神经坏死病毒感染的石斑鱼脑细胞具有高特异性、高亲和力、无免疫原性、稳定易修饰、便于合成和保存的优点，可以应用于石斑鱼神经坏死病毒的快速检测和治疗方案。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式，对本发明ssDNA核酸适配体及其有益效果进行详细说明。
图1为本发明实施例中通过筛选得到的与石斑鱼神经坏死病毒(red-spottedgrouper nervous necrosis virus,RGNNV)感染的GB细胞具有高特异性、高亲和力的适配体特征分析。其中，左边为通过流式细胞分析，荧光标记的适配体与RGNNV感染的GB细胞的亲和力(细线峰)相较于与正常GB细胞(粗线峰)有很大偏移，表明适配体对RGNNV感染的GB细胞有高特异性和亲和力。中间为通过流式细胞分析，荧光标记的适配体与RGNNV感染的GB细胞的亲和力(细线峰)相较于与正常GB细胞(粗线峰)有很大偏移，表明适配体对RGNNV感染的GB细胞有高特异性和亲和力。右边为通过流式细胞分析，荧光标记的适配体与RGNNV感染的GB细胞的亲和力(细线峰)相较于与正常GB细胞(粗线峰)有很大偏移，表明适配体对RGNNV感染的GB细胞有高特异性和亲和力。
图2为本发明实施例中羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记的适配体与RGNNV感染的GB细胞特异性结合分析。左边是明场的成像，右边是荧光通道的成像，是同一照片中不同通道的信息。由上至下分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
图3为本发明实施例中羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记的适配体与被RGNNV感染的石斑鱼脑组织、正常石斑鱼脑组织染色荧光强度差异比较(图中的两组图片，左边是明场的成像，右边是荧光通道的成像，是同一照片中不同通道的信息)。由上至下分别为SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和文库。
图4为本发明实施例中通过筛选得到的与RGNNV感染的GB细胞具有高特异性、高亲和力的适配体通过MFold程序(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)预测的二级结构。由左至右分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。
实施例
本发明ssDNA核酸适配体序列包含SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列所示的DNA片段。
本发明ssDNA核酸适配体主要通过以下方法筛选得到：
(1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物：
随机文库Library50的序列如SEQ ID NO:4所示；引物的序列如SEQ ID NO:5～7所示。
(2)Cell-SELEX筛选：
i.含10％胎牛血清的L15培养基培养GB细胞至铺满培养瓶底95％，加入石斑鱼神经坏死病毒(GNNV)感染48h后，用PBS缓冲液清洗细胞3-5次准备用于筛选。
ii.将10nmol随机文库溶解于筛选缓冲液，95℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min。
iii.将冰浴后的随机文库加入GNNV感染了的GB细胞，于4℃孵育结合1h，然后弃掉孵育上清，并用清洗液清洗细胞3次。
iv.用枪吹下该瓶中的细胞，转移至离心管中，94℃的水浴锅中加热5分钟后，离心取得上清。此上清即为筛选获得的针对GNNV感染的GB细胞的富集文库。
(3)文库扩增：将步骤(2)中筛选得到的特异核酸适配体文库进行PCR扩增，程序是：94℃2min，94℃1min，60℃30sec，72℃1min，经过12轮循环，72℃5min。第一轮筛选后得到的上清，要全部用于进行PCR扩增，得到扩增产物。
(4)DNA单链文库的制备：将步骤(3)中获得的PCR产物回收后，于92℃变性5min后置于冰上5min。将链酶亲和素标记的磁珠加入，并在常温下孵育，利用双链DNA上的生物素与磁珠上链酶亲和素的亲和作用，将双链DNA结合到磁珠表面，在磁珠中加入碱液反应后，利用磁性分离架回收得到上清；将上清液通过除盐柱收集到含有DNA单链文库的溶液用于下一轮筛选；
(5)重复多轮筛选：将步骤(4)中收集到的DNA单链文库，代替步骤(2)中的随机文库，重复以上步骤(2)-(4)的过程12次；
(6)反筛：在第二轮及第二轮以后筛选中，将生长时间相同的无病毒感染的GB细胞做同样的清洗处理，用于反筛。将10nmol随机文库溶解于筛选缓冲液，95℃恒温水浴5min，然后迅速插入冰中，冰浴10min；将冰浴后的文库加入正常GB细胞，于4℃孵育结合1h，取出上清；将上清加入GNNV感染了的GB细胞，于4℃孵育结合1h，然后弃掉孵育上清，并用清洗液清洗细胞3次；用枪吹下该瓶中的细胞，转移至离心管中，94℃的水浴锅中加热5分钟后，离心取得上清；再次将上清与正常的GB细胞于4℃孵育结合1h，收集上清。此上清即为经过两次反筛获得的针对GNNV感染的GB细胞的富集文库。
(7)反复多轮筛选之后，流式确定最终适配体库：利用流式细胞术检测所得文库对感染SGIV的GS细胞识别能力的增强情况，直至10轮筛选后，文库对对RGNNV感染了的GB细胞识别能力达到最强。将所得产物经克隆测序分析后，最终得到被SEQ ID NO:1～3所示的3条核酸适配体序列。
作为一个总的技术构思，本发明的优化筛选流程步骤(2)中，随机ssDNA单链文库首先会与对照细胞(正常GB细胞)在冰上孵育结合，然后回收上清中ssDNA用于和目标细胞(RGNNV感染的GB细胞)进行孵育结合，清洗之后，高温变性分离能与目标细胞结合的ssDNA。通过与对照细胞(正常GB)的孵育结合大大降低了筛选中非特异性吸附的ssDNA存留，因此提高了筛选效率。
实验例 利用流式细胞术检测筛选得到适配体与RGNNV感染的GB细胞的特异性结合
将RGNNV感染了的GB细胞用枪吹下，300g离心除去上清，用1mL PBS离心洗涤3次。将300nM异硫氰酸荧光素(FITC)标记的适配体(SEQ ID NO:1～3)溶于1mL的结合缓冲液中，然后与经上述处理后的细胞在冰上孵育结合30min，300g离心去上清，用1mL PBS离心洗涤3次，最终将细胞混匀在400ul PBS中，用于流式细胞仪检测。以适配体与正常GB细胞结合为对照。该结果证实，适配体对RGNNV感染的GB细胞有高特异性和亲和力(图1)。
实验例 荧光显微镜检测本实施例中羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记的核酸适配体与RGNNV感染了的GB细胞的特异性结合
在六孔板中的盖玻片上培养GB细胞，接入RGNNV后继续培养48h，获得RGNNV感染了的GB细胞。PBS清洗细胞2次。加入含有300nM上述本实施例中的核酸适配体(SEQ ID NO:1～3)的结合缓冲液，冰浴结合30min。去除上清，用2mL PBS清洗三次，将盖玻片取出，在载玻片上用抗荧光淬灭剂封片，观察。如图2所示，核酸适配体对RGNNV感染了的GB细胞具有特异性结合能力，该结果与流式细胞仪的检测结果一致。
实验例 荧光显微镜检测本实施例中羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记的核酸适配体与RGNNV感染了的石斑鱼脑组织的特异性结合
用羧基四甲基罗丹明(TAMRA)标记的核酸适配体(SEQ ID NO:1～3)，对RGNNV感染了的石斑鱼脑组织冰冻切片进行特异性结合检测，将核酸适配体与正常石斑鱼肝脏组织冰冻切片的结合结果作为对照。首先将冰冻切片用100mL PBS洗涤3次，将切片与200ul含有300nM TAMRA标记的核酸适配体的结合缓冲液室温孵育结合60min，然后将组织放在摇床上用100mL PBS洗涤，对照正常组织的染色和洗涤方法相同。待组织略干燥后，用抗荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜下观察。观察发现，核酸适配体对RGNNV感染了的石斑鱼脑组织具有较强的特异性结合能力，而对正常石斑鱼脑组织几乎没有结合能力(图3)。
实验例 适配体二级结构预测
将第10轮文库进行克隆、测序、聚类分析之后，得到适配体的序列(SEQ ID NO:1～3)，通过MFold程序(http://mfold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)预测的二级结构。结果表明，适配体可形成稳定的茎环结构，这些茎环结构是与RGNNV感染的GB细胞结合的结构基础(图4)。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
SEQ ID NO:1
GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTGGTGGGTTAGGTTGGGGAGTAGGGGTGTTCCATCATGTTGATTGTACTTCGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
SEQ ID NO:2
GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGCTCCACTGGTCCGGATCACTTGATATGTCGTGCGGCAGTCGTTTACATCCCGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
SEQ ID NO:3
GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTGGATATTGGATGGGATCGTGGTGGAAGGATTGGTGTGGTTGGTGGTCCACGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
SEQ ID NO:4
GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG(50N)CGAAGGACGCAGATGAAGTCTC
SEQ ID NO:5
5’-FITC-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’
SEQ ID NO:6
5’-TAMRA-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3’
SEQ ID NO:7
5’-Biotin-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3’

Claims (8)

1.一种ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体包括SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列。
2.根据权利要求1所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体包括与SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列的同源性为60％以上的序列。
3.根据权利要求1所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体包括与SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列进行杂交的序列。
4.根据权利要求1所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体包括与SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列转录的RNA序列。
5.根据权利要求1所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列上的若干个位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
6.根据权利要求1所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料、聚乙二醇、肽段、蛋白、叶酸或酶标记。
7.根据权利要求1所述的ssDNA核酸适配体，其特征在于，所述ssDNA核酸适配体包括SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列衍生出的硫代磷酸脂骨架，或由SEQ ID NO:1～3中任意一条或几条序列改造成的相应的肽核酸。
8.权利要求1～7中任意一条权利要求所述的ssDNA核酸适配体在制备石斑鱼神经坏死病毒的检测探针、药物载体、药物分离与纯化中的应用。
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