CN107177631A

CN107177631A - 利用CRISPR‑CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法

Info

Publication number: CN107177631A
Application number: CN201710496608.1A
Authority: CN
Inventors: 罗云波; 许文涛; 祁潇哲; 黄昆仑; 朱丽叶; 贺晓云
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-06-26
Filing date: 2017-06-26
Publication date: 2017-09-19
Anticipated expiration: 2037-06-26
Also published as: CN107177631B

Abstract

本发明提供一种利用CRISPR‑CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法。根据大鼠Slc22a2基因序列，构建基于CRISPER‑Cas9系统的gRNA表达载体，以此作为Slc22a2基因打靶载体，转入NRK细胞中，获得Slc22a2基因敲除的NRK细胞，其可作为理想的细胞模型，模拟人体肾脏环境中OCT2蛋白的缺失，用于研究OCT2蛋白在药物、毒素以及其他小分子物质转运方面的应用。

Description

利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法。

背景技术

NRK-52E细胞是大鼠肾小管上皮细胞，很多药物、毒素的分泌、吸收都在肾小管上皮细胞完成。在肾脏中有很多转运蛋白在药物、毒素的分泌、吸收中发挥着重要作用。有机阳离子转运蛋白家族(OCTs)是跨膜蛋白，包括三个亚型1-3，由SLC22A1-3编码，转运有机阳离子、弱碱和一些中性化合物。人OCT1主要在肝脏表达，将血液中的有机阳离子转运进肝脏，然后再进行生物转化。OCT2主要分布于肾脏和脑部，参与药物、毒素肾清除和脑转运。OCT3在多种组织中都有表达，例如肾、肝、小肠、脑、骨骼肌、胎盘等，负责中枢神经系统中内源物质的转运。

在该家族成员中，OCT2(基因Slc22a2)在人肾近端小管细胞基底膜表达丰富，所以有可能他们在近端小管从血液吸收化合物的过程中起重要作用。人OCT2和大鼠OCT2均位于肾近端小管基底膜，参与许多化合物肾排泄和肾重吸收。人OCT2转运四乙胺、1-甲基-4-苯基吡啶、4-[4-(二甲氨基)苯乙烯基]-N-甲基吡啶、N-甲基烟酰胺、氨基胍。OCT2还转运神经递质，例如乙酰胆碱、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、5-羟色胺、组胺、胆碱。人OCT2也转运黄曲霉毒素B1、百草枯、溴化乙锭。一些蛋白参与了OCT2的转录后调控，如蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、钙调蛋白。OCT2介导许多药物肾外排的第一步，以及胆碱或其他有机阳离子底物在近端小管重吸收的第二步。人中枢神经系统中的OCT2能将药物转运通过血脑屏障，例如抗帕金森的药物。在急性和慢性肾损伤中，肾OCT2蛋白表达下降，会导致OCT2底物的药代动力学和肾毒性的改变。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法。

本发明的另一目的是提供利用上述方法制备的Slc22a2基因敲除的NRK细胞系及以其作为细胞模型在研究OCT2蛋白的转运功能中的应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种Slc22a2基因打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，gRNA作用位点位于大鼠Slc22a2基因的2号外显子上，gRNA作用位点的DNA序列为5′-TTTCAGTCAGTAGTGAACGT-3′(SEQ ID NO:1)。

用于构建所述表达载体的出发载体为pX458。

所述表达载体其是将gRNA作用位点的DNA序列5′端加上BbsI酶切位点序列，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的pX458载体连接，构建得到的。

本发明还提供所述打靶载体在制备Slc22a2基因敲除的NRK细胞系中的应用。

本发明还提供一种利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法，其是根据大鼠Slc22a2基因序列，构建基于CRISPER-Cas9系统的gRNA表达载体，以此作为Slc22a2基因打靶载体，转入NRK细胞中，获得Slc22a2基因敲除的NRK细胞。

其中，gRNA作用位点位于大鼠Slc22a2基因的2号外显子上，gRNA作用位点的DNA序列为5′-TTTCAGTCAGTAGTGAACGT-3′。

本发明还提供利用上述方法制备的Slc22a2基因敲除的NRK细胞系。利用打靶载体转染NRK细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为Slc22a2基因敲除的NRK细胞系。

用于鉴定中靶阳性细胞克隆的特异性PCR引物(SEQ ID NO:2-3)包括：

Slc22a2-F：5’-AAATGCCAGACTCACACCGT-3’

Slc22a2-R：5’-TGTGCGTTCAGGGTGAAGAA-3’

本发明所述NRK细胞为NRK-52E。

本发明进一步提供所述NRK细胞系在研究OCT2蛋白的转运功能(尤其对药物、毒素以及其他小分子物质的转运)中的应用。

本发明具有以下优点：

(一)利用CRISPR/Cas9系统首次从NRK-52E细胞中敲除Slc22a2基因，简便、快速，可作为理想的细胞模型，模拟人体肾脏环境中OCT2蛋白的缺失。

(二)基于CRISPR/Cas9系统敲除基因Slc22a2的方法，与沉默、干扰、敲低等手段相比，能够更有效地敲除OCT2蛋白，利于研究OCT2蛋白的转运功能。

(三)从基因、蛋白水平两方面检测都发现OCT2蛋白被敲除，说明OCT2蛋白序列已被彻底改变，可能造成OCT2功能的彻底丧失，是较为理想的OCT2敲除的细胞模型。

附图说明

图1为本发明实施例1中pX458质粒与目的片段连接后的PCR扩增结果。其中，泳道1-3均为pX458质粒与目的片段连接后转化大肠杆菌，挑取单克隆，培养后进行菌液PCR的扩增结果。

图2为本发明实施例1中大提质粒pX458-Slc22a2电泳图。

图3为本发明实施例1中转染细胞挑选单克隆鉴定结果。其中，A为不同克隆细胞基因组提取结果，B为不同克隆细胞的基因组PCR扩增结果，C为菌落PCR结果。

图4为本发明实施例1中利用Western blot检测OCT2蛋白的结果。

图5为本发明实施例2中CCK-8法测定Slc22a2基因敲除细胞活力的结果。

图6为本发明实施例3中野生型细胞与Slc22a2基因敲除型细胞在细胞凋亡中的差异比较结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法

1、实验材料

真核表达载体pSpCas9(BB)-2A-GFP(pX458)。

大鼠NRK-52E细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2、CRISPR/Cas9打靶载体的构建

(1)靶序列确定

根据网站http://genome.ucsc.edu获取大鼠Slc22a2基因的外显子信息，选择第2外显子作为靶标设计的区域。然后根据网站http://crispr.mit.edu设计guide sequence：5’-TTTCAGTCAGTAGTGAACGT-3’，在其5’端加上BbsI酶切位点序列，并合成与其互补的序列(SEQ ID NO:4-5)：

Guide sequence:5’-CACCGTTTCAGTCAGTAGTGAACGT-3’

Complementary sequence:3’-CAAAGTCAGTCATCACTTGCACAAA-5’

(2)靶序列与pX458质粒连接

①pX458空载体酶切，20μL反应体系见表1，37℃酶切过夜。

表1pX458空质粒酶切体系

②pX458酶切产物的回收纯化

根据天根生化普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行。

③合成的Guide sequence和Complementary sequence形成双链DNA，10μL反应体系见表2，反应程序：37℃，30min；95℃5min，自然降至室温。

表2合成片段形成双链体系

④将形成双链的目的片段稀释250倍后与载体pX458连接，得到重组载体pX458-Slc22a2。10μL反应体系见表3，反应程序：室温连接3h。

表3连接体系

(3)转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆PCR鉴定

将连接产物加入100μL E.coli感受态细胞DH5α，混匀后冰浴30min，然后进行转化，42℃热激90s，冰浴2min，加入900μL 37℃预温好的无菌LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠)，37℃、200g下振荡培养1h，取100μL菌液涂布LB培养基琼脂平板(每100mL LB琼脂培养基中含100μL浓度为100mg/mL的氨苄青霉素、200μL浓度为20mg/mL的X-Gal溶液)，37℃倒置培养16h左右。挑取白色克隆菌落，在1mL LB培养基(含0.1mg/mL氨苄青霉素)中培养，进行菌液PCR，测序。PCR引物：F：5’-TGGACTATCATATGCTTACCGTAAC-3’，R：5’-AAACACGTTCACTACTGACTGAAA-3’。

PCR扩增片段大小为105bp，见图1，说明目的片段与pX458载体连接成功。筛选出正确序列质粒进行下一步实验。

3、质粒的制备与鉴定

上一步经过PCR鉴定选择符合预期的克隆，用天根生化大提试剂盒大量制备无内毒素的质粒pX458-Slc22a2，测定其浓度和纯度。提取步骤依照说明书进行。在1％琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像系统观察跑胶结果(图2)。

4、Slc22a2基因敲除细胞系的构建

(1)细胞转染

待NRK-52E细胞长至60％～80％汇合度时，转染前lh，给细胞换液。

转染步骤如下：

①配制细胞转染液：取一个1.5mL无菌EP管，先加入320μL DMEM，然后按8μg/6cm皿量加入大提好的质粒pX458-Slc22a2，轻柔混匀，但要尽量保证充分。

②一般按照质粒∶HTF为1∶3(w/v)的比例加入相应体积的HTF(细胞转染试剂)，轻柔混匀并保证充分，室温静置20min。

③转染4～6h后，给细胞换液。

④培养48h后，使用分选型流式细胞仪筛选出有EGFP标记的细胞，分单个细胞在96孔板中培养。

⑤待单克隆细胞数量足够多时分别提取DNA鉴定。

(2)细胞基因组提取

配制细胞裂解液pH 8.0，见表4。

表4细胞裂解液

①细胞消化后，离心弃上清，加600μL裂解液(3.5cm皿)，加入4μL蛋白酶K，65℃孵育20min。

②12000g离心5min取上清，加入2倍体积的异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物。

③12000g离心10min，弃上清，加1mL 70％乙醇洗沉淀。

④12000g离心10min，弃上清，彻底晾干后，加ddH₂O溶解，-20℃保存备用。

将构建成功的质粒转染NRK-52E细胞，转染48h后利用分选型流式细胞仪筛选出转染成功的细胞，在96孔板里单细胞培养。待单克隆细胞数量足够多时分别提取DNA，图3A展示了其中8个细胞克隆A1、A10、B5、B13、C2、C5、C10和C16的DNA提取结果。

(3)PCR鉴定

在Slc22a2基因上，以包含靶序列的517bp片段为目的片段，设计引物Slc22a2-F和Slc22a2-R，序列如下：

Slc22a2-F：5’-AAATGCCAGACTCACACCGT-3’

Slc22a2-R：5’-TGTGCGTTCAGGGTGAAGAA-3’

PCR反应条件：95℃预变性5min；30个循环：95℃变性30s，58℃退火60s，72℃延伸60s；最后72℃终延伸7min。PCR反应体系见表5。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测(图3B)。

表5PCR扩增体系

其中6个细胞克隆的PCR扩增片段大小符合预期517bp，将A1、B13、C2、C5、C10、C16的PCR产物回收纯化。

(4)PCR产物回收纯化

根据天根生化普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行。

(5)回收片段与T-Vector pMDTM19的连接与转化

将PCR产物回收纯化后的片段与T载体连接，连接体系见表6。载体连接条件为16℃过夜。

表6T载体连接反应体系

(6)转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆PCR鉴定

连接产物转化大肠杆菌DH5α，参见前述转化操作步骤。每个平板挑取20个白色克隆菌落，进行菌落PCR。引物使用T载体通用引物：

M13F(-47)5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’

M13R(-48)5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’

PCR反应条件：95℃预变性5min；30个循环：95℃变性30s，58℃退火60s，72℃延伸60s；最后72℃终延伸7min。PCR反应体系见表7。PCR扩增产物大小为673bp，用琼脂糖凝胶电泳检测。

表7PCR扩增体系

PCR胶回收产物连接T载体后，转化大肠杆菌DH5α，挑取白色克隆菌落，进行菌落PCR，选取C16号部分结果展示见图3C。

(7)测序比对

将PCR产物测序，测序结果与原始PCR序列比对，确定具体突变位置以及突变序列。经比对发现只有C16号细胞克隆的PCR产物测序结果显示全部突变，类型为增加一个碱基C，下划线处碱基为新增加的碱基，该碱基的增加导致Slc22a2基因表达移码突变。加粗字体是Slc22a2基因部分序列，斜体为T载体上的部分序列。

CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTAGAACTCGGTACGCGCGGATCTTCCAGAGATTAAATGCCAGACTCACACCGTCAGATGGAATGCTAAATGCTAATGGATTTCCAGGGGAAATCTGGCAATGTATAGAAATTTAGCATGGGTTACGGTGCAGCTGGACTATTGGCACTCCGTTCAAGAAATATTCGAGTAAGTACCACACAGTAATCACCTGAACCGTCTGTGCTCCCAGGAACTCCCAGTTAGAAATACTCAGAGAACTATGATATGAATAGATCTAAGGAGATGCTAATAACATTTTCTCCCTCTCTGCCCTCCCCCACTCTCTTCCCCTCCCCCGGCTTGGACGGCACCGCATATTTGGACAGTTTAACCTGGTGTGTGCTCACTCCTGGATGCTGGACCTGTTTCAGTCAGTAGTGAACCGTGGGGTTTTTCATCGGTGCTATGATGATTGGCTACCTAGCGGACAGGTAGGTGAAACAACTGTGGGGCTTTAAAAATAACCCACAGGTTCAGACAGTACTCGGGCTCACCCACCCTGCCCGAATCCTTCTTCACCCTGAACGCACAATCGTCGAACGGCAGGCGTGCAAACTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCT

(8)Western blot验证

在基因水平验证突变细胞株后，用Western blot进一步验证C16号细胞株是否敲除OCT2蛋白，结果见图4，未检测到OCT2蛋白。

通过以上DNA水平以及蛋白水平的验证，证明Slc22a2基因敲除的NRK-52E细胞系构建成功。然后使用KO代表C16号Slc22a2基因敲除的细胞株。

实施例2CCK-8法测定敲除细胞活力

使用敲除型细胞株KO，用10μM、20μM、50μM OTA以及1000μM TEA(OCT抑制剂)处理细胞24h，检测细胞活力。

1.用胰酶消化收集对数生长期的细胞，加入适量完全培养基吹打成单细胞。在96孔培养板中每孔接种约8000个细胞，每孔添加培养液100μL，空白孔不加细胞，为防止液体挥发影响细胞生长，在96孔板最外侧一圈添加200μL PBS。

2.将96孔板放入37℃、5％CO₂及95％饱和大气湿度培养箱培养。24h后待细胞长到约70％弃去培养液，每孔加入含有不同浓度(0～50μM)OTA的完全培养基，对照组(有细胞、无OTA)和空白组(无细胞、无OTA)加入同等体积的完全培养基，每个处理组设置6个复孔，培养箱孵育24h。

3.每孔加10μL CCK8工作液，在37℃培养箱中放置1h。用酶标仪在450nm处测定吸光值。

4.待确定OTA的处理浓度后，用胰酶消化收集对数生长期的细胞，加入适量完全培养基吹打成单细胞。每孔接种8000个细胞，每孔添加培养液100μL，空白孔不加细胞，为防止液体挥发影响细胞生长，在96孔板最外侧一圈添加200μL PBS。

5.将96孔板放入37℃、5％CO₂及95％饱和大气湿度培养箱培养。24h后待细胞长到约70％，弃去培养液，用含有OCT的抑制剂TEA(Tetraethylammonium chloride)(0～100μM)的完全培养基预处理细胞15min，每孔细胞悬液体积100uL，然后弃去TEA，再用含有OTA和TEA的完全培养基共同处理细胞24h。

6.每孔加入10μL CCK-8工作液，37℃孵育1h。用酶标仪在450nm处测定吸光值。

OTA处理24h对敲除细胞的细胞活力产生影响(图5)，OTA剂量为10μM、20μM、50μM时，细胞活力均显著降低。在OTA处理的同时添加TEA，发现细胞活力与单独OTA处理无显著变化。该结果表明敲除OCT2蛋白后，再使用OCT家族的抑制剂，对于细胞存活无显著缓解作用，说明OCT1，OCT3并不在OTA影响细胞存活中起主要作用。

实施例3OTA对敲除细胞凋亡的影响

用50μM OTA处理野生型细胞与敲除型细胞KO 24h，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1)将细胞以10⁵个/孔的密度传代于6孔板中，生长约24h待细胞覆盖底面积约70％时用OTA处理(0、20μM、50μM)或OTA与TEA共处理。

2)处理24h后，弃处理液，用PBS冲洗两遍后用不含EDTA的胰酶消化收集细胞。

3)用PBS洗涤细胞2次，以2000g离心5min，收集细胞沉淀。

4)加500μL的Binding Buffer悬浮细胞，2000g离心5min，收集细胞沉淀。

5)加500μL的Binding Buffer悬浮细胞，加5μL FITC混合均匀后，加5μL PI混匀，放置10min。

6)流式细胞仪上机检测，重复三次，收集数据和图像。

为了探究OTA诱导的细胞凋亡是否在OCT2敲除后发生了变化，本实验用50μM OTA处理细胞24h，比较野生型细胞与敲除型细胞KO在细胞凋亡中的差异。结果见图6，50μM OTA处理细胞24h，野生型细胞的凋亡率由9％增加到40％(p<0.05)；敲除型细胞KO的凋亡率由10％增加到14％，无显著增加；在50μM OTA处理24h后，敲除型细胞KO的凋亡率显著低于野生型细胞。说明OCT2敲除缓解了OTA引发的NRK-52E细胞凋亡。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法

<130> KHP171113745.0

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tttcagtcag tagtgaacgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaatgccaga ctcacaccgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtgcgttca gggtgaagaa 20

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caccgtttca gtcagtagtg aacgt 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caaagtcagt catcacttgc acaaa 25

Claims

1.Slc22a2基因打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，gRNA作用位点位于大鼠Slc22a2基因的2号外显子上，gRNA作用位点的DNA序列为5′-TTTCAGTCAGTAGTGAACGT-3′。

2.根据权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，出发载体为pX458。

3.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，其是将gRNA作用位点的DNA序列5′端加上BbsI酶切位点序列，并人工合成其互补序列，将两条互补序列形成的双链DNA，与经过BbsI酶切的pX458载体连接，构建得到的。

4.权利要求1-3任一项所述打靶载体在制备Slc22a2基因敲除的NRK细胞系中的应用。

5.利用CRISPR-CAS9技术敲除NRK细胞Slc22a2基因的方法，其特征在于，其是根据大鼠Slc22a2基因序列，构建基于CRISPER-Cas9系统的gRNA表达载体，以此作为Slc22a2基因打靶载体，转入NRK细胞中，获得Slc22a2基因敲除的NRK细胞；

6.Slc22a2基因敲除的NRK细胞系，其特征在于，用权利要求1-3任一项所述打靶载体转染NRK细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为Slc22a2基因敲除的NRK细胞系。

7.根据权利要6所述的NRK细胞系，其特征在于，用于鉴定中靶阳性细胞克隆的特异性PCR引物包括：

Slc22a2-F：5’-AAATGCCAGACTCACACCGT-3’

Slc22a2-R：5’-TGTGCGTTCAGGGTGAAGAA-3’。

8.根据权利要求6或7所述的NRK细胞，其特征在于，所述NRK细胞为NRK-52E。

9.权利要求6-8任一项所述NRK细胞系在研究OCT2蛋白的转运功能中的应用。