CN105218642B - 一种肽适体及其作为稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种肽适体及其作为稻瘟菌钙调节蛋白拮抗剂的应用，属于蛋白质工程领域。本发明的肽适体命名为SNP‑D4，是以葡萄球菌核酸酶为基本骨架的肽适体。该肽适体以稻瘟菌钙调蛋白CaM为靶标，通过细菌双杂交获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码其的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。肽适体SNP‑D4既能与CaM特异性相互作用，又具有抑制稻瘟菌孢子发育功能，可作为稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂，在植物保护领域具有广泛的用途。

Description

一种肽适体及其作为稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂的应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，具体地说，涉及以葡萄球菌核酸酶为基本骨架的肽适体及其在水稻稻瘟病防治中的应用。

背景技术

稻瘟病、白叶枯病和纹枯病被列为水稻三大主要病害。稻瘟病是由稻瘟霉(Magnaporthe grisea)引起的水稻真菌性病害,分布范围十分广泛，90年代以来，我国稻瘟病的年发生面积均在5700万亩以上，年损失稻谷达数亿公斤。稻瘟菌侵染过程依赖多种信号通路参与调控，其中Ca²⁺信号通路在稻瘟菌的生长发育、孢子萌发、侵染结构形成和致病性方面也具有重要作用。钙调蛋白(Calmodulin，CaM)是Ca²⁺信号通路中的重要组成部分，尤其与稻瘟菌孢子萌发和附着胞形成密切相关。

钙调蛋白拮抗剂是以钙调蛋白为靶点的药物，对研究钙调蛋白在稻瘟菌致病性方面的功能具有重要意义。但是，目前市场上钙调蛋白拮抗剂均专一性不强，且无任何稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂的研究报道，使得钙调蛋白拮抗剂不仅于稻瘟菌钙调蛋白，还会影响其他的通路蛋白，无法实现单一变量的实验策略。

肽适体(peptide aptamer，pepaptemers)是人工合成的随机氨基酸文库中筛选出的可特异性、高亲和力结合靶标的短肽。其主要结构包括一段无生物活性的支架蛋白(scaffold protein)以及两端固定在支架蛋白上的可变肽段。肽适体文库的设计原理是将大量人工合成的随机肽序列，插入、整合于蛋白支架之上构成肽库，利用随机区域的信号基序(signal motif)与靶蛋白之间的相互作用，筛选得到针对靶蛋白的高亲和力、高特异性的肽适体。本实验室拥有库容量约为1.5-2.0×10⁷的肽适体文库：肽库为可编码16个随机氨基酸的寡核苷酸文库，以改造的葡萄球菌核酸酶SNase(Staphylococcal nuclease，SN)为脚手架蛋白，借助两端限制性酶切位点，成功将随机片段插入至SNase中。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够作为稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂的肽适体及其应用。

本发明提供的肽适体，其为SNP-D4，以葡萄球菌核酸酶为基本骨架，具有：

1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸。

本发明提供了编码上述肽适体的基因，其具有：

1)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或

2)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

含有上述编码肽适体的基因表达载体属于本发明的保护范围。

含有前述表达载体的宿主细胞属于本发明的保护范围。

本发明提供了含有肽适体SNP-D4的生物制剂。

本发明提供了含有肽适体SNP-D4的稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂。

本发明还提供了含有肽适体SNP-D4的农药。

本发明提供了肽适体SNP-D4在植物保护方面的应用和在抑制稻瘟菌中的应用。

本发明提供了含有肽适体SNP-D4的生物制剂在在植物保护方面的应用和在抑制稻瘟菌中的应用。

本发明提供了含有肽适体SNP-D4的农药在植物保护方面的应用和在抑制稻瘟菌中的应用。

本发明提供了肽适体SNP-D4在制备抑制稻瘟菌的生物制剂或农药中的应用。

本发明提供了肽适体SNP-D4在制备转基因植物方面的应用。

本发明具有下列优点及有益效果：

本发明提供的肽适体SNP-D4(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，核苷酸序列如SEQID No.2所示)既能与CaM特异性相互作用、又具有抑制稻瘟菌孢子发育功能，可作为稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂在植物保护、抑制稻瘟菌生长方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为稻瘟菌CaM PCR扩增产物1％琼脂糖电泳图，其中M为DS5000 Marker；1为空白对照，2为稻瘟菌CaM。

图2为显微镜下SNP-D4抑制稻瘟菌生长的观察图。以PBS和SNase处理组为阴性对照，1％三环唑处理组为阳性对照，显微观察各组孵育0h、3h、7h后孢子萌发及芽管形成的差别。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

大肠杆菌E.coli XL1-Blue MRF’、E.coli XL1-Blue MR为实验室保存菌种。质粒pBT、pTRG、pBT-LGF2、pTRG-Gal11p为实验室保存质粒。肽适体文库pTRG-SNP由本实验室构建。表达质粒pET32a-CaM已在文献(马志斌,刘静,张红玉,王立安.稻瘟病菌钙调素基因的克隆及原核表达特性研究.中国植物病理学会2008年学术年会论文集.2008.5月:249-253页)中公开。稻瘟病菌菌株Magnaporthe oryzae为实验室保存菌株。

实施例1稻瘟菌CaM基因的克隆

1、引物设计

根据稻瘟菌CaM核酸序列，使用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件设计上下游引物(如表1所示)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 稻瘟菌CaM PCR扩增引物

2、PCR扩增

PCR反应体系(50μl)：

PCR反应程序：94℃，3min；94℃30s,63℃45s,72℃45s，共30个循环，72℃10min。PCR结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

3、PCR产物回收

利用PCR产物纯化试剂盒(上海捷瑞)进行PCR产物纯化回收，电泳检测回收的DNA片段。

4、“诱饵”重组质粒的构建

4.1酶切

(1)稻瘟菌CaM基因片段双酶切

①稻瘟菌CaM基因片段，酶切体系如下：

②37℃酶切3h。纯化，溶于30μl TE缓冲液。

(2)“诱饵”表达载体pBT双酶切

①pBT载体双酶切，体系如下：

②37℃酶切3h，取0.5ul 1×CIP处理30min。回收、纯化，溶于30μl TE缓冲液。

4.2连接反应

按照载体/基因片段摩尔比为1:3或者1:4，使用T₄DNAligase进行连接反应，反应体系(10μl)如下：

16℃处理4h后，存放于-20℃用于后续实验

4.3XL1-BLUE MRF’感受态细胞的制备

采用CaCl₂法制备XL1-BLUE MRF’大肠杆菌感受态细胞。

4.4热激转化

(1)向大肠杆菌XL1-BLUE MRF’的CaCl₂感受态细胞中加1μl重组质粒DNA，轻轻摇匀，冰上放置30min；

(2)42℃水浴热激90s，立即放入冰上冷却2min；

(3)加800ul LB液体培养基，37℃摇床温育1-2h；

(4)取200ul菌液涂布于Cam/IPTG/X-gal平板上，37℃培养12h。

4.5阳性克隆的筛选

挑取Cam/IPTG/X-gal平板上长出的白色菌落划线，37℃培养12h。

4.6菌落PCR验证阳性克隆

分别采用CaM上下游引物CaM-F/CaM-R和pBT载体上游引物pBT-F 5'TCCGTTGTGGGGAAAGTTATC 3'与CaM下游引物CaM-R两对引物对阳性克隆进行菌落PCR验证。

PCR验证体系①：细菌裂解上清1μl，CaM-F0.5μl，CaM-R 0.5μl，2×PCR mix 6μl，ddH₂O 4μl，总体积12μl。

PCR程序：94℃3min；94℃30s,63℃45s,72℃45s,共25个循环；72℃10min。

PCR验证体系②：细菌裂解上清1μl，pBT-F 0.5μl，CaM-R0.5μl，2×PCR mix 6μl，ddH₂O 4μl，总体积12μl。

PCR程序：94℃3min；94℃30s,57℃45s,72℃45s,共25个循环；72℃10min。

选用引物CaM-F/R，以质粒pET32a-CaM为模板进行PCR扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如图1所示，在分子量450bp处出现一条与预期分子量大小一致的目的片段。将获得的阳性克隆送往生工生物工程有限公司进行测序，测序结果见SEQ ID NO.3。将pBT-CaM测序结果进行NCBI-BLAST分析(http://www.nicbi.nlm.gov/)。结果显示，测序结果与NCBI数据库中的稻瘟菌钙调蛋白(Calmodulin，CaM)基因序列(GenBanK序列号：FJ865430.1)匹配率为100％。由此说明，“诱饵”重组质粒pBT-CaM构建成功。

实施例2对稻瘟菌孢子具有抑制功能的肽适体的筛选

1、细菌双杂交筛选特异性肽适体

(1)37℃预热SOC培养液，并于-20℃预冷电转杯和1.5ml离心管若干；

(2)取出-80℃保存的XL1-BLUE MRF’甘油感受态细胞于冰上解冻15min左

(3)设置电转化参数(电压1.5kv，电阻400Ω，电容25μF)；

(4)添加50ng实施例1获得的诱饵质粒pBT-CaM和50ng pTRG-SNP肽适体文库。该肽适体文库构建方法为：

1)提取葡萄球菌基因组分别用5SNA及3SNA，5SNB及3SNB进行PCR,用对应酶切，连接到载体pTRG上，构建成pTRG-SN。

5SNA:5'-GGATCC GCG GCC GCAATG GGT TAC CCATAC GAC GTT C-3'(Bam HI位点)

3SNA:5'-GTACTT AGATCT GGC CTT TCT TAAGGAGAA TTC TG-3'(Bgl II位点)

5SNB:5'-AAG GCC AGATCT AAG TAC GGT CCAGAAGCT TC-3'(Bgl II位点)

3SNB:5'-GAT CTC ACT AGT TTAGTG GTG GTG GTG GTG GTG GTC GAT GTC-3'(ScaI位点)

2)合成单链随机核酸序列，其中N代表A/G/T/C中的一种；S代表G/C中的一种。5'

GGTGGTNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSGGTGGT3'；

3)单链转换成双链，并将此片段插入pTRG-SN载体，构成含有可变环的pTRG-SN-peptide(简称pTRG-SNP)；转化随机挑取单菌落测序，计算库容量可达10^7-8。

至解冻的40μl大肠杆菌XL1-Blue MR甘油感受态细胞中，并于冰上反复轻柔吹打混匀；

(5)转移步骤(4)中的质粒、感受态细胞混合物至预冷的电转杯中，轻敲电转杯，使混合物均匀铺满杯底；

(6)擦干电转杯，滑动电转杯至电触头，使其与电极紧密接触；

(7)脉冲电击电转杯后，迅速取出电转杯，加入预热至37℃的SOC培养基900μl，重悬菌体。

(8)转移菌液至1.5ml EP管，37℃，150rpm孵育2h；

(9)室温或4℃下，2000g离心10min；

(10)小心吸出上清，用1ml M9⁺His-Dropout Broth(提前使其温度恢复至室温)重悬菌体；

(11)室温或4℃下，2000g离心10min；

(12)小心吸出上清，再用1ml M9⁺His-Dropout Broth重悬菌体；

(13)37℃，150rpm孵育2h；

(14)孵育期间，将筛选平板避光放置于超净台中吹1-1.5h；

(15)将步骤13中的菌体以5000rpm，3min离心，富集至300μl

(16)各取150μl菌液分别涂布于3-AT平板和No-3-AT平板；

(17)37℃倒置避光培养24h后，取出放置于室温避光培养24h。

2、菌落PCR验证

采用pBT载体引物pBT-F5'-TCCGTTGTGGGGAAAGTTATC-3'；pBT-R 5'-GGGTAGCCAGCAGCATCC-3'以及pTRG载体引物pTRG-F 5'-TGGCTGAACAACTGGAAGCT-3'；pTRG-R5'-ATTCGTCGCCCGCCATAA-3'对获得目的菌株进行菌落PCR验证。

①菌落PCR体系：细菌裂解上清1μl，pBT-F和pBT-R各0.5μl，pTRG-F和pTRG-R各0.5μl，2×PCR mix 6μl，ddH₂O 4μl，总体积13μl。

②菌落PCR程序：94℃3min；94℃30s，50℃45s，72℃1min，共20个循环；72℃10min。

③1％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物。

3、获得与pBT-CaM相互作用的肽适体pTRG-SNP

①获得与pBT-CaM相互作用的pTRG-SNP

(1)挑取3-AT平板中的阳性克隆接种至LB+Cam(25μg/ml)+Ter(12.5μg/ml)双抗平板，37℃，避光倒置培养12h；

(2)将双抗平板上的菌落转接至5ml LB+Ter(12.5μg/ml)液体培养基，37℃，150rpm震荡培养12h；

(3)收集步骤2中的菌体，利用质粒小量提取试剂盒提取质粒

(4)将步骤3中的质粒通过热激转化转入XL1-BLUE MRF’大肠杆菌感受态细胞，涂布于LB+Ter(12.5μg/ml)平板，避光倒置过夜培养；

(5)挑取步骤4中的阳性克隆，分别于LB+Cam(25μg/ml)平板和LB+Ter(12.5μg/ml)平板上进行划线培养；

(6)选取步骤5中在LB+Cam(25μg/ml)平板不长，但是，在LB+Ter(12.5μg/ml)平板上能够生长的菌落，接种于5ml LB+Ter(12.5μg/ml)液体培养基，37℃过夜震荡培养；

(7)收集步骤6中的菌液，提质粒，即获得单一的、与pBT-CaM相互作用的靶标质粒pTRG-SNP。

②菌落PCR验证

采用pBT载体引物pBT-F/pBT-R以及pTRG载体引物pTRG-F对获得到的包含单质粒pTRG-SNP-MRF’菌株进行菌落PCR验证。

通过上述共转化诱饵质粒pBT-CaM与肽适体文库(pTRG-SNase peptideaptamers，pTRG-SNPs)至XL1-Blue MR感受态细胞，3-AT平板筛选获得与CaM特异性相互作用的肽适体。将3-AT平板筛选出的菌落重新划线过夜培养，通过双引物菌落PCR验证，琼脂糖凝胶电泳结果显示所有阳性克隆均具有两条条带，大小分别为596bp和759bp，与预期大小相一致，表明均含有两种质粒。经过4次细菌双杂交实验筛选，共获得目的菌株34株。

4、筛选对稻瘟菌孢子具有抑制功能的肽适体

4.1制备稻瘟菌孢子悬液取若干培养4-5d的稻瘟菌燕麦平板，用无菌水冲洗平板表面的菌苔，收集冲洗后的液体，经8层纱布过滤即为孢子悬液。为了保证孢子抑制实验的可靠性，一般通过离心浓缩控制孢子悬液的浓度达到5×10⁵个/ml。

4.2诱导表达筛选得到的特异性肽适体

(1)从pTRG-SNP-XL1-BLUE MR菌液中提取质粒pTRG-SNP。采用CaCl2法制备XL1-BLUE MR大肠杆菌感受态细胞。

(2)将获得的pTRG-SNP-XL1-BLUE MR菌挑单菌落至5ml LB+Ter(12.5μg/ml)液体培养基，37℃震荡过夜培养；

(3)次日，以1:1000的比率转接菌液至50ml LB+Ter(12.5μg/ml)液体培养基；

(4)转接菌液的同时，添加IPTG，使得IPTG终浓度为50μM；

(5)扩大培养3-4h，至菌液OD600达到0.4-0.5；

(6)将菌液分装至50ml离心管，5000rpm，10min，离心收集菌体。

(7)用无菌水洗一次，收集沉淀，PBS重悬；

(8)超声波破碎：间歇时间3s，超声时间2s，全程30min，温度4℃

(9)5000rpm，离心10min，收集裂解上清，上清即为SNP蛋白粗提液。

4.3筛选对稻瘟菌孢子具有抑制功能的肽适体

(1)准备孢子悬液及SNP蛋白粗提液，同时按照制备SNase蛋白(阴性对照)粗提液。

(2)分别将阴性对照(SNase蛋白粗提液)、阳性对照(0.2％三环唑溶液)、空白对照(PBS缓冲液)、实验组(SNP蛋白粗提液)与稻瘟菌孢子悬液等体积混匀点在载玻片上孵育，置于28℃恒温培养箱内培养。

(3)分别在孵育0h、3h、6h显微观察孢子萌发、芽管生长以及附着胞的形成过程，并拍照记录。

通过上述以SNase处理组为阴性对照，1％三环唑处理组为阳性对照，将不同SNP处理组作为实验组，显微观察各组孵育0h、3h、6h后孢子萌发及芽管形成的差别，从而筛选出对稻瘟菌孢子萌发及芽管形成具有抑制作用的特异性SNP-D4。

特异性肽适体SNP-D4处理后的稻瘟菌孢子，孵育3h后，其芽管长度明显短于阴性对照组；孵育6h后，阴性对照组和空白对照组中均能观察到附着胞，而D4未观察到附着胞的形成。因此D4肽适体具有抑制稻瘟菌芽管生长和侵染性结构附着胞形成的功能(图2)。

4.4功能性肽适体的序列测定与分析

将筛选得到SNP-D4肽适体，提取质粒，运用pTRG载体引物送往生工生物工程有限公司进行测序，测序结果显示SNP-D4肽适体的核苷酸序列为GTCACCTTCCTCGTGAACACCTACCCGAACGGGG TCCAGAGCAGGGCC(SEQ ID NO.2)

氨基酸序列为：VTFLVNTYPNGVQSRA(SEQ ID NO.1)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种肽适体，其为SNP-D4，以葡萄球菌核酸酶为基本骨架，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.编码权利要求1所述的肽适体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求2所述基因的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。

5.含有权利要求1所述肽适体的生物制剂。

6.含有权利要求1所述肽适体的稻瘟菌钙调蛋白拮抗剂。

7.含有权利要求1所述肽适体的农药。

8.权利要求1所述的肽适体或权利要求5所述的生物制剂或权利要求7所述的农药在植物保护方面的应用。

9.权利要求1所述的肽适体或权利要求5所述的生物制剂或权利要求7所述的农药在抑制稻瘟菌中的应用。

10.权利要求1所述的肽适体在制备抑制稻瘟菌的生物制剂或农药中的应用。