CN108184889B

CN108184889B - 一种人工肽适体用于抑制尖孢镰刀菌的用途

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Publication number: CN108184889B
Application number: CN201711399468.2A
Authority: CN
Inventors: 唐燕琼; 刘柱; 马香; 黄君君; 唐鸿倩; 胡新文
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: CN108184889A

Abstract

本发明涉及一种肽适体在制备用于抑制或抵抗尖孢镰刀菌的生物制剂、农药或保护剂中的用途。该肽适体包含可变肽段，所述可变肽段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其变体，或由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其变体编码。优选地，本发明的肽适体具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其变体，或由如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或其变体编码。特别地，本发明涉及所述的肽适体在制备用于防治由尖孢镰刀菌引起的植物病害(例如枯萎病)的生物制剂、农药或保护剂中的用途，尤其是在防治香蕉枯萎病中的用途。

Description

一种人工肽适体用于抑制尖孢镰刀菌的用途

技术领域

本发明涉及一种肽适体(例如，具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其变体的肽适体，或由如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或其变体编码的肽适体)在抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)，尤其是防治香蕉枯萎病中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

枯萎病是多种经济作物和农作物的主要病害之一。枯萎病病原菌致病力强、存活时间长、传播途径广，非常容易出现扩散、蔓延或失控的情况。例如，作为世界上最古老也是最重要的栽培果树——香蕉就深受枯萎病的危害。

香蕉枯萎病是由一种尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cubense,Foc)真菌侵染香蕉根部引起的土传维管束病害。(参考Poetz R C.,“Fusarium wilt of banana is caused by several pathogens referred to asFusarium oxysporum f.sp.Cubense,”[J].Phytopathology,2006,96(6):653-656)。尖孢镰刀菌以菌丝体、大型分生孢子和小型分生孢子的形式附着于根系表皮细胞(参考殷晓敏，徐碧玉，郑雯等，“香蕉枯萎病菌侵染香蕉根系的组织学过程，[J].植物病理学报，2011，41(6):570-575)；通过分泌一系列毒素来破坏根系的膜结构，造成代谢紊乱(参考许文耀，兀旭辉，林成辉，“香蕉枯萎病菌粗毒素的毒性及其模型，”[J].热带作物学报，2004，25(4):25-29)；后期直接侵染维管束，导致维管束木质化。香蕉枯萎病难以根治，容易对香蕉产业造成毁灭性的打击，是威胁我国香蕉产业的主要因素之一。

除了香蕉以外，尖孢镰刀菌也可侵染很多其它植物种类，包括但不限于：棉花、甘蔗、番茄、黄瓜、哈密瓜、西瓜、大豆、豇豆等，从而引起这些植物的枯萎病。

虽然现有技术已经通过化学杀菌剂例如除多菌灵、苯并噻二唑等对尖孢镰刀菌产生了一定的防治作用，但防治效果并不令人满意。本领域仍需一种更有效地，尤其是通过生物学手段来防治尖孢镰刀菌的方法。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提出了一种肽适体，所述肽适体包含可变肽段，所述可变肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生；其中，经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生的氨基酸序列保持所述可变肽段的活性或功能，或者所述可变肽段由上述氨基酸序列组成。

在一个实施方案中，编码所述可变肽段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者由SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生，或者，与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后的核苷酸序列特异性杂交，条件是经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列或与之特异性杂交或与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列特异性杂交的核苷酸序列保持SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的活性或功能，或者编码所述可变肽段的核苷酸序列由上述核苷酸序列组成。

在一个实施方案中，本发明的肽适体还包含支架蛋白。优选地，所述支架蛋白是葡萄球菌核酸酶，即，本发明的肽适体以葡萄球菌核酸酶为基本骨架。

在一个实施方案中，本发明所述的肽适体包含如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或包含由SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生的氨基酸序列，条件是经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸后产生的氨基酸序列保持所述肽适体的活性或功能，或者所述肽适体由上述氨基酸序列组成。在一个实施方案中，编码本发明所述的肽适体的核苷酸包含如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，或者包含由SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列，或者，包含与SEQID NO:4所示的核苷酸序列或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后的核苷酸序列特异性杂交的核苷酸序列，条件是经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸后产生的核苷酸序列或与之特异性杂交或与SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列特异性杂交的核苷酸序列保持SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的活性或功能，或者编码所述肽适体的核苷酸序列由上述核苷酸序列组成。

在一个实施方案中，本发明所述的肽适体由支架蛋白和本发明所述的可变肽段组成，优选地，所述可变肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。在一个优选的实施方案中，所述支架蛋白是葡萄球菌核酸酶。在一个优选的实施方案中，本发明所述的肽适体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示或其核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。

在一个实施方案中，本发明所述的可变肽段包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约91％、至少大约92％、至少大约93％、至少大约94％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、至少大约99％同源性的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列组成。可选地，编码本发明所述可变肽段的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:2的核苷酸序列具有至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约91％、至少大约92％、至少大约93％、至少大约94％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％或至少大约99％同源性的核苷酸序列，或由上述核苷酸序列组成。

在一个实施方案中，本发明所述的肽适体包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约91％、至少大约92％、至少大约93％、至少大约94％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％、至少大约99％同源性的氨基酸序列，或由上述氨基酸序列组成。可选地，编码本发明所述肽适体的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约91％、至少大约92％、至少大约93％、至少大约94％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％或至少大约99％同源性的核苷酸序列，或由上述核苷酸序列组成。

在一个实施方案中，本发明所述的可变肽段和/或肽适体的氨基酸序列或核苷酸序列可以通过本领域常用的方法进行修饰或标记。例如，本发明所述的可变肽段和/或肽适体的氨基酸序列或核苷酸序列可经一个或多个氨基酸或核苷酸的取代、缺失和/或插入而被修饰，或经本领域已知的任何修饰手段被修饰，从而在保持所述可变肽段和/或肽适体原有功能的情况下赋予其额外的性能。例如，本发明所述的可变肽段和/或肽适体的氨基酸序列或核苷酸序列可以被可检测地标记，从而确定靶蛋白的存在或量。标记方法是本领域熟知的，所述标记包括本领域常用的那些，包括但不限于荧光标记、同位素标记等。

根据本发明的另一个方面，提出了本发明上述肽适体或编码其的核苷酸片段在制备用于抑制或抵抗尖孢镰刀菌的生物制剂、农药或保护剂中的用途，或在制备用于抑制、抵抗或预防尖孢镰刀菌引起的植物病害的生物制剂、农药或保护剂中的用途。鉴于尖孢镰刀菌可侵染瓜类、茄科、香蕉、棉属植物、豆科及花卉等多种植物，例如棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黄瓜、哈密瓜、西瓜、大豆、豇豆等，从而引起这些植物的枯萎病，本发明也提出了上述肽适体在制备针对上述植物的抑制或抵抗尖孢镰刀菌的生物制剂、农药或保护剂中的用途。

在一个实施方案中，由尖孢镰刀菌引起的植物病害是植物枯萎病。在一个实施方案中，所述植物包括瓜类、茄科、香蕉、棉属植物、豆科及花卉等多种植物，例如棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黄瓜、哈密瓜、西瓜、大豆、豇豆等。优选地，所述植物是香蕉，所述枯萎病是香蕉枯萎病。

在本发明中，氨基酸序列或核苷酸序列的“变体”是指由所述氨基酸序列或核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸或核苷酸后产生的能够保持其功能或活性的氨基酸或核苷酸序列，或与所述氨基酸序列或核苷酸序列具有至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％、至少大约91％、至少大约92％、至少大约93％、至少大约94％、至少大约95％、至少大约96％、至少大约97％、至少大约98％或至少大约99％同源性的能够保持其功能或活性的氨基酸序列或核苷酸序列，或由所述氨基酸序列或核苷酸序列经本领域已知的手段进行修饰或标记后产生的能够保持其功能或活性的氨基酸序列或核苷酸序列。

本发明的上述肽适体对尖孢镰刀菌具有有效的抑菌和杀菌作用，因而可用于制备能够特异性抑制尖孢镰刀菌，且对植物(例如香蕉)植株无害、环境友好型的杀菌药剂，对枯萎病(例如香蕉枯萎病)的防治带来新突破，对其病原微生物的防治也具有重要的理论和实际意义。

前述内容仅仅是示意性的并且决不旨在是限制性的。除了上述示意性方面、实施方式和特征，通过参考下述详细说明，进一步的方面、实施方式和特征将更容易被理解。

附图说明

通过参考下述附图，本发明的进一步的方面、特征将更容易被理解。本领域技术人员应该理解，这些附图仅示意性地阐述了根据本发明的一些实施方式，而不应将其视为是对本发明范围的限制。

图1示出肽适体的特征性结构。

图2分别示出肽适体SNP-D4的全长核苷酸序列(如SEQ ID NO:4所示，长度为576bp)与氨基酸序列(如SEQ ID NO:3所示，长度为191个氨基酸)。

图3分别示出肽适体SNP-D4中可变肽段的核苷酸序列(如SEQ IDNO:2所示，长度为48bp)与氨基酸序列(如SEQ ID NO:1所示，长度为16个氨基酸)。

图4示出肽适体SNP-D4对尖孢镰刀菌孢子萌发的抑制作用，其中圆圈标记的为未萌发的孢子，箭头标记的为萌发较短的孢子。

图5显示阳性克隆子PCR验证的结果，其中M：D5000Marker；泳道1：pET 28a SN载体引物扩增序列；泳道2：pET 28a SN目的片段特异性引物扩增序列；泳道3：pET 28a SNP-D4载体引物扩增序列；泳道4：pET 28a SNP-D4目的片段特异性引物扩增序列。

图6显示纯化的重组SNP-D4与SN的SDS-PAGE电泳图，其中M：蛋白Marker；泳道1和泳道2：纯化后的重组SN；泳道3和泳道4：纯化后的重组SNP-D4。

图7显示不同浓度SNP-D4对尖孢镰刀菌孢子萌发率的影响。

图8显示不同处理对孢子杀菌率的影响，其中阴性对照：50mM Tris-Hcl；SN：体外重组蛋白SN；SNP-D4：体外重组蛋白SNP-D4。

具体实施方式

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

肽适体(peptide aptamer，pepaptamer)是一种从人工合成的随机氨基酸文库中筛选出的、可高特异性、高亲和力结合靶标的短肽(Hopper S F,Crnkovic M I,Tomai E等,“Peptide aptamers:specific inhibitors of protein function,”[J].Curr.Mol.Med.,2004,4(5):529-538)。

参考图1，肽适体主要结构包括一段结构稳定的支架蛋白(scaffold protein,SN)和两端固定在支架蛋白上的可变肽段(参见Groner B,Borghouts C,Kunz C.,“Peptideaptamer libraries,”[J].Comb.Chem.High Throughput Screen,2008,11(2):135-145)。可变肽段通常由8-20个氨基酸组成，具有识别及结合靶蛋白的功能。

肽适体具有以下三个特征：其一、对同源靶标具有极高的特异性，可以区分同一蛋白家族的不同成员；其二，相较于抗体而言，肽适体分子量小，对靶蛋白识别与结合能力与抗体相当；其三，肽适体在体内可折叠形成稳定的三级构象，与一般游离的氨基酸相比更有利于保持较高的生物学活性(参见江丽，兰小鹏，“适体家族新成员——肽适体，”[J].中国生物化学与分子生物学报，2009，2(1):99-103)。

由于肽适体自身能够以高特异性、高亲和力结合靶蛋白的特性，其越来越多地被应用于药物开发。本实验室之前的研究，已通过肽适体文库筛选，获得对稻瘟病有抑制作用的氨基酸序列和核苷酸序列如图2所示的人工肽适体SNP-D4。进一步地，有关人工肽适体SNP-D4的相关信息可以参考申请号为201510615168.8，申请日为2015年9月24日，申请人为海南大学的中国专利申请，其通过引用以其整体并入本文。

实验材料和方法

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

1.供试菌株和病原菌

供试菌株：大肠杆菌reporter、大肠杆菌BL21(DE3)。

病原菌：尖孢镰刀菌热带四号小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubenseTropical race 4,Foc TR4)。

以上菌株均由本实验室保存。

2.培养基

LB液体培养基，含有以下物质：胰蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、NaCl 0.5g、蒸馏水100mL，用10mol/L NaOH调pH至7.2，121℃高压灭菌20min，置4℃保存备用。

LB固体培养基，含有以下物质：胰蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、NaCl 0.5g、琼脂糖1.5g、蒸馏水100mL，用10mol/L NaOH调pH至7.2，121℃高压灭菌20min，冷却至约50℃时倾注平板，保存备用。

PDA培养基，含有以下物质：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(购自Solarbio公司)3.7g、蒸馏水100ml。

3.试剂

洗脱液I：4％(w/v)SDS、100mM Tris/HCl、1mM DTT、pH 7.6。

洗脱液II：500mM咪唑。

1％营养液：1g葡萄糖、0.1g蛋白胨、1g酵母提取物，加水至100ml，使用时稀释为0.3％营养液。

透析外液：1L 10mM PBS中溶解8g NaCl、0.2g KCl、3.58gNa₂HPO₄.12H₂O和0.27gKH₂PO₄。

pET28a、pTRG为实验室保存质粒。肽适体文库pTRG-SNP由本实验室构建。

实施例1.肽适体文库的筛选

1.构建肽适体文库

(1)提取葡萄球菌基因组，分别用5SNA及3SNA，5SNB及3SNB进行PCR，用对应酶切，连接到载体pTRG上，构建成pTRG-SN。

5SNA:5′-GGATCC GCG GCC GCAATG GGT TAC CCATAC GACGTT C-3′(Bam HI位点)(SEQ ID NO:5)

3SNA:5′-GTACTT AGATCT GGC CTT TCT TAAGGAGAA TTCTG-3′(Bgl II位点)(SEQID NO:6)

5SNB:5′-AAG GCC AGATCT AAG TAC GGT CCAGAAGCTTC-3′(Bgl II位点)(SEQ IDNO:7)

3SNB:5′-GAT CTC ACT AGT TTAGTG GTG GTG GTG GTG GTGGTC GAT GTC-3′(ScaI位点)(SEQ ID NO:8)

(2)合成下列单链随机核酸序列：

5′GGTGGTNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSGGTGGT3′，其中N代表A/G/T/C中的一种；S代表G/C中的一种。

(3)单链转换成双链，并将此片段插入pTRG-SN载体，构成含有可变环的pTRG-SN-肽(简称pTRG-SNP)；转化随机挑取单菌落测序，计算库容量可达10^7-8。

2.肽适体文库的转化

将肽适体文库质粒转入制备好的大肠杆菌reporter感受态细胞中，分离单菌落，并使用载体特异性引物pTRG-F(5′-TGGCTGAACAACTGGAAGCT-3′)(SEQ ID NO:9)和pTRG-R(5′-ATTCGTCGCCCGCCATAA-3′)(SEQ ID NO:10)验证，之后分别保种，一共得到84个肽适体单克隆。

3.肽适体诱导表达

将分离、保种的肽适体单克隆分别接种至5ml LB液体培养基(四环素抗性)，37℃，150rpm摇床过夜；测菌液OD值，保证相同接种量，将菌液接种至20ml的LB液体培养基(四环素抗性)中，加入IPTG(终浓度50uM)，30℃150rpm诱导过夜。

4.抑菌试验

测菌液OD值，保证菌量相同，收集菌体，用4ml PBS缓冲液悬浮，进行超声破碎。超声5s，间隙6s，功率35％，共20min。收集上清，即细胞裂解液。

分别将10ul细胞裂解液、10ul 4*10⁶个/ml尖孢镰刀菌孢子悬液和10ul 0.3％营养液混匀，同时以PBS为阴性对照，0.3％恶霉灵为阳性对照，在28℃培养箱培养12h，之后在光学显微镜下观察孢子萌发情况。

最后从34种肽适体中筛选到了5种肽适体对尖孢镰刀菌孢子有一定的抑制作用，其中SNP-D4作用效果最佳(见图4)，因此将其提取质粒，并测序。将测序结果进行分析，确保肽适体上可变肽段序列是3的倍数，确保可变肽段上不含终止密码子，之后将其翻译成氨基酸序列。最终以序列完整的肽适体(其核苷酸和氨基酸序列如图2所示)及其可变肽段(其核苷酸和氨基酸序列如图3所示)为研究对象。

实施例2.人工肽适体SNP-D4的原核表达载体构建

将肽适体SNP-D4基因片段与表达载体pET28a连接，转化大肠杆菌感受态细胞BL21，挑取阳性克隆子分别使用载体特异性引物与目的片段特异性引物进行PCR验证，结果如图5所示。将重组质粒进行测序，结果得到582bp的测序产物，通过序列比对确认其与SNP-D4的全长氨基酸序列一致，表明人工肽适体SNP-D4的原核表达载体构建成功。

实施例3.重组肽适体的抑菌效果评估

1.诱导原核表达

将肽适体SNP-D4(以下简称SNP-D4)构建到原核表达载体上，使用IPTG诱导其大量表达，通过镍柱纯化蛋白，结果见图6。使用BCA试剂盒测定纯化后的蛋白浓度。

2.抑菌试验

梯度稀释纯化后的SNP-D4，取10ul肽适体粗裂解液、10ul 4*10⁶个/ml尖孢镰刀菌孢子悬液和10ul 0.3％营养液混匀，以透析外液为阴性对照，在28℃培养箱培养12h，之后在光学显微镜下观察孢子萌发情况，统计萌发率。

萌发结果见图7，表明在浓度为8μM时，孢子萌发率最低，低于40％。

3.平板实验

为了进一步研究SNP-D4是否对尖孢镰刀菌具有杀菌作用，用纯化后的肽适体处理孢子悬液，28℃孵育12h，之后将其涂布在PDA培养基上，28℃培养48h，统计菌落数。为了排除骨架蛋白SN对尖孢镰刀菌孢子萌发的影响，使用纯化后的SN作为对照。杀菌率％＝[(阴性对照菌落数-处理组菌落数)/阴性对照菌落数]*100％。

结果见图8，显示SNP-D4对尖孢镰刀菌的杀菌率高达70％。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到其各种变化或替换，这些都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 海南大学

<120> 一种人工肽适体用于抑制尖孢镰刀菌的用途

<141> 2017-11-28

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val Thr Phe Leu Val Asn Thr Tyr Pro Asn Gly Val Gln Ser Arg Ala

1 5 10 15

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtcaccttcc tcgtgaacac ctacccgaac ggggtccaga gcagggcc 48

<210> 3

<211> 191

<212> PRT

<213> SNP-D4

<400> 3

Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Pro Gly Ile Gln Pro Ala Thr

1 5 10 15 20

Ser Thr Lys Lys Leu His Lys Glu Pro Ala Thr Leu Ile Lys Ala Ile Asp Gly Thr Thr

21 25 30 35 40

Val Lys Leu Met Tyr Lys Gly Gln Pro Met Thr Phe Arg Leu Leu Leu Val Asp Thr Pro

41 45 50 55 60

Glu Phe Gly Gly Val Thr Phe Leu Val Asn Thr Tyr Pro Asn Gly Val Gln Ser Arg Ala

61 65 70 75 80

Gly Gly Arg Ser Lys Tyr Gly Pro Glu Ala Ser Ala Phe Thr Lys Lys Met Val Glu Asn

81 85 90 95 100

Ala Lys Lys Ile Glu Val Glu Leu Asp Lys Gly Gln Arg Thr Asp Lys Tyr Gly Arg Gly

101 105 110 115 120

Leu Ala Tyr Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Met Val Asn Glu Ala Leu Val Arg Gln Gly Leu

121 125 130 135 140

Ala Lys Val Ala Tyr Val Tyr Lys Pro Lys Asn Thr His Glu Gln His Leu Arg Lys Ser

141 145 150 155 160

Glu Ala Gln Ala Lys Lys Glu Lys Leu Asn Ile Trp Ser Glu Asp Asn Ala Asp Ser Gly

161 165 170 175 180

Gln Val Asp Ile Asp His His His His His His

181 185 190

<210> 4

<211> 576

<212> DNA

<213> SNP-D4

<400> 4

atgggttacc catacgacgt tccagactac gcttctttgc cagggatcca accagctacc 60

tctaccaaga agttgcacaa ggaaccagct accttgatca aggctatcga cggtaccacc 120

gttaagttga tgtacaaggg tcaaccaatg accttcagat tgttgttggt tgacacccca 180

gaattcggtg gtgtcacctt cctcgtgaac acctacccga acggggtcca gagcagggcc 240

ggtggtagat ctaagtacgg tccagaagct tctgctttca ccaagaagat ggttgaaaac 300

gctaagaaga tcgaagttga attggacaag ggtcaaagaa ccgacaagta cggtagaggt 360

ttggcttaca tctacgctga cggtaagatg gttaacgaag ctttggttag acaaggtttg 420

gctaaggttg cttacgttta caagccaaag aacacccacg aacaacactt gagaaagtct 480

gaagctcaag ctaagaagga aaagttgaac atctggtctg aagacaacgc tgactctggt 540

caagttgaca tcgaccacca ccaccaccac cactaa 576

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 5SNA

<400> 5

ggatccgcgg ccgcaatggg ttacccatac gacgttc 37

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 3SNA

<400> 6

gtacttagat ctggcctttc ttaaggagaa ttctg 35

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 5SNB

<400> 7

aaggccagat ctaagtacgg tccagaagct tc 32

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 3SNB

<400> 8

gatctcacta gtttagtggt ggtggtggtg gtggtcgatg tc 42

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> pTRG-F

<400> 9

tggctgaaca actggaagct 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> pTRG-R

<400> 10

attcgtcgcc cgccataa 18

Claims

1.可变肽段氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的肽适体在制备用于抑制、抵抗或预防尖孢镰刀菌引起的植物病害的生物制剂、农药或保护剂中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述肽适体还包含作为支架蛋白的葡萄球菌核酸酶。

3.如权利要求2所述的用途，其中所述肽适体为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1至3任一项所述的用途，其中所述植物病害是植物枯萎病。

5.如权利要求4所述的用途，其中所述植物是棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黄瓜、哈密瓜、西瓜、大豆或豇豆。

6.如权利要求4所述的用途，其中所述植物是香蕉。

7.一种编码肽适体的核苷酸或核苷酸片段在制备用于抑制、抵抗或预防尖孢镰刀菌引起的植物病害的生物制剂、农药或保护剂中的用途，其中所述肽适体由支架蛋白和可变肽段组成，并且其中编码所述可变肽段的核苷酸或核苷酸片段的核苷酸序列为：

SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述支架蛋白是葡萄球菌核酸酶。

9.如权利要求8所述的用途，其中编码所述肽适体的所述核苷酸或核苷酸片段的核苷酸序列是：

SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

10.如权利要求7-9任一项所述的用途，其中所述植物病害是植物枯萎病。

11.如权利要求10所述的用途，其中所述植物是棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黄瓜、哈密瓜、西瓜、大豆或豇豆。

12.如权利要求10所述的用途，其中所述植物是香蕉。